REACTOR TUBULAR LIPASAS DE

INMOVILIZADAS PARA LA
PRODUCCIN DE GLICEROL Y CIDOS
GRASOS A PARTIR DE ACEITES

Nombre: Jorge
Apellidos: Vegas Surez
Asignatura: Ampliacin de Reactores Qumicos
Curso: 2016/2017

ndice
Introduccin...3
Materiales y equipos..5
Metodologa...5
Desarrollo del modelo matemtico6
Modelado del proceso9
Nomenclatura...11
Bibliografa..12

Introduccin
Los avances en el diseo de los biorreactores en la industria de grasas y aceites permite
realizar la hidrlisis de triglicridos en condiciones estndar, mejorando su
productividad y evitando la formacin de subproductos indeseados.
La investigacin bsica y aplicada dedicada a la manufacturacin a escala industrial de
productos derivados de lpido se ha apoyado en el excedente de grasas y aceites de los
pases ms desarrollados. Los avances cientficos-tecnolgicos en el rea han permitido
sustituir procesos qumicos donde se requiere un alto consumo de energa por procesos
enzimticos que emplean condiciones suaves de reaccin y presentan adems una
mayor actividad y especifidad (Cuellas, 2005).
Las lipasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y pueden catalizar
una amplia gama de reacciones qumica donde muchas de las cuales constituyen un
importante potencial tecnolgico en industrias alimenticias, farmacuticas y de
detergentes. La hidrlisis reversible de triglicridos originando cidos grasos y glicerol
es una de las aplicaciones ms importante. Esta reaccin tiene lugar travs de pasos
intermedios que dan lugar a la formacin de diglicridos y monoglicridos (Jaeger y
Eggert, 2002).
A pesar de contar con una extensa bibliografa sobre la hidrlisis de grasas y aceites,
an no se ha descrito un modelo que prediga las velocidades de hidrlisis en forma
adecuada. No obstante, distintos estudios indican que el modelo cintico que se presenta
en la Figura 1, conocida como ping-pong se ajusta para describir la accin cataltica de
las lipasas independientemente de la reaccin considerada.

Figura 1. Representacin del mecanismo ping-pong para la hidrlisis de grasas y

aceites.
El auge en el uso de enzimas en el plano industrial, permite desarrollar tcnicas de
inmovilizacin enzimtica que posibilita la reutilizacin, mejora la estabilidad y facilita
el desarrollo de procesos continuos. A pesar de estos beneficios, no siempre es factible
trabajar con una enzima inmovilizada. La aplicacin de esta tecnologa depende de
distintos factores como:
-

La eleccin del mtodo de inmovilizacin y del soporte.

Las condiciones de operacin.
El tiempo de vida til del catalizador.
El cambio de escala.
El control del desarrollo microbiano durante el proceso.

Las lipasas han sido inmovilizadas por diferentes mtodos:

-

Adsorcin.
Entrecruzamiento.
Unin covalente
Atrapamiento fsico.

Donde se utilizan como soporte tanto materiales orgnicos como inorgnicos. No

obstante, los protocolos que involucran tcnicas mixtas, confieren mayor estabilidad y
resistencia al biocatalizador. Por lo general, estos procedimientos consisten en

inmovilizar las lipasas en una resina de intercambio inico o un soporte polimrico

utilizando un reactivo de cross-linking como dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos,
sales de bisdiazonio y diaminas. Estos reactivos bifuncionales favorecen la unin tanto
con el soporte como con la enzima (Fernndez-Lorente y cols, 2006).
En este trabajo se pretende explicar el modelo de un reactor continuo de una Lipasa
inmovilizada con actividad hidroltica para la obtencin de cidos grasos y glicerol.
Materiales y equipos
Reactivos:
-

Lipasa B de Candida antrtica (5000 u/ml).

Aceite puro de girasol.
Polietileno de alta densidad.
Glutaraldehdo Sigma.
cido oleico.
Otros reactivos.

