17/06/2016

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

UNIDAD DE POSTGRADO

CURSO:
TPICOS EN
PROTEMICA VEGETAL

CLASE V:
MICROSCOPIA CONFOCAL LASER DE BARRIDO

Prof. Mara Elena Gonzlez Romero, Ph.D.

TEMAS CLASE V

*Microscopio Confocal Laser de Barrido,

*Marcadores Fluorescentes (Fluorforos,GFP

(Fluorforos,GFP,, YFP, CFP),

*Tcnicas usadas en microscopia (FRET, FRAP. FLIP, FLIM)

*Manipulacin de imgenes digitales

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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MICROSCOPIA DE LASER CONFOCAL CON

ESCANEO (CLSM)
Imagen Confocal: Marvin
Minsky (MIT) en 1957.

Dimetro del Pinhole determina

cuanta fluorescencia es detectada.

Photobleaching: un enemigo
o un aliado?

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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MICROSCOPIA DE LASER CONFOCAL CON

ESCANEO (CLSM)

Ventajas:

Mejora la nitidez de la imagen.

Incrementa la resolucion.

Mejora el rango seal-ruido.

Permite clara examinacion de objetos gruesos y que
dispersan la luz.

Es posible realizar un scaneo xy sobre una area amplia
del specimen.

Inclusion de un Z-scan es posible.

Ajustes electronicos de magnificacin.

Una serie de secciones opticas podrian ser convertidas a
imagenes 3D.
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

MICROSCOPIA DE LASER CONFOCAL CON

ESCANEO (CLSM)

Limitaciones:

Photobleaching: los fluoroforos dejan de emitir luz al ser

expuestos a la luz de excitacion.

Phototoxicity (fototoxicidad) de la muestra.

La profundidad de la imagen en muestras gruesas

El alto costo del equipo en comparacion con otros

microscopios.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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COLORANTES Y SONDAS

Fluorforos: es un
compuesto qumico
fluorescente que puede
emitir luz al ser excitado
por una luz (Ej.
Fluorescein, coumarin,

Cromforo es la parte de
Protenas fluorescentes).
la molcula responsable de
producir color. El color es
producido por la molcula
cuando esta absorbe luz a
cierto largo de onda y
emite otra.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D. B-caroteno

CARACTERSTICAS DE FLUORFOROS

Caractersticas Bioqumicas:

Solubilidad en agua

Transporte: permeabilidad de la membrana.

Asociacin molecular: afinidad de unin a un receptor

Accin metablica con la sonda: rango de conversin

enzimtica

Self-quenching: se da cuando hay una interaccin

fluoroforo-fluoroforo en una molcula formando dmeros
haciendo que alguno de los fluoroforos o ambos no
emitan luz.

Produce la disminucin de fluorescencia cuando la

concentracin del dye incrementa.
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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CARACTERSTICAS DE FLUORFOROS

Caractersticas del espectro de luz del fluoroforo:

Numero y energa de distribucin de los fotones

disponibles para ser detectados.

Espectro de excitacin y emisin.

Rendimiento de la fluorescencia.

Rango de photobleaching.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

FLUORFOROS MS USADOS

Fluorescein y derivados: 520 nm, verde,

sensible a variaciones de pH.

Susceptibles a photobleaching.

Coumarinas y derivados: 450-521 nm,

laser azul-verde ,

Baja eficiencia de exitacion.

Rhodamines y derivados: 580 nm,

naranja,

Agregados en soluciones acuosas, resultando en
self-quenching del fluoroforo..

Se une a la membrana de la mitocondria.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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FLUORFOROS MS USADOS

AlexaFluor dyes

19 dyes, excitacin 350-750 nm.

Mayor solubilidad en agua que fluoresceins,
lo que reduce el self-quenching una vez unida
a la protena y mejora la fotoestabilidad

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

Cy dyes

Tienen pocas variantes en largo de onda
de excitacin pero contienen acido
sulfonico lo q incrementa solubilidad y N-
hydroxysuccinimethyl (NHS) para unir a
grupos aminos libre en las protenas y
otras molculas.

Fluoroforos
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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PROTENAS FLUORESCENTES
GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP)
Medusa Aequoria victoria, GFP (27
kDa)

Martin Chalfie, Osamu Shimomura y

Roger Y. Tsien-Premio Nobel en

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

Qumica 2008.

GFP exhibe fluorescencia verde cuando

es expuesta a una luz en el rango de
azul a ultravioleta.

GFP Cromforo
Estructura es un barril B (4.2 nm largo x
2.4 nm diametro), consiste de 11 -sheets
con 6 helices alpha conteniendo un
cromoforo 4-(p-
hydroxybenzylidene)imidazolidin-5-one
(HBI) en el medio.

