EXTRACCIN DE DNA POR EL METODO DE CTAB/NaCl

1.

Incubar el microorganismo en medio liquido

2.

Centrifugar 10 min a 3 000 x g

3.

Suspender en 567 l de amortiguador TE y EDTA 10:1 mM pipetaer

continuamente. Adicionar 300 l de SDS al 10%, 30l de proteinasa K
20mg/ml.

4.

Incubar 1 h a 37C en bao

5.

Adicionaron 100 l de NaCl 5M

6.

Agregar 80 l CTAB/NaCl precalentado e incubar 10 min a 65C en bao

Mara

7.

Aadir 800 l de cloroformo-alcohol isoamlico 24:1

8.

Centrifugar 5 min a 16 000 x g, se recupera sobrenadante

9.

Aadir un volumen igual de fenol, cloroformo y alcohol isoamlico 25:24:1

10.

Mezclar y centrifugar 5 min a 16 000 x g

11.

Transferir el sobrenadante a otro tubo y adicionar 0.6 vol de isopropanol

12.

Dejar en hielo 15 min

13.

Centrifugar 10 min a 16 000 x g

14.

Eliminar el isopropanol

15.

Agregar 500 l de etanol al 70% y centrifugar 20 min a 16 000 x g

16.

Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla con etanol al 70%

17.

Dejar secar la pastilla y suspender en 300 l de amortiguador TE o agua

y se agrega 2 l de RNAasa

EXTRACCIN DE DNA POR EL METODO DE TIOCIANATO DE GUANIDINA

1. Se siembra 10 O 20 ml de medio LB con S. Enteritidis, se incuba toda la
noche a 37 con agitacin a 200 rpm
2. Centrifugar 10 min a 4 000 rpm a 4C
3. Retirar sobrenadante
4. Las pastilla se suspende en 550 l de amortiguador de lisis, se agita en
vortex
5. Se adiciona 250 l de acetato de amonio a 7.4 M, mezclar e incubar 10
min en hielo
6. Agregar 500 l de Fenol:Cloroformo (1:1) , agitar en vortex por 10 seg
7. Centrifugar 5 min a 10 000 rpm a 4C
8. Transferir el sobrenadante a otro tubo y adicionar 500 l de
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamlico (25:24:1), mezclar por 10 min
9. Centrifugar 5 min a 10 000 rpm
10. Retirar sobrenadante y precipitar con 0.7 volumen de isopropanol,
colocar en hielo 60 min
11. Centrifugar 10 min 12,000 rpm
12. Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla con etanol al 70%
13. Centrifugar 10 min a 12,000 rpm
14. Decantar sobrenadante y secar la pastilla
15. Suspender DNA H2O miliQ o en amortiguador TE, se agrega 2 l de
RNAasa

EXTRACCIN DE DNA PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA

1.

Cultivar en 2ml de medio la bacteria transformada hasta la fase

logartmica (generalmente toda la noche).

2.

Centrifugar 1.5 ml del cultivo a 13400 g por 4 minutos.

3.

Retirar todo el sobrenadante.

4.

Suspender el sedimento en 100 l de la solucin I con agitacin

vigorosa. Es importante que se alcance una resuspensin total.

5.

Preparar la solucin II y adicionar 200 l. Mezclar volteando el tubo 5

veces con movimientos suaves (sin utilizar el vortex) asegurndose que las
paredes entren en contacto con la solucin. Posteriormente colocar el tubo
en hielo por 1-2 minutos.

6.

Adicionar 150 l de la solucin III previamente enfriada. Mezclar

suavemente en el vortex.

7.

Colocar el tubo en hielo por 3-5 minutos

8.

Centrifugar a 13400 g por 5 minutos y transferir el sobrenadante a otro

tubo.

9.

Precipitar el ADN con dos volmenes de etanol fro, se homogeniza y se

incuba 2 minutos a temperatura ambiente.

10.

Centrifugar a 13400 g por 5

decantacin.

minutos y retirar el sobrenadante por

11.

Lavar con 1 ml de etanol al 70 % previamente enfriado.

12.

Centrifugar a 13400 g por 5 minutos y retirar el sobrenadante y secar.

13.

Suspender en un volumen de 5-20 l de solucin TE.

