Tesis Maestria Monserrat Vidal Alvarez PDF

EVALUACIN DE LOS MECANISMOS DE ADSORCIN Y
ACUMULACIN INTRACELULAR DE PLOMO (Pb2+), EN

SISTEMAS CONTINUOS DE FITORREMEDIACIN CON
Salvinia minima.
TESIS QUE PRESENTA I.Q. MONSERRAT VIDAL LVAREZ

PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS
Xalapa, Veracruz, Mxico 2009
EVALUACIN DE LOS MECANISMOS DE ADSORCIN Y

ACUMULACIN INTRACELULAR DE PLOMO (Pb2+), EN
SISTEMAS CONTINUOS DE FITORREMEDIACIN CON
Salvinia minima.
TESIS QUE PRESENTA I.Q. MONSERRAT VIDAL LVAREZ

PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS
DIRECTORA DE TESIS DRA EUGENIA J. OLGUIN PALACIOS
Xalapa, Veracruz, Mxico 2009
El presente trabajo se realiz en la Unidad de Biotecnologa Ambiental del Instituto de Ecologa

A.C. bajo la direccin de la Dra. Eugenia J. Olgun Palacios.
Forma parte del proyecto Mecanismos pasivos y activos de remocin de Pb y Cd por la

comunidad Salvinia minima-microalgas rizosfricas y por Arthrospira maxima y de degradacin
y/o bioacumulacin de bisfenol-a y 17-beta estradiol (E2) por Anabaena sp y Phormidium
bohneri . Financiado por CONACyT, clave: P-46697-Z
AGRADECIMIENTOS
A Dios por haberme dado la vida y colmarme de bendiciones, derramando en m su

espritu infnito que me ilumina y gua por el camino correcto para alcanzar de manera perfecta
todas mis metas y sueos.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT), por otorgarme la beca

para cursar mis estudios de maestra.
Al Instituto de Ecologa por darme la oportunidad de cursar mis estudios de posgrado, y

a la vez permitirme conocer a personas tan maravillosas e interesantes que en l laboran, y que
me brindaron siempre su invaluable amistad, confianza y apoyo.
A la Dra. Eugenia Olgun por permitirme conocerla y por otorgarme su apoyo,

disponibilidad y asesora en mis estudios de maestra, por el gran impulso que me dio para
superar los retos que se presentaron, y que a la vez me fortalecieron y motivaron ms a seguir
adelante para alcanzar mis objetivos.
A los miembros de mi comit tutorial, la M. C. Gloria Snchez Galvn y el Dr. Eric

Houbron, quienes me apoyaron y asesoraron durante la elaboracin y revisin de este trabajo.
Al Dr. Flix Gutirrez Corona y al Dr. Pedro Guillermo ngeles lvarez, por su
colaboracin como revisores de este trabajo.
A todos mis compaeros y amigos que tuve el privilegio de conocer y compartir

momentos inolvidables en esta etapa de mi vida.
DEDICATORIAS
A mi madre, por que esta meta lograda se la debo a ella, por todo el apoyo, amor, gua y
sabios consejos que siempre me ha dado. Y por ser la mejor amiga que jams he tenido.
A mi familia por su amor, confianza y apoyo incondicional.
Al Ing. Jacinto Romero por apoyarme e impulsarme siempre a seguir adelante.
Aprend que no se puede dar marcha atrs,

que la escencia de la vida es ir siempre adelante.
Thomas Carlyle
NDICE
1. INTRODUCCIN
2. GENERALIDADES
2.1 Metales pesados
2.2 Toxicidad de metales pesados en plantas
2.3 Fuentes de metales pesados
2.4 Plomo
2.4.1. Caractersticas fsicas y qumicas
2.4.2. Toxicidad de plomo
2.4.3. Fuentes generadoras de plomo
2.5 Biotecnologa para la remocin de metales pesados

2.6 Fitorremediacin
9
10
2.6.1 Fitorremediacin de suelos
10
2.6.2 Fitorremediacin acutica
11
2.6.2.1 Macrofitas acuticas
12
2.6.2.2 Microalgas
13
2.7 Mecanismos de respuesta de las plantas a la presencia de

metales pesados
14
2.7.1 Adsorcin de metales pesados a superficies biolgicas
16
2.7.2 Quelantes intracelulares
17
2.7.2.1 Fitoquelatinas
17
2.7.1.2 Metalotionenas
18
2.8 Salvinia mnima
18
2.8.1
Aspectos generales de S. mnima
18
2.8.2
Remocin de metales pesados por S. mnima
20
3 OBJETIVOS
22
3.1 Objetivo general
22
3.2 Objetivos especficos
22
4. MATERIAL Y METODOS
23
4.1 Condiciones de cultivo de la biomasa de S. mnima

8
23
4.1.1 Composicin del medio de cultivo para S. minima y experimentos

de remocin de plomo
23
4.2 Caractersticas de diferentes tipos de biomasa de S. minima
24
4.2.1 Biomasas de S. minima y de Lyngbya sp. para experimentos en

sistemas por lote
24
4.2.2 Biomasa de S. minima para determinar acidez carboxlica
24
4.3 Parmetros para cuantificacin de la biomasa
25
4.4 Cuantificacin de acidez carboxlica
26
4.5 Unidades y condiciones experimentales
28
4.5.1 Determinacin del tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los

experimentos continuos
28
4.5.2. Experimento para determinar la acidez carboxlica en S. minima
28
4.5.3 Experimentos en sistema continuo
28
4.6 Monitoreo
30
4.6.1 Experimentos en sistema por lote con plomo
30
4.6.2 Experimento para determinar la acidez carboxlica en

S. minima
30
4.6.3 Experimentos en sistema continuo

4.7 Cuantificacin de plomo en la fase lquida
31
32
4.8 Factores de Bioconcentracin (FBC), de Adsorcin (FAD) y Acumulacin

Intracelular (FAI)
33
4.9 Porcentaje de remocin
35
4.10 Plomo adsorbido y acumulado intracelularmente en la biomasa de

S. minima
35
4.11 Anlisis de datos
35
4.12 Estrategias experimentales
35
4.12.1 Estrategia experimental-sistema por lote
35
4.12.2 Estrategia experimental-sistema continuo
36
4.13 Diagrama de flujo de lagunas con S. minima expuestas a medio con

plomo, operando en sistema continuo
37
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
38
5.1 Determinacin del tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los

experimentos continuos
38
5.2 Experimentos en sistemas continuos
43
5.2.1 Condiciones ambientales
43
5.2.2 Porcentaje de remocin de plomo por S. minima
44
5.2.3 Factores de acumulacin intracelular, adsorcin y bioconcentracin de

plomo en S. minima al final del tiempo experimental
45
5.2.4 FAI, FAD y FBC a diferentes tiempos de exposicin de S. minima al

plomo
50
5.2.5 Cambios del valor del FBC de plomo en S. minima en todas las
condiciones probadas
55
5.2.6 Bioadsorcin de plomo en mg/kg de biomasa a la superficie

de S. minima
58
5.2.7 Acumulacin intracelular de plomo en mg/kg a la biomasa de S.

minima
61
5.2.8 Efecto de la intensidad luminosa sobre la concentracin de grupos

carboxilos en la biomasa de S. minima
63
5.2.9 Porcentaje de frondas daadas de S. minima despus de estar expuesta a

diferentes concentraciones de plomo
66
6. CONCLUSIONES
68
7. RECOMENDACIONES
70
8. BIBLIOGRAFA
71
ANEXO 1
84
ANEXO 2
85
10
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Lmites mximos permisibles para metales pesados y cianuros
Tabla 2. Fuentes naturales de metales y elementos en la lista de contaminantes

Prioritarios
Tabla 3. Composicin del medio sinttico modificado Hutner 1/10
23
Tabla 4. Concentracin de clorofila presente en biomasa de S. minima y Lyngbya sp

. en medio Hutner modificado 1/10 con CPb de 12.59 + 0.04 mg Pb/l
41
Tabla 5. Factor de Acumulacin Intracelular y Factor de Adsorcin de dos tipos de

biomasa de S. minima y Lyngbya sp. en medio Hutner modificado 1/10 con
CPb de 12.59 + 0.04 mg Pb/l
41
Tabla 6.Condiciones ambientales para diferentes grupos de experimentos
43
Tabla 7. Concentracin de acidez carboxlica en biomasa de S. minima despus

de 6 das expuesta a diferentes intensidades luminosas/temperaturas
64
Tabla 8. Porcentaje de frondas daadas de S. minima expuesta a diferentes Ci e

intensidades luminosas en lagunas de fitorremediacin en sistema continuo,
despus de 52 horas
67
11
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Resumen de los mecanismos potenciales celulares disponibles para la

destoxificacin y tolerancia de metales en plantas
Figura 2. Esquema de S. mnima
15
19
Figura 3. Cintica de remocin de plomo por S. minima y Lyngbya sp. en

medio Hutner modificado 1/10 con CPb de 12.59 + 0.04 mg Pb/l
en condiciones controladas de temperatura e intensidad luminosa
de 25 + 2C y 105 molm-2s-1 respectivamente y pH=6 + 0.02
39
Figura 4. Porcentajes de remocin de plomo por S. minima a diferentes

condiciones ambientales probadas y a diferentes concentraciones
promedio de plomo
44
Figura 5. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb= 1.24 + 0.38 mg Pb/l,
I.L.=109 molm-2s-1 y temperatura de 24.6 C
46
47
Figura 7. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb= 4.94 + 0.8mg Pb/l,
48
49
I.L.=650molm-2s-1 y temperatura de 25.33 C
49
Figura 10. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb= 12.87 + 1.3mg Pb/l,
I.L.=650molm-2s-1 y temperatura de 25.33 C
50
Figura 11. FAI, FAD y FBC en S. minima a lo largo del tiempo expuesta a una
CPb=0.58 + 0.21 mg Pb/l, I.L.=422 molm-2s-1 y temperatura de
24.5 C
51
CPb = 27.58 + 1.51 mg Pb/l, I.L.=422 molm-2s-1 y temperatura de
24.5 C
52
12
CPb = 3.22 + 0.27 mg Pb/l, I.L.=810 molm-2s-1 y temperatura de
32.26 C
53
CPb = 10.56 + 1.37mg Pb/l, I.L.=810 molm-2s-1 y temperatura de
32.26 C
55
Figura 15. Resumen de los FBC en S. minima expuesta a diferentes concentraciones

de plomo y diferentes intensidades luminosas
56
Figura 16. Plomo adsorbido a la superficie de la biomasa de S. minima (mg Pb/kg

biomasa) a diferentes intensidades luminosas y diferentes concentraciones
promedio de plomo
59
Figura 17. Plomo acumulado intracelularmente a la biomasa de S. minima (mg Pb/kg

biomasa), a dos diferentes intensidades luminosas y dos diferentes
concentraciones promedio de plomo
61
Figura 18. Acidez carboxlica de S. minima expuesta a diferentes condiciones de

intensidad luminosa y temperatura
64
13
EVALUACIN DE LOS MECANISMOS DE ADSORCIN Y ACUMULACIN

INTRACELULAR DE PLOMO (Pb2+), EN SISTEMAS CONTINUOS DE
FITORREMEDIACIN CON Salvinia minima.
1. INTRODUCCIN
En la actualidad, la problemtica de la contaminacin con metales pesados en las
aguas superficiales y marinas se est incrementando a la par con el crecimiento del desarrollo
industrial y tecnolgico no sustentable. Los metales pesados, han sido reconocidos como
peligrosos para la salud del hombre y la biota acutica, adems, han sido includos en la
Lista de contaminantes prioritarios por agencias de control ambiental de todo el mundo,
dados los impactos negativos que pueden generarse incluso cuando stos se encuentren en
concentraciones muy bajas (Novotny, 1996).
La presencia de elevadas concentraciones de estos contaminantes en el agua, as como la
falta de tratamiento de los mismos, traen como consecuencia enfermedades al ser humano, la
falta de suministro de agua potable, intoxicacin de peces, prdida de especies, dao a los
ecosistemas, problemticas sociales y un sin fin de efectos negativos.
Existen varios mtodos fsico-qumicos para la eliminacin de metales pesados de los

efluentes, dentro de los cuales se encuentran: precipitacin, intercambio inico y
smosis
inversa. Sin embargo, la mayora de stos son poco rentables o resultan muy costosos en trminos
energticos y/o de consumo de productos qumicos, cuando se utilizan para la remocin de bajas
concentraciones (Howard et al, 2000).
El desarrollo de tecnologas para la remediacin de aguas contaminadas con metales

pesados es una prioridad en Mxico debido a que el pas cuenta con muchas industrias que
descargan este tipo de contaminantes en sus aguas residuales y no les dan un tratamiento
adecuado. Adems, es de alta relevancia disear tecnologas adecuadas al contexto socioeconmico y ambiental de pases en desarrollo, como Mxico aprovechando la alta radiacin
solar, diversidad vegetal y disponibilidad de tierras marginales (Olgun et al., 1994).
1
Dentro de esta perspectiva, la fitorremediacin es una opcin muy viable para Mxico y
otros pases que cuenten con estas condiciones; sin embargo, slo desde hace muy pocos aos, se
han iniciado investigaciones en esta lnea (Nez et al., 2004).
Por lo anterior, el presente trabajo es original y relevante dado que investiga aspectos
bsicos, como es el efecto de factores ambientales, as como de la concentracin de plomo en la
columna de agua, sobre los mecanismos de remocin de metales con una planta acutica
(Salvinia minima) que ha sido descrita como hiperacumuladora de metales pesados (Olgun et al.,
2002). Adems, esta investigacin ofrece las bases de diseo para el desarrollo de sistemas de
fitorremediacin acutica con esta planta.
2. GENERALIDADES
2. 1 Metales pesados
Los metales pesados son un grupo de elementos de alta prioridad, debido a su alta
toxicidad sobre la mayora de los organismos, a su ubicuidad y a que se pueden bioacumular a
travs de las cadenas trficas en ecosistemas acuticos y terrestres.
Los metales pesados tienen una densidad superior a 4,5 g/cm3, y aunque algunos son
esenciales en el metabolismo de los seres vivos, como el cobalto, cobre, hierro, manganeso,
molibdeno, vanadio, estroncio, y zinc, en concentraciones muy elevadas stos son demasiado
txicos y pueden ocasionar daos irreversibles. Algunos otros como el cadmio y el mercurio son
muy txicos inclusive a concentraciones muy bajas. Los metales pesados adems tienden a
persistir en el ambiente, dada su resistencia a la degradacin qumica o biolgica (Salomons y
Frstner, 1995).
En cuerpos receptores de agua, los metales pueden originarse de fuentes naturales y/o
antropognicas. De los 59 elementos metlicos, 13 han sido includos en la lista de contaminantes
prioritarios por la Environmental Protection Agency (EPA).
Actualmente en Mxico, el agua se ha convertido en elemento central de la poltica

ambiental; su disponibilidad y distribucin condiciona la posibilidad de desarrollo de algunas
regiones del pas y su calidad es el factor determinante para la salud y bienestar de la humanidad.
Debido a ello, el aumento de la contaminacin en las aguas superficiales y marinas se est

convirtiendo en una amenaza de altas proporciones por la presencia de elevadas concentraciones
de metales pesados como el plomo, cadmio, cromo y nquel (Moreno y Devars, 1999). Esta
problemtica se ha acrecentado debido al mal manejo de las descargas industriales y al ineficiente
tratamiento que se les da a las mismas.
Las enfermedades relacionadas con el agua contaminada son una tragedia humana que
cada ao cobra la vida de ms de 5 millones de personas, de acuerdo a la Organizacin Mundial
de la Salud (OMS) ( http://www.who.int/es/). Como resultado de esta problemtica, los costos
del cuidado de la salud causados por aguas contaminadas representan tres mil millones de dlares
anualmente a nivel mundial (Frenk, 1993). Adems La Organizacin de las Naciones Unidas
(ONU, 2006), ha reportado que el agua contaminada causa el 80% de las enfermedades del
mundo, la mayor parte de los que sufren estas enfermedades son nios menores a 5 aos de
acuerdo a la Organizacin de las Naciones Unidas para la Educacin, la Ciencia y la Cultura
(UNESCO, por sus siglas en ingls) (http://www.un.org/es/rights/).
2.2 Toxicidad de metales pesados en plantas
La toxicidad puede resultar de la unin de metales a grupos sulfhdricos en protenas,

conduciendo a una inhibicin de actividades o defectos en la formacin de la estructura de las
clulas, o desplazando un elemento esencial dando como resultado deficiencias en el
metabolismo de las plantas.
Adems, el exceso de metales pesados puede estimular la formacin de especies reactivas

de oxgeno, resultando en estrs oxidativo (Dietz et al., 1972). Las plantas tienen diversos
mecanismos potenciales a nivel celular que pueden estar involucrados en la detoxificacin y de
esta manera en la tolerancia a metales pesados.
Debido a las problemticas de contaminacin y toxicidad que pueden causar los metales
pesados, la Norma Oficial Mexicana (NOM-001-ECOL-1996) (Tabla 1), establece los lmites
mximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes
nacionales, considerando los cianuros y los siguientes metales pesados: arsnico, cadmio, cobre,
cromo, mercurio, nquel, plomo y zinc.
Tabla 1. Lmites mximos permisibles para metales pesados y cianuros.
Fuente: NOM-001-ECOL-1996
(*) Medidos de manera total.
P.D. = Promedio Diario
P.M. = Promedio Mensual
N.A. = No es aplicable
(A), (B) y (C): Tipo de Cuerpo Receptor segn la Ley Federal de Derechos.
2.3 Fuentes de metales pesados
Los metales son algunos de los elementos abundantes en la corteza de la Tierra. Los
minerales tales como los enlistados en la Tabla 2 representan la fuente original de los metales
encontrados en suelos y ambientes acuticos.
Las fuentes de metales urbanas e industriales han sido identificadas como la causa
principal de contaminacin por metales txicos. Los orgenes de estos compuestos txicos son
muy diversos. Las ms obvias son las operaciones industriales como son las fundiciones, fbricas
de acero, placas de metal, la elaboracin y fabricacin de metales, y de plantas mineras. Algunas
de las industrias que generan aguas residuales contaminadas por metales pesados entre otros
contaminantes son: azucarera, petrolera, cervecera, textil, celulosa y papel, acabados metlicos,
cobre y sus aleaciones, curtidura, alimenticias, hierro y acero. Estas fuentes son legalmente
clasificadas como focos puntuales de contaminacin, aunque el escurrimiento de estos complejos
es considerado como una fuente difusa.
5
Tabla 2. Fuentes naturales de metales y elementos en la lista de contaminantes prioritarios

