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Técnicas de Histología Vegetal PDF
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HISTOLOGA
VEGETAL
por
CONTENIDO
INTRODUCCIN ......................................................................................................................................................... 1
FIJACIN ................................................................................................................................................................... 1
INTRODUCCIN .............................................................................................................................................................. 1
EXAMEN EN FRESCO........................................................................................................................................................ 1
CONCEPTO DE FIJACIN ................................................................................................................................................ 2
FIJADORES FSICOS ......................................................................................................................................................... 3
EL CALOR ........................................................................................................................................................................................ 3
EL FRO ............................................................................................................................................................................................ 3
LA CRIODESECACIN (LIOFILIZACIN)............................................................................................................................................. 3
INCLUSIN ................................................................................................................................................................. 9
INCLUSIN EN HIELO..................................................................................................................................................... 10
INCLUSIN EN PARAFINA .............................................................................................................................................. 11
CONFECCIN DE LOS BLOQUES....................................................................................................................................................13
REALIZACION DE LOS CORTES .......................................................................................................................................................13
DESPARAFINACIN E HIDRATADO .................................................................................................................................................13
CARMN ACTICO.......................................................................................................................................................... 17
CARMN-VERDE IODO................................................................................................................................................... 18
FLOROGLUCINA ............................................................................................................................................................ 18
FUCSINA BSICA-VERDE DE METILO .............................................................................................................................. 18
FUCSINA BSICA-VERDE LUZ ........................................................................................................................................ 19
HEMALUM DE MAYER .................................................................................................................................................... 19
HEMATOXILINA FRRICA DE HEIDENHAIN....................................................................................................................... 20
LUGOL .......................................................................................................................................................................... 20
ORCENA ACTICA ........................................................................................................................................................ 21
SAFRANINA-VERDE RPIDO .......................................................................................................................................... 21
SUDN III ...................................................................................................................................................................... 21
TIONINA FENICADA ....................................................................................................................................................... 22
VESUVINA ..................................................................................................................................................................... 22
COLORANTES................................................................................................................................................................ 23
AZUL DE ANILINA...........................................................................................................................................................................23
AZUL DE LACTOFENOL ...................................................................................................................................................................23
AZUL DE METILENO ........................................................................................................................................................................24
AZUL DE METILENO-ALUMBRE ........................................................................................................................................................24
AZUL DE METILENO DE LOEFFLER ....................................................................................................................................................24
CARMIN ACETICO ..........................................................................................................................................................................25
CARMIN ALUMBRE DE GRENACHER ................................................................................................................................................25
CARMIN ALUMBRE .........................................................................................................................................................................25
FABRIL ...........................................................................................................................................................................................25
FLOROGLUCINA ............................................................................................................................................................................26
FUCSINA BASICA DE ZIEHL .............................................................................................................................................................26
GLICEROGELATINA........................................................................................................................................................................26
BIBLIOGRAFA ............................................................................................................................ 40
INTRODUCCIN
Este manual expone en forma clara, sencilla e inmediata las tcnicas que se siguen en el procesamiento histolgico para la elaboracin de preparaciones anatmicas, la observacin y el registro
de los tejidos vegetales. Las preparaciones permanentes para estudios microscpicos son indispensables como fuente de informacin bsica, tanto en cualquier investigacin botnica formal como en
la enseanza, en un curso bsico de botnica o en cursos ms especializados o avanzados.
Todas las plantas estn formadas por los mismos tejidos -drmico, fundamental y vascular-, sin embargo, la manera cmo estn organizadas sus clulas dentro de cada uno es muy variable, haciendo
que las diferencias estructurales entre las plantas sean notables y, por lo tanto, los mtodos histolgicos para procesarlas sean variados.
FIJACIN
INTRODUCCIN
Antes de entrar en los detalles ms significativos sobre los distintos mtodos que existen para la
fijacin de tejidos vegetales, es necesario resaltar que los mtodos ms sencillos y ms prcticos son
los que no necesitan de la fijacin, pero no siempre son posibles, ya que con frecuencia las muestras
se encuentran alejadas del laboratorio, la capacidad de trabajo tambin es limitada y por tanto
hay que recurrir a los mtodos de fijacin con mayor frecuencia de la que sera deseable.
EXAMEN EN FRESCO
Este mtodo tiene la ventaja de una gran simplicidad y por otra parte no produce alteracin alguna
en las muestras; en histologa animal se presentan grandes inconvenientes para su uso, puesto que
slo puede utilizarse, bien para organismos vivos de pequeo tamao o bien para piezas sumergidas durante un tiempo limitado en lquidos fisiolgicos (solucin de Ringer, solucin de Locke, solucin
de Tyrode, etc.). Los vegetales presentan ventajas sobre los animales, ya que se pueden fcilmente
cultivar en el laboratorio o bien llevarlos desde el campo al mismo sin que los procesos de lisis se
presenten con la rapidez que ocurren en los tejidos animales.
Aun teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha frecuencia debe recurrirse en histologa vegetal al uso de fijadores, bien porque las muestras se recojan lejos del laboratorio durante
campaas botnicas ms o menos amplias o porque los trabajos se prolonguen excesivamente debido
a largos tratamientos, por lo que es necesario recurrir a la fijacin de las muestras a estudiar.
Tambin queremos llamar la atencin sobre las tcnicas de fijacin que se van a emplear y describir,
ya que se refieren nicamente a tcnicas para microscopa ptica, obviando las de microscopa electrnica, tanto de barrido como de transmisin.
