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1. INTRODUCCIN

1.1 Conceptos bsicos

cido desoxirribonucleico (ADN). Polmero nucleotdico que lleva la informacin

gentica en virus, bacterias y organismos superiores; el ADN puede ser de cadena
sencilla (ADNcs, como en algunos genomas de virus) o de doble cadena (ADNcd) como
en organelos y cromosomas de organismos superiores.

ADN desnaturalizado. Molcula de ADN de cadena doble que ha sido disociada a
cadena sencilla mediante la desintegracin o ruptura de los puentes hidrgeno que se
encuentran entre las dos cadenas complementarias.

Agarosa. Polisacrido de galactn sulfatado lineal y neutral con -D-galactopiranasa y
3-6 anhidro--L-galactopiranasa ligado por enlaces glicosdicos (1,3-1,4) en forma
alterna, la agarosa es el componente principal de las plantas marinas (agar), se usa
extensamente para preparar geles que se utilizan en la tcnica de electroforesis
debido a su propiedad de ser soluble en solucin acuosa caliente y se solidifica cuando
se enfra.

Amortiguador de carga. Mezcla de colorantes en una solucin viscosa de glicerol,
sacarosa o ficoll, usada para incrementar la densidad de las muestras de ADN, ARN o
protena antes de colocarla en los pozos del gel; tambin sirve para ubicar el
desplazamiento de fragmentos de ADN, de cierto peso molecular durante la
electroforesis. Por ejemplo, en amortiguador TBE 0.5X (tris-HCL, pH 7.5; cido brico,
EDTA), el colorante azul de bromofenol deja una huella cuando migra a travs de la
agarosa a la altura del ADNcd de 10 a 100 kb, mientras que el colorante xileno cianol
migra con los ADNdc linearizados de alrededor de 4 a 5 kb.

Amplificacin.
a) Incremento del nmero de copias de un fragmento particular de ADN,
resultante de la duplicacin de un vector en donde previamente dicho
fragmento fue clonado.
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b) Incremento del nmero de copias de un plsmido (amplificacin de plsmido)

esta puede ser afectada por la exposicin al cloranfenicol de su clula
hospedera, ya que este antibitico inhibe la duplicacin del cromosoma.
c) Duplicacin de genes especficos en ausencia de duplicacin general del
cromosoma.

Antgeno. Caracterstica estructural especfica; por ejemplo, una protena que induce
la produccin de un anticuerpo especfico si fue introducido dentro de un organismo
inmunolgicamente reactivo.

Banda.
a) En cidos nucleicos o molculas de protenas tienen propiedades
electroforticas idnticas (tamao, carga y conformacin en geles no
desnaturalizantes), se separan en un gel y migran idnticamente formando
una lnea detectable.

Bromuro de etidio. Colorante cancergeno fluorescente a rayos UV, se utiliza para
visualizar molculas de cido nucleico de doble cadena en geles de agarosa y
poliacrilamida por emisin de fluorescencia a 590 nm.

Electroforesis:
a) Movimiento de molculas cargadas en solucin a travs de un campo elctrico.
b) Mtodo para separar molculas cargadas en un campo elctrico, el cual
manifiesta diferencias en la carga elctrica neta y en la forma y tamao de la
molcula, la separacin electrofortica en solucin libre es posible, pero
generalmente se lleva a cabo en un gel.

Enzima termoestable. Cualquier enzima proveniente de un organismo termoflico con
capacidad de resistir exposiciones largas a temperaturas desnaturalizantes (por
ejemplo, > 90 oC) sin prdida apreciable en su actividad.

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Fragmento de restriccin. Cualquier oligo o polinucletido que se libera a partir de

rompimientos no aleatorios de una molcula grande de ADN mediante una
endonucleasa de restriccin.

