CTEDRA "B" DE CITOLOGA, HISTOLOGA Y EMBRIOLOGA F.C.M. U.N.L.P.

Autor Responsable: Prof. Marhta VIDAL - Diseo y Edicin Pablo DEGREGORI

OBJETIVOS DE LA MATERIA
Formar un estudiante que posea conocimientos de Citologa, Histologa y Embriologa en un nivel
adecuado y suficientemente actualizado, capaz de interpretar los fenmenos dinmicos de la
Histofisiologa y del desarrollo embriolgico del hombre.

Desarrollar en el alumno la capacidad de observacin, de anlisis y sntesis, de comparacin y de

crtica, para poder resolver los problemas que se le planteen. As se podr llegar, mediante la
discusin inteligente y bien fundamentada, a un conocimiento ms slido y perdurable.

Contribuir a una profunda formacin cientfica general, preparando al estudiante para saber
categorizar los valores ticos y desarrollar el sentido de la responsabilidad.

HISTO: tejido
LOGOS: estudio, palabra o aprendizaje.

El fundamento de nuestras actividades prcticas, ser familiarizar a los alumnos con el estudio
microscpico de las estructuras normales, de los distintos rganos de la economa;
interrelacionarlos; comprender sus funciones (Fisiologa) y concluir en la posibilidad de que existan
alteraciones morfolgicas y/o funcionales, de los mismos (Fisiopatologa), intentando
capacitarlos para su futura introduccin al estudio de las enfermedades (Patologa), las
cuales se expresan mediante signos y sntomas que se estudian en la Clnica Mdica.

Toda metodologa didctica que nos permita concretar lo fundamentado anteriormente, ser
valida.

TECNICA HISTOLOGICA
Con ms de cien aos de existencia, se ha ido perfeccionando con el paso del tiempo. Esta tcnica
debe estudiar una capa muy delgada de la muestra, susceptible de ser observada, por
transparencia, en el microscopio, conservando:
1. La forma y tamao, lo ms exactamente posible.
2. La estructura de las clulas y los tejidos.

Para conciliar estas dos exigencias, las piezas a estudiar deben sufrir un cierto nmero
de procedimientos, que comprendern ciertas etapas o pasos. Para ello proponemos a los
alumnos, las siguientes Unidades de Accin:
A. Nombre los pasos de la Tcnica Histolgica, para el examen mediato (Tcnica Corriente)
B. En la obtencin de material, discuta la diferencia entre Necropsia y Biopsia.
C. Nombre los animales de laboratorio mas comnmente utilizados, para la obtencin de material
de estudio.
D. Explique la importancia de la fijacin.
E. D ejemplos de Fijadores Fsicos, Fijadores Qumicos y Mezclas Fijadoras ms comunes.
F. Nombre el Fijador Qumico ms comn.
G. Establezca la importancia de la INCLUSIN.
H. Mencione la sustancia que se usa comnmente para la inclusin y los pasos utilizados
para la misma.

Ctedra B de Citologa, Histologa y Embriologa. Facultad de Ciencias Mdicas. U.N.L.P. 2015. Reserva de derechos. Quedan reservados todos los
derechos de propiedad intelectual, diseos e imgenes contenidas en estas pginas. Queda totalmente prohibida cualquier copia o reproduccin total o
parcial de dicha edicin por cualquier medio del contenido sin la autorizacin previa, expresa y por escrito de la Ctedra.
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I. Mencione el espesor de los cortes que se utilizan en microscopia ptica; comprelos con el
espesor exigido en microscopia electrnica.
J. Explique brevemente el montaje.
K. Se discutir, en forma practica, la orientacin de los cortes. Los diferentes planos en que
pueden ser cortados: Clula-rgano Hueco-rgano Macizo.
L. Defina qu es un Colorante.
M. Establezca la diferencia entre Coloracin e Impregnacin.
N. D ejemplos de los colorantes ms utilizados.
O. Establezca diferencias y relaciones entre los siguientes trminos:
BASFILO
ACIDFILO (EOSINOFILO)
ESTRUCTURA BASICA
ESTRUCTURA CIDA
P. Mencione la Coloracin Dicrmica, ms comn; analice sus pasos.
Q. Nombre algunas tcnicas Tricrmicas.
R. Qu entiende por Metacromasia?
S. Mencione algn Colorante Metacromtico.