Elemento
Antimonio
Arsnico
Berilio
Cadmio
Cromo
Cobre
Plomo
Mercurio
Nquel
Selenio
Plata
Talio
Zinc
Fuentes naturales de metales (metales minerales)

Sb2S3. Manantiales geotrmicos, minas.
Arsenito (HAsO2), gases volcnicos, manantiales geotrmicos.
Beril Be3Al2Si6O16
Carbonato de zinc y minerales de sulfuro, carbonato de cobre.
Cromita (FeCr2O), xido crmico (Cr2O3)
Metal libre (Cu), sulfuro de cobre (CuS2), calcopirita (CuFeS2), minas.
Galena (PbS)
Metal libre (Hg), cinabrio (HgS)
Minerales de ferromagnesio, minerales de sulfuro ferroso, xido de nquel
(NiO2), hidrxido de nquel (Ni(OH)3)
Elemento libre (Se), Ferroselita (FeSe2), depsitos de uranio,
Metal libre (Ag), cloruro de plata (AgCl2), cobre, plomo, minerales de
zinc
Cobre, plomo, residuos de plata
Calamina (ZnCO3), minas
Fuente: Salomons y Frstner (1995).
Otras fuentes importantes de contaminacin por metales en las zonas urbanas son: los
tejados metlicos, canalones y bajantes, tuberas metlicas oxidadas, tuberas de plomo viejas,
depsitos de automviles y vertederos de basura y desechos slidos (muchos de ellos insalubres y
que emiten contaminantes).
2.4 Plomo
2.4.1. Caractersticas fsicas y qumicas
El plomo (Pb, N.A. 82) es el metal pesado ms abundante en la naturaleza, tiene una
densidad relativa o gravedad especfica 11.4 a 16C.
Fsicamente el plomo es de color azuloso, se empaa para adquirir un color gris mate, es
flexible, inelstico y se funde con facilidad. Su punto de fusin es 327.4C y el de ebullicin es
1725C. Las valencias qumicas normales son 2+ y 4+.
Qumicamente, combinado con otros elementos forma compuestos con caractersticas

nicas y altamente tiles, tiene la capacidad de formar muchas sales, xidos y compuestos
organometlicos.
2.4.2. Toxicidad del plomo
Posner y colaboradores (1978), Rosen y Sorell (1978) y Chang y colaboradores (1984),

examinaron el consumo principal y los efectos del plomo, sobre las personas. Altas
concentraciones de plomo que son txicas algunas veces provienen de la actividad humana como
extraer y fundir adhesivos, de utensilios hechos de peltre (aleacin de plomo), soldadura de
plomo, cermica, plomo-vidrioso, y ventanas de cristal de colores, de tubos de plomo e
instalacin de caeras, de descomponer pinturas basadas en plomo, y donde hay automviles
que usan gasolinas con aditivos de plomo (Moreno y Devars, 1999). A pesar de sus numerosas
aplicaciones beneficiosas, el plomo se define como un peligro a la salud humana en
concentraciones relativamente pequeas dentro del cuerpo, que se pueden adquirir por ingestin
de alimento y agua o inhalando partculas aerotransportadas.
La intoxicacin aguda por plomo resulta en una disfuncin en los riones, el sistema
reproductor, hgado, cerebro, y sistema nervioso central, resultando en enfermedades o la muerte
(Manahan, 1984). Otros efectos crnicos incluyen la anemia, la fatiga, problemas
gastrointestinales y anorexia (Jain, 1989; Fergusson, 1990). Los indicadores de calidad de agua
potable para el plomo en la mayora de los pases desarrollados y para la Organizacin Mundial
de Salud (OMS) establecen un contenido mximo de 0.05mg /l (van der Leeden et al., 1990).
Needleman y colaboradores (1979) confirm que los efectos venenosos del plomo para el
sistema neurolgico ocurren incluso con la exposicin al plomo en niveles muy bajos, los cuales
han sido ligados a la disminucin de inteligencia y de la funcin cognoscitiva, as como al
comportamiento delincuencial en nios (Schwartz, 1994; Jacobs, 1996; Needleman et al., 1990).
Niveles de plomo en la sangre humana tan bajos como 0.1ppm (10 microgramos por decilitro= 10
g/dl) ahora son considerados causa para intervencin por las agencias pblicas tales como
Centres for Disease Control (CDC) y Environmental Protection Agency (EPA) (National
Research Council, 1993).
En cuanto a las plantas, el plomo disminuye la fotosntesis, disminuye la actividad de las

enzimas y disminuye el transporte mitocondrial de los electrones (Moreno y Devars, 1999). Se
sabe adems, que el plomo no es esencial para el crecimiento de las plantas y es considerado
txico para ellas a la concentracin de 30-300 g/g en sus tejidos (Roos, 1994).
Aunque se ha reconocido por muchos siglos que el plomo es un contaminante

potencialmente peligroso para la salud y el ambiente, la utilizacin del mismo ha aumentado con
el aumento de la actividad industrial.
2.4.3 Fuentes generadoras de plomo
El plomo se distribuye como elemento traza en aire, agua, y tierra, segn lo resumido por
Kesler (1978). La galena (sulfuro de plomo) es el mineral dominante de plomo.
El uso ms amplio del plomo, como tal, se encuentra en la fabricacin de acumuladores.
Otras aplicaciones importantes son la fabricacin de tetraetilo de plomo, forros para cables,
elementos de construccin, pigmentos, soldadura suave, municiones, plomadas para pesca y
tambin en la fabricacin de juguetes.
El plomo tiene un amplio uso en la construccin, en particular en la industria qumica ya
que es resistente al ataque por parte de muchos cidos porque forma su propio revestimiento
protector de xido. Sin embargo, es atacado por las bases nitrogenadas, como consecuencia de
esta caracterstica ventajosa, el plomo se utiliza mucho en la fabricacin y el manejo del cido
sulfrico, cido ntrico, ciertos elementos halgenos y el vapor de azufre. Adems, durante
mucho tiempo, el plomo se ha empleado como pantalla protectora para las mquinas de rayos X.
En virtud de las aplicaciones cada vez ms amplias de la energa atmica, se han vuelto
cada vez ms importantes las aplicaciones del plomo como blindaje contra la radiacin. Su
utilizacin como cubierta para cables, ya sea la de telfono, de televisin, de internet o de
8
electricidad, sigue siendo una forma de empleo. La ductilidad nica del plomo lo hace
particularmente apropiado para esta aplicacin, porque puede estirarse para formar un forro
continuo alrededor de los conductores internos.
Las fuentes de exposicin al plomo han cambiado en los aos recientes, con la
declinacin de la gasolina plomada y de la soldadura del plomo en latas de alimentos (Jacobs,
1996). Sin embargo, an existen otras fuentes que causan efectos negativos e impactos al
ambiente.
2.5 Biotecnologa para la remocin de metales pesados
Los mtodos convencionales y procesos existentes para la remocin de metales pesados

de aguas residuales son principalmente la precipitacin, coagulacin,
intercambio inico,
filtracin, y ultra-filtracin. Sin embargo, estos procesos requieren demasiadas construcciones

(por ejemplo tanques, estaciones de bombas y batidoras), as como una gran cantidad de
compuestos qumicos, energa, y personas capacitadas. Estos mtodos, adems, generan grandes
volmenes de lodos para ser procesados, los cuales presentan a su vez un alto costo en su
tratamiento (Howard et al 2000).
La biotecnologa ambiental se basa en el desarrollo, uso y regulacin de sistemas

biolgicos para la remediacin de ambientes contaminados (suelo, aire, agua), para la
preservacin del medio ambiente y para el uso sustentable de recursos (Internacional Society
Environmental Biotechnology, http://www3.inecol.edu.mx/iseb/).
La biotecnologa es tambin una herramienta esencial para conseguir una de las tareas
ms importantes de la humanidad: conciliar el desarrollo y el crecimiento econmico en armona
con la explotacin sostenida y racional de recursos (Olgun, 1996). En este sentido, en nuestro
pas, la biotecnologa puede convertirse en una opcin viable, ofrecindonos una manera natural
de la aplicacin de mtodos alternativos para el tratamiento de metales pesados en los efluentes
de residuos industriales y municipales, disminuyendo de esta forma los costos y aumentando la
eficiencia de tratamiento.
9
2.6 Fitorremediacin
La fitorremediacin puede definirse como una tecnologa sustentable que se basa en el

uso de plantas para reducir in situ la concentracin o peligrosidad de contaminantes orgnicos e
inorgnicos en agua, suelo y aire (Pilon-Smits, 2006); a partir de procesos bioqumicos realizados
por las plantas y microorganismos asociados a su sistema de raz que conducen a la reduccin,
mineralizacin, degradacin, volatilizacin y estabilizacin de los diversos tipos de
contaminantes (Flathman y Lanza, 1998; EPA, 2000).
La fitorremediacin de metales pesados ha mostrado competitividad frente a los mtodos

ms convencionales, especialmente para la remocin de bajas concentraciones de estos
componentes (Macek, 2000). Asimismo, es una tecnologa de bajo costo, eficiente, no requiere
personal especializado para su manejo ni consumo de energa, no produce contaminantes
secundarios y se pueden reciclar recursos (agua, biomasa, metales), entre muchas otras ventajas
(Polprasert, 1996).
2.6.1 Fitorremediacin de suelos
La fitorremediacin de suelos ha tenido mayor atencin por parte de los investigadores en

comparacin a la fitorremediacin acutica. Debido a ello, durante los ltimos aos se ha
generado una terminologa nueva basada en el papel que tienen las plantas durante el proceso de
remediacin, as como de los principales mecanismos involucrados, de forma que se han definido
mltiples estrategias de fitorremediacin terrestre (Salt et al. 1998; Nez et al., 2004).
-Fitoextraccin o fitoacumulacin. Las races de las plantas acumulan los metales principalmente
en sus tallos y hojas (Blaylock et al., 1997).
-Fitodegradacin. Se lleva a cabo a travs de reacciones enzimticas que generan plantas y

microorganismos en la rizsfera, los contaminantes son parcial o completamente degradados o
10
transformados, para ser secuestrados en la vacuola de la planta o fijados a estructuras celulares

insolubles (Nez et al., 2004, Newman et al., 1997, Schnoor et al., 1995).
-Fitoestabilizacin. Esta estrategia se encarga de reducir la biodisponibilidad de metales y otros

contaminantes en el ambiente por medio de mecanismos de secuestracin, lignificacin o
humidificacin. Esto ocurre a travs de reacciones qumicas como la precipitacin o formacin
de complejos insolubles o por mecanismos fsicos, como la adsorcin (Cunningham y Ow,
1996a; Nez et al., 2004; Novak et al., 1995).
-Fitovolatilizacin. Los contaminantes son absorbidos, metabolizados y transportados desde la

raz de las plantas hasta a sus hojas y son liberados a la atmsfera en formas voltiles, menos
txicas en comparacin con sus formas oxidadas. La volatilizacin se lleva a cabo durante la
transpiracin por un intercambio de gases (Nez et al., 2004; Vroblesky et al, 1999).
2.6.2 Fitorremediacin acutica
El fundamento de este tipo de tratamiento consiste en que los compuestos presentes en el

agua son adsorbidos e incorporados dentro de la estructura de las plantas, logrando eliminar la
contaminacin del agua y favoreciendo la restauracin de la calidad de la misma (Olgun et al.,
1994).
Las lagunas con plantas acuticas para el tratamiento de aguas residuales, se basan en
principios ecolgicos, en donde los efluentes son tratados eficientemente mediante relaciones
mutuas y coordinadas de flujo de energa y nutrientes, entre las plantas acuticas y los
microorganismos degradadores (Shi y Wang, 1991).
Adems, con base en los estudios de remocin de compuestos txicos por plantas
acuticas, se pueden considerar a los sistemas de fitorremediacin acutica como una alternativa
ecolgica y econmicamente viable, no slo para el tratamiento de los efluentes municipales sino
tambin para efluentes industriales (Olgun et al., 1994).
11
En la rizofiltracin, los metales son adsorbidos y/o absorbidos por las races de las
plantas. Se basa exclusivamente en hacer crecer, en cultivos hidropnicos, races de plantas
terrestres con alta tasa de crecimiento y rea superficial para absorber, concentrar y precipitar
metales pesados de aguas residuales contaminadas (Cunningham y Ow, 1996b; Nez et al.,
2004; Raskin y Salt, 1997).
2.6.2.1 Macrofitas acuticas
Anteriormente las macrofitas acuticas eran consideradas como una plaga debido a su
rpido crecimiento, invasin de lagunas y los problemas generados por las mismas (Arrivallaga y
Arredondo, 1978). Sin embargo, se pueden convertir en una herramienta muy til en el
tratamiento de aguas residuales, dndoles un manejo adecuado para aprovechar sus capacidades
de absorcin de nutrientes y bioacumulacin de otros compuestos del agua (Boyd, 1970).
En la actualidad, la aparicin de macrofitas acuticas esta relacionada con la qumica del

agua. Adems, las comunidades de estas especies de plantas se han usado como bioindicadores y
tienen como objetivo el estudio de calidad del agua. Las macrofitas acuticas se utilizan con
frecuencia para vigilar la contaminacin de agua dulce por metales pesados y plaguicidas en las
zonas tropicales y regiones subtropicales, debido a su abundancia y la gran biomasa producida
(Whitton, 1985; Vazquez et al. 2000 y Klumpp et al. 2002).
Los sistemas de depuracin basados en macrofitas consisten generalmente en un

monocultivo o policultivo de stas, dispuestos en tanques, lagunas o zanjas poco profundas y con
un tiempo de retencin superior al de los sistemas convencionales (Ansola, 2003).
Por otro lado, las macrofitas acuticas, usadas para el tratamiento de aguas residuales
deben contar con las siguientes caractersticas: alta productividad, alta eficiencia de remocin de
nutrientes y contaminantes, alta predominancia bajo condiciones naturales adversas,
adaptabilidad al clima de la regin, capacidad de transporte de oxgeno de la superficie a la
rizosfera y fcil cosecha (Olgun et al., 1994; Ansola et al., 2003). Asimismo, las macrofitas
acuticas flotantes han sido utilizadas en la fitorremediacin gracias a sus caractersticas de
12
acumular o hiper-acumular metales y metaloides (Welsh y Denny, 1980; Say et al., 1981; Heisey
y Damman, 1982; Kovacs et al., 1984; Bishop y DeWaters, 1988; Brix y Schierup, 1989; GardeaTorresday et al., 2005).
Valitutto y colaboradores (2006), reportaron que las macrofitas acuticas como