Gene. Unidad fundamental fsica y funcional que lleva la informacin hereditaria de
una generacin a la siguiente; el gene es una secuencia especfica de nucletidos en el
ADN (en ciertos virus son de ARN) que determinan tanto la secuencia de ARNt, ARNr y
ARNm (para conformar un polipptido especfico). Los genes frecuentemente
contienen una secuencia leader y una secuencia triler, principalmente en
eucariontes, contienen intrones entre las secuencias codificadoras (exones). Cualquier
gene ocupa una posicin especfica en un cromosoma y puede mutar a varias formas
llamadas alelos, que pueden causar uno o ms efectos fenotpicos en el organismo.

Genoma. Material gentico completo de un virus, de un organelo celular (por ejemplo
mitocondria, plastidio), de una clula o de un organismo.

Huellas moleculares. Patrn de pptidos u oligonucletidos obtenidos por
degradacin enzimtica de una protena o cido nucleico respectivamente y
subsecuente cromatografa o electroforesis.

Oligonucletido. Molcula pequea de cido nucleico de ms de 100 nucletidos de
longitud (oligmero), que consiste de desoxirribonuclotidos (oligorribonucletidos;
frmula general: dNx; por ejemplo, dAdAdAdA o (dA)4, un tetrmero o ribonucletidos
(oligorribonucletidos; AAAA (A)4. Los oligos pueden tambin consistir de una mezcla
de ambos desoxirribonucletidos y ribonucletidos (en este caso los
desoxirribonucletidos y ribonucletidos se denotan por los prefijos d o r para
evitar confusin.

Polimerasa. Enzima que cataliza el ensamble de ribonucletidos al ARN (ARN
polimerasa) o de desoxirribonucletidos al ADN (ADN polimerasa).

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Protena verde fluorescente. Protena que proviene de la gelatina del pez Aequorea
victoria que absorbe la luz azul (alrededor de 395 nm) y emite luz fluorescente de color
verde (alrededor de 509 nm) el gen que codifica esta protena puede ser utilizada
como gene reportero. La fluorescencia GPF no requiere de algn cofactor, como podra
ser un substrato especfico.

Sonda. Secuencia definida de cido nucleico marcada con algn mtodo que se utiliza
en clonacin molecular, para identificar molculas especficas de ADN con secuencias
complementarias por autorradiografa o con sistemas de deteccin no radioactiva de
ADN. El trmino tambin se usa para protenas (por ejemplo, anticuerpos
monoclonales que reaccionan con una protena blanco).

Termociclador. Instrumento que permite de manera programada el rpido
calentamiento y enfriamiento de pequeos volmenes de mezclas de reaccin. El
termociclador se usa en la tcnica de la PCR con diferentes temperaturas para la
desnaturalizacin trmica del ADN blanco (alrededor de 94 oC), para la alineacin de la
molcula iniciadora (por ejemplo, a 37 oC) y para la extensin de dicha molcula (de
alrededor de 72 oC).

Transferencia tipo Nothern blot. Transferencia elctrica o por capilaridad de
molculas de ARN a una membrana que se separaron de acuerdo a su tamao en
electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida. Las cadenas sencillas de cidos
nucleicos se fijan e inmovilizan por calor a la membrana (horneado). La hibridacin de
las molculas de ARN con sondas marcadas de cadena sencilla permite la deteccin de
ARNs individuales a partir de una poblacin compleja de ARNs.

Transferencia tipo Southern blot. Tcnica para la transferencia de fragmentos de
ADN a partir del gel a una membrana. Los fragmentos separados por tamao mediante
la electroforesis respectiva se desnaturalizan in situ y se transfieren a membranas por
fuerzas elctricas o de capilaridad. Las cadenas sencillas de cidos nucleicos pueden
fijarse a las membranas mediante horneado y de esta forma inmovilizarse. La
hibridacin con sondas especificas marcadas radiactiva o no radioactivamente ayuda a
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identificar fragmentos individuales a partir de la compleja mezcla de millones de otros

fragmentos (Valadez y Kahl, 2000).