Nuestra Ctedra de Citologa, Histologa y Embriologa tiene como principal objetivo a lo largo y a
travs de nuestras actividades practicas, orientar a cada estudiante a comprender la microanatoma
de las clulas, los tejidos y los rganos que ellos constituyen, pudiendo as correlacionar la estructura
y la funcin.

El estudio directo de clulas y tejidos vivos solo tiene aplicaciones limitadas, presentando los tejidos,
en este estado, cierto espesor que dificulta el paso de la luz a travs de ellos. Por lo que se utiliza con
mayor frecuencia el estudio de tejidos muertos obtenidos por biopsia o necropsia (autopsia) y
mantenidos a travs de diversas acciones qumicas, a las que son sometidos de forma inmediata a su
extraccin.

El material se ha obtenido en algunos casos por biopsia, por ejemplo: piel, pero en mayor nmero
por necropsia de animales de laboratorio (rata, perro, gato, conejo, mono, etc.) o del hombre. Puede
tratarse de: un rgano entero o mas comnmente un trozo o fragmento del rgano. Siempre se
realiza con instrumental quirrgico y con el debido conocimiento anatomotopogrfico.

De las diversas acciones qumicas para preparar y preservar este material de estudio, el primer
paso esta marcado por la accin fijadora de ciertos agentes qumicos (individuales o mezclas). Los
fijadores conservan la estructura de las clulas y de los componentes extracelulares deteniendo el
metabolismo celular, es decir, frenando la autlisis y estabilizando las protenas. El fijador qumico
individual mas utilizado es el formol, solucin acuosa de formaldehdo al 37%, el formol es un mal
fijador de las membranas plasmticas pues no reacciona con los lpidos. La mezcla fijadora mas
utilizada es la de Bouin (formol, cido actico y cido pcrico). Si bien no los utilizamos en el material
que examinamos en nuestros trabajos prcticos, recordemos que tambin hay fijadores fsicos: fro,
calor, congelacin y desecacin.

El segundo paso es infiltrar o incluir la muestra con la finalidad de permitir cortes muy delgados y la
sustancia de inclusin empleada es la parafina debido a sus condiciones de penetrabilidad y
consistencia. Por lo tanto al retirar la muestra de la solucin fijadora, se deber lavar y luego: a)
deshidratar lenta y progresivamente en soluciones alcohlicas de concentracin creciente: 70% - 80
a 90% - hasta llegar al alcohol absoluto (100%). Se quita el agua de clulas y tejidos que componen
la muestra, porque la parafina no ser miscible ni en agua ni en alcohol. b) se proceder luego a la
aclaracin utilizando un solvente orgnico como el xileno, miscible tanto en alcohol como en
parafina, por lo tanto es reemplazado el alcohol absoluto.

Finalmente sobreviene la imbibicin en parafina fundida (estufa a 60), que deber ocupar todos los
espacios entre las clulas y en el interior de las mismas. Al retirar de la estufa la parafina fundida, se
enfra y endurece formando un bloque de tamao adecuado: taco, el cual se coloca en aparato de
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gran precisin, provisto de una cuchilla de acero: Micrtomo, el mismo se encargar de efectuar cortes lo
suficientemente delgados (5-10 m de espesor) que permitan el paso de la luz a travs de ellos.

Para acceder a la tercera etapa que es la coloracin, observar el corte histolgico al microscopio
ptico y examinarlo en detalle, habr que disolver y extraer la parafina utilizando nuevamente al
xileno. Procediendo luego a la rehidratacin de los tejidos mediante el uso de soluciones alcohlicas
de concentracin decreciente (100% - 90% - 70%). Los cortes o muestras se colorean, se colocan en
concentraciones crecientes (90-100) de soluciones alcohlicas para su deshidratacin y se montan
con blsamo de Canad, al cual se le adhiere un cubreobjeto.