Eichhornia crassipes y Pistia stratiotes, pueden actuar como hiperacumuladoras de Pb bajo
ciertas condiciones ambientales. Adems de poseer la ventaja de ser fciles de cosechar en
comparacin a las plantas emergentes (Rahmani y Sternberg, 1999).
La fitorremediacin con macrofitas acuticas para la remocin de metales pesados

compite con otros tratamientos secundarios como por ejemplo la precipitacin, siendo el principal
mecanismo la adsorcin a travs de las races (Denny y Wilkins, 1987). Para las macrofitas
acuticas que poseen races pero no tienen contacto directo con los sedimentos, el agua es
indudablemente la principal fuente de elementos.
2.6.2.2 Microalgas
Adems de las plantas, las algas tambin son usadas para fines de fitorremediacin y se ha
probado la efectividad de hiperacumulacin de metales pesados que tienen las mismas. Existen
varios estudios en donde se reportan mltiples algas resistentes a metales pesados (Haq y
Shakoori, 1998; Rehman y Shakoori, 2001; Nishikawa y Tominaga, 2001).
Se han utilizado diversas algas para poder entender mejor los mecanismos de acumulacin
de metales (Wilde y Benemann 1993). Payne (2000), realiz un estudio en donde prob que
Spirulina y Chlamydomonas tienen gran habilidad para acumular metales pesados como Zn, Pb y
Cu.
Por otro lado, en el 2001, Ettajani y colaboradores reportaron que las microalgas
Skeletonema costatum y Tetraselmis suecica son hiperacumuladoras de Cadmio.
13
2.7 Mecanismos de respuesta de las plantas a la presencia de metales pesados
Las plantas tienen diferentes mecanismos de respuesta ante la presencia de compuestos

txicos como los metales pesados (Reed y Gadd, 1990). Entre ellos, destacan los mecanismos de
exclusin, mineralizacin, reduccin, solubilizacin, acumulacin, quelacin y translocacin
(Salt et al., 1995; Lytle et al., 1998). Algunos son pasivos, como la adsorcin por exclusin y
otros son activos, es decir, que requieren energa metablica para llevarse a cabo, como la
acumulacin, translocacin o relocalizacin. La translocacin es un tipo de alteracin de un
patrn de compartamentalizacin del metal, es decir, algunas plantas translocan o transfieren el
exceso de metal a las hojas viejas, otras limitan el transporte de la raz al tallo.
La vacuola tiene un funcionamiento especial en el almacenamiento de metales. Los iones

metlicos se transportan de manera activa al interior del tonoplasto como iones libres o como
complejos metal-molcula quelante (Moreno y Devars, 1999).
La pared celular vincula la disminucin de permeabilidad de la membrana celular, y en

algunas ocasiones activa la extrusin, la absorcin por orgnulos y vacuolas o complejacin con
agentes quelantes tales como las protenas, por ejemplo, metalotionenas y fitoquelatinas (Gekeler
et al. 1988; Rauser, 1990).
Los procesos de destoxificacin que usualmente se conocen son la adsorcin y

bioacumulacin (Verma y Singh, 1995; Sandau et al., 1996; Rehman y Shakoori, 2003; Gin et
al., 2002). En aos recientes, la habilidad de las plantas para acumular contaminantes ha recibido
mayor atencin (Black, 1995). Hay informes que indican que algunas especies pueden acumular
metales pesados especficos, por ejemplo, Spirodela polyrhiza que acumula Zn (Markert, 1992).
Adems, se han encontrado algunas especies con la capacidad de acumular altas concentraciones
de metales pesados en su biomasa las cuales son llamadas hiperacumuladoras.
La hiperacumulacin combina los aspectos de adsorcin, transporte y translocacin de

metales. Se considera que existe hiperacumulacin en las plantas, cuando la concentracin del
metal acumulado en los tejidos de las plantas se encuentra en el rango de 0.1-1% del peso seco de
14
la planta, este porcentaje es particular para diferentes metales (Suresh y Ravishankar, 2004).
Hasta la fecha, han sido reportadas ms de 430 especies como hiperacumuladoras de metales
pesados, desde hierbas anuales hasta arbustos perennes y rboles. Por ejemplo, manglares como
Avicenia, han sido reportados como hiperacumulares de cobre, plomo y zinc (Mac y Burchett,
2002).
Las estrategias para evitar que los metales pesados aumenten en las plantas son diversas.
Extracelularmente se incluyen las micorrizas, la pared celular y exudados extracelulares. La
tolerancia puede adems involucrar la membrana plasmtica y el citosol. Dentro del protoplasto
existe una variedad de mecanismos potenciales, por ejemplo, para la reparacin de los daos de
estrs se ha involucrado a proteinas de choque trmico o a las metalotionenas, as como la
quelacin de metales por cidos orgnicos, aminocidos o pptidos, o su compartamentalizacin
a procesos metablicos para el transporte dentro de la vacuola (Hall, 2002). Esta gama de
mecanismos esta resumido en la Figura 1
Figura 1. Resumen de los mecanismos potenciales celulares disponibles para la destoxificacin y

tolerancia de metales en plantas. 1. Restriccin del movimiento del metal a las races por
micorrizas. 2. Unin a la pared celular y exudados de las races. 3. Entrada del flujo reducido
frente a la membrana plasmtica. 4. Salida activa dentro del apoplasto. 5. Quelacin en citosol
por varios ligandos. 6. Reparacin y proteccin de la membrana plasmtica bajo condiciones de
tensin. 7. Transporte del complejo PC-Cd dentro de la vacuola. (Modificado de Marschner,
1995).
15
2.7.1 Adsorcin de metales pesados a superficies biolgicas
La adsorcin es un proceso por el cual las molculas se adhieren a superficies slidas. La

adsorcin fsica no es especfica, y las fuerzas que atraen a las molculas a las superficies de los
slidos son relativamente frgiles. La energa de activacin por adsorcin fsica usualmente no es
mayor de una Kcal/gmol. En la adsorcin, los iones metlicos son secuestrados de la solucin a
travs de algunos mecanismos como intercambio inico, quelacin, adsorcin por fuerzas fsicas
y atrapamiento de iones (Stirk y Staden, 2001).
Se ha reportado que la temperatura puede influenciar al proceso de adsorcin (Volesky,

2003). Kuyucak y Volesky (1989), demostraron que el cobalto (Co) adherido a un alga caf,
(Ascophyllum nodosum) aument de un 50 a un 70%, cuando la temperatura increment de 4
hasta 23 C.
En general, los mecanismos de remocin son diferentes entre las distintas especies de
plantas y estarn determinados por el tipo de metal. Sin embargo, la adsorcin es sin duda el
mecanismo de remocin extracelular ms reportado en plantas acuticas (Stirk y Staden, 2001).
Por otro lado, la biomasa usualmente contiene ms de un tipo de sitios disponibles para el
secuestro de metales y el efecto de la temperatura en cada tipo de sitio puede, adems, contribuir
al total del metal secuestrado. Esto fue confirmado con la adsorcin de Cu a una biomasa
microbiana saturada con potasio (Weppen y Hornburg, 1995). Para muchos de los metales, el
calor de reaccin fue constante, independientemente del grado de ocupacin de los sitios. Sin
embargo, para el Cu el calor de reaccin decreci con el aumento del grado de ocupacin delos
sitios de 27 a 14 KJ/mol, indicando la unin de varios sitios de ligandos o la formacin de
diferentes tipos de complejos de Cu con la biomasa. Para otros metales pesados, el calor de
reaccin de adsorcin fue entre 7 y 11 KJ/mol, para metales ligeros entre 2.1 y 6 KJ/mol
(Weppen y Hornburg, 1995).
16
2.7.2 Quelantes intracelulares
Por otro lado, a nivel intracelular los metales forman complejos con un ligando existente
o sintetizado de novo, que pueden ser cidos orgnicos, algunos aminocidos, metalotionenas y
fitoquelatinas, siendo los dos ltimos los ms importantes (Rauser, 1999; Cobbett, 2000).
2.7.2.1 Fitoquelatinas
Estas molculas son pptidos sintetizados enzimticamente que juegan un papel

importante en la homeostasis y destoxificacin de metales pesados. Son de bajo peso molecular
(<10KDa), consisten en tres aminocidos: cistena, glicina y cido glutmico (Lee et al., 2003).
Las fitoquelatinas (FQs), derivan del glutatin y se polimerizan para formar pptidos
secuestradores de metales pesados en muchas especies de plantas y microorganismos.
La sntesis de fitoquelatinas es citoplsmica, comienza con la respuesta de la planta a un

metal pesado por la activacin de la enzima fitoquelatina sintasa, que acta sobre un sustrato de
glutatin para producir fitoquelatinas (Suresh y Ravishankar, 2004). Adems, la reaccin
catalizada por la enzima no requiere de ATP, slo de la presencia de un metal pesado en altas
concentraciones, el cual acta como un activador esencial de la enzima (Moreno y Devars, 1999).
Se asume que la principal funcin de las fitoquelatinas tiene que ver con la
destoxificacin de metales no esenciales (micronutrientes), particularmente de hierro, cobre y
zinc. Se sabe que una amplia variedad de metales pueden inducir la formacin de fitoquelatinas,
entre ellos el cadmio, nquel, cobalto, plomo, plata, zinc, cobre, aluminio, arsnico, selenio y
mercurio (Nez et al., 2004).
17
2.7.2.2 Metalotionenas
Son protenas de bajo peso molecular (<40KDa) que carecen de aminocidos aromticos y
que pueden sintetizarse por las bacterias, plantas, hongos, invertebrados y mamferos (Moreno y
Devars, 1999). Tambin se conocen como polipptidos ricos en cistena codificados
genticamente (Cobbett, 2000).
Estas protenas contienen largas fracciones de residuos de cistena y muestran alto

contenido metlico con iones coordinados en grupos metal-tiolato. Se ha propuesto que estn
involucradas en el metabolismo y la homeostasis de los metales esenciales, ms que en la
destoxificacin de metales pesados (Nez et al., 2004).
2.8 Salvinia minima
2.8.1 Aspectos generales de S. minima
S. minima es un helecho acutico de libre flotacin. Pertenece a la familia Salviniaceae,

crece en aguas estancadas con aporte de materia orgnica, habitando en regiones tropicales y
subtropicales. Sus hojas flotantes son orbiculares de forma oval y su longitud oscila entre 0.4 a 2
cm (Figura 2). La superficie axial de las hojas flotantes est provista de vellosidades (tricomas).
Su crecimiento es rpido y la fragmentacin ocurre fcilmente, favoreciendo su amplia extensin
(Cook et al., 1974; Palacios y Rico, 1992).
Salvinia ha colonizado diversas partes del mundo, notablemente frica (Mitchell, 1970) e
India (Cook et al., 1974) y ha tenido una buena tasa de crecimiento bajo condiciones ambientales
favorables.
S. minima resulta un modelo muy adecuado para su uso en fitorremediacin, dadas las
siguientes consideraciones: es de amplia distribucin geogrfica, soportando temperaturas de 3C
y 43C (Whiteman y Room, 1991); su crecimiento es rpido (Cook et al., 1974), su velocidad
especfica de crecimiento es mayor que la de las lemnceas (Olgun et al., 2007).
18
Adems, se ha reportado que S. minima es hiperacumuladora de plomo y cadmio en

comparacin a otras macrofitas acuticas (Olgun et al, 2002; 2005).
En una investigacin para determinar las caractersticas fsico-qumicas de S. minima,

Snchez-Galvn y colaboradores (2008) demostraron que tiene un rea superficial muy alta (264
m2/g DW), la cual es similar a las reportadas para otras macrofitas acuticas, como Salvinia
herzogii (270 m/g) y Eichhornia crassipies (250 m/g) (Schneider y Rubio, 1999).
Tambin, posee un alto contenido de grupos funcionales carboxlicos (0.95 mmol H+/g de
biomasa) (Snchez-Galvn et al., 2008). stas propiedades hacen muy til el uso de ste helecho
acutico para la fitorremediacin de aguas contaminadas con metales pesados.
Figura 2. Esquema de S. minima
19
2.8.2 Remocin de metales pesados por S. minima
En el ao 2002, Olgun y colaboradores demostraron por primera vez la capacidad de

hiperacumulacin de cadmio por S. minima, cuando la planta estuvo a expuesta a una
concentracin de 4 0.18 mg Cd /l bajo condiciones exteriores de la ciudad de Xalapa, Veracruz,
reportndose 11,262 mg Cd /kg biomasa de S. minima. Adems, se observ que el pH tuvo
significativa influencia en la capacidad de remocin de cadmio
Por otro lado, Srivastav y colaboradores (1993), demostraron que S. minima tiene la
capacidad de remover entre 70-90% de plomo y de zinc en dos das, cuando la expusieron a
concentraciones de los metales de 1 a 8 mg/l. Por otro lado, Olgun y colaboradores (2005a)
demostraron que esta planta era capaz de remover hasta un 89.7% de Pb2+ en slo 24 horas,
habiendo sido expuesta a una concentracin de plomo relativamente alta de 11.77 mg/l, en
contraste con otros datos reportados para Lemna obscura (Gallardo-Williams et al, 2002), en los
cuales se encontr que se requiri una semana para que la planta removiera el 97% del mismo
metal en solucin.
La capacidad para acumular elementos traza puede ser medida mediante el Factor de
Bioconcentracin (FBC), que indica la relacin entre la concentracin del elemento traza en la
planta (mg/g peso seco) y la concentracin del elemento correspondiente en el medio acuoso
(mg/ml)
(Zayed et al., 1998; Miretzcky et al., 2004; Rahmani y Sternberg, 1999).
Adicionalmente, estos factores son tiles para
interpretar la cantidad efectiva del metal
recuperado en la planta (Boniardi et al., 1999). En este sentido, se han observado Factores de
Bioconcentracin (FBC) muy altos para Salvinia en el orden de 2000 para sistemas por lote
(Olgun et al., 2005a) y hasta de 17,000 en sistemas continuos (Olgun et al, 2005b).
Snchez y colaboradores (2008) se basaron en el anlisis de compartamentalizacin de
plomo por S. minima en sistemas por lote, para proponer por primera vez el uso del Factor de
Acumulacin Intracelular (FAI) y del Factor de Adsorcin (FAD) para evaluar la capacidad de la
planta para hiperacumular el metal en trminos de adsorcin a su superficie y de acumulacin a
nivel intracelular. Sin embargo, en sistemas continuos estos factores no han sido investigados.
20
Adems, se ha reportado que la adsorcin de Pb2+ a la superficie de las pseudo-races en

ausencia de nutrientes, es un mecanismo rpido y reversible que predomina sobre un mecanismo
ms lento e irreversible de acumulacin en sistemas por lote (Olgun et al., 2004; Olgun et al.,
2005a), y que la dinmica entre ambos mecanismos y la compartamentalizacin del Pb2+ est
afectada por la presencia de nutrientes y de factores ambientales, tales como la intensidad
luminosa y la temperatura (Olgun et al, 2005a).
Tambin, se ha descrito que S. minima es capaz de adsorber la mayor cantidad de Pb en

tan slo 30 minutos, cuando es expuesta a un medio con concentraciones iniciales desde 1 hasta
30mg Pb/l en sistemas por lote (Snchez-Galvn et al., 2006).
En relacin a su uso como biomasa seca, se ha demostrado su gran capacidad de adsorber

Pb en sistemas por lote y en continuo al trabajar con concentraciones del metal tan altas como
250mg Pb/l (Gonzalez-Portela et al.,2005a, b).
Ante la urgente necesidad de controlar la contaminacin del agua por la presencia de

metales pesados, la demanda de nuevas tecnologas para la remocin de metales pesados de las
aguas residuales y debido a la alta capacidad que tiene S. minima para hiperacumular metales
pesados, as como a las mltiples ventajas que presenta en comparacin a otras macrofitas
acuticas; se decidi utilizar este helecho acutico para la elaboracin del presente trabajo,
reportando resultados an no descritos en la literatura cientfica y estableciendo las bases de
diseo para el desarrollo de sistemas de fitorremediacin acutica con esta planta, para la futura
apliacin de esta biotecnologa, considerndola una alternativa viable para nuestro pas.
21
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Investigar el efecto de factores ambientales tales como la combinacin de la intensidad

luminosa y la temperatura, as como de la concentracin de plomo en la columna de agua, sobre
los mecanismos de adsorcin y acumulacin intracelular de este metal en la biomasa de S.
minima en sistemas continuos de fitorremediacin.
3.2 Objetivos especficos

Definir el tipo de biomasa (S. minima lavada y sin lavar) requerido para la remocin de
Pb2+ en sistemas continuos de fitorremediacin.
Evaluar el efecto de la intensidad luminosa (en el rango de 109 a 810 molm-2s-1) y la
temperatura (en el rango de 23.44 a 32.26C) y de la concentracin de plomo (en el rango
de 0.58 a 27.58 mg Pb/l), sobre los mecanismos de adsorcin y acumulacin intracelular
de Pb2+ en sistemas continuos de fitorremediacin con S. minima.
22
4. MATERIAL Y MTODOS.
4.1 Condiciones de cultivo de la biomasa de S. minima

La biomasa de S. minima que sirvi de inculo para los experimentos fue cosechada
despus de 7 das de cultivo. Las plantas fueron crecidas en contenedores de plstico con
capacidad de 10 l conteniendo 6 l de Medio sinttico Hutner modificado 1/10 preparado con
agua de llave, de acuerdo a Vermaat y Hanif, (1998). La biomasa creci bajo condiciones
controladas de temperatura e intensidad luminosa de 25 + 2 C y 133 + 3 molm-2s-1,
respectivamente. El pH inicial fue de 6.0 + 0.2.
4.1.1 Composicin del medio de cultivo para S. minima y experimentos de remocin de

plomo.
En la Tabla 3, se muestra la composicin del medio que se utiliz para cultivar la biomasa
de S. minima, as como para los experimentos en donde las plantas se expusieron a diferentes
concentraciones de plomo. Cabe sealar que para estos ltimos, el medio se prepar sin la adicin
de K2HPO4 ni de EDTA con agua destilada. Adems, el pH del medio fue ajustado a 6.0 + 0.2
con HNO3 al 10% o NaOH.
Tabla 3. Composicin del Medio sinttico modificado Hutner 1/10
Nutriente
mg/lt
NH4NO3
20
K2HPO4
40
MgSO4* 7H20
50
FeSO4*7H20
2.5
MnSO4*7H2O
1.5
ZnSO4*7H20
6.5
H3BO3
1.5
NaMoO4 *H20
2.5
CuSO4*5H20
0.4
Na2EDTA *H2O
50
CoSO4*H20
0.1
CaCl2*H20
16.2
Fuente: (Vermaat y Hanif, 1998)
NOTA: Ya que Vermaat y colaboradores (1998) no mencionan la concentracin del CaCl2*H2O
en el medio, se decidi adicionar la misma concentracin que en el medio Huebert (16.2mg/l).
23
4.2 Caractersticas de diferentes tipos de biomasa de S. minima
4.2.1 Biomasas de S. minima y de Lyngbya sp. para experimentos en sistemas por lote
Para poder determinar el tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los experimentos en

sistemas continuos, se decidi realizar un experimento previo en sistema por lote, en el cual se
utilizaron los siguientes tipos de biomasa de S. minima:
a) Sin lavar: La biomasa se sac de los contenedores donde creci y no se pas bajo la
corriente de agua de la llave.
b) Lavada: La biomasa se sac del medio anterior donde creci, se coloc en una coladera y
estuvo una vez bajo la corriente de agua de la llave durante 5 minutos.
Biomasa de Lyngbya sp.:
Para la recoleccin de la microalga, se tomaron 20 gramos de base hmeda (gbh) de S.