1.2 Antecedentes histricos de la Biologa Molecular

El metabolismo celular es la base del mantenimiento del fenmeno de la vida, y este

ha sido el resultado de un proceso complejo de evolucin qumica y molecular en el
planeta. Los principios evolutivos bsicos descritos por Charles Darwin; la variacin, la
competencia y seleccin, operan no solamente a nivel de organismo, sino tambin a
nivel molecular; la variacin se origina por cambios en el material gentico de los
organismos que ocurren al azar a travs de muchas generaciones, y se mantienen o
eliminan de las poblaciones segn las condiciones ambientales. En este sentido, se
tiene un registro fsil de organismos de pocas antiguas, el registro de fsiles
prebiticos moleculares que fueron la base qumica de la vida, y que no se han
conservado como tales.

Existen los llamados fsiles intelectuales, constituido por el cdigo gentico que
dirige la sntesis de protenas, los mensajes genticos codificados por el ADN y el ARN,
y las vas bioqumicas que mantienen el metabolismo celular, los cuales contienen
informacin para hacer descripciones aproximadas de la posible evolucin molecular
prebitica. A partir de estos fragmentos de informacin se han inferido las posibles
leyes evolutivas que llevaron a la aparicin de la vida en el planeta, adems de que los
principios darwinianos bsicos se han utilizado para explicar la evolucin de las
molculas.

El principio bsico de la competencia es la base de la seleccin natural, donde aquellos

organismos que se reproducen a mayor velocidad y se adaptan mejor a las condiciones
de su medio, tienden a desplazar a especies menos adaptadas. En la era prebitica, las
molculas compitieron de manera similar aunque se ha reconocido que ciertas formas
de cooperacin molecular tambin fueron esenciales. El balance entre la competencia
y la cooperacin entre molculas debi de haberse establecido, por la necesidad de
estabilizar y mejorar la informacin gentica, y probablemente esto determin el
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primer principio organizador selectivo que permiti su evolucin.

La bsqueda de la identidad de las primeras molculas que fueron capaces de

replicarse y a la vez pasar informacin a su progenie, ha llevado a la conclusin de que
el ARN fue probablemente el material gentico primario. Puede considerarse que las
primeras rutas de sntesis y diferenciacin proveyeron concentraciones mnimas de
secuencias cortas de nucletidos, que pudieron diferenciarse de acuerdo con su
arreglo espacial, su estereoqumica y su secuencia, ya que las distintas secuencias de
ribonucletidos pudieron tener estructuras secundarias con estabilidad o estructura
diferente, esto a su vez pudo conferirles resistencia a la hidrlisis o degradacin en su
medio ambiente, obedeciendo as el principio de la seleccin natural.

Las molculas as seleccionadas por su resistencia tuvieron que lograr su

autorreplicacin para extenderse por el medio.

La extensin de la longitud de las molculas de ARN y el mantenimiento simultneo de

una secuencia especfica mediante los mltiples eventos de replicacin, pudieron ser
posibles slo con la aparicin de mecanismos de deteccin y correccin de errores. La
distincin entre lo correcto o incorrecto en cuanto a la estructura, est
determinada por el esqueleto fosfodiester de los polmeros de ARN, pero la secuencia
de ordenacin de las bases requiri de un mecanismo diferente, slo si la secuencia
complementaria permaneca unida a la secuencia original. As la secuencia incorrecta
pudieron identificarse como no apareadas. Esto pudo ser el origen de las dos
cadenas de cidos nucleicos unidos por complementariedad de las bases. Una
deshidroxilacin posterior del azcar ribosa del ARN, origin al ADN.

Existen hiptesis acerca de la evolucin que se dio hasta llegar a un sistema molecular
en donde la informacin gentica es leda y manejada por componentes proteicos
(enzimas), para lograrlo se tuvo que dar la separacin entre genotipo (la informacin
per se) y fenotipo (funcin codificada por el genotipo); la compartimentacin de las
molculas (su separacin del ambiente como entidades individuales) y finalmente la
especializacin y organizacin de funciones enzimticas y estructurales. Una vez
constituidas estas protoclulas, la evolucin continu al interior con el fin de adaptarse
mejor a las condiciones ambientales, la especializacin de las funciones bioqumicas y
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la evolucin de un cdigo de informacin que fuese mantenido de generacin a

generacin (Balbs, 2002).