EXTRACCIN DE RNA
A partir de cultivo celular infectado con virus de Distemper canino:
1.- Se retira el medio de cultivo, se lava el estrato celular con PBS fro y se
desecha.
2.- Agregar 1 ml de Trizol por cada 25 cm 2 de monoestrato, homogeneizar
bien.
3.- Pasar el homogenizado a un microtubo de 1.5 ml.
4.- Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
5.- Agregar 0.2 ml de cloroformo y agitar con la mano.
6.- Incubar 2 o 3 minutos a temperatura ambiente.
7.- Centrifugar a 12,000 x g por 15 minutos a 4 C.
8.- Transferir la fase acuosa a un microtubo limpio y desechar el restante.
9.- Agregar 0.5 ml de isopropanol.
10.- Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
11.- Centrifugar a 12,000 x g por 10 minutos a 4 C.
12.- Retirar el sobrenadante cuidando de no llevarse la pastilla.
14.- Agregar 1 ml de etanol al 75 % con DEPC.
15.- Mezclar muy bien.
16.- Centrifugar a 7,500 x g por 5 minutos a 4 C.
17.- Desechar sobrenadante.
18.- Secar parcialmente la pastilla.
19.- Disolver la pastilla en agua tratada con DEPC.
20.- Incubar 10 minutos a 55 C.
Congelar la muestra a 70 C hasta su anlisis.

EXTRACCIN DE RNA
1. Las clulas crecidas en una botella de 25 cm 2 con 100% de confluencia,
se lavan con 1 ml de PBS
2. Se retira el excedente de PBS y se agrega 1 ml de TRIZOL por cada 10
cm2 de superfie de monoestrato presente en la botella
3. Se incuba 5 min sobre hielo y Pasar el homogenizado a un microtubo de
1.5 ml
4. Se agregar 0.2 ml de cloroformo y agitar con vortex por 15 seg, se
incuba 2 min en hielo
5. Se centrifugar por 15 min a 12,000 x g a 4
C.
6. Transferir la fase acuosa a un microtubo limpio y desechar el restante.
7. Se precipitael ARN agregando 0.5 ml de isopropanol fro
8. Incubar 10 minutos en hielo
9. Centrifugar a 12,000 x g por 10 minutos a 4 C
10. Retirar el sobrenadante cuidando de no llevarse la pastilla de ARN
11. Se lava la pastilla con 1 ml de etanol fro al 75 % con agua tratada con
DEPC
12. Mezclar muy bien
13. Centrifugar por 5 min a 7,500 x g a 4 C
14. Se desecha el sobrenadante
15. Se secar parcialmente la pastilla a temperatura ambiente
16. La pastilla se suspende en 20 l de agua con DEPC
17. Congelar la muestra a 70 C hasta su anlisis

INMUNOTRANSFERENCIA
1.

Separe las protenas por electroforesis a 70v en un gel de poliacrilamida

SDS al 12%.

2.

Una vez listo el gel, se procede a lavarlo en agitacin 3 veces durante 1

min con buffer de transferencia (25mM Trizma, 192mM Glicine y 20%
Metanol v/v).

3.

Cortar un cuadro de membrana de nitrocelulosa y dos cuadros de papel

filtro, considerando 5mm extra al tamao del gel.

4.

Humeder la membrana en agua destilada, las esponjas y el papel filtro

en buffer de transferencia.

5.

El ensamblaje del estuche de transferencia se hace en el siguiente

orden: tapa blanca, esponja, papel filtro, membrana, gel, papel filtro,
esponja, tapa negra y ajuste del seguro.

6.

Se deposita la mitad del volumen de buffer de transferencia en la

cmara de electroforesis y se inserta el refrigerante previamente preparado
y el estuche de transferencia, finalmente se llena la cmara con el buffer.

7.

La transferencia se realiza a 100v durante de una hora.

8.

Al terminar la transferencia se tie el gel con azul de Coomasie, para

confirmar que las protenas salieron del gel y se coloca la membrana en
TBS-T (100mM Tris, 0.9% NaCl w/v, a un pH de 7.5 y 0.05% de Tween), con
3% de gelatina en agitacin durante 30min.

9.

La membrana
agitacin.

10.

Se incuba toda la noche, la membrana a temperatura ambiente con el

anticuerpo primario a una dilucin de 1:2000.

11.

La membrana
agitacin.

12.

se lava con TBS-T durante tres ciclos de 5min en

se lava con TBS-T durante tres ciclos de 5min en

Se incuba por 1 h, con el anticuerpo secundario a una dilucin 1:1000.

13.

Repetir el ciclo de lavado.

14.

Prepare la solucin reveladora:

15.