Reactor:
La reaccin se lleva a cabo en un reactor de base acrlica que contiene un tubo de
polietileno de alta densidad que acta como soporte de la enzima. La porosidad de este
material es del 50% y el dimetro promedio de los poros es 70 m. Las medidas de este
tubo son:
-

6 cm de longitud.
12.7 mm de dimetro externo.
4 mm de dimetro interno.

El rea de intercambio efectiva es 0.1 m2/g y la capacidad del reactor es 7 ml

aproximadamente.
Metodologa
Inmovilizacin de la lipasa:
Para obtener el derivado enzimtico se recurre a un protocolo mixto de inmovilizacin.
El polietileno se pone en contacto 24 horas con la solucin de glutaraldehdo al 10%.
Una vez esto, el soportes es lavado con un buffer fosfato de pH neutro e incubado otras
24 horas en una solucin al 50% de la enzima. Finalmente, el excedente de enzimas fue
eliminado con un enjuague con buffer fostato. La determinacin de la protena
inmovilizada se realiz por diferencia entre el contenido total de protena en la solucin
enzimtica inicial y la protena final soluble una vez terminado el proceso de
inmovilizacin. La protena enzimtica fue determinada mediante el mtodo de
Bradford (1976).
Evaluacin de la actividad hidroltica:

El grado de hidrlisis del aceite se llev a cabo mediante la tcnica colorimtrica de

Lowry y Tinsley (1976). Este mtodo consiste en colocar un volumen de muestra a
determinar en un recipite, agregar 5 ml de C6H6 y agitar hasta disolver la muestra.
Luego, se agrega 1 ml de reactivo I (solucin acuosa de acetato de cobre al 5% filtrado,
ajustan el pH 6.0-6.2) y se agita en vortex durante 2 minutos. Posteriormente, se
centrifuga 5 minutos a velocidad mxima. Finalmente, se mide espectroftomtrica la
fase superior a 715 nm.
Para obtener la concentracin de cidos grasos [% v/v] se realiz una curva patrn con
cido oleico puro.
Constantes cinticas
Los parmetros cinticos fueron calculados por regresin no lineal, a partir de datos
experimentales determinados en un reactor batch con agitacin.
Desarrollo del modelo matemtico
Para caracterizar el biorreactor se propone analizar el comportamiento de diferentes
modelos cinticos sobre una serie de datos experimentados obtenidos en un reactor
discontinuo basado en la experiencia. Para el desarrollo del modelo se tuvieron en
cuenta los siguientes factores:
-

La velocidad de reaccin de hidrlisis.

La velocidad de prdida de la actividad de la enzima inmovilizada.
Los balances de materia macroscpicos.
El mecanismo de la hidrlisis enzimtica.

La reaccin catalizada por la lipasa puede ser vista como la produccin de un residuo
alcohol y un cido graso libre a partir de cada molcula de glicrido. En cuanto a la
velocidad de reaccin, como ya se ha comentado, se aplican los mecanismos ping-pong
bi-bi. En todos los casos, la concentracin de sustrato se presenta como la concentracin
molar de puentes steres accesibles [G]. Este tipo de modelo cintico realiza un ajuste
adecuado de los datos experimentales en la accin cataltica de las lipasas (Al-Zuhair y
cols., 2009).
Como el nmero de parmetros requeridos por el mecanismo en su forma general es
grande, es posible que ocurra sobreparametrizacin. Por tanto, el nmero de parmetros
del modelo es mayor que el nmero de grados de libertad del mismo. Para evitar esto se
puede aplicar algunas simplificaciones. Si se asume que existe un paso limitante en la
reaccin, se puede plantear diferentes posibilidades:
-

Que el paso limitante de la reaccin sea la deacilacin (mecanismo A).

Que el paso limitante de la reaccin sea la acilacin (mecanismo B).

Estos mecanismos se pueden ver en una forma sencilla como los diagramas de King
Altman, tal como se refleja en la Figura 2.