1.3 Estructura y propiedades del ADN

El ADN es una macromolcula lineal sin ramificaciones, forma hebras largas hasta de
varios cm, en el hombre alcanza hasta 1.7 m, su dimetro es de 200 nm, esta formado
por dos cadenas de polinucletidos enrollados alrededor del mismo eje (doble hlice),
con giro a la derecha, cada uno de ellas est formado por los fosfatos al exterior en
contacto con el medio acuoso, estas se unen en el C5 y el C3 de dos desoxirribosas de
nucletidos vecinos, el azcar se enlaza por el extremo opuesto a las bases pricas y
pirimdicas correspondientes, situado en la parte interna de la molcula quedando
perpendiculares al eje, se enlaza una base prica con una pirimdica con puentes
hidrgeno; A=T y G=C, este enlace es ms fuerte aproximadamente en un 50 %.

Estn dispuestas en forma de escalera de caracol, cada vuelta de la hlice tiene una
extensin de 34 y la distancia entre base y base es de 3.4 , as que en cada vuelta
de la hlice hay 10 pares de bases nitrogenadas; arregladas de la siguiente manera:
A=T, T=A, C=G, G=C, A=T, T=A, C=G, G=C, A=T, T=A, el nmero de purinas es igual al de
las pirimidinas A + G=C + T (Ramrez Bautista, 1996).

Se debe resaltar dentro de las propiedades del ADN un almacn de informacin, lo

cul es difcil describir en trminos moleculares; considerando que un gene
corresponde a un segmento particular de ADN, la suma de la informacin gentica que
un organismo individual hereda de sus padres es el equivalente a la suma de todos los
segmentos de ADN presente en el huevo fecundado que inicia la vida.

Todos los individuos que integran una poblacin de especies, muestran el mismo
grupo de genes. Sin embargo, los diferentes individuos poseen de modo invariable
ligeras variaciones distintas (alelos) de muchos de estos genes; de esta forma, cada
especie muestra un contenido nico de informacin gentica, el cul se conoce como
genoma. Para los seres humanos, el genoma es equivalente a toda la informacin
gentica presente en un solo grupo (haploide) de los cromosomas humanos, que
incluyen 22 autosomas diferentes y los cromosomas sexuales X y Y (Karp, 2007).
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1.3.1 Estudio de la composicin de bases

Se saba que la unidad bsica para construir ADN era un nucletido, que consiste en un
azcar de cinco carbonos conocido como desoxirribosa, al cul se fija un fosfato
esterificado en la posicin 5 del anillo de azcar y una base nitrogenada en el sitio 1.
Se encuentran dos tipos de bases nitrogenadas en un cido nucleico, las pirimidinas,
que contienen un solo anillo y las purinas, con dos anillos.

El ADN contiene dos diferentes pirimidinas, la timina (T) y la citosina (C), y dos tipos de
purinas, guanina (G) y adenina (A); los nucletidos estn unidos de forma covalente el
uno con el otro y forman un polmero lineal o cadena, con un esqueleto compuesto de
azcares que se alternan y grupo fosfatos unidos por enlace del tipo fosfodiester 3- 5;
las bases unidas a cada azcar se proyectan desde el esqueleto y semejan una columna
Conceptos bsicos de
de estructuras biologa molecular, II
apiladas. cidos nucleicos

cidos nucleicos
Los nucletidos tienen una estructura polarizada; un extremo donde se localiza el
fosfato y se conoce como el extremo 5(extremo 5 prima terminal), mientras que el
otro extremo es el 3 terminal (Figura 1).
La molcula de azcar contiene 5 tomos de Carbono
etiquetados 10 a 50 H
HO 50 H
O base
40 10
H H
H 30 20
HO H