20ml de metanol fro + 60mg de 4-cloro-naphtol, 100l de H2O2 y 100ml

de TBS. La solucin a y b se mezclan al mismo tiempo en el TBS donde
esta
inmersa la membrana, con la precaucin de no verter sobre la
membrana.

16.

Se coloca la membrana en la solucin reveladora, hasta ver la reaccin,

momento en que se detiene vertiendo agua destilada.

EXTRACCIN DE PROTENAS DE MEMBRANA EXTERNA

1. La bacteria suspendida en PBS, se centrifuga 15 min a 4 C a 5000 rpm.
2. La pastilla bacteriana se suspende en 15 ml de solucin fosfatos y se vuelve
a centrifugar.
3. Se desecha sobrenadante y se suspende la pastilla bacteriana en 10 ml de
solucin de fosfatos.
4. La muestra se sonica a 4 C bajo las siguientes condiciones: 50% de
amplitud, 2.5 seg. de pulso, y 9.9 seg de descanso.
5. La muestra obtenida se centrifuga 15 min a 4 C a 10,000 rpm.
6. Se colecta el sobrenadante y se ultracentrifuga 35 min a 40,000 rpm a 4 C.
7. La pastilla se suspende en 10 ml de Na2HPO4 2% y se incuba 30 min a 37 C
8. Se repite la ultracentrifugacin
9. La pastilla se suspende en 100 l de PBS y se congela a -70 C.

ELECTROFORESIS
1. Se monta la cmara de electroforesis y se prepara el gel de poliacrilamida,
el cual consta de dos frmulas distintas.
2. Gel separador, la preparacin consta de los siguientes elementos:
Agua destilada
1.5 m TRIS- HCL Ph 8.8
SDS 10%
Acrilamida
Persulfato de amonio 10%
TEMED

3.35 ml
2.5 ml
100 l
4.0 ml
60 l
7 l

3. Gel concentrador, la preparacin consta de los siguientes elementos:

Agua destilada
1.5 m TRIS- HCL Ph 6.8
SDS 10%
Acrilamida
Persulfato de amonio 10%
TEMED

6.1 ml
2.5 ml
100 l
1.3 ml
60 l
10 l

4. Se coloca dentro de la cmara de electroforsis el gel separador y se aplica

sobre ste un sello de agua, esperando a que polimerice.
5. Despus de la polimerizacin se desecha el sello de agua y se coloca el gel
concentrador colocando en este momento el cepillo para formar los carriles
del gel y esperando a que polimerice.
6. La muestra se prepara colocando 5 l de proteina y 20 l de buffer de
muestra, la cual se calienta a 100 C en bao Mara, durante 5 min.
7. El gel se coloca dentro de solucin Tris Glicine 1X o buffer de corrida.
8. La muestra se coloca en uno de los carriles del gel y se colocan 10 l de
marcador de peso molecular en otro carril.

9. El gel se corre a 50 volts para el gel concentrador y a 100 volts para el gel
separador.
10.Al eliminar el colorante se desmonta el gel y se tie en azul de coomasie
durante 4 h.
11. Despus de sto se coloca en solucin desteidora hasta observar los
carriles y bandas proteicas de la muestra y del marcador.

TRANSFORMACIN DE Escherichia coli (CaCl2).

A) Preparacin de clulas competentes.
1. Inocular una colonia de bacterias en 5 ml de medio LB. Incubar toda la
noche a 37C y 200 a 250 rpm.
2. Inocular 400 l del cultivo en 400 ml de medio LB en un matraz con
capacidad para 1 o 2 litros. Incubar a 37C y 200 a 250 rpm, hasta llegar
a una OD600 de 0.6 a 0.7.
3. Alicuotar el cultivo en tubos estriles de 50 ml enfriados previamente.
4. A partir de este punto las clulas deben mantenerse en fro en todo
momento.
5. Pueden utilizarse tubos de mayor capacidad o botellas, pero se debe
conservar la proporcin en los volmenes.
6. Centrifugar a 4000 x g por 10 min a 4C. Decantar el sobrenadante.
7. Es preferible no utilizar freno en los pasos de centrifugacin.
8. Decantar el sobrenadante y suspender cada pellet en 10 ml de solucin
fra de CaCl2 (CaCl2 60 mM; glicerol 15%; PIPES pH 7 10 mM; esterilizar
por filtracin o autoclave).
9. Repetir los pasos 6 y 7.
10. Suspender en el volumen remanente despus de decantar.
11. Combinar el contenido de todos los tubos y centrifugar a 6000 x g por 10
min a 4C.
12. Decantar el sobrenadante y suspender cada pellet en 2 ml de solucin
fra de glicerol al 10%. Es importante suspender completamente.
13. Distribuir volmenes de 200 l en tubos estriles de 1.5 ml enfriados
previamente. Congelar en nitrgeno lquido o, de preferencia, en hielo
seco. Mantener a 70C.
B) Transformacin.
1. Seleccionar 2.5 kV, 25 F y 200 a 400 ohms en el aparato de
electroporacin.