CONCEPTO DE FIJACIN
Se entiende por fijacin toda manipulacin sobre un ser vivo, o bien sobre parte de l, que tiene
por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como qumica lo ms inalterada posible,
de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas caractersticas que cuando dicho
ser o tejido estaban vivos. Es claro que la mayora de la estructura celular se debe a la presencia
de protenas y, por tanto, todo proceso de fijacin debe tener en cuenta la naturaleza qumica de
stas, de forma que el fijador no reaccione con las mismas. Es cierto que existen componentes muy
distintos, ms o menos lbiles, que tambin se encuentran formando parte de la estructura celular,
pero son las protenas las que nos van a reflejar fundamentalmente si un fijador es o no bueno. Por
otra parte, un fijador prepara tambin de alguna forma el tejido o la clula para la posterior
manipulacin, bien en el proceso de inclusin, actuando como mordiente o como fijador del colorante
dependiendo de su naturaleza, por eso es importante la eleccin del fijador.
Por otra parte hay que distinguir bien entre fijador y conservador, ya que con frecuencia, y sobre
todo en histologa vegetal, se tienen conceptos errneos al respecto. Un conservador es aquella
sustancia, o bien fenmeno fsico, que evita la autolisis cadavrica, pero que una vez eliminada su
accin, la muestra o la clula, quedan a merced de sus propios enzimas lisgenos y son, por tanto,
susceptibles a la autodestruccin. Son conservadores: el fro, y ciertos lquidos como los de Petit, de
Ripert, etc. As pues, una pieza que se ha mantenido durante un tiempo en un conservador debe ser
fijada rpidamente antes de cualquier estudio o manipulacin, ya que de no hacerse se corre el
peligro de que sufra graves alteraciones. Un fijador, por el contrario, inmoviliza y estabiliza los
elementos celulares, bien sea por precipitacin de las protenas y dems sustancias celulares activas,
ya sea mediante un bloqueo qumico de su actividad, siendo estos fenmenos permanentes.
En resumen, un fijador tiene como misin:
Para la eleccin de un fijador hay que tener en cuenta, adems de lo sealado anteriormente, unas
caractersticas que son intrnsecas al mismo, como son la velocidad de penetracin, la velocidad de
fijacin y el coeficiente de endurecimiento, as como el efecto de retraccin. Estos factores son de gran
importancia a la hora de elegir un fijador; sobre todo, en histologa vegetal. Es muy importante el
coeficiente de endurecimiento y el efecto de retraccin, ya que de por s los tejidos vegetales son
frecuentemente duros y estos dos fenmenos contribuyen a una mayor elasticidad de los tejidos, con
el consiguiente posible perjuicio a la hora de manipularlos para obtener los cortes. Menos importancia tienen quizs el poder de penetracin y la velocidad de fijacin, ya que como se ha indicado
anteriormente los procesos de lisis en los tejidos vegetales son ms lentos en trminos generales que
en los tejidos animales; en cuanto a la velocidad de penetracin y de fijacin, son muy distintas, ya
que un fijador puede tener una gran velocidad de fijacin y un bajo poder o velocidad de penetracin o viceversa. Por tanto la eleccin de un fijador es un problema de suma importancia en
histologa vegetal. Un fijador ideal sera aquel que tuviera una gran velocidad de penetracin y
fijacin y unos coeficientes de retraccin y endurecimiento lo ms bajos posibles.
Los fijadores que se usan para el tratamiento de los tejidos vegetales son prcticamente los mismos
que se utilizan en histologa animal; las clulas vegetales presentan, sobre todo en la pared celular,
una estructura celulsica o bien una impregnacin o sustitucin de sta por compuestos distintos como
la lignina, suberina, etc., que diferencia totalmente a los vegetales de los animales. El comportamiento de los fijadores al menos a este nivel es muy distinto; si a ello unimos que los estudios de los
efectos sobre las estructuras celulares vegetales son prcticamente nulos, nos encontramos con un
problema serio a la hora de elegir un fijador. En histologa animal se saben la mayora de los
efectos de retraccin, endurecimiento, etc., que presentan cada uno de los fijadores utilizados, cosa
que no se conoce cuando se trata de tejidos vegetales. nicamente la experiencia y los ligeros
conocimientos de qumica permiten al histlogo vegetal poder elegir un fijador que le ofrezca ciertas
garantas; desgraciadamente, estos conocimientos no estn reflejados en los textos de tcnicas histolgicas ni en los de histologa vegetal.
Vamos a dar un listado de los fijadores ms frecuentes y a discutir brevemente sus distintas caractersticas. Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores fsicos y fijadores qumicos.
FIJADORES FSICOS
Son varios los fijadores fsicos que usualmente se utilizan en histologa, sobre todo por su simplicidad,
pero la mayora de ellos debemos desecharlos, porque alteran gravemente la estructura de los
vegetales.
EL CALOR
Es el ms antiguo y ms utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiologa, como en frotis de clulas animales, la fijacin se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulacin rpida de las protenas y por
tanto su estabilizacin. Esta tcnica no es recomendable cuando de se trata de tejidos vegetales, puesto que
produce retracciones importantes y muy desiguales en la paredes celulares.
EL FRO
Como anteriormente hemos mencionado, el fro (congelacin), se ha tenido y se tiene como agente de fijacin,
pero es realmente un agente conservador y por tanto no debe utilizarse como tal.
LA CRIODESECACIN (LIOFILIZACIN):
Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50 C y eliminar el agua a una presin baja. Este mtodo
puede ser muy efectivo, si despus la pieza se incluye en parafina o plstico, pero es bastante complejo y
excesivamente caro; no produce deformaciones ni retracciones, ni tampoco endurecimientos de las muestras.
Su inconveniente es el precio y lo engorroso que puede resultar el que, al manipular la muestra, no se rehidrate posteriormente.
FIJADORES QUMICOS
Existen numerosos fijadores qumicos, unos simples, y otros que son mezclas de varias sustancias. Los ms
reseados en la bibliografa son:
Acetato mercrico
cido actico
cido crmico.
Etanol
Etanol-Glicerina-Agua (G.A.W.)
Formaldehido
Formaldehido-Alcohol
Formaldehido-Propinico-Alcohol (F.P.A.)
Formol-Actico-Alcohol (F.A.A.)
Mezcla Cromo-Actico-Formaldehido (C.R.A.F.)
Mezcla Cromo-Actico.