El enlace queFigura crea1. Oel esqueleto

rientacin est
de la molcula entre
de ADN, inicia el
5y tCarbono
ermina en 3. 30 de un

nucletido, el grupo fosfato y el Carbono 5 0 del nucletido

En 1950, Erwin Chargaff notific un notable hallazgo que elimin la teora del
siguiente
tetranucletido y proporcion informacin de importancia vital acerca de la estructura
de ADN. Chargaff determin la cantidad relativa de cada base en muestras de ADN, el
Por estaanlisis de la composicin de bases se llev a cabo por hidrlisis de las bases fijas de
razn las molculas de ADN tienen una orientacin, la
cual porlos convencin inicia
azcares, se aislaron enhidrolizado
estas del 50 y termina en 30
mediante cromatografa en papel y se

duardo R ODRGUEZ T. (C INVESTAV) Conceptos bsicos de biologa molecular 17 de mayo del 2012 5 / 42
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cuantific la cantidad de material en cada uno de los cuatro puntos hacia los que
migraron las cuatro bases.

Chargaff encontr que la relacin de las cuatro bases fue muy distinta de un tipo de
organismo a otro y a menudo se apartaba en grado notable de la relacin 1:1:1:1
predicha para la teora del tetranucletido. Por ejemplo, la relacin A:G del ADN de un
bacilo de la tuberculosis fue 0.4, pero la relacin A:G del ADN humano fue 1.56. Dentro
de la gran variedad de bases que componen diferentes especies de ADN se descubri
que el nmero de adeninas siempre fue igual al nmero de timinas y el nmero de
guaninas siempre semejo al de las citocinas; por lo que Chargaff descubri las
siguientes reglas en la composicin de bases de ADN:

[A] = [T], [G] = [C], [A] + [T] [G] + [C]

Los datos de Chargaff arrojaron nueva informacin sobre la molcula de ADN y le

confiri especificidad e individualidad de un organismo a otro (Karp, 2007).

1.3.2 Modelo de Watson y Crick

Watson y Crick propusieron un modelo de la estructura del ADN que incluye los
siguientes elementos:

1. La molcula se integra con dos cadenas de nucletidos.

2. Las dos cadenas, enrolladas en forma espiral la una sobre la otra, forman una
especie de hlice dextrgiras. Las hlices proyectadas trazan una rotacin
dextrgira.
3. Las dos cadenas comprenden una doble hlice que discurre en direcciones
opuestas, esto es, son antiparalelas. Esto significa que si una cadena est
alineada en la direccin 5 3, la cadena compaera debe de estar
alineada en direccin 3 5.
4. El esqueleto (azcar-fosfato-azcar-fosfato) se localiza en el exterior de la
molcula con dos grupos de bases que se proyectan hacia el centro. Los grupos
fosfato confieren a la molcula carga negativa.
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5. Las bases ocupan planos ms o menos perpendiculares al eje longitudinal de la