PROTENAS FLUORESCENTES
GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP)
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

http://www.glofish.com/

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PROTENAS FLUORESCENTES

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

Shaner et al., (2005) Nature methods 2 (12): 905-909

PROTENAS FLUORESCENTES
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

YFP=S65G, V68L, S72A, T203Y

F64L

CFP=S65A, Y66W, S72A, N146I,M153T, V163A

Shaner et al., (2005) Nature methods 2 (12): 905-909

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PROTENAS FLUORESCENTES

Coral mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

Discosoma sp.

YFP=S65G, V68L, S72A, T203Y

F64L

CFP=S65A, Y66W, S72A, N146I,M153T, V163A

Shaner et al., (2005) Nature methods 2 (12): 905-909

AUTOFLUORESCENCIA:
COMO USARLA EN
NUESTRO BENEFICIO?

Considrela un amigo: si
puede ser separada en otro canal
esta puede ser considerada como
otro marcador fluorescente (e.g.,
flavonoides ).

Enmascarar con un colorante

de extincion (quenching dye;
Evans Blue para celulas de
mamiferos, Sudan dyes para
suberina, etc.), Ca2+ para la
quinina.
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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COMO INTRODUCIR EL FLUOROFORO A LA MUESTRA?

Agrobacterium Infiltracin en N. benthamiana

 Inmunostaining
 Electroporacin

 Biolistica

 Permeabilidad

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

LIVE CELL IMAGING

SP-GFP

Tcnica de imgenes para producir una

imagen basada en las diferencias de la emisin
de fluorescencia desde una muestra
fluorescente.
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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LIVE CELL IMAGING

H2O Pared celular
ER

Ncleo
Clulas Plasmolizadas Pared
1M NaCl celular

Localizacion subcelular observada

ER, ncleo, pared celular.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D. Images taken by Maria Elena Gonzalez Romero Ph.D.

FSTER RESONANCE ENERGY TRANSFER (FRET)

FRET es un mecanismo en el cual la energa

se transfiere entre dos molculas de luz-
sensibles (cromforos).

Un donador cromforo, inicialmente en su

estado excitado, puede transferir energa a un
cromforo aceptor a travs de una
acoplamiento dipolo-dipolo no radioactivo.

FRET es extremadamente sensible a cambios

en distancia (CFP-YFP: 4.9 a 5.2 nm)

CFP YFP CFP YFP

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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G-protein-coupled receptor

Biosensores basedos en FRET

inositol trisphosphate receptor (InsP3R)

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D. Courtesy of Dr. Howard Berg

FLUORESCENCE RECOVERY AFTER PHOTOBLEACHING

(FRAP)

Tcnica que identifica la difusin de un cromoforo en una clula.

Tcnica usada en difusin de protenas en membranas celulares y

unin de protenas

http://www.giga.ulg.ac.be/jcms/cdu_8791/confocal-microscopy-faqs
https://www.youtube.com/watch?v=P8-CWDw5X3c Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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FLUORESCENCE LOSS IN PHOTOBLEACHING (FLIP)

Tcnica para identificar el movimiento de molculas dentro de una

clula y membranas.

La regin de inters esta fuera de la regin donde se realiza el

photobleaching.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

FLUORESCENCE-LIFETIME IMAGING MICROSCOPY

(FLIM)

La deteccin de la fluorescencia se logra contando el numero de fotones

emitidos por el estado excitado del fluoroforo.

Es usado para medir FRET,

mide el tiempo excitado del
donador.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

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MANIPULACIN DE IMGENES DIGITALES

Photoshop

Image J http://rsbweb.nih.gov/ij/

Nature Protocols 2008 Vol: 3(4):619-628.

Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.
Andrew P French; Steven Mills; Ranjan Swarup; Malcolm J Bennett; Tony P Pridmore
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

MANIPULACIN DE IMGENES DIGITALES

Imaris http://www.bitplane.com/go/products
$12000

High-Resolution Imaging in Zebrafish

Prof. R. Klemke and colleagues, University of California at San
Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

Diego
Visualization of tumor induced angiogenesis.
Fish bloodvessels=green, tumor cells=red; scale bars= 20m.

Three-dimensional vacuole reconstruction of a

vacuolated BobTIP26-1::gfp expressing cell 7 days after
subculture. (a)
Reisen et al. BMC Plant Biology 2005 5:13

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IDEAS Y SUGERENCAS!

PARA MICROSCOPIOS INVERTIDOS

Cover glass petri dish

(Willco Wells BV, cat #

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

GWSB-5040)

Mantiene la muestra viva: Courtesy of Dr. Howard Berg

oxigeno, humedad.

Courtesy of Dr. Howard Berg

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Hibbs, A.R. (1999) Confocal Microscopy for Biologists.

Maria Elena Gonzalez Romero, Ph.D.

Murphy, D.B. (2001) Fundamentals of light microscopy

and electronic imaging.

Pawley, J. (2006) Handbook for biological confocal

microscopy, 3rd edition.

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