minima sin lavar con Lyngbya sp. adherida a la planta, y se depositaron en 600ml de medio
Hutner modificado 1/10 en un matraz erlenmeyer de 1 litro en un agitador orbital a 200 rpm.
Dicho procedimiento se realiz por triplicado. Posteriormente, se retiraron los matraces del
agitador y se coloc cada matraz sobre una placa de agitacin con un magneto durante 5 minutos
y posteriormente se retir la biomasa de S. minima, para conservar slo la microalga.
4.2.2. Biomasa de S. minima para determinar acidez carboxlica.
Se obtuvo la biomasa de S. minima de 7 das de crecimiento, adaptada en medio Hutner y

se incub bajo 3 diferentes condiciones de intensidad luminosa:
Condicin controlada: Biomasa crecida en la cmara de crecimiento de 25C a una intensidad

luminosa de 105 molm-2s-1.
24
Condiciones no controladas:
a) Biomasa crecida en la planta piloto de fitorremediacin (PPF): obtenindose altas
radiaciones propias de los meses de Mayo y Junio, a una intensidad luminosa promedio
de 962 molm-2s-1 y una temperatura promedio de 28C.
b) Biomasa crecida bajo sombra: en condiciones exteriores durante los meses de Mayo y
Junio a una intensidad luminosa promedio de 28 molm-2s-1 y una temperatura promedio
de 22C.
4.3 Parmetros para cuantificacin de la biomasa

Determinacin de peso fresco en S. minima:
Se tom la biomasa de S. minima con una coladera, se dej escurriendo 5 minutos y se
coloc durante 15 minutos sobre papel filtro doblado por la mitad, posteriormente la cantidad
pesada ese report como gramos de base hmeda (gbh).
Determinacin de clorofila en Lyngbya sp. asociada a S. minima:

A lo largo de las resiembras de los cultivos de S. minima en condiciones controladas de
luz y temperatura tanto en medio Hutner como en medio Huebert, se ha observado la presencia de
una microalga rizosfrica identificada como Lyngbya sp., la cual se adhiere a las pseudo-races de
la planta y a la parte posterior de la fronda.
Se determin clorofila de acuerdo a Lorenzen (1967), Golterman (1970) y Holm-Hansen

(1978), utilizando metanol como agente extractante. Las muestras fueron ledas en un
Espectrofotmetro marca Hach modelo DR-4000V, despus de aplicar el siguiente
procedimiento:
a) Se tomaron 10 gbh de S. minima de cada laguna y se colocaron en matraces erlenmeyer de 2
litros con 1.5 litros de medio Hutner modificado 1/10. Dichos matraces se incubaron en el
agitador orbital a 200 rpm durante 60 minutos.
b) Posteriormente, los matraces se agitaron durante 5 minutos en una placa de agitacin con un
magneto.
25
c) Se retir la biomasa y se tomaron 2 ml del sobrenadante de cada matraz, los cuales fueron
filtrados utilizando papel filtro whatman no. 4.
d) Se elimin el exceso de agua del papel filtro.
e) Posteriormente se introdujo el papel filtro en un tubo de ensayo con 5 ml de metanol.
f) Se tap el tubo y mezcl perfectamente con la ayuda de un vortex.
g) Todas las muestras se guardaron en la oscuridad y en el refrigerador toda la noche.
h) A continuacin las muestras se centrifugaron a 3,200 rpm por 10 minutos.
i) Por ltimo, se vaci el sobrenadante en una celda de 1cm y se midi clorofila a 665 nm y a
750 nm (cero con metanol).
El clculo de la concentracin de clorofila (Chl-a) se realiz mediante la siguiente ecuacin:
Chl-a (g/l)= (Abs[665nm]-Abs[750nm]) x A x Vm

Vf x L
Donde:
A = Coeficiente de absorbancia para clorofila-a en methanol (12.63)
Vm = Volumen de metanol usado para la extraccin (5 ml)
Vf = volumen de agua filtrada (litros)
L = Ancho de la celda (1 cm)
4.4 Cuantificacin de Acidez Carboxlica.
La determinacin de grupos carboxilo se realiz de acuerdo a Prado et al., (1999) y se

basa en la reaccin de stos con acetato de calcio en solucin acuosa, provocando su
desprotonizacin. El procedimiento consta de los siguientes pasos:
a) Se sec la biomasa en la cmara de 25C, en una gaveta sin lmparas encendidas. La biomasa
seca se moli en un mortero y se tamiz para tener un tamao de partcula entre 1 a 4mm.
Posteriormente, se coloc en una bolsa de plstico, nueva y limpia y se guard en un
desecador.
b) Se pesaron 3 muestras de 0.05 gbs (gramos de base seca) y se colocaron en matraces
Erlenmeyer de 250ml.
26
c) Se colocaron matraces erlenmeyer de 250 ml y se adicionaron 50 ml de acetato de calcio

aprox. 0.2M a cada uno, asimismo se colocaron nicamente 50 ml de acetato de calcio en
otros tres matraces erlenmeyer (50 ml cada uno) como blancos. Los 6 matraces se taparon con
parafilm y se colocaron en un agitador orbital durante 24 horas a 180 rpm, en la cmara de
crecimiento a 25C.
d) Al trmino de las 24 horas, se filtraron las muestras utilizando una bomba de vaco, en
unidades de filtracin Nalgene (M.R) de 250 ml con papel filtro Whatman no. 42. Para lavar
la biomasa, se hizo pasar un volumen de 150 ml de agua desionizada hervida (libre de dixido
de carbono) a travs del papel filtro donde se encontraba la biomasa. De estos 150 ml de
agua 100 ml se utilizaron primero para remover restos de biomasa y acetato que quedaron en
el matraz erlenmeyer y posteriormente se pasaron a travs de la biomasa. El acetato de calcio
y el agua de lavado que se recolectaron en la unidad de filtracin, posteriormente se
traspasaron a otro matraz erlenmeyer de 250 ml para proceder a la titulacin con NaOH
0.1M.
e) Los matraces erlenmeyer con el acetato de calcio (blancos) nicamente se les retir la tapa de
parafilm y se procedi a la titulacin con NaOH 0.1M.
f) Cada matraz se coloc en una placa de agitacin y se coloc el electrodo del potencimetro
dentro del matraz. Se registr el pH inicial y se titul con la solucin de NaOH 0.01N y se
dej caer sobre el matraz lentamente, hasta que el pH de la solucin alcanzara un valor de 9.8.
La concentracin de acidez carboxlica se clculo de acuerdo a la siguiente ecuacin:
Acidez carboxlica (mmol H+/g de biomasa)= (VB2-VB1)*CB*1000/mb

Donde:
VB2= vol. (ml) de NaOH usado para titular la muestra
VB1= vol. (ml) de NaOH para titular el blanco
CB= concentracin de NaOH (Molar)
mb= peso de biomasa en miligramos
27
4.5 Unidades y condiciones experimentales:
4.5.1 Determinacin del tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los experimentos en

sistema continuo:
Para el experimento en sistema por lote con plomo, las unidades experimentales fueron
lagunas de plstico (0.15 m ancho x 0.19 m largo x 0.09 m alto) conteniendo 1.5 litros de medio.
Se montaron 3 unidades experimentales por cada tratamiento, y una tina adicional de cada
tratamiento para cuantificar la clorofila al final del experimento. Como controles se utilizaron 2
unidades experimentales conteniendo solamente medio con plomo y sin planta, para poder
cuantificar el posible plomo adherido a las paredes de la laguna y/o precipitacin del metal.
Las lagunas se ubicaron en la cmara de crecimiento de 25C con una intensidad luminosa
controlada de 105 molm-2s-1. A cada unidad experimental se le colocaron 20 gbh de inoculo de
S. minima, que corresponde a 42.85 gbs/m2 de biomasa para el inculo, lavado y sin lavar, y la
cantidad de microalga que se desprendi de 20 gbh de planta en 1.5 l de medio.
4.5.2. Experimento para determinar la acidez carboxlica en S. minima
Las unidades experimentales fueron lagunas de plstico (0.15 m ancho x 0.19 m largo)
conteniendo 1.5 litros de medio Hutner modificado 1/10, para cuantificar la concentracin de
grupos carboxilos a los tiempos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 das. Se montaron dos unidades
experimentales por cada condicin de intensidad luminosa.
4.5.3 Experimentos en sistema continuo:
Para realizar los experimentos en sistema continuo, se utilizaron lagunas de acrlico con
dimensiones de 1 x 0.1 x 0.5 m conteniendo un volumen til de 20 l. Las unidades
experimentales se expusieron a las condiciones de intensidad luminosa y temperatura de la planta
piloto de fitorremediacin (PPF) de la Unidad de Biotecnologa Ambiental del Instituto de
Ecologa. Se montaron 2 unidades experimentales por cada tratamiento. Cabe sealar que los
28
experimentos se realizaron a lo largo de varios meses, por lo que se monitorearon las dos
variables que afectaron los experimentos de manera ms importante, al estar expuestas las
lagunas a condiciones exteriores: la intensidad luminosa y temperatura.
Las lagunas fueron alimentadas continuamente a travs de bombas peristlticas marca

Cole-Parmer. Todos los experimentos se realizaron a un TRH (Tiempo de Retencin Hidrulica)
de 20 horas, ya que en un trabajo previo (Prez-Prez, 2006), se observ que a un TRH de 30
horas la planta presentaba clorosis y que a un TRH de 10 horas, el proceso de remocin no
alcanzaba el equilibrio.
El flujo requerido para un TRH=20 horas fue de un litro por hora, y se calcul de acuerdo
a la siguiente ecuacin (Perry y Green, 1992):
Q= V / TRH
Donde:
Q= flujo o caudal
V= Volumen til (20 l)
TRH= Tiempo de Retencin Hidrulica (20 hrs)
Las bombas estuvieron conectadas a depsitos de alimentacin de 150 litros, conteniendo

medio sinttico Hutner modificado 1/10 sin EDTA y sin K2HPO4, conteniendo diferentes
concentraciones de plomo (mg/l) dependiendo del experimento. Adems, para cada
concentracin se cont con un control que contena el medio con metal pero sin biomasa de S.
minima, con el fin de evaluar la posible precipitacin u adsorcin del metal a las paredes de las
lagunas.
En consideracin a que los experimentos tuvieron una duracin de 52 horas, fue necesario
reponer la solucin de medio Hutner modificado con plomo en los depsitos de alimentacin.
Desafortunadamente, en algunos casos, la concentracin de plomo no fue exactamente la misma
que en la primera alimentacin. En la seccin de resultados, se presenta la concentracin
promedio de plomo, resultado de 2 o hasta 3 cambios en el depsito de alimentacin.
29
4.6 Monitoreo
4.6.1 Experimento en sistema por lote con plomo

- Al inicio del experimento, es decir antes de adicionar la planta al medio con plomo, se
tomaron las muestras correspondientes al tiempo cero (triplicados de 20 ml de medio), para
determinar la concentracin promedio de cada unidad experimental.
- Se determin la concentracin de Lyngbya sp., as como el pH y la clorofila a los tiempos 0, 5,
6 y 7hrs, de cada unidad experimental.
- La concentracin de plomo en la columna de agua se determin con triplicados de 20 ml de
medio a los tiempos 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 24 hrs.
- Al final del experimento (tiempo 24 horas), la biomasa de cada unidad experimental se
recolect y se lav con 150 ml de EDTA, cuidando que la relacin entre la concentracin de
EDTA y de plomo fuera 12. Posteriormente la biomasa se lav con 400 ml de agua
desionizada. De dichos lavados, se tomaron 20 ml de medio para determinar el plomo
adherido a la superficie de la biomasa.
- En el caso de la microalga, al final del experimento se separ la microalga del medio,
eliminando el exceso de medio por decantacin y filtrando a la microalga sobre papel filtro
Whatman No. 4 previamente ajustado a peso constante. Posteriormente, se realizaron los
lavados siguiendo la misma metodologa que se us para la biomasa de S. minima, utilizando
un menor volumen de EDTA y agua desionizada (150 y 100 ml respectivamente). De estos
lavados se tomaron 20 ml de muestra por triplicados.
- Nota: Todas las muestras de medio fueron tomadas con una pipeta automtica de 5 ml y
preservadas en frascos de plstico de 30 ml de capacidad.
4.6.2 Experimento para determinar la acidez carboxlica en S. minima

La determinacin de la cantidad de grupos carboxilo, se realiz de acuerdo a la tcnica
para la cuantificacin de acidez carboxlica (Prado et al., 1999) anteriormente descrita. La
determinacin se hizo por triplicado diariamente durante 7 das a la misma hora.
- El pH se ajust diariamente a 6 + 0.2 a la misma hora (11 am), para que ste no fuera una
variable ms.
30
- Se monitore la temperatura y la intensidad luminosa durante 7 das a tres diferentes horas

para obtener un promedio por da (10:00, 14:00 y 17:00 horas).
4.6.3 Experimentos en sistema continuo:

- Para cada experimento, se monitore la intensidad luminosa y la temperatura de la planta
piloto de fitorremediacin a tres diferentes horas del da (10:00a.m, 14:00 p.m y 17:00p.m)
durante todo el experimento para obtener un promedio de cada variable.
- A lo largo de los experimentos S. minima se expuso a diferentes concentraciones de plomo
(CPb), en un rango de 0.58 a 27.58 mgPb/l. Asimismo, la planta se expuso a diferentes
intensidades luminosas y temperaturas en rangos de 109 a 810 molm-2s-1 y 23.44 a 32.26C
respectivamente.
- La concentracin del metal remanente en la columna de agua, as como el pH, se determinaron
muestreando cada dos horas durante las primeras 8 horas y posteriormente cada 4 horas, hasta
un total de 52 horas. Las muestras fueron tomadas con una pipeta automtica de 5 ml a la
salida de las lagunas. Slo se tomaron muestras en la entrada de las lagunas a los tiempos 0,
20 y 44 horas para obtener una concentracin promedio, ya que el recipiente que alimentaba a
las lagunas con medio, se le colocaba nuevo medio cuando este se vaciaba.
Nota: Todas las muestras de medio fueron tomadas con una pipeta automtica de 5 ml y
preservadas en frascos de plstico de 30 ml de capacidad.
- Al inicio y al final de cada experimento se tomaron fotografas de la biomasa de S. minima
para observar los posibles cambios de la apariencia de la biomasa (frondas y races).
Al final de cada experimento la biomasa se recolect de cada laguna con una coladera de plstico
y dejndola escurrir durante 5 minutos, posteriormente se coloc la biomasa en papel filtro de
poro medio doblado por la mitad durante 15 minutos para absorber el exceso de medio. Se pes
toda la biomasa para obtener el peso fresco total. Una vez obtenido el peso fresco, se tomaron 20
gbh para ser lavada con EDTA y agua desionizada al igual que en el experimento en sistema por
lote, y de igual manera se tomaron 20 ml de muestra por triplicados de cada lavado.
31
Posteriormente, la biomasa se sec en una estufa a 45C hasta obtener su peso constante y se
digiri de acuerdo a Olgun et al. (2005).
- Al final de los experimentos se realiz un conteo de frondas daadas de S. minima para observar
el posible dao superficial que la biomasa presentara al estar expuesta a las diversas
concentraciones de plomo. Para ello, se tom como base la gua para diferenciar daos en las
frondas de S. minima expuesta a plomo (Anexo 2).
4.7 Cuantificacin de plomo en la fase lquida.
El anlisis y cuantificacin de Pb se realiz por un mtodo espectrofotomtrico de acuerdo a