ACETATO MERCRICO
Produce mejor fijacin que el cido actico.
CIDO ACTICO
Conserva la cromatina. Retrae los tejidos Es ms un conservante que un fijador.
CIDO CRMICO
Se utiliza en soluciones al 2%. Hay que tener precaucin al usarlo, puesto que disuelve las lminas medias y
las celulosas. Despus de una fijacin de 1-2 horas, se debe sacar la muestra del mismo y pasarla a un
conservador. Es buen fijador si se toman las precauciones debidas.
ETANOL
El nico alcohol que se puede usar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de 96. Se debe usar
junto con otros fijadores para potenciar la accin de los mismos, o como solucin de otros fijadores, pero no
solo, ya que tiene poco poder de penetracin, es un mal fijador de ncleos y mediocre de citoplasma, y
retrae excesivamente los tejidos. Ms que un verdadero fijador, el etanol a baja concentracin puede ser un
buen conservador.
ETANOL-GLICERINA-AGUA O ALCOHOL-GLICERINA-AGUA. (G.A.W.)
Alcohol 96
Glicerina
Agua destilada
1/3
1/3
1/3
Fijador lento y conservador perecedero, mximo dos aos de permanencia en la solucin. No endurece; para
cortar por congelacin debe lavarse la muestra en agua destilada un mnimo de cuatro horas.
FORMALDEHIDO
El formol se utiliza en concentraciones del 10% comercial. Es un fijador regular, prctico y fcil de manejar;
tiene el inconveniente de polimerizar los fenoles libres, que son muy frecuentes en los vegetales y que una
fijacin prolongada los endurece excesivamente. No debe ser usado o se debe usar con ciertas precauciones
en tejidos muy lignificados.
FORMOL-ACTICO-ALCOHOL (F.A.A.)
Alcohol etlico de 50-70
cido actico glacial
Formaldehido 40%
90 mL
5 mL
5 mL
Buen fijador general para tallos, races y hojas. Sirve como conservador. Endurece las muestras.
FORMALDEHIDO-ALCOHOL.
Alcohol etlico 96
Agua destilada
Formaldehido 40%
15 mL
10 mL
1 mL
Fijador general y conservador para estudios anatmicos de material leoso. Endurece las muestras.
FORMALDEHIDO-PROPINICO-ALCOHOL (F.P.A.)
La misma frmula del F.A.A. sustituyendo el cido actico por propinico. Mezcla recomendada
para brifitos y pteridfitos. Produce endurecimiento de los tejidos.
MEZCLA CROMO-ACTICA.
a) Dbil:
Anhdrido crmico, solucin acuosa al l0 %
cido actico al 10%
Agua destilada hasta
2.5 mL
5 mL
100 mL
7 mL
10 mL
100 mL
Se recomienda aadir 0.5% de saponina para aumentar el poder de penetracin del fijador. Tras fijar el
material durante 24 horas, debe lavarse abundantemente en agua corriente y pasar a un conservador. Es un
buen fijador para pices.
1g
7 mL
92 mL
Solucin b):
Formaldehido 40%
Agua destilada
30 mL
70 mL
Ambas soluciones se deben mezclar en partes iguales inmediatamente antes de su uso y, tras una fijacin de
12-24 horas, el material debe ser lavado en alcohol de 70.
GLUTARALDEHIDO-PARAFORMALDEHIDO AL 5%.
Se trata de una variacin del fijador de Karnovsky, ya que este es una mezcla de ambos componentes a una
concentracin del 2.5%.
En primer lugar hay que preparar el paraformaldehido disolviendo en agua la cantidad suficiente para que
resulte una concentracin del 10%, ello ha de hacerse en caliente y en agitacin continua mediante un agitador magntico, procurando que la temperatura no sobrepase los 70C; para la correcta disolucin hay que
aadir unas gotas de KOH 1N. Al llegar a los 70C. Se observar que la disolucin, que antes era turbia, se
torna rpidamente transparente. Se realizar el proceso en campana de extraccin para no respirar los
vapores que resultan txicos.
Una vez fro el paraformaldehido se mezcla a un volumen igual de glutaraldehido al 10% en tampn, con lo
que la mezcla tendr una concentracin de ambos fijadores del 5%. La mezcla ha de guardarse en nevera
y puede mantenerse durante mucho tiempo.
Preparacin de 100 ml de fijador
1. Disolver 4 g de paraformaldehido en 50 mL de agua destilada, agitando y calentando a
60-70C. Se han de aadir 3-4 gotas de KOH 1N para aclarar la solucin.
2. Aadir 10 ml de glutaraldehido 50%
3. Verter a la solucin, hasta alcanzar los 100 ml tampn fosfato 0.1 M y pH 7.2
El fijador se lleva al campo tambin en nevera porttil para asegurarnos que no se sobrepasen los 4C.
Concentraciones menores de esta mezcla dan lugar a resultados deficientes para la observacin de cortes en
microscopa electrnica de transmisin. Ello se debe a que el contenido hdrico de las vacuolas es alto y al
penetrar el fijador, su concentracin intracelular desciende considerablemente. De este modo estructuras que
rpidamente degeneran, como las membranas, no se aprecian con nitidez, por una deficiente fijacin.
Hay otras razones por las que los tejidos vegetales no deben fijarse como los animales. Muchas veces las
plantas estn cubiertas de sustancias creas en sus cutculas que son hidrfobas e impiden la penetracin del
fijador. Por otra parte el bajo contenido proteico de las clulas vegetales, en comparacin con las animales,
vuelve al glutaraldehido menos efectivo en sus enlaces cruzados con la protena. Asimismo, la pared de las
clulas vegetales supone una barrera parcial a la penetracin del mismo.
