Mtodos extraccin del RNA total y purificacin de mRNA y

valoracin espectofotomtrica y electrofortica del RNA extrado.

Equipo 8: Acosta Prez Estefana Elizabeth, Rodrguez Santiago Juan Cristian, Torres Velazco
Norma Alejandra, Flores de la Cruz Alan Augusto

Extraccin del RNA

Mtodo: TRIzol. (tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo)
El TRIzol es un reactivo listo para utilizarse en el aislamiento de arn de clulas y tejidos, esuna
solucin mono-fsica de fenol e isocianato de guanidina que durante lahomogenizacin o lisis de
la muestra mantiene la integridad del rna, al mismo tiempo quealtera la estabilidad de las clulas y
disuelve los componentes celulares.

Homogenizacin:
1. Homogenice la muestra mezclando el tejido (vegetal o animal) con .5ml de TRIzol por cada
35mg de tejido.
2. Tomamos 0.5 ml del homogenizado se coloca en un tubo nuevo.

Fase de separacin:
3. Repose el homogenizado durante 5 minutos y temperatura ambiente para permitir la
disociacin completa de protenas.
4. Agregue al homogenizado 0.2ml de cloroformo por cada 1ml de trizol utilizado.-agite
vigorosamente a mano durante 15 segundos o utilice un vortex.
5. Centrifugue la muestra a 12 000 rpm durante 15 minutos y 2-8c, despus de centrifugar
la muestra deber estar separada en dos fases, una roja que corresponde a la fase fenol-
cloroformo y una fase incolora que corresponde a la fase acuosa, el RNA permanece
exclusivamente en esta ltima fase.

Precipitacin del RNA:

6. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo, guarde la fase orgnica si se desea una
posterior extraccin del DNA precipite el RNA de la fase acuosa utilizando alcohol
isopropanol, agregue 0.5ml por cada1ml de TRIzol usado en la fase de homogenizacin
7. encube las muestras a temperatura de 10-30c durante 10 minutos
8. centrifugue la muestra a 12 000 rpm durante 10 minutos y 2-8c, despus de centrifugar la
muestra, el RNA precipitado a menudo es visible formando un botn al fondo del tubo.

Fase de Lavado:
9. Retire el sobrenadante y lave una vez el botn de RNA con 1ml de etanol al 75% por cada
1ml de TRIzol utilizado en la homogenizacin.
10. Centrifugue a 7 500 rpm durante 5 minutos y temperatura de 2 a 8c.
11. Re-suspenda la muestra de RNA en agua libre de RNasa.
12. Almacenar a -20 C.
Extraccin total del RNA mtodo CTAB.

Extraccin que utiliza un compuesto de buffer llamado CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio ) un

detergente que precipita cidos nucleicos.

Se utiliza con frecuencia en tejidos vegetales.

Extraccin:
1. Pulverizar 150mg de material vegetal con Nitrgeno lquido.
2. Homogenizar el material vegetal con 1.5ml de buffer de maceracin CTAB e incubar
durante 10min a 65C.
3. Adicionar un volumen igual de cloroformo:alcohol isoamilico (24:1 v/v) y centrifugar
durante 15min a 12000rpm a 4C.
4. Transferir la fase acuosa a un tubo de reaccin nuevo.

Precipitacin:
5. Adicionar un volumen igual de LiCl 4M e incubar overnight a 4C.
6. Centrifugar durante 30min a 12000rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.
7. Resuspender el pellet en 1ml de buffer TE-SDS.
8. Adicionar 100l NaCl 5M y 300l de isopropanol e incubar durante 30min a -20C.
9. Centrifugar durante 10min a 12000rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.

Lavado:
10. Lavar el pellet fue lavado con 1ml de etanol absoluto, agitar vigorosamente, centrifugar
durante 5min a 7500rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.
11. Dejar secar el pellet y resuspender con 30l de agua tratada con DEPC.
12. Almacenar los extractos a -20C hasta su procesamiento.