2. Descongelar las clulas en hielo y aadir 5 pg a 500 ng de DNA

transformante en 1 l. Mezclar suavemente sin pipetear.
3. Transferir la mezcla a una celdilla de electroporacin previamente
enfriada y secar su exterior con papel absorbente.
4. El volumen de DNA aadido debe ser el mnimo posible.
5. La concentracin total de sales en la celdilla no debe ser mayor de 1
mM.
6. Colocar la celdilla en el aparato.
7. Aplicar el pulso y retirar la celdilla.
8. Inmediatamente aadir 1 ml de medio LB o, preferentemente, de medio
SOC (extracto de levadura 0.5%; triptona 2%; NaCl 10 mM; KCl 2.5 mM;
MgCl2 10 mM; MgSO4 10 mM; glucosa 10 mM) y transferir a un tubo
estril. Incubar por 1 h a 37C y 200 a 250 rpm.
9. Realizar diluciones y cultivar volmenes apropiados (e. g. 100 l)
mediante expansin en la superficie de cajas de agar LB con el
antibitico indicado. Dejar secar el lquido e incubar a 37C por 12 a 16
h.
10. Es conveniente cultivar varias diluciones. Los volmenes restantes
pueden almacenarse a 4C.

PCR
InvA
H2O
Amortiguador 10X
ClMg
dNTPs
Iniciador 1
Iniciaodor
Tritn 0.1%
BSA
DNA
Taq

24 l
5 l
4.5l
2.5l
2 l
2 l
2.5l
2.5l
4 l
1 l

Calentamiento
Desnaturalizacin
Alineamiento
Extensin
Extensin fina

94 C
94 C
55 C
72 C
72 C

5 min
30 seg
30 seg
30 seg
7 min

30 CICLOS
PCR SopE
H2O
Amortiguador 10X
ClMg
dNTPs
Iniciador 1
Iniciaodor
DNA
Taq

35 l
5 l
2 l
1 l
2 l
2 l
2 l
1 l

Calentamiento
Desnaturalizacin
Alineamiento
Extensin
Extensin fina

94 C
94 C
43 C
72 C
72 C

30 CICLOS

5 min
30 seg
30 seg
30 seg
5 min

APENDICE DE SOLUCIONES
MEDIOS DE CULTIVO
Caldo nutritivo A
Caldo nutritivo
Extracto de levadura
Glicerol
K2HPO4
KH2PO4

7.0 g
1.0 g
2.0 ml
3.7 g
1.3 g

Se afora a 1000 ml con agua destilada y se esteriliza a 121 C, 121 lb, 15 min.
Se almacena a temperatura ambiente.
Agar nutritivo A
Caldo nutritivo
Extracto de levadura
Glicerol
K2HPO4
KH2PO4
Agar

7.0 g
1.0 g
2.0 ml
3.7 g
1.3 g
15 g

Se afora a 1000 ml con agua destilada y se esteriliza a 121 C, 121 lb, 15 min.
Se almacena a temperatura ambiente.
PBS
NaCl
KCl
Na2HPO4
K2HPO4

8.0 g
0.2 g
1.44 g
0.24 g

Se ajusta pH a 7.4, se afora a 1000 ml con agua destilada y se esteriliza a 121

C, 121 lb, 15 min. Se almacena a temperatura ambiente.
SOLUCIONES PARA EXTRACCIN DE PROTENAS
Solucin amortiguadora de Na2HPO4 1 M pH 7.2
Solucin amortiguadora de Na2HPO4 10 mM pH 7.2
Na2HPO4 1M pH 7.2
1 ml
Se afora a 100 ml con agua destilada y se utiliza el mismo da.
Solucin amortiguadora de Na2HPO4 10 mM pH 7.2 con 2% de Tritn
Na2HPO4 1M pH 7.2
1 ml
Tritn X-100 2%
1 ml

Se afora a 100 ml con agua destilada y se utiliza el mismo da.