El tiempo de fijacin en esta mezcla nunca debe ser inferior a 12 horas para las muestras que nosotros
manipulamos, aunque frecuentemente no se observa hundimiento de estas en el fijador hasta pasadas 20
horas. Podemos decir lo mismo que se indicaba para el fijador anterior en lo referente a la dificultad de
penetracin por la naturaleza de las flores y los pelos hidrfobos; es recomendable, sobre todo para las
flores con un grado de madurez elevado fijar al vaco, esto supone una dificultad aadida al tener que
mantener las muestras a baja temperatura en nevera; utilizamos para ello recipientes hermticos en los que
se hace el vaco con una bomba de vaco manual y luego pasamos a nevera.
Hay que lavar el fijador, como mximo, a las 24 horas, para evitar el excesivo endurecimiento. El lavado se
lleva a cabo en tampn fosfato 1 molar a pH 7.2. Se pasan las muestras a un frasco con abundante tampn
y se hacen 5 cambios de hora cada uno. En el tampn y en nevera podemos mantener las muestras durante
varios das sin que se aprecie ninguna alteracin.
Sobre todo, si pretendemos hacer preparaciones para microscopa electrnica de transmisin, llevaremos a
cabo una post-fijacin con tetrxido de osmio al 2% en tampn fosfato durante dos horas a temperatura
ambiente y en oscuridad total. Una de las caractersticas de la completa fijacin es la de que el lquido
adquiere una coloracin parecida al vino tinto, y el material est negro. El osmio torna de un color negro
todo contenido lipdico celular, resultando, adems de fijador, un elemento de contraste que delata la presencia de lpidos.
Procedemos a lavar, tras la post-fijacin, de nuevo con tampn fosfato, de modo anlogo al caso anterior.
Conviene pasar las muestras cuanto antes a alcohol de 70 y proceder lo ms pronto posible a la confeccin
de bloques.
tincin posterior.
5. Sobre un tamiz muy fino se disgrega la muestra para individualizar los elementos, tomando la
precaucin de sumergir ste en agua.
6. Recoger el agua del tamizado en un tubo de centrfuga.
7. Centrifugar la suspensin para sedimentar el material y decantar el agua sobrante.
8. Tincin.
9. Lavados sucesivos, centrifugando y decantando cada vez.
10. Montar.
INCLUSIN
La observacin de los distintos tejidos, tanto vegetales como animales, con microscopio ptico viene
limitada por la opacidad de los mismos; para poder ver la estructura celular de un tejido y los
componentes de las mismas clulas es necesario por tanto obtener cortes que sean translcidos. Por
muy habilidosa que sea una persona, jams puede obtener a mano secciones tan finas como las que
se obtienen mediante aparatos especiales como son los microtomos.
La histologa vegetal se ha nutrido esencialmente de las experiencias realizadas en los tejidos animales y frecuentemente no se ha tenido en cuenta la distinta naturaleza de estos tejidos. La presencia
de una pared celular rgida y la concatenacin general que ello supone, da a los tejidos vegetales
una particularidad a tener en cuenta a la hora de elegir un proceso de inclusin. Se utilizan en
general las mismas tcnicas en un caso y en otro, por lo que muchas veces los resultados no son, ni
con mucho, los deseables, puesto que la respuesta frente a un mismo tratamiento en uno u otro tipo
de tejido es muy diferente.
Para poder manejar los tejidos fcilmente y poder cortar con los distintos tipos de microtomos que
existen, es necesario que el tejido o la muestra a cortar tenga un soporte, y que ste sea homogneo,
por tanto es necesario no slo que dicho soporte envuelva a la muestra, sino que penetre en su
interior y que adems dicho soporte no obstaculice o interfiera lo mnimo posible en la arquitectura
de la clula y en la naturaleza qumica de la misma.
Los soportes que se utilizan estn en funcin de los
distintos microtomos y pueden ser simples y no interferir en absoluto en la muestra, como ocurre al utilizar el microtomo de mano o de Ranvier (Figura 1),
donde se utiliza como soporte de la muestra mdula
de saco, zanahoria o plsticos como el polispan,
pero no se trata en este caso de una verdadera inclusin, pues como ya se ha mencionado anteriormente una verdadera inclusin es aquella en la cual
el soporte penetra en el interior del tejido.
Figura 1. Microtomo de mano (de Ranvier).
aqu nicamente a mencionarlos y comentar algunas variantes a los mtodos ya citados, as como a
una crtica de los mismos en lo referente a la histologa vegetal.
Existen varios mtodos de uso comn, pero los que se utilizan con ms frecuencia son:
Inclusin en hielo (Microtomo de congelacin)
Inclusin en parafinas o sustancias similares (Histosec, Paraplast, etc.)
Inclusin en resinas y plsticos (Microscopa de cortes semifinos)
Cada una de estas tcnicas presenta ventajas e inconvenientes. Por este motivo discutiremos cada
una de ellas.
INCLUSIN EN HIELO
Es la tcnica ms fcil y natural que podemos utilizar es histologa vegetal (Figura 2); permite la observacin de las clulas
y de los tejidos sin que stos sufran prcticamente alteracin
alguna. Para ello, cuanto ms rpida sea la inclusin, mejores
resultados se obtienen, puesto que la formacin de cristales microscpicos altera mnimamente la estructura celular. Hay que
tener en cuenta, antes de congelar un tejido, que la cantidad
de agua que existe en el interior de los tejidos es siempre menor
que la que va a rodear externamente a dicho tejido en el bloque, lo que crea una diferencia muy importante de textura a la
hora de cortar; mientras el bloque de hielo es externamente
homogneo, los tejidos presentan una menor resistencia a la cuchilla y, por tanto, se corre el riesgo de que al cortar la muestra,
se desgarren los mismos. Se puede evitar esta diferencia en el
contenido de agua si previamente sometemos las muestras (hoFigura 2. Microtomo de congelacin
jas, tallos, races, etc.) a una hidratacin, mantenindolos en
agua durante algn tiempo antes de cortar, dependiendo de la naturaleza y tamao de la muestra.