molcula y por lo tanto se coloca una sobre otra como platos apilados. Las
interacciones hidrfabas y las fuerzas de van der Waals, entre las bases
planares apiladas suministran estabilidad a la molcula de ADN; las vueltas
helicoidales y los pares de bases planares en su conjunto confieren a la
molcula la semejanza de una escalera de caracol.
6. Las dos cadenas se conservan unidas mediante puentes hidrgeno como las
bases de una cadena y sus correspondientes bases sobre la otra cadena. Un
puente de hidrgeno, por si solo, es dbil y fcil de romper, lo que posibilita la
separacin de la cadena de ADN durante ciertas funciones. Al mismo tiempo, la
fuerza de los puentes de hidrgeno es aditiva, de modo que un gran nmero de
ellos mantiene las cadenas juntas y confieren la estabilidad a la doble hlice de
la molcula de ADN.
7. La distancia del esqueleto del tomo de fosfato al centro del eje es de 1 nm (en
consecuencia , el ancho de la doble hlice es de 2 nm).
8. Una pirimidina en cadena est siempre apareada con una purina en la cadena
complementaria. Este ordenamiento produce una molcula que es de 2 nm de
ancho a lo largo de toda su estructura.
9. Los tomos de nitrgeno unidos al carbono cuarto de la citosina y el sexto de la
adenina muestran de manera predominante la configuracin amino (NH2) y no
la forma imino (NH). De manera similar, los tomos de oxgeno unidos al
carbono sexto de la guanina y el cuarto de la timina de modo predominante
muestran configuracin ceto (C=O) en vez de enol (C-OH). Estas restricciones
estructurales de la configuracin de las bases sugieren que la nica purina
capaz de unirse a la timina desde el punto de vista estructural es adenina y que
la guanina es la nica purina capaz de unirse a la citosina; por lo tanto, los
nicos pares posibles son: A-T y G-C, que satisfacen de manera perfecta el
anlisis previo de la composicin de bases efectuado por Chargaff. Los pares A-
T se unen mediante dos puentes hidrgeno y los pares G-C mediante tres
puentes de hidrgeno.
10. Los espacios entre los giros que forman la hlice crean dos surcos de diferente
amplitud; un surco ms amplio llamado surco mayor y uno ms estrecho
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denominado surco menor que rodean en espiral la superficie externa de la

doble hlice. Las protenas que se unen al ADN ocupan a menudo sus surcos. En
muchos casos una protena unida a un surco es capaz de leer la secuencia de
nucletidos a lo largo del ADN sin tener que separarse de las cadenas.
11. La doble hlice realiza una vuelta completa cada 10 residuos de nucletidos
(3.4 nm) o 150 vueltas por cada milln de daltones de masa molecular.
12. Debido a que una A en una cadena est siempre unida a una T en la otra
cadena, y una G a una C, la secuencia de nucletidos de las dos cadenas est
siempre fija en relacin con la otra. Esta relacin entre las dos cadenas de la
doble hlice se define como complementariedad. Por ejemplo, una A es
complementariedad de una T, 5-AGC-3es complementaria de 3-TCG-5y una
cadena entera es complementaria de la otra (Figura 2) (Karp, 2007).

Figura 2. Estructura qumica del ADN.

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1.3.3 ADN como material gentico

El ADN como material gentico, definieron tres funciones principales que se deben de
cumplir:

1. Alineacin de la informacin gentica. Como material gentico, el ADN debe

contener un registro grabado de instrucciones que denomina todas las
caractersticas heredables que un organismo puede exhibir. En trminos
moleculares, el ADN debe contener la informacin para el orden especfico de
aminocidos de todas las protenas que sintetiza el organismo.
2. Replicacin y herencia. El ADN debe contener la informacin para la sntesis de
nuevas cadenas de ADN (replicacin). La replicacin del ADN permiten que las
instrucciones genticas se transmiten de una clula a sus clulas hijas y, de esta
forma, de un individuo a su descendencia.
3. La expresin del mensaje gentico. El ADN es ms que un centro de
almacenamiento, tambin funge como director de la actividad celular. Por
consecuencia, la informacin codificada del ADN tiene que expresarse de
alguna forma que tome parte de los sucesos internos de la clula, de manera
ms especfica, la informacin del ADN debe usarse para dirigir el orden por
medio del cual los aminocidos especficos se incorporan dentro de una cadena
polipeptdica.

Es importante sealar que a cada gene corresponde determinado segmento de ADN; la

secuencia especfica de nucletidos en el segmento dicta la secuencia de aminocidos
en el polipptido correspondiente. Un cambio en la secuencia lineal de los nucletidos
de dicho segmento provocara una mutacin hereditaria en dicho gene; se pens que
la diferencias en la secuencia nucleotdica formaban la base de la variacin gentica,
entre individuos de una especie o entre las mismas especies (Karp, 2007).