Arreglos de RNA y Northern Blot

Equipo 9: ANA FLETES LEAL, MNICA GALVN, NGEL JIMNEZ

ARREGLOS DE RNA
Permite analizar y monitorear la expresin de genes.
Se utilizan para conocer el mecanismo molecular mediante el cual acta un
medicamento o frmaco.
Diagnosticar enfermedades congnitas.
Sirve para reparar genes alterados.
Se crearon como una solucin rpida para analizar todos los genes de un
organismo al mismo tiempo.
Microarreglos
Son una superficie slida donde se coleccionan fragmentos de DNA en
pozos.
Pueden ser de vidrio, plstico, o silicona, tambin son llamados chips de
DNA o microarrays.
Microarreglos de DNAc o DNA Complementarios
Se basa en la comparacin de dos muestras biolgicas diferentes, sonda y
muestra a analizar.
El DNA utilizado para la comparacin es el que se obtiene de la
retrotranscripcin de RNAm.
Pasos para realizar un procedimiento de microarreglos de DNAc.
Extraccin de RNA
Marcado del RNA y sntesis de DNAc
Impresin de Microarreglos
Hibridacin del DNAc
Lectura
Los puntos de tonalidades rojas a naranjadas indican el aumento en la expresin
de gen.
Los puntos que van de tonalidades verdes a verdes claras indican una
disminucin en la expresin del gen.
Los puntos totalmente amarillos indican que en ambas condiciones el gen se
expresa igual.

NORTHERN-BLOT
Permite determinar la cantidad y tamao de RNAs especficos presentes en
preparaciones de RNA total, mensajero o ribosmico.
Procedimiento
Se extrae una muestra de RNA.
Se homogenizan las clulas y tejidos que contienen RNA en una solucin
que contenga inhibidores de RNAasas.
Se separa DNA del RNA.
Se precipita RNA purificado con etanol.
Se desnaturaliza la muestra.
Electroforesis
Se usa la electroforesis en gel de agarosa.
Se cargan las muestras en los pocillos de una caja de gel horizontal.
Se conecta la corriente elctrica.
Los fragmentos de RNA migran a travs del gel de acuerdo a su tamao.
Se forma la calle o carril de patrones.
Transferencia del RNA a una membrana
Se traspasan a un tipo de membrana mediante capilaridad.
Existen 2 tipos: nitrocelulosa y nylon.
Es necesario inmovilizar el RNA de la membrana y esto se puede conseguir
a travs de dos maneras: Horno de vaco e Irradiacin UV.
Hibridacin
Proceso de complementacin de bases entre dos hebras sencillas de DNA
y RNA, o RNA pero cuyo origen es distinto.
Se quiere conseguir la mxima interaccin entre la sonda y la molcula de
cido nucleico que se quiere detectar.
Existen distintos factores que intervienen en la hibridacin.
Se lleva a cabo en tres etapas: Pre-hibridacin, hibridacin y lavado.
Deteccin
Es la captura de la radiacin ionizante por una emulsin fotogrfica.
Autoradiografia
Pelcula de rayos X
Fluorografa
Quimioluminiscencia
Deteccin cromognica
Ventajas:
La muestra de RNA requiere un mnimo de procesamiento.
La tcnica puede ser fcilmente evaluada (degradacin, lmite de
deteccin).
Nos permite reconocer el anlisis de mutaciones y alteraciones de RNAm
de enzimas, y en la regulacin de la expresin gnica de marcadores
Desventajas:
-El costo de su elaboracin es elevado
-La reproducibilidad de los datos no siempre es consistente. Este problema se ha
resuelto parcialmente haciendo mediciones por duplicado.
-El resultado depende de la sonda que se utilice, de las propiedades qumicas de
esta.
Aplicaciones
Permite observar un patrn particular de expresin gnica entre tejidos,
rganos, estadios en desarrollo, niveles de estrs ambiental, infecciones
causadas por patgenos y durante el curso de tratamiento de las mismas.
Conocer funciones de los genes. Desde que el RNA se separo por su
tamao, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamao
o sugerir motivos repetidos en la secuencia.

REFERENCIAS
http://m.sb-10.com/himiya/29638/index.html?page=5
http://www.ub.edu/stat/docencia/biologa/introbioinformatica/MicroArrays/Mi
croarrays_de_DNA.pdf
Biologa Celular y Molecular de Harvey Lodish / Arnold Berk / Paul
Matsudaira / Chris A. Kaiser / Monty Krieger/ Matthew P. Scott / Lawrence
Zipursky / James Darnell. Edicin: 5 Pginas 614 a 616
Conceptos de Gentica de William S. Klug, Charlotte A. Spencer, Michael
R. Cummings