Un inconveniente que presentan los cortes por congelacin, es la variabilidad en el grosor de los
mismos, si no se dispone de un criotomo de precisin motorizado. El grosor de los cortes, por otra
parte, no es un obstculo en la histologa vegetal, por lo menos en un principio, ya que el tamao
de las clulas, mucho mayor que las animales, puede suplir esta desventaja.
Otra posible dificultad que puede surgir es la manipulacin posterior de los cortes, ya que obligatoriamente se deben recoger sobre agua. Se ha recomendado el uso de pequeos pinceles para
manipular los cortes. Nosotros desaconsejamos la utilizacin de los mismos, puesto que por mucha
delicadeza que se tenga, la naturaleza de la estructura vegetal (tramas de paredes) puede ser
destruida fcilmente al manipularla con el pincel. Es preferible, para el mejor manejo de los cortes,
el uso, de pequeos tamices sobre los que se recogen los cortes, utilizndose los mismos para todo
proceso de tincin o tratamiento que a los mismos se quiera dar, as la manipulacin de los mismos
10
es mnima y, por tanto, tambin disminuye el riesgo de destruccin. Los cortes realizados por congelacin tienen una gran importancia, sobre todo por la posibilidad de observar el tejido in vivo. Por
tanto, las dimensiones, disposicin, morfologa, etc. de las clulas y de los tejidos son las reales, cosa
que no ocurre despus de un proceso de inclusin en parafina, plstico u otro medio. No obstante,
para el estudio de un tejido es necesario utilizar ms de una tcnica. Por otra parte, los orgnulos
celulares, normalmente por rotura de la clula, se pierden; as difcilmente se pueden observar ncleos o vacuolas en clulas que se han cortado mediante congelacin, y mucho menos si los cortes
son finos.
Por otra parte la inclusin en hielo y los cortes realizados por congelacin nos dan la posibilidad de
estudiar aquellos productos metablicos solubles en los lquidos polares y apolares que son eliminados de los tejidos cuando se utilizan otras tcnicas de inclusin, como son los lpidos, las clorofilas,
etc. Cuando se requiere informacin de tipo histoqumico el mejor mtodo es la obtencin de cortes
por congelacin.
INCLUSIN EN PARAFINA
Las parafinas son mezclas hidrocarburos saturados de cadenas que oscilan entre 22 y 28 tomos
de carbono. El punto de fusin depende del nmero de tomos de carbono y se encuentra entre 45
y 60 grados. Las mezclas de parafinas comerciales tienen un punto de fusin entre 54 y 56 C.
La tcnica de inclusin en parafina es una perfusin de la misma en los tejidos para crear un medio
homogneo, que permita la realizacin de los cortes de menor grosor con gran facilidad y una
precisin mayor que cuando los mismos se realizan por congelacin. Como toda tcnica, presenta
ventajas e inconvenientes; sobre todo es en esta modalidad de inclusin donde se pueden discutir
ciertos procesos que son vlidos en histologa animal pero que al aplicarlos a los tejidos vegetales
pueden originar alteraciones, a veces profundas, en las estructuras anatmicas e histolgicas; el
primer problema que nos encontramos al incluir en parafina un tejido es la apolaridad de la misma;
para poder incluir el tejido se han descrito varios mtodos de deshidratacin, pero en general se
sigue, como en histologa animal, la deshidratacin por alcohol etlico en graduaciones crecientes
hasta llegar a alcohol absoluto.
La parafina y el alcohol etlico absoluto tampoco son miscibles, por lo que hay que sustituir ste por
un lquido apolar miscible con aqulla. Hay varios lquidos apolares como benceno, cloroformo, xileno, etc., que se han descrito en todas las tcnicas histolgicas, pero que deben usarse con muchas
reservas, por las grandes retracciones y deformaciones que producen en los tejidos vegetales, alteraciones que no son homogneas, puesto que cada uno de los distintos tejidos de una muestra a
cortar, reaccionan de forma muy distinta a la retraccin debido al distinto grosor y naturaleza de
la pared celular. Nosotros sustituimos el benceno, xileno, etc., por acetato de isoamilo o bien miristato
de isopropilo; ms frecuentemente el primero. Si la deshidratacin se ha realizado correctamente,
la pieza a incluir se hundir en el acetato. Si flotase sobre el mismo, hay que esperar 15 minutos y
si sigue flotando es que la deshidratacin no se ha realizado correctamente, debiendo ser introducida la muestra de nuevo en alcohol absoluto.
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Alcohol etlico 96
Alcohol etlico 96
Alcohol etlico absoluto
Alcohol etlico absoluto
Alcohol etlico absoluto
Acetato de isoamilo
Acetato de isoamilo
Acetato de isoamilo
Parafina a 56-58 estufa
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
el tiempo necesario en funcin del tipo de muestra
Despus de tres baos de acetato de isoamilo, la muestra puede ser incluida en parafina, Histosec,
Paraplast, etc. Este proceso es quiz el que merezca mayor atencin junto con el anteriormente
explicado. Los manuales de tcnicas y los distintos trabajos sobre histologa vegetal nos dan tiempos
muy dilatados de inclusin: mnimo de 6 horas. Los tejidos vegetales tienen una naturaleza muy
distinta a la de los animales, pero las tcnicas de inclusin que se describen en los distintos manuales
han sido aplicadas a partir de las experiencias sobre tejidos animales; en algn caso, esta experiencia es til y sirve para el proceso de inclusin de vegetales, pero en la mayora de los casos no
lo es, y a cada muestra vegetal hay que darle un tratamiento muy distinto dependiendo de los
tejidos que presente y de la disposicin de los mismos. No se puede tratar de igual manera una
muestra que contenga tejidos lignificados o suberificados que otra que contenga grandes parnquimas o grandes conductos aerferos. Por tanto, lo ms importante antes de realizar una inclusin es
conocer la naturaleza y la organizacin de la muestra a incluir, o por lo menos presuponerla. Los
cortes realizados con el microtomo de congelacin nos pueden dar la pauta a seguir en el caso de
que se desconozca la organizacin de un vegetal determinado.