Figura 2. Diagramas de King Altman correspondiente a formas simplificadas del

mecanismo Ping Pong Bi Bi.
Las expresiones de velocidad basadas en los mecanismos propuestos son:
Mecanismo A
r A=

k 1 [ E ][ G ]
(1)
K M +[ G ]

Mecanismo B
k1 [ E ]
[G]
KM
r A=
(2)
[ G ] [ G 0 ] [ G ]
1+
+
KM
KI
Mecanismo C

Por su parte, el modelo completo Ping Pong bi bi o Mecanismo C se puede expresar de

la siguiente forma:
r A=

k 1 [ E ][ G ] k 3 [ W ][ F ]
k 3 [ W ][ F ] K M + ( k 3 [ F ] K M +k 3 [ F ] [ W ] ) [ G ] + [ X ] + [ Y ]

(3)

Dnde:

X=

Y=

2 k1 [ E ] K M k3 [ F ] [W ] K M
+
K eq
KI

)([

G 0 ][ G ] ) (4 )

k 1 [ E ][ G ] K M
k [ E]
2
G 0 ][ G ] ) + 1 ([ G0 ] [ G ] ) (5)
([
K eq K I
K eq

[G0] representa la concentracin inicial de puentes steres accesibles para la hidrlisis,

[G] es la concentracin molar de las molculas de glicridos en las proximidades de la
lipasa inmovilizada (0 < [G] < [G 0]). El resto son parmetros caractersticos de los
modelos cinticos, velocidades mximas, constantes de saturacin, inhibicin, etc.
Prdida de la actividad enzimtica
La prdida de la actividad enzimtica con el paso del tiempo es un factor importante en
el modelado de procesos catalizados por enzimas. Con el objetivo de modelar el
sistema, se puede asumir que las prdidas de activacin en el proceso ocurren en un solo
paso que es caracterizado por una expresin de velocidad de primer orden:
a=a0 ek t (6)
d

Modelo de la reaccin en un reactor Batch

Para obtener los parmetros presentados anteriormente, se utiliza un reactor Batch (en
las mismas condiciones de trabajo utilizadas para la reaccin en continuo). La ecuacin
propuesta para describir el comportamiento del reactor discontinuo es la siguiente:
d [G]
a (t )
=r Am
(7)
dt
a0
Donde rAm es reemplazado por cada uno de los modelos que se han propuesto
Modelo de la reaccin en un reactor continuo
Los parmetros cinticos que se obtienen en sistemas discontinuos, se pueden
incorporar a un modelo de reactor continuo. De este modo, es posible predecir el
comportamiento de dicho biorreactor. El modelo propuesto para la reaccin en un
equipo continuo se presenta a continuacin:

F
d [ G] F1
a (t)
= [ G0 ] 2 [ G ] r Am
(8)
dt
V
V
a0
Si se define el tiempo de residencia, , como el cociente entre el volumen del equipo y
el flujo de entrada o de salida, y se asume que las corrientes de alimentacin y de
descarga son iguales, entonces:
entonces:
1 F1 F2
= (9)
V V
La ecuacin (8) ahora se puede expresar como:
d [G] 1
k t
= ( [ G 0 ] [ G ] )r Am e (10)
dt

Integrando la anterior ecuacin, con la siguiente condicin inicial:

t=0 [G]=[G]i
Y reemplazando con las expresiones de velocidad, se puede obtener la variacin de la
corriente de salida con el tiempo, es decir, que la cantidad de producto se forma en el
interior del reactor en funcin del tiempo.
Modelado del proceso
Para simplificar los modelos de los mecanismos A,B y C, se lleva a cabo una
reparametrizacin y normalizacin de los parmetros (Malcata, 1992). La normalizacin
se necesita para evitar un comportamiento numrico inestable y para reducir el nmero
total de parmetros. Los resultados de esta serie de operaciones matemticas son las
siguientes formas simplificadas de las expresiones de velocidad para la reaccin de
hidrlisis para cada uno de los tres modelos:
Modelo A
r A = A [ G ] (11)
Modelo B
r A=

B 1 [ G ]
(12)
1+ B 2 [ G ]

Modelo C

r A=

C 1[ G]
(1 3)
1+ C2 [ G ] + C 3 [ G ]