Clesceri y colaboradores (1998), utilizando un espectrofotmetro de absorcin atmica (EAA) de
aspiracin directa Back Scientific modo 210 VGP, usando flama de aire-acetileno, lmpara de
Pb; A=283.2 nm y lmpara correctora de deuterio. El lmite de deteccin del equipo es de 0.l
ppm, y el lmite de cuantificacin 0.5 ppm. Las muestras, en caso necesario, fueron diluidas para
quedar dentro del rango ptimo de calibracin.
Curva estndar de plomo:

a) A partir de la solucin Stock estandarizada (Aldrich TM atomic adsoption Standards, 1000
mg Pb/l) se preparan soluciones en un intervalo de concentraciones de 1 a 20 mgPb/l,
utilizando una solucin de cido ntrico grado ultra puro Ultrex-II (1.5ml/l) en agua
desionizada.
b)
Se calibra el equipo con las soluciones preparadas, para obtener una curva de calibracin
con un coeficiente de regresin lineal r2=O.9996 o superior.
c)
Posteriormente, se leen regularmente (cada 15 muestras) los estndares, para confirmar la

calibracin y la estabilidad del equipo.
Observaciones: Todo el material a utilizarse se lav como se indica a continuacin:

a) Extrn libre de fosfatos (sol. al 2% v/v en agua tibia) durante 1 hora.
b) Posteriormente, se enjuag con abundante agua destilada.
32
c) Se coloc el material en acido ntrico GR (sol. Al 10% en agua destilada) durante 12 horas.
d) Por ltimo, se enjuaga nuevamente con agua destilada.
Equipo de seguridad: Se utiliz el equipo de seguridad adecuado (mascarilla contra vapores y

gases cidos, guantes resistentes a cido, gafas de proteccin) y se trabajo bajo la campana de
extraccin de humos.
4.8 Factores de Bioconcentracin (FBC), de Adsorcin (FAD) y Acumulacin Intracelular

(FAI)
Con el objeto de poder cuantificar la concentracin de plomo (CPb) acumulada
intracelularmente y adsorbida a la superficie de S. minima y de Lyngbya sp., se procedi a
realizar lavados con EDTA con el siguiente procedimiento de acuerdo a Olgun y colaboradores
(2005a):
a) Se removi la biomasa de cada unidad experimental y se coloc en un matraz Erlenmeyer de
250 ml conteniendo 150 ml de una solucin de EDTA con una relacin molar EDTA/Pb = 12.
b) Posteriormente se colocaron los matraces en un agitador orbital a 200 rpm durante 1 hora, al
finalizar este tiempo se retir la biomasa y se pas a otro matraz Erlenmeyer de 500 ml
conteniendo 400 ml de agua desionizada. Se agit suavemente para quitar restos de la
solucin de EDTA.
c) Se sac la biomasa y se dej escurrir por 15 minutos sobre papel filtro doblado por la mitad
para absorber el exceso de agua.
d) Se pes la biomasa para determinar el peso fresco. Esto se realiz en frascos de plstico los
cuales haban sido pesados previamente. El peso seco se determin secando la planta dentro
de la cmara de 25C colocando los frascos con las muestras de manera horizontal y sin la
tapa.
e) Se tomaron muestras de la solucin de EDTA y agua desionizada despus de cada lavado de
la biomasa. ** Esta concentracin corresponde a una relacin molar de EDTA/Pb igual a 12
(Noraho y Gaur, 1996.
33
A continuacin, se realiz el mtodo de digestin modificado de acuerdo al Standard

Methods (1998), para lo que se pesaron 0.05g de muestra seca y se colocaron en tubos del
digestor AIM 500-C a los cuales se les adicion 10 ml de HNO3 concentrado (grado reactivo) y
se dejaron reposar toda la noche.
Despus de 24 horas, se digirieron las muestras a una temperatura de 150C durante 60

minutos hasta desaparicin de vapores pardos, con esta temperatura estos vapores desaparecen a
los 15 minutos de la digestin.
Se agreg HNO3 hasta que la muestra se aclar. Las muestras digeridas fueron diluidas al
volumen adecuado con agua desionizada (50 ml). Posteriormente, las muestras fueron ledas en
un espectrofotmetro de absorcin atmica (EAA) de aspiracin directa Back Scientific modo
210 VGP
Por ltimo, se calcularon los Factores de Acumulacin Intracelular (FAI) y de Adsorcin

(FAD), de acuerdo a Snchez-Galvn y colaboradores (2008), utilizando las siguientes frmulas:
FAI= Concentracin del metal acumulado intracelularmente en el tejido de S. minima (mg/kg)

Concentracin promedio del metal en el medio acuoso (mg/l)
FAD= Concentracin del metal adsorbido en la superficie de S. minima (mg/kg)

Concentracin promedio del metal en el medio acuoso (mg/l)
El Factor de Bioconcentracin (FBC), fue calculado de acuerdo a Zayed y colaboradores (1998):
FBC= Concentracin del elemento traza en el tejido de la planta cosechada (mg/kg)

Concentracin promedio del elemento en la solucin (mg/l)
34
4.9 Porcentaje de Remocin:
El porcentaje de remocin se calcul de acuerdo a la siguiente frmula:
% Remocin= Ci - Cf * 100
Ci
Donde:
Ci= Concentracin inicial (mg/l)
Cf= Concentracin final (mg/l)
4.10 Plomo adsorbido y acumulado en la biomasa de S. minima
-El plomo adsorbido a la superficie de S. minima se calcul de acuerdo a la siguiente ecuacin:
mg Pb adsorbidos/kg biomasa= (mg Pb en 0.15 l EDTA + mg Pb en 0.40 l de H2O

desionizada) *1000 * peso biomasa seca (gps)
-El plomo acumulado intracelularmente a la biomasa de S. minima se calculo de acuerdo a la
siguiente ecuacin:
mg Pb acumulados/kg biomasa= (mg Pb en biomasa lavada total seca) *1000

peso biomasa seca
4.11 Anlisis de datos:
Todos los resultados, fueron analizados usando pruebas de ANOVA de una y dos vas
dependiendo del caso. El anlisis estadstico fue desarrollado usando el programa SIGMA STAT
(Versin 3.0, 2003) a un nivel de significacin p<0.05.
35
4.12 Estrategias experimentales

4.12.1 Estrategia experimental-sistema por lote
En el siguiente diagrama se muestra la estrategia que se sigui para realizar el experimento en sistema por lote
Inculo de 6 das de S. minima en medio Hutner preparado con agua de la llave con Lyngbya sp.
Medio Hutner preparado con agua desionizada, sin EDTA ni K2HPO4 a pH= 6.0
Control 1
Medio Hutner
(preparado con
agua desionizada)
y Pb2+
Control 2
Medio Hutner
(preparado con agua
destilada) y Pb2+
To, primero se tom muestra del

medio con Pb2+ y posteriormente se
coloc la biomasa.
Biomasa sin lavar

(planta + microalga
+ Pb
Biomasa lavada
(5 min)
(planta + Pb)
Medio con
microalga
+ Pb
Determinar Pb2+ y pH en el medio acuoso al tiempo 0,

0.5, 1, 2, 4, 8 y 24 hrs. En cada laguna.
A las 24 horas, se lav toda la biomasa fresca con 150 ml de EDTA, durante 1 hora de agitacin en el agitador orbital a
200 rpm. En el caso de la microalga, se realiz lo mismo pero al final se filtr y lav la microalga sobre el papel filtro.
Lavar la biomasa con 400 ml de agua desionizada
Separar la biomasa
Dejar secar la biomasa
por a1545C
minutos
filtro y pesar
Secar la biomasa
hastasobre
peso papel
constante.
35
Clculo de % de Remocin, FAI,

FAD, FBC.
4.12.2 Estrategia experimental-sistema continuo
En el siguiente diagrama se muestra la estrategia que se sigui para realizar todos los
experimentos en sistema continuo.
Inculo de S. minima en medio Hutner modificado 1/10 libre de fosfatos y EDTA.

TRH= 20horas
Colocar 104 gbh en cada laguna expuestas a la intensidad y temperatura del invernadero de la
Unidad de Biotecnologa Ambiental.
Control sin biomasa, Slo medio con metal.
Biomasa lavada durante 5 minutos.
Determinar Pb2+ y pH en el medio acuoso al tiempo 0, 2, 4, 6, 8, 20, 22,24, 28,32, 44, 48 y 52.
Al tiempo 52 retirar la biomasa de las lagunas, poner a escurrir en coladeras durante 5 min.
Transcurrido este tiempo colocar la biomasa en papel filtro doblado por la mitad durante 15
min.; posteriormente pesar 20gbh de cada laguna.
Lavar la biomasa con 150 ml de EDTA (en una relacin de 12 respecto a la concentracin de
plomo (CPb); agitar una hora.
Tomar muestras de
los lavados (20 ml)
Digerir 0.05g de biomasa seca y determinar la concentracin de metal en la planta
Anlisis de Datos
36
4.13 Diagrama de flujo de lagunas con S. minima expuestas a medio con Pb2+, operando en sistema continuo
Biomasa de S. minima + Pb2+

3
CONTROL (sin biomasa)
CONTROL (sin biomasa)

3
4
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Recipiente de alimentacin 1 concentracin de metal (mg Pb/l) capacidad de 150 l.

Recipiente de alimentacin 2 concentracin de metal (mg Pb/l) capacidad de 150 l.
Bombas peristlticas para un flujo mnimo de 8ml/min.
Tubera de silicn (15mm de dimetro)*
Lagunas de acrlico (1m * 0.1m *0.5m) con capacidad de 20 l hasta 20 cm de altura.
Recipiente aguas residuales (450 l de capacidad)
37
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
5.1 Determinacin del tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los experimentos en

sistema continuo
En investigaciones previas (Olgun et al., 2005), se demostr que S. minima present una
microalga adherida a sus pseudo-races, la cual fue identificada como Lyngbya sp. Adems, se
realizaron experimentos en sistema por lote, comparando la capacidad de remocin de plomo por
dos tipos de biomasa de S. minima (lavada y sin lavar) y Lyngbya sola cultivadas en medio
Hutner. Los resultados mostraron que la presencia de Lyngbya sp., no contribuy de manera
significativa a la remocin de plomo.
En consideracin a que en los experimentos en sistemas continuos la cantidad de biomasa

de S. minima a utilizar es mucho mayor que en el caso de los experimentos previos en lote (108
gbh vs 20 gbh), se realizaron experimentos orientados a determinar la influencia de Lyngbya sp
sobre el tipo de biomasa de S. minima a utilizar, es decir con microalgas del gnero Lyngbya sp
(sin lavar) o sin microalgas (lavada). En estos experimentos, se cuantific la concentracin de la
microalga adherida a la biomasa de S. minima. Para tener una visin ms amplia del proceso de
remocin del metal, se calcularon el Factor de Adsorcin (FAD) y el Factor de Acumulacin
Intracelular (FAI), as como el Factor de Bioconcentracin (FBC=FAD + FAI).
En relacin a la cintica de remocin de plomo en los tres tipos de biomasas (Figura 3),
se observ que Lyngbya sp. tiene una capacidad de remocin muy alta durante la primera hora de
exposicin al plomo. Despus de la primera hora se observ un incremento en la concentracin
de plomo en la columna de agua, la cual se debi a una posible desorcin del metal.
Posteriormente el sistema se estabiliz alrededor del 60% de remocin durante el resto del
perodo experimental. Por el contrario, el porcentaje de remocin en el caso de los dos tipos de
biomasa de S. minima, aument gradualmente y alcanz su mximo a las 8 horas (72.56%
biomasa sin lavar y 76.93% biomasa lavada). Posteriormente, se estabiliz aproximadamente en
un 80% de remocin. No se encontraron diferencias significativas entre los dos tipos de biomasa
38
de S. minima (lavada y no lavada) despus de 24 horas. Ambas biomasas de S. minima mostraron

porcentajes de remocin significativamente mayores (p<0.05) que Lyngbya sp. (80 % vs 60%).
Por otro lado, el control que contena slo metal preparado con agua desionizada mostr
una ligera remocin; la posible causa es que el plomo se haya precipitado o porque se qued
adherido a las paredes del contenedor.
Figura 3. Cintica de remocin de Pb2+ por S. minima y Lyngbya sp. en medio Hutner
modificado 1/10 con CPb de 12.59 + 0.04 mg Pb/l
en condiciones controladas de
temperatura e intensidad luminosa de 25 + 2C y 105 molm-2s-1, respectivamente, y

pH=6 + 0.02.
Los resultados de este trabajo son similares a los reportados por Olgun y colaboradores
(2005a), quienes observaron una remocin de 89.7% de Pb2+ en slo 24 horas, cuando biomasa
de S. minima fue expuesta a una concentracin relativamente alta de 11.77 mgPb/l en sistemas
por lote.
Khosravi y colaboradores (2005) estudiaron la remocin de plomo por Azolla filiculoides

en sistemas por lote, utilizando una concentracin inicial de 4 mg Pb/l. Despus de 15 das, se
39
observ una remocin del 61% del plomo. En este trabajo, S. minima alcanz una remocin
mxima de aproximadamente un 80% (promedio de biomasa lavada y sin lavar) despus de 24
horas, siendo la CPb, tres veces ms alta (12.59 + 0.04 mg Pb/l) que la CPb evaluada por Khosravi
y colaboradores (2005).
Por otro lado, se ha demostrado (Miretzky et al., 2004) que Pistia stratiotes mostr una
remocin de plomo del 85 % despus de 24 hrs, cuando fue expuesta a una concentracin de
plomo mucho menor que la probada en este experimento (4mg Pb/l), cabe sealar que en la
solucin haba la presencia de otros metales, es decir que Pistia stratiotes se expuso a un sistema
multimetal. Por lo anterior, se puede mencionar que S. minima es ms eficiente que Azolla
filiculoides y que Pistia stratiotes para la remocin de plomo en sistemas por lote, en presencia
de altas concentraciones iniciales de este metal.
La biomasa de Lyngbya sola registr el mayor porcentaje de remocin en el menor

tiempo. Estos resultados son similares a los reportados previamente por Olgun y colaboradores
(2005c). Esto se puede explicar debido a que las algas tienen grandes reas superficiales, poseen
alta tolerancia a metales pesados y adems poseen una alta capacidad para remover este tipo de
contaminantes. Adems, las paredes celulares de las algas juegan un papel importante en este
proceso, gracias a los grupos funcionales que se encuentran presentes es estas, tales como
carboxilos, fosfatos, hidroxilos, amino, sufuros, tioles, etc. (Holan y Volesky, 1994).
Con el objeto de cuantificar la concentracin de Lyngbya asociada a S. minima, se

determin la concentracin de clorofila (g/l) a los dos tipos de biomasa de la planta, as como a
la microalga sola al inicio y al final de este experimento. La Tabla 4 muestra que el contenido de
Lyngbya sp. disminuy despus de 5 min de lavado. Sin embargo, la diferencia entre la biomasa
lavada y sin lavar de S. minima, no es significativa.
Al final del experimento (24 horas), en ninguna de las biomasas se encontr presencia de
clorofila, debido a que al estar en presencia del metal y removerlo, la biomasa de Lyngbya sp.
pudo haberse lisado. Se ha reportado que la acumulacin de metales pesados es responsable del
40
decremento parcial o total de la concentracin de clorofila (Abdel-Basset et al., 1995; Manios et

al., 2003).
Tabla 4. Concentracin de clorofila presente en biomasa de S. minima y Lyngbya sp. en medio
Hutner modificado 1/10 con CPb de 12.59 + 0.04 mg Pb/l
Tipo de biomasa
Concentracin de clorofila (g/l)

0 horas
24 horas
S. minima sin lavar
505.2 + 280.64
S. minima lavada
284.1 + 265.50
Lyngbya sp.
473.6 + 48.22
Posteriormente, se procedi a realizar el clculo de los factores de acumulacin

intracelular (FAI) y de adsorcin (FAD), de acuerdo a Snchez y colaboradores (2008), as como
el factor de bioconcentracin (FBC) calculado de acuerdo a Zayed y colaboradores (1998) (Tabla
5). Se puede observar que para el caso de los dos tipos de biomasa de S. minima, los valores ms
altos fueron los obtenidos para el Factor de Adsorcin (FAD), alcanzando valores de 1485+64 y
1633 + 166 para la biomasa sin lavar y lavada, respectivamente.
No se encontraron diferencias significativas entre dichos factores. Por el contrario, para el

caso de Lyngbya sp., el FAI fue significativamente mayor (p< 0.05) que el FAD, alcanzando un
valor de 6621.27 + 1418.16, el cual es aproximadamente ocho veces mayor que los obtenidos por
las biomasas de S. minima. Adems, el FAD reportado para la microalga fue significativamente
mayor (p< 0.05) que los reportados para S. minima.
Tabla 5. Factor de Acumulacin Intracelular (FAI), Factor de Adsorcin (FAD) y Factor de