El calor es uno de los enemigos ms importantes de los tejidos vegetales. La presencia de pared
celular y la distinta naturaleza que sta puede presentar es la causa de que el calor, los fijadores,
los compuestos hidratantes y deshidratantes, el xileno, benceno, etc., produzcan en las paredes celulares retracciones muy importantes y no constantes, que pueden distorsionar en gran manera la
estructura anatmica de un vegetal. Ante los mismos agentes, en una seccin, no todos los tejidos
responden igual: las deformaciones dependen entre otras cosas del grosor de la pared celular,
naturaleza de la misma, disposicin de los diferentes tejidos, tiempo de actuacin de los distintos
agentes, etc. Por tanto, si las deformaciones son variables, las interpretaciones que se dan son, con
frecuencia, errneas.
Por tanto, para incluir una muestra vegetal en parafina, o bien en sucedneos de la misma (Paraplast, Histosec, etc.), es necesario calcular los tiempos mnimos, que pueden oscilar desde 35
minutos a varias horas.
Los tiempos de deshidratacin pueden ser ms o menos constantes para todos los tejidos, pero varan
mucho los tiempos de parafinacin. Un tallo macizo, con mucho tejido esqueltico (esclernquima), o
de proteccin (peridermis), puede necesitar varias horas. La prctica nos ir diciendo cuales son los
tiempos ms idneos para los rganos o partes de rganos que estemos utilizando.
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Lo ms importante es comprender que no existen dos muestras vegetales o tejidos iguales y, por
ello, cada una se comportar de distinta forma. Con experiencia se calcula fcilmente los tiempos
que necesitan los distintos tejidos.
CONFECCIN DE LOS BLOQUES
Se realiza de la misma forma que en histologa animal: existen pinzas (Leukart) y recipientes especiales para
realizar bloques, pero lo ms barato es confeccionar recipientes, de papel satinado o de aluminio, ms o
menos cbicos o en forma de paraleleppedo, dependiendo de las caractersticas de la muestra a incluir. Lo
ms importante en la confeccin del bloque es la orientacin que se da a la muestra, porque de ello va a
depender que el corte sea bueno o malo.
REALIZACION DE LOS CORTES
Para obtener los cortes o secciones a partir de bloque de parafina, se pueden utilizar dos tipos de microtomos
muy distintos. Microtomos tipo Minot, (Figura 3) que se caracteriza por ser mvil el bloque y fija la cuchilla,
o bien microtomos de deslizamiento, en los cuales la cuchilla es mvil y orientable, mientras que el bloque es
fijo.
Los microtomos tipo Minot son prcticos nicamente cuando se trata de
realizar cortes en tejidos blandos y sin grandes complicaciones, pero
estos microtomos tipo guillotina no son muy efectivos cuando se trata
de tejidos duros, pues se suelen romper al intentar cortarlos; esto no
slo ocurre en histologa vegetal: ciertos tejidos duros, como los tejidos
seos de los animales, se cortan igualmente mal en este tipo de microtomos. Para los tejidos duros o para aquellas muestras que presenten
gran variedad en los mismos, es mucho ms recomendable y prctico
el microtomo de deslizamiento aunque sea algo engorroso su manejo.
El grosor de los cortes que se obtienen con estos tipos de microtomos
oscila entre 10 y 20 micras, lo que se puede considerar fino, comparndolo con la magnitud de las clulas.
Los cortes se recogen sobre agua a 36-40 C, en un bao de Mara,
Figura 3. Microtomo de parafina
de aqu se pescan" sobre los portaobjetos que, previamente, se han
impregnado con una ligera capa de albmina de Mayer, y se llevan a
la estufa, durante media hora a unos 58 C. De esta forma se logra el pegado de los cortes sobre el porta
y la mejor manipulacin de stos en los procesos de desparafinacin y tincin.
DESPARAFINACIN E HIDRATADO:
Una vez pegados los cortes pueden, o bien almacenarse indefinidamente, o bien pasar a la desparafinacin
y posterior hidratacin y teido de los mismos; para ello se utiliza el proceso inverso al realizado para la
inclusin con la variante de utilizar el xileno o el benceno para eliminar la parafina. En este punto del proceso
la utilizacin de xileno o benceno en los cortes no es tan importante como cuando se incluye en parafina, ya
que el corte se encuentra pegado sobre el porta.
13
Xileno
Xileno
Alcohol etlico absoluto
Alcohol etlico absoluto
Alcohol etlico de 96
Agua
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
1/2 hora
Si los colorantes se encuentran en disolucin acuosa se realizarn todos los pasos. Es obvio que si los colorantes
a utilizar se hallan en disolucin alcohlica o en disolventes apolares (esencia de clavo, etc.) no se llegar a
la hidratacin.
Una vez hidratados, si conviene, se proceder con los cortes a la coloracin ms oportuna y de nuevo se
deshidratar para realizar el montaje permanente.
Los pasos a seguir son:
1.
2.
3.
4.
5.
Tincin
Lavado con agua destilada
Deshidratacin mediante goteo de etlico absoluto
Aclarado con creosota, aceite de clavo, xilol, etc.
Montaje permanente con Blsamo de Canad, Entelln, Euparal, etc.
En algunas ocasiones puede darse la circunstancia de que no se desee pasar las secciones realizadas por
disolvente alguno como alcohol, xileno, etc., bien por la tincin o bien porque histoqumicamente no es aconsejable, y se quiera montar de forma permanente o semipermanente un corte, para ello es necesario recurrir
a la utilizacin la glicerogelatina o glicogelatina.
INCLUSIN EN RESINAS
CONFECCIN DE LOS BLOQUES DE RESINA
En el mercado existen muchas resinas pero, para incluir tejidos vegetales, no todas dan buenos resultados;
nosotros, despus de probar varias, hemos constatado que las ms adecuadas para nuestros intereses son la
LR White y la Spurr
Se trata de resinas que penetran muy bien, son miscibles con el etanol y no totalmente hidrfobas en el caso
de la LR White. Pero lo que las hacen idneas es la gran facilidad con que penetran los colorantes una vez
polimerizadas.