La composicin qumica de un tejido vivo es muy diferente a un tejido muerto que ha pasado por la
accin de agentes fijadores y de otras reacciones qumicas posteriores. Perduran tras la fijacin,
macromolculas que no se disuelven con facilidad: nucleoprotenas, protenas del citoesqueleto,
protenas extracelulares, componentes de la membrana celular. Pero hay otras macromolculas que
se pierden si el fijador est en solucin acuosa, como: glucgeno, proteoglucanos y GAG.

De las tcnicas de coloracin empleadas en la ctedra para la enseanza, la ms frecuente es la

coloracin dicrmica con hematoxilina y eosina (H y E):
la eosina es un colorante cido de carga neta negativa en su parte coloreada (aninica)
la hematoxilina es un colorante bsico de carga neta positiva en su parte coloreada
(catinica). Aunque no es estrictamente un colorante bsico, tiene propiedades
tintoriales muy semejantes a las anilinas bsicas.

HEMATOXILINA Grupos aninicos: (carga -):

BASOFILIA
Colorante bsico - fosfatos de los cidos nucleicos.
Reaccionan con

AZUL
o basfilo de carga + - sulfatos de GAG (glucosaminoglucanos)
(catinico) - carboxilo de las protenas.
Basofilia = capacidad de tincin de los colorantes bsicos
EOSINA

ACIDOFILIA

ROSADO
Colorante cido o Grupos catinicos: (carga +)
Reaccionan con
acidfilo de carga - Protenas bsicas del citoplasma.
(aninico)
Acidofilia = capacidad de tincin de los colorantes cidos

Tambin se incorporan en los trabajos prcticos aunque en menor nmero, cortes histolgicos
teidos con tcnicas tricrmicas tales como:
a) de Gomori: Hematoxilina (bsico), color azul violceo.
Crosmotropo (cido), color rojo.
Verde luz (cido), color verde.

b) de Azn: Azocarmn (bsico), color rojo.

Azul de anilina (cido), color celeste.
Orange G (cido), color naranja.

Hay diversas variantes de Azn, una de ellas es el Mallory (Mallory-Azn) con tres colorantes cidos:
orange G, azul de anilina y fucsina cida.

Con la tcnica del PAS (cido Perydico-reactivo de Schiff), que tien de color rojo prpura:
carbohidratos (glucgeno, glucoprotena, GAG, etc). Mostramos en trabajo prctico un corte de
hipfisis (glndula endocrina), la membrana basal de los cordones epiteliales secretores e incluso
algunas clulas secretoras de hormonas glucoproteicas.

Con la impregnacin argntica los tejidos son tratados con sales metlicas (de plata) producindose
un precipitado al ser enfrentadas dichas sales a un agente reductor. Con esta tcnica mostramos
fibras reticulares como sostn o estroma en un ganglio linftico y tambin en la observacin de
clulas de la neuroglia, en cortes de rganos del sistema nervioso central.
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La inmunohistoqumica nos permite reconocer clulas del pncreas endocrino y clulas de la

adenohipfisis, son tcnicas muy especficas que mostramos ocasionalmente en nuestras actividades
prcticas.

El organismo reacciona ante sustancias extraas (antgenos) y forma anticuerpos (protenas

especficas) que sintetizan y secretan clulas del tejido conectivo (plasmocitos).

En el laboratorio un anticuerpo se conjuga o une qumicamente a un colorante fluorescente por

ejemplo fluorescena, este reactivo se aplica a cortes de tejidos fijados dbilmente y luego colocados
sobre portaobjetos y detectan al antgeno en clulas y tejidos (los hace visibles). La
especificidad de la reaccin entre el antgeno (Ag) y el anticuerpo (Ac), es el fundamento de la
inmunocitoqumica. Adems de esta tcnica de anticuerpo fluorescente, se puede utilizar otra
tcnica como la histoqumica enzimtica, en la cual al anticuerpo se le adosa la enzima
peroxidasa (en lugar de la fluorescena), pudindose identificar complejos antgeno-anticuerpo
mediante la determinacin enzimohistoqumica de la peroxidasa, fundamento de algunos cortes de
tejido glandular endocrino que incorporamos en trabajos prcticos.