Bioconcentracin (FBC) de dos tipos de biomasa de S. minima y Lyngbya sp. en medio
Hutner modificado 1/10 con CPb de 12.59 + 0.04 mg Pb/l.
Tipo de biomasa
S. minima sin lavar
S. minima lavada
Lyngbya sp. sola
FAI
FAD
FBC
812.5 + 13
775.18 + 28
6621.27 + 1418.16
1485 + 64
1633 + 166
4689.25 + 1647.73
2297.56 + 52.05
2408.21 + 188.23
11,491.22 + 1517.05
41
El promedio de FBC para los dos tipos de biomasa de S. minima alcanz un valor de
2,352.88; estos resultados son similares a los reportados por Olgun y colaboradores (2005a) en
donde observaron valores de FBC similares, en el orden de 2000 en sistemas por lote.
Adems, con los resultados anteriores se confirma que en sistemas por lote la adsorcin
es el mecanismo predominante para S. minima (Olgun et al., 2005), debido posiblemente a las
caractersticas que presenta este helecho acutico, las cuales favorecen el mecanismo de
adsorcin, tales como tener un rea superficial muy alta as como una elevada concentracin de
grupos carboxilo (Snchez-Galvn et al., 2008).
Por otro lado,
el mecanismo predominante para Lyngbya sp. fue la acumulacin
intracelular, debido posiblemente a que al estar la microalga sola tiene ms superficie disponible
para la acumulacin as como para la adsorcin del metal. Se sabe adems, que los iones
metlicos son adsorbidos a la superficie de las clulas por las interacciones entre los iones
metlicos y algunos grupos funcionales metlicos tales carboxilos, fosfatos, hidroxilos, amino,
tioles, etc., los cuales se encuentran presentes en las paredes celulares. Se ha demostrado que la
acumulacin de metales pesados en las algas, induce la sntesis de fitoquelatinas (Gekeler et al.
1988), las cuales se unen a los metales pesados con gran afinidad y favorecen los incrementos en
la acumulacin de los metales. En otros estudios, Howe y Merchant (1992) reportaron un
incremento en el contenido de glutatin de la microalga Chlamydomonas al estar expuesta a
mercurio. Asimismo, Tsuji et al. (2003) mostraron que Dunaliella tertioleca tiene un alto
contenido de fitoquelatinas, a lo cual se le atribuye la capacidad para hiperacumular Zn y Cd.
En consideracin a la posibilidad de que Lyngbya sp. pueda presentar un alto contenido

de fitoquelatinas que expliquen su alta capacidad para acumular Pb, se recomienda que se
investigue este factor en futuros trabajos.
De acuerdo a los resultados obtenidos en este experimento, y al observar que no hubo

diferencias significativas de la remocin de plomo entre la biomasa lavada y sin lavar, se decidi
utilizar biomasa de S. minima lavada, para todos los experimentos en sistema continuo.
42
5.2 Experimentos en sistemas continuos
5.2.1 Condiciones ambientales
Una vez que se determin que era ms adecuado utilizar biomasa de S. minima lavada, se
procedi a iniciar los experimentos en sistemas continuos expuestos a condiciones ambientales
diversas dentro de un invernadero.
La Tabla 6 muestra las condiciones ambientales de todos los experimentos. Para cada
intensidad luminosa promedio empleada, se reporta una temperatura promedio asociada a esta
condicin experimental.
De acuerdo a lo anterior, los experimentos realizados se agruparon de acuerdo a la

intensidad y temperatura: baja, media y alta.
Tabla 6. CONDICIONES AMBIENTALES PARA DIFERENTES GRUPOS DE

EXPERIMENTOS
GRUPO
GRUPO 1
BAJA
GRUPO 2
MEDIA
GRUPO 3
ALTA
INTENSIDAD
TEMPERATURA
PROMEDIO
LUMINOSA (I.L.)
(TEMP.)
I.L. /TEMP.
(molm-2s-1)
(C)
(molm-2s-1 / C)
109
24.6
151
23.6
160
23.44
422
24.5
422 / 24.5
650
25.33
650 / 25.33
810
32.26
810 / 32.26
43
140 / 23.88
5.2.2 Porcentaje de remocin de Pb2+ por S. minima

Al final de los experimentos (52 horas), se calcularon los porcentajes de remocin de Pb2+ por S.
minima para todos los experimentos a las diferentes condiciones ambientales probadas (Figura 4).
140/23.88
422/24.5
650/25.33
810/32.26
Figura 4. Porcentajes de remocin de plomo por S. minima bajo diferentes condiciones

ambientales probadas y a diferentes concentraciones promedio de plomo.
El mximo valor del porcentaje de remocin se observ en el grupo de experimentos

dentro del rango de I.L. y temperaturas bajas (109-160 molm-2s-1), cuando se prob una CPb
de plomo tambin baja (1.24 + 0.38 mg Pb/l), alcanzando un punto mximo de remocin de
77.68%. Por otro lado, dentro de este mismo grupo (140 molm-2s-1), se observ el mnimo valor
de porcentaje de remocin (19.62%) cuando la biomasa de S. minima se encontraba expuesta a la
mxima concentracin probada (24.29 + 6.86 mgPb/l) dentro de este grupo de experimentos.
Para el resto de las condiciones probadas de luz/temperatura (Grupo 2 y 3), se observ la

misma tendencia que en el grupo anterior, es decir, que a medida que increment la
44
concentracin
del metal, se redujo el porcentaje de remocin, independientemente de las
condiciones ambientales probadas.
Para el caso de los experimentos realizados con concentraciones promedio de plomo

semejantes (4.9 + 0.27 y 12.87+ 1.3 mgPb/l), los cuales estuvieron expuestos a dos diferentes
intensidades luminosas (140 y 650 molm-2s-1) y temperaturas (23.44 y 25.33 C), se observa
(Figura 4) que a la menor intensidad luminosa y temperatura, los porcentajes de remocin fueron
significativamente mayores (p<0.05), alcanzando valores de aproximadamente 56% para las dos
concentraciones probadas, en comparacin a los resultados obtenidos a una intensidad luminosa
de 650 molm-2s-1 (49.37 y 25.58% para una CPb baja y una CPb alta, respectivamente).
Por otro lado, cuando se experiment a la intensidad luminosa y temperaturas ms alta
(810 molm-2s-1/ 32.26 C) y se evalu la remocin de dos diferentes concentraciones promedio
de plomo (3.22 y 10.56 mgPb/l), se observ que los porcentajes de remocin finales fueron
significativamente ms altos (p<0.05) que los obtenidos para el resto de las concentraciones
(excepto a la CPb= 1.24mg/l), alcanzando valores de hasta 72.28 y 61.30%, respectivamente.
Los resultados anteriores sugieren, que para el manejo de este sistema a una escala mayor,
se deber atender con mucho cuidado el nivel de concentracin promedio de plomo con la que se
est tratando, ya que, en caso de que la CPb estuviera en concentraciones relativamente bajas es
posible que se puedan obtener mejores porcentajes de remocin, independientemente de las
condiciones ambientales a las que se exponga la planta.
5.2.3 Factores de acumulacin intracelular, adsorcin y bioconcentracin de Pb2+ en S.

minima al final del tiempo experimental
El porcentaje de plomo removido es slo un amplio parmetro para conocer la capacidad

de remocin de S. minima. El uso complementario de los Factores de Bioconcentracin (FBC),
as como los FAD y FAI (Snchez et al., 2008) y el anlisis de compartamentalizacin nos
45
ofrecen una visin ms amplia en el proceso de remocin de los metales (Olgun et al., 2005).
Dichos factores se calcularon en este trabajo al final del tiempo experimental (52 horas).
Las aguas residuales estn caracterizadas por variaciones substanciales en el pH y pueden

tener diferentes iones de metales pesados a diversos rangos de concentraciones. Adems, la
acumulacin de metales por plantas acuticas est influenciada por varios factores, tales como
temperatura, pH y luz (Greger, 1999; Blaylock y Huang, 2000). Por lo anterior, es de esperarse
variaciones en los resultados de los FAD, FAI y FBC, ya que en este trabajo se realizaron
diversos experimentos en condiciones exteriores, lo que determin la intensidad luminosa y
temperatura de cada experimento (Tabla 6).
En esta seccin se presentan los resultados que se obtuvieron posteriormente a la cosecha

de la biomasa y lavado con EDTA, para realizar anlisis de compartamentalizacin y el clculo
de los Factores FAD, FAI y FBC.
En la Figura 5, se puede observar que para el caso de la primer intensidad luminosa

probada (109 molm-2s-1) del grupo 1 de experimentos, y cuando la biomasa de S. minima estuvo
expuesta a una CPb= 1.24 + 0.38 mg Pb/l, el FAI fue significativamente ms alto que el FAD
(5,715.05 + 1,699.66 vs 2,581.58 + 194.8) (p<0.05).
Figura 5. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb = 1.24

+ 0.38 mg Pb/l, I.L.=109 molm-2s-1 y temperatura de 24.6 C.
46
El valor de FBC al final del tiempo experimental (52 horas) fue de 8,296.63 + 1,656.6. En
un reciente trabajo (Uysal y Taner, 2009), probaron la capacidad de Lemna minor para remover
plomo en sistema por lote, a diferentes valores de pH y temperatura, en presencia de diferentes
concentraciones del metal (0.1-10.0 mg Pb/l).
Cuando probaron una CPb de 1 mgPb/l a una temperatura de 25C se observ que el valor
de FBC para Lemna minor fue de 1,985, el cual fue mucho menor que el obtenido en este trabajo
bajo condiciones similares. Estos datos indican que S. minima tiene mayor capacidad para
remover plomo que Lemna minor en condiciones relativamente semejantes de CPb y temperatura
(1.24 mg Pb/l y 24.6C vs 1 mgPb/l y 25C).
Posteriormente, al incrementarse un poco la intensidad luminosa (151molm-2s-1), y cuando
S. minima estuvo expuesta a una concentracin del metal muy alta respecto a la probada en el
caso anterior (24.29 + 6.86 mg Pb/l) (Figura 6), se observ un valor significativamente ms alto
(p<0.05) para el FAD en comparacin al FAI (2,148.90 + 402.06 vs 1,262.52 + 58.14), al
contrario que en el caso anterior. Predomin significativamente (p<0.05) el mecanismo de
adsorcin sobre la acumulacin intracelular para estas condiciones experimentales.

47
Por otro lado, cuando se realiz un experimento a una I.L. de 160 molm-2s-1, y se
evaluaron dos concentraciones de plomo (4.94 + 0.8 y 12.98 + 0.6 mgPb/l), se observ la misma
tendencia que en el caso anterior, es decir, el FAD result mayor que el FAI (Figura 7 y 8).
Adems, bajo esta ltima intensidad luminosa, se observ el mximo valor de FAD del grupo 1
de experimentos, obtenindose un valor de 4,112.19 + 240.86, cuando la planta estuvo expuesta
a una concentracin de plomo relativamente pequea (4.94 + 0.8 mgPb/l). En estas condiciones
de luz y temperatura predomin notablemente la capacidad que tiene S. minima para adsorber
plomo a su superficie.
En un reciente trabajo, Snchez y colaboradores (2008), evaluaron la capacidad de S.

minima para hiperacumular plomo en un sistema por lote. Al exponer la biomasa de la planta a
una CPb relativamente similar que la de ste caso (4.7 + 0.06 mgPb/l), y a una intensidad
luminosa de 116 molm-2s-1 y temperatura de 25C, se observ un valor de FAD menor que el
obtenido en el presente trabajo (1,500 vs 4,112.19).
Figura 7. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb = 4.94 +

0.8mg Pb/l, I.L.=160 molm-2s-1 y temperatura de 23.44 C.
48

Para el caso de la primer I.L. (650 molm-2s-1) del grupo 2 de experimentos, se observaron
los mximos valores obtenidos de FAD (p<0.05), cuando se probaron dos concentraciones
promedio de plomo una media y una alta (4.9 + 0.27 y 12.87 + 1.3mg Pb/l), obtenindose valores
de 7,212.34 + 589.51 y de 8,478.71 + 575.14, respectivamente (Figuras 9 y 10).
Figura 9. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb = 4.9 +

0.27 mg Pb/l, I.L.=650molm-2s-1 y temperatura de 25.33 C.
49
Figura 10. FAI, FAD y FBC en S. minima expuesta a una CPb =

12.87+ 1.3mg Pb/l, I.L.=650molm-2s-1 y temperatura de 25.33 C.
Lo anterior sugiere, que existe un efecto de la intensidad luminosa y la temperatura sobre el

valor de FAD, ya que stos valores incrementaron notablemente en comparacin a los obtenidos
anteriormente (Figuras 7 y 8), en donde las concentraciones del metal fueron similares a las
probadas en este caso, y solamente increment la I.L. y temperatura (160 molm-2s-1/23.44 C vs
650molm-2s-1/25.33 C). Por lo anterior, se puede mencionar que el mecanismo de adsorcin a
la superficie de la planta, predomina notablemente cuando la planta se encuentra expuesta a un
ptimo de I.L./Temp., que para el presente trabajo se encontr en el grupo 2 a 650molm-2s-1 y
25.33C.
5.2.4 FAI, FAD y FBC a diferentes tiempos de exposicin de S. minima al plomo
Con el objeto de determinar el efecto que tuvo el tiempo de exposicin al metal sobre los
mecanismos de adsorcin y acumulacin intracelular a la biomasa de S. minima, se decidi
calcular los FAI, FAD y FBC en tiempos intermedios antes de finalizar el experimento. En este
caso, slo se expusieron las plantas a condiciones de luz y temperatura clasificadas como
media y alta.
50
En la figura 11, se pueden observar las diferencias en los factores anteriormente descritos,
entre el tiempo 44 horas y el tiempo 52 horas, cuando la biomasa de S. minima se encontr
expuesta a una I.L. media (422 molm-2s-1) y una concentracin del metal muy baja (CPb =
0.58 + 0.21mg Pb/l) y a una temperatura de 24.5C. En el tiempo 44 horas se observ que no
hubo diferencias significativas entre los valores de FAD y FAI (3,032.29 + 394 vs 2,829.21 +
518). Posteriormente, al final del experimento (52 horas), el valor del FAI se increment en gran
medida a casi el triple del valor del FAD y ste ltimo disminuy en comparacin al tiempo 44
horas. Posiblemente a bajas concentraciones, como se observ para el caso de CPb= 1.24 + 0.38
mg Pb/l (Figura 5), el mecanismo de acumulacin intracelular se vea favorecido
independientemente de las condiciones de luz y temperatura.
Figura 11. FAI, FAD y FBC en S. minima a lo largo del tiempo

expuesta a una CPb = 0.58 + 0.21mg Pb/l, I.L.=422 molm-2s-1 y
temperatura de 24.5 C
Respecto al valor de FBC, nuevamente se observ que S. minima mostr un valor ms

alto que el reportado por Uysal y Taner (2009) para Lemna minor cuando sta se expuso a
condiciones relativamente similares, en trminos de concentracin del metal y temperatura (0.5
mgPb/l y 25C) durante 160 horas, reportando un valor de FBC de 1,918, mientras que en el
presente trabajo se obtuvo un valor de 7,096.60 + 1,048.34. Es decir, S. minima tiene capacidad
en trminos de FBC casi cuatro veces mayor que la mostrada por Lemna minor.
51
A estas mismas condiciones de luz y temperatura, cuando se aument la concentracin del

metal hasta 27.58 +1.51 mg Pb/l (Figura 12), se observ el efecto que tuvo el tiempo de muestreo
sobre los factores, obtenindose un valor significativamente mayor (p<0.05) de FAD (3, 628.29 +
12.33), respecto al observado a una concentracin menor (0.58 + 0.21mg Pb/l) al tiempo 44
horas. Sin embargo, al final del experimento (52 horas), se observ una notable reduccin en el
valor del FAD y un ligero aumento en el valor del FAI (2, 461.34 + 264.46 y 1,082.47 + 364.4),
pero sin dejar de predominar el mecanismo de adsorcin.
Figura 12. FAI, FAD y FBC en S. minima a lo largo del tiempo

expuesta a una CPb = 27.58 + 1.51 mg Pb/l, I.L.=422 molm-2s-1 y
temperatura de 24.5 C
En las figuras 11 y 12, los valores de FAI, aumentaron con el tiempo para las dos
concentraciones probadas, observndose los valores ms altos al final del experimento (52
horas). Sin embargo, es importante que el mecanismo de adsorcin slo predomin a la CPb ms
alta (27.58 + 1.51 mg Pb/l).
Cuando se registraron la I.L. y temperatura ms altas (810 molm-2s-1 y 32.26C), se
evaluaron dos diferentes concentraciones promedio de plomo, una baja de 3.22 mgPb/l y una ms
alta de 10.56 mgPb/l (Figura 13 y Figura 14).
52
En la Figura 13, se muestran los resultados de los FAD, FAI y FBC por S. minima a una
CPb=3.22 + 0.27 mg Pb/l, para el caso del FAD. Se observ un incremento significativo (p<0.05)
entre el tiempo 20 y 52 horas obtenindose un valor al final del experimento de 3,901.66 + 95.07.
Figura 13. FAI, FAD y FBC en S. minima a lo largo del tiempo expuesta a
una CPb = 3.22 + 0.27 mg Pb/l, I.L.=810 molm-2s-1 y temperatura de
32.26 C.
En el tiempo 20 horas no se observaron diferencias significativas entre ambos factores