El proceso de inclusin en resina vara ligeramente segn se elija una u otra.
Este proceso de inclusin puede hacerse al vaco, lo que permite, sobre todo en las muestras de tamao
grande, una infiltracin ms rpida y completa.
Los bloques se etiquetan y se guardan en un frasco de vidrio cerrado.
14
Una vez colocados los cortes pasamos el porta a una plancha de calor a 65, con ello logramos que se
evapore el agua y que los cortes queden pegados sobre el vidrio y puedan manipularse en la tincin. Si el
agua evapora a temperatura ambiente o a temperaturas inferiores a la indicada los cortes no quedan bien
pegados, y al manipularlos se desprenden. De igual modo, cortes de grosor superior a los 3 m no suelen
pegarse bien.
El material incluido en plstico no debe sufrir ms manipulacin. Normalmente las resinas que se utilizan no
interfieren en la visin microscpica de los tejidos, por lo que no hay que eliminarlas como ocurre con la
parafina.
15
deshidratar y montar de forma permanente y los inconvenientes no son mayores que los que presenta
la coloracin del azul de lactofenol. Es ms fcil de manejar que aquel.
Modo de empleo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Se colorean en azul tanto la celulosa como la calosa, aunque el citoplasma de los tubos cribosos
puede tambin aparecer teido si nos excedemos en el tiempo de permanencia en azul de anilina.
AZUL DE LACTOFENOL
Este colorante tiene afinidad por la calosa, y se usa por tanto para poner de manifiesto aquellas
paredes celulares en las que se deposita la misma: placas cribosas del floema y paredes celulares
de ciertos hongos. No es una coloracin de resultados espectaculares ni mucho menos y es necesario
que la calosa se encuentre en cierta cantidad para que se ponga de manifiesto, por tanto ser difcil
poner de manifiesto cribas jvenes. Por otra parte se usa este colorante para preparaciones extemporneas que se desechan una vez observadas al microscopio.
Modo de empleo:
1. Cubrir con el colorante el corte durante 5-10 minutos.
2. Depositar sobre el colorante y el corte un cubreobjetos y observar al microscopio.
Si se desea una preparacin permanente aadir al cubre una gota de glicerogelatina y sellar con
laca o parafina.
AZUL DE METILENO
El azul de metileno en soluciones del 1% y 0.1% se utiliza con frecuencia para poner de manifiesto
las paredes celulares de naturaleza celulsica. Se utiliza sobre todo en preparaciones extemporneas. Es un colorante poco limpio y tie muy desigualmente, por esto se recomiendan las soluciones
ms diluidas.
Modo de empleo.
1. Colorear durante 5 minutos con la solucin de azul de metileno.
2. Lavar abundantemente para eliminar los precipitados.
3. Observar al microscopio.
Si se desea conservar, esta tincin acepta la deshidratacin y el montaje permanente. Tambin se
16
Con esta doble coloracin, el floema aparece teido de verde, el esclernquima en violeta, el xilema
en azul y los parnquimas ms o menos rosados.
CARMN ACTICO
Este colorante se utiliza sobre todo para la observacin de mitosis.
Modo de empleo:
1. Hidrlisis enzimtica o bien cida de las lminas medias y paredes celulares de los meristemos, anteras, etc.
a) La hidrlisis enzimtica se realiza utilizando hemicelulasa y celulasas a una temperatura de 27-30 C durante un tiempo variable, dependiendo de la concentracin
del enzima y de la naturaleza del rgano.
b) La hidrlisis mediante cidos inorgnicos diluidos, se realiza mediante cido clorhdrico 0.1 N en caliente (60 C) durante una hora.
2. Lavar abundantemente con agua destilada.
3. Teir con carmn actico las races durante media hora en un crisol a la estufa (a 60 C).
4. Aplastar las races sobre un porta mediante una presin realizada con el cubre, hasta lograr
una capa lo ms fina y homognea posible.
5. Si se quiere conservar durante un cierto perodo, levantar con mucho cuidado el porta y
poner sobre l una o dos gotas de glicerogelatina y volverlo a dejar sobre la preparacin.
6. Sellar con laca.
17
CARMN-VERDE IODO
Una coloracin clsica de histologa vegetal, que da tambin buenos resultados, aunque su preparacin es ms engorrosa y los resultados comparables a los que se han reseado para la safraninaverde rpido; tiene la ventaja de que la tincin es permanente.
Modo de empleo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Los elementos lignificados se colorean en un azul verdoso y el resto de los tejidos en rojo carmn.
FLOROGLUCINA
La floroglucina es un mtodo de reconocimiento para la lignina, por tanto se utilizar en aquellos
tejidos que la presentan: el xilema y el esclernquima. Se conoce esta coloracin con el nombre
de test de la lignina y se realiza de manera extempornea. Existen dos formas de hacerlo.
Modo de empleo:
a) Sistema 1
1.
2.
3.
4.
b) Sistema 2
1. Cubrir el corte con una solucin alcohlica de floroglucina previamente preparada.
2. Aadir unas gotas de cido clorhdrico al 50%
3. Observar al microscopio.
Los tejidos lignificados toman una coloracin rojo cereza.
FUCSINA BSICA-VERDE DE METILO
4 partes
1 parte
18
Modo de empleo:
1. Tincin de los cortes en la mezcla, durante 8-10 min.
2. Lavar alternativamente varias veces con agua y alcohol de 96 hasta que las paredes lignificadas tomen color violceo y las otras azul verdoso.
3. Deshidratar y montar.
FUCSINA BSICA-VERDE LUZ
Esta doble tincin, que es menos usada en histologa vegetal; tiene la ventaja de colorear bien la
cutcula y los pelos de la epidermis.