MICROSCOPIO PTICO
MICROSCOPIO PTICO O DE LUZ (COMPUESTO): denominado compuesto por estar
constituido por dos sistemas de lentes. (OBJETIVO Y OCULAR)

- TUBO
- REVLVER PORTAOBJETIVO
- COLUMNA O BRAZO
PARTE MECNICA O ESTATICO - PLATINA
- PIE O BASE
- TORNILLO MACROMETRICO
- TORNILLO MICROMETRICO
- OCULAR/ES
- OBJETIVO/S
PARTE PTICA - ESPEJO
- APARATO DE ILUMINACIN - CONDENSADOR
- DIAFRAGMA

En este esquema, asigne cada componente del Microscopio Compuesto con el nombre correcto.
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TUBO: sostiene el sistema de lentes, Ocular/es en su parte superior y Objetivos en la inferior

(acoplados al sistema revlver). Su longitud es de 160 mm; puede portar uno o ms Oculares. Puede
ser Vertical u Oblicuo, determinando el eje del microscopio.

COLUMNA O BRAZO: es la parte que sostiene al Tubo y a la Platina; permite trasladar el

microscopio. Se articula con el Tubo, permitiendo a ste, movimientos de ascenso y descenso (con la
utilizacin de los tornillos de enfoque).

PLATINA: es una pieza metlica, de forma diversa (rectangular, circular o cuadrada). Dispuesta en
forma perpendicular al eje ptico, sirve de apoyo al preparado, para su observacin. Est provista de
un orificio central, el cual permite el paso de los rayos de luz procedentes del aparato de
iluminacin, situado por debajo de ella. Puede ser fija, con pinzas que sujeten el preparado, el cual
tendr que ser desplazado manualmente para observar distintos campos; puede ser mvil. Algunos
modelos ms modernos tienen la posibilidad, a travs de un sistema de tornillos, de imprimirle al
objeto coloreado (preparado) desplazamientos anteroposteriores y de derecha a izquierda.

PIE O BASE: base de sustentacin del aparato, siendo diversa su forma.

SISTEMA REVLVER: disco giratorio adosado al borde inferior del tubo, donde se atornillan los
distintos objetivos.

TORNILLO MACROMTRICO: como su nombre lo dice es el de mayor tamao. Permite

desplazamientos rpidos de aproximacin (que se observan a simple vista)

TORNILLO MICROMTRICO: permite realizar movimientos imperceptibles, posibilitando el

enfoque de detalles finos (el enfoque definitivo del preparado); el desplazamiento del tubo no pasa
de unos 3mm. Su mecanismo es muy delicado y no debe forzarse, razn por la cual
conviene comenzar el trabajo colocndolo en la mitad de su recorrido

Dichos tornillos se encuentran en la columna, a ambos lados del microscopio, permitiendo

desplazamientos a expensas del tubo. En otros modelos ms modernos, los sistemas de enfoque
rpido y lento se encuentran en un solo tornillo; y en ellos es la platina la que asciende
y desciende.

OCULAR/ES: cilindro hueco metlico, ubicado en el extremo superior del Tubo, con una lente o
sistema de lentes convergentes, en cada extremo. La Lente Ocular es la ms prxima al ojo del
observador y la Lente Colectora o de Campo es la inferior (recibiendo directamente los rayos
provenientes del objetivo). Aumenta slo la imagen producida (en su plano focal) por el
objetivo, pero sin agregar nuevos detalles y corrigiendo defectos de la imagen.

OBJETIVO/S: por su aplicacin pueden ser:

A. A seco: constituidos por un sistema de lentes, una principal y cercana al objeto (preparado), que
es la Lente Frontal, responsable del aumento del objetivo. Las otras son lentes simples,
dispuestas en dobletes o tripletes, unidas entre s por una sustancia transparente; corrigen
los defectos (aberraciones). Al usar estas lentes, se interpone aire entre la lente frontal y el
preparado.
B. De inmersin: permiten los mayores aumentos y pueden ser para agua, glicerina o aceite; los
ms utilizados son los de inmersin en aceite (sinttico o de cedro). Para evitar que una
gran cantidad de rayos luminosos, que atraviesan el portaobjeto, se desven
(difraccin), al salir del mismo es que se coloca una gota de aceite de cedro sobre el
preparado, ya que el aceite tiene un ndice de refraccin muy prximo al del vidrio.
Aqu se interpone aceite, entre la lente frontal y el preparado.
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INDICE DE REFRACCION DE:

VIDRIO: n = 1,52
AIRE: n = 1,00
AGUA: n = 1,33
ACEITE: n = 1,52

LECTURA DE UN OBJETIVO

OBJETIVO DE X 25 (planocromtico) OBJETIVO

APERTURA NUMRICA = 0,45

= Seno del semingulo
TUBO = 160 mm de abertura

CUBREOBJETO DE 0,17 mm de espesor PORTA OBJETO

APERTURA NUMRICA (A.N.): la abertura numrica de un objetivo representa la cantidad

mxima de rayos que la Lente Frontal puede captar; la misma viene grabada en los objetivos. A
mayor abertura numrica del objetivo, mayor nitidez de la imagen. Responde a la
siguiente frmula: A.N. = n x sen, lo cual significa que el ndice de refraccin (n), del medio
que se encuentra entre el objeto o preparado y la lente frontal del objetivo, se multiplica por el seno
(sen) de la mitad del ngulo del cono de la luz que entra en el objetivo. Dicho ngulo est
determinado por los rayos lumnicos ms perifricos.

ESPEJO: por lo general se encuentra sostenido a la columna, con movimientos en todas

direcciones; otros modelos de microscopio tienen el espejo en la base o pie. El espejo de cara plana
se utiliza cuando la luz es excesiva y el espejo de cara cncava se utiliza para captar la mayor
cantidad de rayos luminosos, cuando la luz es dbil.

CONDENSADOR: concentra los rayos luminosos reflejados por el espejo y los proyecta sobre el
preparado, con un ngulo de incidencia apropiado para que atraviesen la Lente Frontal del
objetivo. En definitiva, es un conjunto de lentes que aumentan la intensidad luminosa, desviando los
rayos de luz de una zona relativamente extensa hacia una reducida. El Condensador debe estar
alto, es decir lo ms cerca de la platina posible, por lo tanto lo ms cercano al Objeto. En
algunos microscopios se puede acercar o alejar el Condensador con los movimientos de
un tornillo que se ubica a un lado de la Columna.

DIAFRAGMA: generalmente acompaa a los Condensadores, pero puede ser independiente.

Regula la apertura del Condensador.

MANEJO DEL M/O (TCNICA DE ENFOQUE)

A. Ubquese frente al microscopio, de manera cmoda. Puede inclinar la Columna hacia usted, si el
microscopio lo permite.
B. Ponga en posicin correcta:
1. Mediante el revlver el Objetivo de menor aumento situado en el eje ptico y fijado por el
retn del revlver.
2. Fuente luminosa artificial, situada a 20 30 cm del espejo.
3. El espejo con la cara cncava, hacia la fuente de luz.
4. El condensador colocado en la posicin ms alta (muy cerca de la Platina)
5. El diafragma completamente abierto.
C. Efecte las operaciones necesarias para que el campo quede completamente iluminado y con la
mayor intensidad que le sea posible conseguir; para ello proceda bajando el Tubo hasta que la
lente frontal del Objetivo este a 1 cm de la Platina. Observe por el Ocular, moviendo el espejo y
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trate de que los rayos reflejados se dirijan al eje ptico del microscopio; a partir de esto, no
mueva el microscopio de su lugar.
D. Tome el preparado y compruebe que est limpio, fjese si tiene huellas digitales o polvo, en caso
de haberlas, lmpielas con un pauelo.
E. Coloque el Preparado sobre la Platina y sujtelo con las pinzas; tenga en cuenta que el
Cubreobjeto este hacia arriba, mirando hacia el Objetivo.
F. Mueva el Preparado de tal manera, que el material de estudio (objeto coloreado), est
aproximadamente sobre el orificio de la Platina.
G. Baje el Tubo mediante movimientos hacia adelante del tornillo macromtrico, mirando
lateralmente desde afuera, hasta que la lente frontal del Objetivo est a 2 - 4 mm del
cubreobjeto.
H. Mire por el ocular, mientras sube el Tubo hasta obtener una imagen clara del objeto.
Subir el Tubo moviendo el tornillo macromtrico, lentamente siempre atrs. Trate de
observar siempre por el ocular con un ojo, mientras mantiene el otro abierto; al principio
resultar difcil (porque ver tanto el preparado como la mesa), pero luego le ser ms cmodo.
I. Regule con el tornillo micromtrico para lograr la imagen ms ntida posible; mueva dicho
tornillo hacia delante o atrs, lentamente.
J. Recorra el preparado movindolo con los dedos o con los tornillos de la Platina mvil, si la
hubiere, mientras observa por el ocular en caso de que el Objeto quede fuera de foco.
Cuando realiza el movimiento, regule con el tornillo micromtrico.
K. Para observar a mayor aumento, gire el revlver hasta colocar, en el eje ptico, el objetivo de
mayor aumento. Fjese que quede trabado por el reten (se tacta un click)
L. Observe por el ocular, mientras regula con el tornillo micromtrico para obtener una buena
imagen. Queda totalmente prohibido utilizar el tornillo macromtrico, para regular a
mayor aumento. Generalmente para colocar en foco, al pasar de menor aumento, a
mayor, debe moverse el tornillo micromtrico hacia atrs.
M. Recorra el preparado de la misma manera que a menor aumento, mientras enfoca con el tornillo
micromtrico, pues el movimiento del preparado a mayor aumento, hace que el objeto salga de
foco frecuentemente.