(p<0.05). Sin embargo, al tiempo 44 horas, el valor del FAI increment de manera importante
predominando sobre el mecanismo de adsorcin (5,574.01 + 549.81 vs 3,164.87 + 344.55).
Posteriormente, al finalizar el tiempo experimental (52 horas), el valor del FAI es
significativamente mayor (p<0.05) que el FAD.
Tambin, se observ que entre el tiempo 20 y 44 horas los valores de FAD no fueron
diferentes significativamente (p<0.05), debido posiblemente a que en este tiempo de monitoreo,
el sistema comenzaba a estabilizarse, tomando en cuenta que el TRH fue de 20 horas.
53
Por otro lado, en la Figura 14 se muestran los FAI, FAD y FBC de plomo para S. minima
en tres diferentes tiempos de muestreo (20, 44 y 52 horas) para una CPb=10.56+1.37mgPb/l a
intensidad luminosa y temperatura de 810 molm-2s-1 y 32.26 C, respectivamente.
Se puede observar nuevamente que los valores de FAI son ms altos que los de FAD, a
excepcin del tiempo 44 horas. Sin embargo, es importante resaltar que el valor del FAD fue
disminuyendo a lo largo del tiempo experimental, observndose un decremento importante, en
virtud de que a las 20 horas se tena un valor aproximado de FAD de 7,937.35 + 350 y al final del
experimento se obtuvo un valor aproximado de 3,192.42 + 97.93 Lo anterior se puede explicar
debido posiblemente a que al ser una concentracin relativamente alta, durante las primeras horas
la planta adsorbi ms plomo y posteriormente se satur y comenz a desorber parte del metal a
la columna de agua. Sin embargo, no es fcil explicar porqu este fenmeno de adsorcindesorcin no ocurri a menores intensidades luminosas/temperatura. Para el caso del FAI,
tambin se observ un decremento importante a lo largo del tiempo experimental. Cabe sealar
que no hubo diferencias significativas (p<0.05) entre los valores de FAI de los tiempos 44 y 52
horas. En trminos generales, se observ un decremento importante en la acumulacin del plomo
en la planta, ya que el FBC disminuy considerablemente de 17,300 a 7,000 de 20 a 52 hrs, es
decir que la planta disminuy su capacidad de bioconcentrar plomo al aumentar la concentracin
del metal a estas condiciones de luz y temperatura.
Comparando las Figuras 13 y 14, se puede observar que en los dos ltimos tiempos (44 y
52 horas), los valores de FAI fueron en comparacin a la ms alta (10.56 + 1.37mg Pb/l) probada
bajo estas condiciones. Por lo anterior, se puede mencionar que la biomasa de S. minima presenta
una mejor capacidad de acumular ms cantidad de plomo en su biomasa si la concentracin del
metal se encuentra en este rango de concentracin (3.22 mgPb/l) y si est expuesta a intensidad
luminosa y temperatura altas, como fue el caso de este experimento en donde se alcanzaron
valores promedio de 810 molm-2s-1 y 32.26C, las cuales fueron la mayor I.L./temp. probadas en
este trabajo.
Por lo anterior, se puede mencionar que la biomasa de S. minima presenta una mejor
capacidad de acumular ms cantidad de plomo en su biomasa si la concentracin del metal se
54
encuentra en este rango de concentracin (3.22 mgPb/l) y si est expuesta a intensidad luminosa
y temperatura altas, como fue el caso de este experimento en donde se alcanzaron valores
promedio de 810 molm-2s-1 y 32.26C, las cuales fueron la mayor I.L./temp. probadas en este
trabajo.
CPb = 10.56 + 1.37mg Pb/l, I.L.=810 molm-2s-1 y temperatura de 32.26 C
Al final del tiempo experimental y para estas condiciones experimentales (10.56 + 1.37mg
Pb/l y 32.26 C), se obtuvo un valor de FBC de 7,137.67 + 928, el cual fue mucho mayor que el
reportado por Uysal y Taner (2009) para Lemna minor (862), cuando fue expuesta a 10mgPb/l y
a una temperatura de 30C en sistemas por lote. Comparando este valor con el obtenido en este
trabajo, se puede decir que S. minima es ms eficiente que Lemna minor para la remocin de
plomo en un sistema continuo, en presencia de concentraciones promedio de este metal
relativamente altas. Sin embargo, es importante mencionar que en Uysal y Taner (2009), el Pb no
fue alimentado continuamente a pesar de que el experimento duro 168 hrs, por lo tanto las plantas
no fueron expuestas a las mismos flujos msicos de Pb. Lo interesante es que el FBC en S.
minima no disminuy (7096.60 vs 7137.67) a pesar de que aument la CPb de 0.5 a 10 mgPb/l y
la temperatura de 25 a 30C. En cambio en Lemna minor si disminuy el valor de FBC de 1918
a 862, por lo que se puede decir que S. minima fue ms resistente al aumento de la concentracin
del metal y temperatura.
55
5.2.5. Cambios del valor del FBC de plomo en S. minima en todas las condiciones probadas
En la Figura 15 se muestran los resultados de los FBC promedio para S. minima cuando
estuvo expuesta a diferentes concentraciones promedio de metal y a diferentes condiciones de
FBC
intensidad luminosa/temperatura.
Figura 15. Resumen de los FBC en S. minima expuesta a diferentes concentraciones

de plomo y diferentes intensidades luminosas
El efecto de la intensidad luminosa/temperatura (I.L./temp.) sobre el FBC fue variable

dependiendo del rango de I.L./temp. y de la concentracin de plomo en que se expusieron las
plantas (Figura 15). En un rango llamado bajo (Tabla 6) en el que se realizaron los
experimentos del grupo 1, la concentracin del metal tuvo efecto sobre el FBC, ya que a la menor
CPb de plomo probada se observ el mayor valor de FBC (p<0.05).
El mximo valor del FBC se observ a una CPb de 12.87 + 1.31 mg/l y a una I.L/temp. en
el rango denominado medio (650 molm-2s-1 /25.33C). Cuando la I.L/temp. aument al rango
denimonado alto (810 molm-2s-1 y 32.26C), ya no aument el valor del FBC, a pesar de que
las concentraciones de Pb fueron menores a las probadas anteriormente (3.22 + 0.27 y
10.56 + 1.37mg Pb/l).
56
Uysal y Taner (2009) reportaron que las altas temperaturas pueden causar un efecto de
estrs en las plantas, ya que observaron que hubo un decremento importante en el valor de FBC
por Lemna minor, cuando estuvo expuesta a diferentes concentraciones de plomo y a la mayor
temperatura probada (35C), obtenindo los valores ms altos de FBC a una temperatura de 30C.
Bajo este criterio, se puede mencionar que probablemente stas ltimas condiciones de luz y
temperatura (810 molm-2s-1 y 32.26C respectivamente) causaron en S. minima un efecto de
estrs, por lo que no logr remover tanto metal en su biomasa como el caso en el que la planta
estuvo expuesta a una I.L/temp. media (650 molm-2s-1 /25.33C) y se obtuvieron los valores
ms altos de FBC (9,134.79 + 810 y 11,998.52 + 1,120 a CPb de 4.9 y 12.87 mgPb/l
respectivamente).
Anteriormente, se han observado FBC muy altos para S. minima en el orden de 2000 para
una concentracin de 29.79 + 1.3 mg Pb/l en sistemas por lote (Olgun et al., 2005a) y hasta de
17,000 en sistemas continuos para una concentracin de 4.64mg Pb/l (Olgun y Prez, 2005b).
Por otro lado, Yaowakham y colaboradores (2005) evaluaron los FBC obtenidos en cuatro
macrofitas acaticas (Ceratophyllum demersum, Hygrophila difformis, Cabomba caroliniama y
Ludwigia hyssopifolia), cuando estas fueron expuestas a diferentes concentraciones del metal
(0.1, 1 y 10 mgPb/l) durante 15 das en sistemas por lote a una intensidad luminosa de 387.94
molm-2s-1 y una temperatura de 27C. Los resultados mostraron que existi un decremento
gradual del FBC cuando se incrementaba la concentracin de plomo. H. difformis mostr el
mximo valor de FBC (3480) hasta despus de 9 das de exposicin. Este valor es casi similar al
obtenido por S. minima cuando estuvo expuesta a una concentracin mucho ms alta (24.29 mg
Pb/l). Sin embargo, es importante mencionar que los resultados obtenidos en este trabajo se
calcularon a las 52 horas. C. demersum, mostr tambin valores altos de FBC entre los 6 y 9 das
de exposicin, obteniendo valores de FBC=1621 a 1 mg Pb/l y de FBC=698 cuando estuvo
expuesta a la concentracin ms alta (10 mg Pb/l) (Yaowakham et al., 2005).
En un reciente trabajo, Weiss y colaboradores (2008) probaron la capacidad de tres

macrofitas acuticas para la remocin de diversos metales en un sistema de flujo continuo en
condiciones de invernadero, cuando expusieron las macrofitas a una CPb de plomo de 0.3mg/l
57
obtuvieron valores muy bajos de FBC respecto a los reportados en el presente trabajo. Para
Glyceria grandis se report un FBC=40, para Scirpus validus un FBC=46 y para Spartina
pectinata un FBC=58.
Cabe sealar que en la literatura cientfica no se han encontrado valores de Factores de

Bioconcentracin de plomo tan altos como los reportados en el presente trabajo para sistemas en
continuo, por lo que se puede decir que S. minima sigue mostrando ms eficiencia para la
remocin de plomo, en comparacin a otras macrofitas acuticas.
5.2.6. Bioadsorcin de plomo en mg/kg de biomasa a la superficie de S. minima.

Para tener un dato ms especfico del metal que se adsorbi en relacin al peso de la
biomasa de S. minima, se decidi realizar un nuevo anlisis con los mismos datos, pero ahora
calculando los mg de plomo por cada Kg de biomasa de la planta.
En la Figura 16 se puede observar que para el grupo 1 (140 molm-2s-1), el mnimo valor
obtenido en mg Pb adsorbidos/kg biomasa, fue para la menor concentracin probada dentro de
este grupo de experimentos (1.24 mg Pb/l). Al incrementar la concentracin del metal a 4.9 mg
Pb/l, se obtuvo un valor aproximado de 20,000 mg Pb adsorbidos/kg biomasa.
Cuando se increment la concentracin a 12.98 mg Pb/l, se observ que el plomo

adsorbido a la superficie de S. minima no vari significativamente del resultado anterior (Figura
16). Sin embargo, cuando la concentracin casi se duplic (24.29 mg Pb/l), la planta logr
adsorber la mayor cantidad de plomo en comparacin a las dems concentraciones del Grupo 1,
obteniendo un valor aproximado de 60,000 mg Pb adsorbidos/kg biomasa (p<0.05). El
comportamiento anterior sugiere que a una concentracin mxima de plomo (dentro del rango
probado), ocurre una adsorcin mxima (en trminos de mg Pb/kg biomasa) dentro de este rango
de I.L./temp. que se ha denominado bajo.
58
Figura 16. Plomo adsorbido a la superficie de la biomasa de S. minima (mg

Pb/kg biomasa) a diferentes intensidades luminosas y diferentes concentraciones
promedio de plomo.
Por otro lado, se puede observar que a una intensidad y temperatura medias (422
-2 -1
molm s ) y a la concentracin de metal ms alta probada (27.58 mg Pb/l) dentro de este grupo,
se obtuvo el valor ms alto de adsorcin, alcanzando un valor aproximado de casi 70,000 mg
Pb/kg de biomasa de S. minima.
Se ha reportado que la adsorcin de elementos contaminantes por plantas combina las

ventajas de grandes reas superficiales con la alta afinidad de receptores qumicos (Dushenkof et
al. 1997; Heaton et al. 1998). Adems, Snchez y colaboradores (2008) demostraron que S.
minima tiene una gran superficie especfica (264 m2/g peso seco), lo cual favorece al mecanismo
de adsorcin ya que al tener mayor rea superficial la planta posee una mayor cantidad de sitios
activos disponibles para la bioadsorcin (Tien, 2002).
Para el caso de la otra concentracin probada a esta intensidad luminosa (0.58 mg Pb/l),
se logr adsorber muy poco metal a la superficie de la planta, debido posiblemente a que al ser
una concentracin muy pequea de metal, el plomo se pudo haber adherido en las paredes de las
lagunas o incluso en las mangueras que alimentaban a las mismas y por lo tanto no se logr
59
observar un efecto real de esta concentracin mnima probada. En contraste a lo anterior, para el
segundo caso del Grupo 2 (intensidades y temperaturas medias de 650 molm-2s-1 y 25.33C),
cuando la biomasa de S. minima estuvo expuesta a dos diferentes concentraciones promedio de
plomo (4.9 y 12.87 mg Pb/l) se obtuvieron valores similares entre ellos (aprox. 35,000 y 40,000
mg Pb adsorbidos/kg biomasa, respectivamente).
Para el Grupo 3 de experimentos en donde se registr la mayor intensidad luminosa y

temperaturas probadas (810 molm-2s-1 y 32.26C respectivamente), se observaron valores del
FBC alrededor de los 35,000
mg Pb adsorbidos/kg biomasa, cuando se probaron dos
concentraciones promedio de plomo (3.22 y 10.56 mg Pb/l).
Cabe sealar que los valores del plomo adsorbido a la superficie de S. minima para las dos
concentraciones probadas no son diferentes significativamente entre ellos, lo que puede indicar
que a estas condiciones de luz y temperatura, la concentracin del metal no tenga una relacin
directa con la bioacumulacin de plomo a la planta.
Anteriormente, se ha reportado que la adsorcin de Pb2+ a la superficie de las pseudoraces en ausencia de nutrientes, es un mecanismo rpido y reversible que predomina sobre un
mecanismo ms lento e irreversible de acumulacin en sistemas por lote (Olgun et al, 2004).
Tambin se conoce que la dinmica entre los mecanismos de adsorcin y acumulacin
intracelular, as como la compartamentalizacin del Pb2+ estn afectados por la presencia de
nutrientes y de factores ambientales tales como la intensidad luminosa y la temperatura (Olgun
et al, 2005a).
Desafortunadamente,
no hay reportes en la literatura cientfica que expliquen la
influencia que la intensidad luminosa tiene sobre la adsorcin de plomo a la biomasa de plantas
acuticas en sistemas continuos de fitorremediacin.
60
5.2.7 Acumulacin intracelular de plomo en mg/kg a la biomasa de S. minima

En la Figura 17 se puede observar que para una de las concentraciones de metal ms altas
probadas, (12.87 + 1.31 mg Pb/l), expuesta a una IL= 650 molm-2s-1, la cantidad de plomo en
la biomasa es mucho mayor que a las otras concentraciones de plomo e I.L. probadas, alcanzando
un valor aproximado de 45,000 mg Pb/kg biomasa de S. minima.
Figura 17. Plomo acumulado intracelularmente a la biomasa de S. minima

(mg Pb/kg biomasa), a dos diferentes intensidades luminosas y dos diferentes
concentraciones promedio de plomo.
Se ha reportado que la bioacumulacin de metales depende de numerosos factores

biticos y abiticos, tales como la temperatura, el pH y los iones disueltos en el agua (Lewander
et al., 1996; Demirezen, 2002). Se sabe tambin que la acumulacin (en trminos de adsorcin)
de elementos traza es una combinacin de procesos fisicoqumicos, incluyendo quelacin,
intercambio inico y precipitacin qumica (Maine et al., 2000) y que la presencia de
aminocidos en las plantas parece jugar un papel importante en la adsorcin de los metales
debido a que los grupos amino (NH2) y -carboxilato (COOH) son capaces de quelar
compuestos (Haider et al., 1983). Mishra y colaboradores (2006) reportaron que la produccin de
fitoquelatinas es importante para la detoxificacin de plomo, por Ceratophyllum demersum y que
la concentracin de fitoquelatinas es mayor cuando incrementa la concentracin promedio del
metal.
61
La acumulacin de fitoquelatinas en las plantas ante la presencia de metales pesados, es

uno de los mecanismos ms reportados en la literatura cientfica. Las fitoquelatinas forman
complejos al interior de las clulas, por ejemplo en vacuola y cloroplastos, para reducir el efecto
del deterioro de las clulas por la exposicin a iones metlicos (De-Knecht et al., 1994;
Mendoza-Czatl et al., 2006). El secuestro de metales por glutatin y fitoquelatinas son de los
mecanismos ms conocidos de detoxificacin de Pb2+ en plantas (Sharma y Shanker, 2005).
Olgun y colaboradores, (2002; 2005), as como Hoffmann y colaboradores (2004),

comprobaron la gran capacidad de S. minima para acumular plomo dentro de sus tejidos.
Por otro lado, en un reciente estudio (Estrella-Gmez et al., 2009) expusieron a S. minima
a 40 M Pb (NO3)2 durante 120 horas y evaluaron la relacin entre la acumulacin de Pb2+ y la
activacin del mecanismo de secuestro del metal mediante la produccin de fitoquelatinas. Los
resultados mostraron que en respuesta a la exposicin de plomo, la produccin de fitoquelatinas
se increment ms en las races de S. minima que en las frondas de la misma, observando que
este helecho acuatico acumul mayor concentracin de plomo en las races que en sus frondas.
En resumen, Estrella-Gmez y colaboradores (2009) sugieren que la acumulacin de FQs en S.
minima es una respuesta directa a la acumulacin de Pb y que las FQs participan como uno de los
mecanismos de tolerancia a la presencia de dicho metal. Por lo anterior, la alta capacidad que
presenta S. minima para acumular y/o tolerar altas concentraciones de plomo en sus clulas,
podra estar relacionada a la sintesis de fitoquelatinas.
Tomando en consideracin los resultados tanto de adsorcin como de acumulacin

intracelular de Pb en S. minima, es claro que Salvinia mostr una gran capacidad para adsorber
plomo y que eso depende altamente de la intensidad luminosa y la temperatura en el ambiente.
Adems, es notorio que la concentracin del plomo tambin es un factor que influye en la
adsorcin y la acumulacin de este ion en la biomasa de S. minima. Los valores mximos
observados en adsorcin fueron de 64,216.47 + 6,899.9 mg Pb/kg biomasa seca y un valor
mximo de 45,300 + 8,162.59 mg Pb/kg biomasa para acumulacin intracelular. Cabe sealar
que el mecanismo de adsorcin predomin para la mayora de las concentraciones probadas,
excepto en el rango de 0.58 a 3.22 mg Pb/l.
62
5.2.8 Efecto de la intensidad luminosa sobre la concentracin de grupos carboxilos en la

biomasa de S. minima.
En los resultados obtenidos durante los experimentos en sistema continuo, se observ que
el mecanismo predominante de remocin de plomo fue la adsorcin para la mayora de los casos,
la cual es atribuida a diversos grupos qumicos que se encuentran en la superficie de la planta
(grupos acetamino, grupos de fosfato en cidos nucleicos, amino amido, grupos carboxilo y
sulfihidrilo en protenas e hidroxilos en polisacridos) que pueden atraer y secuestrar iones
metlicos de soluciones acuosas (Holan y Volesky, 1996; Rascon et al, 2000; Stirk et al.,2001;
Volpe et al., 2003).
Tambin se ha reportado que los grupos carboxilo son los principales responsables de
adsorcin de metales, especialmente en las algas caf (Hashim y Chu, 2004; Jalali et al., 2002).
Por lo anterior, se decidi determinar el efecto de las condiciones ambientales sobre el
contenido de acidez carboxlica ya que a ste y a la gran superficie especfica de S.minima se les
han atribuido previamente la gran capacidad de adsorcin de Pb (Snchez-Galvn et al. (2008).
La Figura 18 muestra los resultados de la concentracin de acidez carboxlica en relacin
a la intensidad luminosa/temperatura, en donde claramente se puede observar que estos factores
tienen un efecto sobre la cantidad de grupos carboxilos presentes en la biomasa de S. minima,
despus de 6 das de exposicin al plomo.
La concentracin de acidez carboxlica
en la biomasa al final de 6 das, fue
significativamente mayor (p <0.05) para las plantas que fueron expuestas a una mayor intensidad
luminosa/temperatura (Figura 18 y Tabla 7), en comparacin con las plantas expuestas a niveles
medios o bajos de estos factores.
63
Cmara de crecimiento (133molm-2s-1 y 25C)