SOLUCIONES PARA GELES DESNATURALIZANTES DE POLIACRILAMIDASDS
1.5 Tris-HCl pH 8.8
Tris base
Agua destilada

18.17 g
50 ml

Se ajusta pH a 8.8 con HCl, se afora a 100 ml con agua destilada y se esteriliza
a 121 C, 121 lb, 15 min. Se almacena a 4 C.
0.5 Tris-HCl pH 6.8
Tris base
Agua destilada

6.0 g
50 ml

Se ajusta pH a 6.8 con HCl, se afora a 100 ml con agua destilada y se esteriliza
a 121 C, 121 lb, 15 min. Se almacena a 4 C.
Acrilamida
Acrilamida
Bisacrilamida

30.0 g
0.8 g

Se afora a 100 ml con agua destilada y se almacena en frasco mbar a 4 C.

Persulfato de amonio
Persulfato de amonio
Agua destilada

100 mg
1 ml

Se utiliza al momento o se hacen alicuotas de 100 l y se congelan a -20 C.

Amortiguador de muestra
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
Glicerol
SDS al 10%
2-mercaptoetanol
Agua destilada
Azull de bromofenol

1.0 ml
0.8 ml
1.6 ml
0.4 ml
0.4 ml
cristales

Se almacena en recipiente mbar a temperatura ambiente.

Amortiguador de corrida
Tris base 25 mM
Glicina 192 Mm
SDS 0.1%
Se afora a 1000 ml con agua destilada.

3.03 g
14.4 g
1g

TINCIONES
Tincin de Coomassie
Etanol 40 %
cido actico 10 %
Azul brillante de Coomassie 0.05%
Agua destilada 60%
Solucin desteidora para tincin de Coomassie
Etanol 40 %
cido actico 10 %
Agua destilada 60%
SOLUCIONES DE TRANSFERENCIA
Solucin de Towbin
SDS 0.037%
Tris base 25 mM
Glicina 192 M
Metanol 20%

0.36 g
3.03 g
14.4 g
200 ml

Se afora a 1000 ml con agua destilada.

SOLUCIONES PARA EXTRACCIN DE DNA
EDTA
Etilenediaminetra-acetato disdico 2H2O 0.5M

18.61 g

Se ajusta pH 8.0 con lentejas de NaOH y se afora a 100 ml, se almacena a

temperatura ambiente.
Tris
Tris base 1M

12.11 g

Se ajusta pH a 8.0, se afora a 100 ml con agua destilada, se almacena a

temperatura ambiente.
CTAB/NaCl
CTAB 10 %
NaCl 0.7M

10 g
4.1 g

Se afora a 100 ml con agua destilada. Se coloca en bao Mara para

homogenizar la mezcla, se esteriliza a 121 C, 121 lb, 15 min. Se almacena a
temperatura ambiente.
TE
Tris

10 mM

pH 8.0

EDTA

1 mM

pH8

NaCl 5M
SDS 10%
Cloroformo-Alcohol isoamlico
24:1
Fenol-Cloroformo-Alcohol isoamlico
25:24:1
Etanol 70%
Solucin de lisis para mtodo Tiocianato de Guanidina
EDTA 0.1 M pH 8.0
Sarcosil 0.16%
Tiocinanato de Guanidina 1.66 M
Acetato de amonio 7.4 M
Almacenara -20C
2-Propanol
SOLUCIONES PARA EXTRACCIN DE PLASMIDOS
SOLUCIN I
Glucosa
Tris-HCl
EDTA

50 mM
25 mM
10 mM

SOLUCIN III
Acetato de potasio
cido actico glacial
SOLUCIN II
SDS
Hidroxido de sodio

pH 8
pH 8

3M
5M
1%
0.2 N

La solucin se prepara unos momentos antes de ser utilizada

EXTRACCION DE RNA
Caja con cultivo clular con 100% de confluencia

Agua con 0.1% de DEPC

Se prepara en la campana
20 ml de agua
20 l de DEPC
Se agita 5 min con la mano, se coloca de 4 a 6 h a 37 C. Se esteriliza 20, se
hacen alcuotas de 1 ml, se cubren con aluminio y se guardan a 4C

MATERIAL PARA PREPARAR

Cajas con puntas de 10 l, 200 l y 1000l
Cajas con puntas de 10 l, 200 l y 1000l CON FILTRO
Botellas con agua destilada esteril
Paquetes de tubos falcon de 15 ml y 50 ml
Frascos con tubos eppendorf de 500 l y 1000 l
Filtros esteriles