Estos modelos, en combinacin con la cintica de inactivacin de la enzima y los

balances de materia se aplicarn con el fin de lograr una estimacin de los parmetros
involucrados en el proceso.
Para ello se tienen que realizar diseos experimentales de hidrlisis en sistemas
discontinuos (o batch). Los resultados que se obtengan se ajustan a modelos dinmicos
que involucran todo lo aportado anteriormente. A modo de ejemplo, la ecuacin
diferencial que describe la evolucin de la concentracin de steres libres y teniendo en
cuenta el modelo cintico A, quedara expresada del siguiente modo:
d [G]
= A [ G ] e kdt ( 14)
dt
Expresiones similares se obtienen para los otros modelos. Posteriormente, se realizan
anlisis de regresin no lineal para obtener los parmetros que se asocian para cada uno
de los modelo. En todos los casos se aplica el algoritmo de Levemberg-Marquardt.
Existen diferentes alternativas en relacin a los mtodos de estimacin.
o Linealizar la ecuacin inicial si es posible, y a continuacin aplicar un mtodo
de regresin lineal.
o Aplicar un mtodo de regresin no lineal directo, en caso que se determinen
experimentalmente las velocidades.
o Integrar analticamente la ecuacin diferencial ordinaria en el caso de que se
determinen experimentalmente las concentraciones y luego efectuar regresin
lineal o no lineal.
o Integrar numricamente la ecuacin diferencial en caso que se determinen
experimentalmente las concentraciones y luego efectuar regresin lineal o no
lineal.
o Determinar parmetros en forma independiente, utilizando diferentes rangos de
datos para cada uno (los rangos de mayor sensibilidad).
A modo de conclusin, la tcnica de inmovilizacin empleada y la eleccin del soporte,
permite la obtencin de biocatalizadores estables, que posibilitan el diseo de un reactor
enzimtico de fcil manejo y control. Por otro lado, los resultados indican que para este
tipo de reaccin, la conversin que se logra en el sistema, depende de distintos factores
como el tiempo de residencia del sustrato en el reactor y la actividad de la lipasa
inmovilizada. Esta reaccin realiza un aporte importante para el desarrollo de procesos
enzimticos para el desarrollo de procesos enzimticos continuos en la industria de
grasas y aceites.

Nomenclatura
a

Actividad de la enzima en el tiempo

a0

Actividad inicial de la enzima

Concentracin de la enzima (lipasa)

Concentracin en el complejo sustrato-enzima

F1

Flujo de entrada

F2

Flujo de salida

Concentracin molar de las molculas de glicridos en las proximidades de la

lipasa inmovilizada

G0

Concentracin inicial de puentes steres accesible para la hidrlisis

kd

Constante de desactivacin de la enzima

Keq

Constante de equilibrio

KI

Constante de inhibicin

KM

Constante de Michaelis-Menten

k1,k3

Constantes cinticas de reaccin

rA

Velocidad de reaccin

Tiempo de reaccin

Volumen del reactor

Tiempo de residencia

Bibliografa
Al-Zuhair S., Dowaidar A., Kamal H. 2009. Dynamic modelling of biodiesel production
from simulated waste cooking oil using immobilized lipase. Biochemical Engineering
Journal. 44, 256-262.
Cuellas A. 2005. Aspectos generales en Estudio de un reactor con enzimas
inmovilizadas para el procesamiento de suero de quesera. Tesis de magster.
Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina.
Fernndez-Lorente G., Palomo J., Mateo C., Munilla R., Ortiz C., Cabrera Z., Guisn J.,
Fernndez-Laguente R. 2006. Glutaraldehyde Cross-Linking of Lipases Adsorbed on
Animated Supports in the Presence of Detergents Leads to Improved Performance.
Biomacromolecules, 7, 2610-2615.
Jaeger K-E. Eggert T. 2002. Lipases for biotechnology, Protein Technologies and
Commercial Enzymes, 390-397.
Malcata F., Hill C., Amundson C. 1992. Hydrolisis of butteroil by immobilized lipase
using a hollowfiber reactor. Part II. Uniresponse kinetic studies. Biotechnol Bioeng. 39,
984-1001.