Sombra (28 molm-2s-1 y 22C)
PPF (962 molm-2s-1 y 28C)
Figura 18. Acidez carboxlica de S. minima expuesta a diferentes condiciones de intensidad

luminosa y temperatura
Tabla 7. Acidez carboxlica en biomasa de S. minima despus de 6 das

expuesta a diferentes intensidades luminosas/temperaturas.
Intensidad luminosa
(molm-2 s-1)
Temperatura
(C)
Acidez carboxlica
(mmol H+/ g biomasa)
28
22
1.41 + 0.00
133
25
1.79 + 0.01
962
28
2.19 + 0.10
De estos resultados se puede inferir que las intensidades luminosas altas favorecen de
algn modo la formacin de grupos carboxlicos.
64
En este trabajo, S. minima present mayor concentracin de grupos carboxilo en

comparacin a lo reportado por Murphy et al (2007) para el alga marina P. palmata, conteniendo
1.31mmolg_1 de estos radicales, cuando fue expuesta a una temperatura constante de 21 + 1 C,
las condiciones de intensidad luminosa no se reportaron.
En ambientes acuosos, la especiacin de los metales, as como la afinidad de stos iones

para los sitios activos de adsorcin, dependen de algunas caractersticas de las plantas
(concentracin de ligandos), as como del medio acuoso como es el pH, la concentracin del
metal (Elder y Horne, 1978), y la temperatura en el mismo (Lewander et al., 1996; Demirezen,
2002). Es de esperarse que al aumentar la intensidad luminosa, aumente la temperatura en el
ambiente as como en el medio acuoso contenido en las lagunas, lo cual puede influir en la
adsorcin de los iones metlicos.
Por otro lado, Murphy y colaboradores (2007) realizaron un trabajo en donde probaron la
capacidad de adsorcin de Cu2+ de varias algas marinas, a una concentracin inicial de 50 mg/l y
expuestas a una temperatura constante de 21 + 1 C, cuantificando la concentracin de grupos
carboxilo de las mismas en presencia de este metal. Los resultados mostraron que para Fucus
vesiculosus se obtuvo la mayor qmax (0.35mmolg-1) respecto a las otras algas y que esta alga
mostr tener la mayor concentracin de grupos carboxilo (2.44 mmolg-1 biomasa).
Anteriormente, ya se haba reportado que S. minima contiene alta (0.95 mmol H+ g-1)
concentracin de grupos carboxilo (Snchez-Galvn et al., 2008), lo cual favorece la adsorcin
de metales a la superficie de la planta. Sin embargo, no existen reportes o informacin acerca de
la formacin de grupos carboxilo favorecida por la intensidad luminosa o la temperatura en S.
minima o en ninguna otra planta o alga.
Por otra parte, en la literatura cientfica relacionada a la adsorcin de metales, no existen

reportes que expliquen la relacin entre mayores FBC e intensidades luminosas y/o temperaturas.
Por lo anterior, los datos antes discutidos sealan que esta lnea de investigacin aporta
conocimiento nuevo, el cual sugiere que la intensidad luminosa y/o la temperatura son
estimuladores del aumento de los grupos carboxilos y por lo mismo, del aumento de la capacidad
de adsorcin.
65
5.2.9 Porcentaje de frondas daadas de S. minima despus de estar expuesta a diferentes

concentraciones de plomo
Para evaluar el posible efecto del plomo sobre las frondas de S. minima, se realiz un
conteo de stas al tiempo 52 horas. Esto se realiz slo para los ltimos dos experimentos a dos
diferentes intensidades luminosas/temperaturas (422 y 810 molm-2-s-1/ 24.5 y 32.26C), cuando
la planta fue expuesta a 4 concentraciones promedio del metal, (0.58, 3.22, 10.56 y 27.58
mgPb/l). Dicho conteo se realiz trazando cuatro cuadrantes de 25 x 10 cm en las lagunas de
fitorremediacin y tomando como base la gua para diferenciar daos (Anexo 2).
En la Tabla 8 se puede observar que el porcentaje de frondas clorticas, extremadamente

daadas y muertas, fue mnimo, independientemente de la concentracin a la que fue expuesta la
planta. S. minima
no present graves daos en sus frondas a pesar de estar
expuesta a
concentraciones elevadas de plomo (27.58 mg Pb/l), lo que indica que este helecho presenta alta
eficiencia en sus mecanismos de tolerancia al plomo.
66
Tabla 8. Porcentaje de frondas daadas de S. minima expuesta a diferentes CPb e intensidades luminosas en lagunas de
fitorremediacin en sistema continuo, despus de 52 horas.
Int.
CPb
Lum.
Caract. de las
- prom.
(molm
frondas
(mgPb/l)
2 -1
-s )
422
Clorticas
Extremadamente
0.58
Daadas
Muertas
Clorticas
Extremadamente
27.58
Daadas
Muertas
Int.
CPb
Lum.
Caract. de las
prom.
(molmfrondas
(mgPb/l)
2 -1
-s )
Clorticas
Extremadamente
3.22
Daadas
Muertas
810
Clorticas
Extremadamente
10.56
Daadas
Muertas
Porcentaje de frondas daadas de S. minima

Laguna 1
Laguna 2
Total de frondas=7693
Cuad. 1
Cuad. 2 Cuad. 3 Cuad. 4 Cuad. 1 Cuad. 2 Cuad. 3 Cuad. 4
0.03
0.16
0.11
0.1
0.14
0.11
0.09
0.02
0.09
0.02
0.16
0.10
0
0.24
0.12
0.01
0.19
0.06
0
0.11
0.11
0.12
0.14
0.12
0.07
0.18
0.05
0.03
0.11
0.06
0.02
0.10
0.24
0.19
0.14
0.10
0.20
0.07
0.10
0.15
0.04
0.13
0.22
0.07
0.10
0.05
0.09
0.10
0.22
0.10
0.11
0.11
0.05
0.08
0.10
0.01
0.13
0.05
0.03
0.04
0.13
0.11
0.16
0.05
0.10
0.07
0.09
0.13
0.17
0.09
0.14
0.07
0.10
0.08
0.10
0.03
0.14
0.22
0.27
0.11
0.05
0.09
0.11
0.18
0.22
0.05
0.11
0.01
Porcentaje de frondas daadas de S. minima
Laguna 1
Laguna 2
Cuad. 1
Cuad. 2 Cuad. 3 Cuad. 4 Cuad. 1 Cuad. 2 Cuad. 3 Cuad. 4
0.09
0.15
0.10
0.11
0.13
0.10
0.08
0.05
67
6. CONCLUSIONES
Experimentos en sistemas por lote:

Se confirm que la adsorcin es el mecanismo predominante de remocin de plomo por
S. minima en sistemas por lote.
Para el caso de
la
microalga (Lyngbya sp.) el mecanismo predominante fue la
acumulacin intracelular en sistemas por lote cuando estuvo expuesta a una

concentracin inicial de 12.59 + 0.04 mg Pb/l.
El sistema con Lyngbya sp. sola mostr una mayor capacidad de remocin durante la
primera hora de exposicin al plomo, en comparacin a la biomasa lavada y sin lavar de
S. minima.
No hubo diferencias significativas en la remocin de Pb entre la biomasa lavada durante

5 minutos y la no lavada de S. minima cuando fue expuesta a una Ci de 12.59 + 0.04 mg
Pb/l en sistemas por lote, al final del tiempo experimental (24 horas).
El tiempo de lavado de 5 minutos permiti eliminar de manera significativa a Lyngbya
sp. adherida a la biomasa de S. minima.
Experimentos en sistema continuo:

El mximo valor del porcentaje de remocin se observ en el grupo de experimentos
dentro del rango de I.L. y temperaturas bajas (109-160 molm-2s-1), cuando se prob
una CPb tambin baja (1.24 + 0.38 mg Pb/l), alcanzando un punto mximo de
remocin de 77.68%.
Para el resto de las condiciones probadas de luz/temperatura (Grupo 2 y 3), se observ la
misma tendencia que en el grupo 1, es decir, que a medida que increment la
68
concentracin del metal, se redujo el porcentaje de remocin, independientemente de

las condiciones ambientales probadas.
Se observ que el mecanismo de adsorcin predomin para la mayora de las
concentraciones de plomo probadas, excepto a las concentraciones ms pequeas en el
rango de 0.58 a 3.22 mgPb/l.
El efecto de la intensidad luminosa/temperatura (I.L./Temp.) sobre el FBC, fue variable
dependiendo del rango de I.L./Temp. en que se expusieron las plantas. En un rango
llamado bajo en el que se realizaron los experimentos del grupo 1, la concentracin
del metal afect negativamente al FBC, ya que a la mayor CPb probada se observ el
menor valor de FBC.
El mximo valor del FBC se observ a una CPb de 12.87 + 1.31 mg/l y a una I.L/temp.
en el rango denominado medio (650 molm-2s-1 /25.33C). Cuando la
I.L/temp.
aument al rango denominado alto (810 molm-2s-1 y 32.26C), ya no aument el

valor del FBC, a pesar de que las concentraciones de Pb fueron menores a las probadas
anteriormente (3.22 + 0.27 y 10.56 + 1.37mg Pb/l).
Las intensidades luminosas altas favorecen, mediante algn mecanismo an no
identificado, la formacin de grupos carboxlicos, lo cual deriva en un incremento
notable en la adsorcin de plomo a la superficie de S. minima.
S. minima no present graves daos en sus frondas a pesar de estar a expuesta a
concentraciones elevadas de plomo (27.58 mg Pb/l) por un perodo de 52 horas, lo que
indica que este helecho presenta alta eficiencia en sus mecanismos de tolerancia al
plomo.
S. minima mostr mayor capacidad de bioconcentracin de plomo en comparacin a
otras macrofitas acuticas (plantas emergentes) en sistemas continuos.
69
En trminos generales, se observ un efecto de los parmetros ambientales probados

(luz, temperatura y concentracin del metal) sobre los mecanismos de adsorcin y
acumulacin intracelular de plomo por S. minima en sistemas continuos
7.
RECOMENDACIONES
Para el manejo de un sistema continuo a una escala mayor, se deber atender con mucho
cuidado el nivel de concentracin promedio de plomo con la que se est tratando, ya
que, en caso de que la CPb estuviera en concentraciones relativamente bajas es posible
que se puedan obtener mejores porcentajes de remocin a un TRH de 20 horas,
independientemente de las condiciones ambientales a las que se exponga la planta.
Investigar ms sobre la activacin de grupos carboxilos en S. minima ante diversas
condiciones ambientales.
70
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83
ANEXO 1. Sistema experimental incluyendo lagunas de acrlico (con 20 litros de medio

experimental) alimentadas en forma continua
Recipientes de
alimentacin
Bombas
peristlticas
Lagunas de
acrlico operando
en flujo continuo
Recipientes de
descarga
84
ANEXO 2.Gua para diferenciar daos en las frondas de S. minima expuesta a plomo en
sistemas continuos de fitorremediacin.
Frondas sanas de Savinia

minima.
Frondas clorticas de S.
minima
Frondas
extremadamente
daadas de S. minima
Frondas muertas de S.
minima
85

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EVALUACIN DE LOS MECANISMOS DE ADSORCIN Y

ACUMULACIN INTRACELULAR DE PLOMO (Pb2+), EN

TESIS QUE PRESENTA I.Q. MONSERRAT VIDAL LVAREZ

Xalapa, Veracruz, Mxico 2009

EVALUACIN DE LOS MECANISMOS DE ADSORCIN Y

TESIS QUE PRESENTA I.Q. MONSERRAT VIDAL LVAREZ

DIRECTORA DE TESIS DRA EUGENIA J. OLGUIN PALACIOS

Xalapa, Veracruz, Mxico 2009

El presente trabajo se realiz en la Unidad de Biotecnologa Ambiental del Instituto de Ecologa

Forma parte del proyecto Mecanismos pasivos y activos de remocin de Pb y Cd por la

A Dios por haberme dado la vida y colmarme de bendiciones, derramando en m su

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT), por otorgarme la beca

Al Instituto de Ecologa por darme la oportunidad de cursar mis estudios de posgrado, y

A la Dra. Eugenia Olgun por permitirme conocerla y por otorgarme su apoyo,

A los miembros de mi comit tutorial, la M. C. Gloria Snchez Galvn y el Dr. Eric

A todos mis compaeros y amigos que tuve el privilegio de conocer y compartir

A mi familia por su amor, confianza y apoyo incondicional.

Al Ing. Jacinto Romero por apoyarme e impulsarme siempre a seguir adelante.

Aprend que no se puede dar marcha atrs,

2.1 Metales pesados

2.2 Toxicidad de metales pesados en plantas

2.3 Fuentes de metales pesados

2.4.1. Caractersticas fsicas y qumicas

2.4.2. Toxicidad de plomo

2.4.3. Fuentes generadoras de plomo

2.5 Biotecnologa para la remocin de metales pesados

2.6.1 Fitorremediacin de suelos

2.6.2 Fitorremediacin acutica

2.6.2.1 Macrofitas acuticas

2.7 Mecanismos de respuesta de las plantas a la presencia de

2.7.1 Adsorcin de metales pesados a superficies biolgicas

2.7.2 Quelantes intracelulares

2.8 Salvinia mnima

Aspectos generales de S. mnima

Remocin de metales pesados por S. mnima

3.1 Objetivo general

3.2 Objetivos especficos

4.1 Condiciones de cultivo de la biomasa de S. mnima

4.1.1 Composicin del medio de cultivo para S. minima y experimentos

4.2 Caractersticas de diferentes tipos de biomasa de S. minima

4.2.1 Biomasas de S. minima y de Lyngbya sp. para experimentos en

4.2.2 Biomasa de S. minima para determinar acidez carboxlica

4.3 Parmetros para cuantificacin de la biomasa

4.4 Cuantificacin de acidez carboxlica

4.5 Unidades y condiciones experimentales

4.5.1 Determinacin del tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los

4.5.2. Experimento para determinar la acidez carboxlica en S. minima

4.5.3 Experimentos en sistema continuo

4.6.1 Experimentos en sistema por lote con plomo

4.6.2 Experimento para determinar la acidez carboxlica en

4.6.3 Experimentos en sistema continuo

4.8 Factores de Bioconcentracin (FBC), de Adsorcin (FAD) y Acumulacin

4.9 Porcentaje de remocin

4.10 Plomo adsorbido y acumulado intracelularmente en la biomasa de

4.11 Anlisis de datos

4.12 Estrategias experimentales

4.12.1 Estrategia experimental-sistema por lote

4.12.2 Estrategia experimental-sistema continuo

4.13 Diagrama de flujo de lagunas con S. minima expuestas a medio con

5.1 Determinacin del tipo de biomasa de S. minima a utilizar en los

5.2 Experimentos en sistemas continuos

5.2.1 Condiciones ambientales

5.2.2 Porcentaje de remocin de plomo por S. minima