CONCLUSIONES

1. Deber iniciarse la tcnica de enfoque colocando el objetivo de menor aumento mediante el

recorrido de diferentes reas (y la observacin de distintas estructuras). Se efectuar un
diagnstico histolgico del corte. Corroborar que el cubreobjetos este hacia arriba.

2. Los movimientos de descenso del Tubo (mediante el tornillo macromtrico de enfoque rpido)
buscando aproximar el objetivo al preparado (ubicado en la Platina), deben realizarse
mirando desde afuera, para evitar la ruptura del preparado.

3. Al colocar el objetivo de mayor aumento, para observar con mayor detalle algunas
estructuras no debe accionarse el tornillo macromtrico.

NOTA: se aclara que la tcnica de enfoque que aqu se describe, ha sido adecuada al estado de
conservacin de nuestros microscopios. Actualmente en la mayora de nuestros microscopios, la
platina es la que se mueve (ascenso y descenso)

Recuerde que los malos resultados en la observacin, pueden deberse a:

A. En la iluminacin:
Espejo en posicin incorrecta.
Condensador bajo.
Diafragma cerrado.
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Una iluminacin eficiente es la que se obtiene cuando el campo se ve homogneamente

iluminado, sin sombras ni puntos ms luminosos.
B. En el enfoque:
Preparado mal centrado que no coincida con el eje ptico del microscopio.
Objetivo mal fijado, en el reten.
Preparado al revs, cubreobjeto para abajo.
Lentes sucias.
Movimientos de Tubo muy rpidos.
Tornillo micromtrico en el tope de su recorrido.

C. En el preparado: que este sucio.

NOTA: algunos de nuestros microscopios poseen un tornillo de enfoque nico, el cual es

de definicin intermedia entre el macro y el micromtrico; en ellos la Platina es la que
asciende y desciende.

Debemos recalcar que el objetivo es el responsable del lmite o poder de resolucin y el

ocular es el responsable de la ampliacin de la imagen (ampliacin total del objeto
observado), la que se obtiene multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del
ocular.

Qu se entiende por Poder Resolutivo?

Compare el Poder Resolutivo del MO y ME con el del ojo humano.

UNIDADES DE MEDIDA:

MACROSCPICO:
Metro (m)
Milmetro (mm) = 0,001 m (1 mm); es la milsima parte del Metro.

MICROSCPICO:
Micrn ( ) o Micrmetro ( m) = 0,001 mm (1 m); es la milsima parte del Milmetro.

SUBMICROSCPICO:
Milimicrn (m ) o Nanmetro ( m) = 0,001 (1 m); es la milsima parte del Micrn.
ngstrom (A) = 0,0001 m; es la diezmilsima parte del Micrn.