Modo de empleo:
1. Colorear 10 minutos con fucsina bsica de Ziehl.
2. Lavar con agua abundantemente para eliminar el exceso de colorante y los precipitados.
3. Colorear con verde luz; si la disolucin es alcohlica, tomar la precaucin de poner
sobre el corte antes de la coloracin unas gotas de alcohol de 96.
4. Lavar con agua.
5. Deshidratar con alcohol etlico absoluto.
6. Aclarar.
7. Montar en blsamo de Canad o similar.
HEMALUM DE MAYER
Es un colorante clsico; se ha utilizado con frecuencia para teir en histologa vegetal. Colorea la
celulosa y los ncleos, debe utilizarse sobre todo en tejidos jvenes y como coloracin de contraste
la safranina.
Modo de empleo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
19
3.
20
2.
3.
4.
5.
Los tejidos lignificados y suberificados se tien de un amarillo intenso, mientras que los tejidos celulsicos aparecen coloreados de amarillo plido.
ORCENA ACTICA
Se utiliza como el carmn actico para la tincin de cromosomas por aplastamiento. Da mejores
resultados que ste y es ms fcil de preparar.
Modo de empleo:
El mismo que el carmn-actico.
SAFRANINA- VERDE RPIDO
Esta doble coloracin es muy sencilla de realizar y de muy claro contraste, pues la safranina, que
tiene afinidad muy marcada por la lignina y algo menor por la suberina, tie de rojo intenso los
tejidos que presentan lignina, como es el xilema y las distintas clulas que forman los tejidos esquelticos de la planta, mientras que el verde rpido colorea el resto de los tejidos de un verde a un
verde-azulado o bien azul, dependiendo del tratamiento que se le haya dado al corte anteriormente.
Modo de empleo:
1. Tincin con safranina 1-2 minutos.
2. Lavar con agua abundante.
3. Si existe un exceso de coloracin, diferenciar con alcohol cido y lavar despus de
nuevo con agua.
4. Deshidratar el corte con unas gotas de alcohol de 96 antes de la segunda tincin.
5. Tincin con verde rpido 1 minuto.
6. Deshidratar con alcohol etlico absoluto.
7. Aclarar.
8. Montar con blsamo de Canad o similar.
Esta doble tincin presenta el inconveniente de que se decolora a lo largo del tiempo, sobre todo el
color del verde rpido; su duracin como mximo es de 3 a 4 aos. Esta decoloracin puede evitarse
en parte si las preparaciones se mantienen al abrigo de la luz y a temperatura adecuada.
SUDN III
Es un colorante que tiene afinidad por los compuestos lipdicos, por lo cual se utiliza fundamentalmente para colorear la cutina y la suberina.
21
Mtodo de empleo:
1.
2.
3.
4.
No es una preparacin permanente; no montar en blsamo ya que se decolora. El Sudan III tie de
rojo-anaranjado la cutcula y las partes lipfilas de los cortes. Puede completarse la coloracin con
otro colorante de contraste.
TIONINA FENICADA
Es un colorante poco utilizado en histologa vegetal, aunque los resultados son muy satisfactorios; se
puede realizar una buena coloracin de contraste con rojo de rutenio.
Modo de empleo:
1.
2.
3.
4.
Los tejidos lignificados se tien de un color azul morado intenso, mientras que los no lignificados
aparecen de color prpura o rojo; no es una tincin permanente ya que despus de montadas, las
preparaciones se decoloran con el tiempo.
VESUVINA
Tie de color pardo-amarillento la celulosa. Es una coloracin delicada, pero sucia si no se tiene la
precaucin de lavar abundantemente en agua. Se puede utilizar como tincin de contraste tanto
safranina como el verde luz, que teirn las partes lignificadas del corte. Es una tincin excelente
por si sola para colorear la epidermis.
Modo de empleo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
22
1 g
5 mL
1000 mL
ALBUMINA DE MAYER
Composicin:
Clara de huevo batida
50 mL
Glicerina
50 mL
Timol o Fenol
unos cristales
Se toman dos o tres huevos y se separa la yema cuidadosamente. Las claras se baten a punto de nieve; una
vez llevadas hasta el punto de nieve se filtra durante varias horas. Se mezcla a partes iguales con glicerina
y se le aade unos cristales de timol o fenol para evitar el ataque bacteriano. Agtese bien la mezcla antes
de usarse.
COLORANTES
AZUL DE ANILINA
Composicin:
Esencia de clavo
Alcohol etlico absoluto
Azul de anilina (C.I. 42755)
100 mL
100 mL
1 g
Preparar en fro.
AZUL DE LACT0FEN0L
Composicin:
Fenol
cido lctico
Agua destilada
Glicerina
0.1
8
10
20
g
mL
mL
mL
23
0.5 g
Se disuelve calentando ligeramente el fenol, el cido lctico, el agua destilada y la glicerina; se deja enfriar
y se aade el azul de anilina. Se deja reposar durante 24 horas. Se filtra y guarda en botella de color
topacio.
AZUL DE METILENO
El azul de metileno se prepara en fro a distintas concentraciones dependiendo del uso que se quiera dar.
Las dos ms frecuentes son:
Composicin:
Azul de Metileno (C.I. 52015)
1 g
Agua destilada
1000 mL
O bien:
Azul de Metileno (C.I. 52015)
1 g
Agua destilada.
100 mL
AZUL DE METILENO-ALUMBRE
Composicin:
Sulfato alumnico potsico
10 g
Agua destilada
100 mL
Azul de metileno (C.I. 52015)
1 g
Disolver primeramente en fro el alumbre potsico en agua destilada. Una vez disuelto el alumbre se aade
el azul de metileno.
AZUL DE METILENO DE LOEFFLER
Composicin:
g
mL
mL
mL
Disolver al Azul de Metileno en el agua calentada a 50C; posteriormente, aadir los otros ingredientes.
Filtrar.
24
CARMIN ACETICO
Composicin:
Carmn (C.I. 75470)
cido actico
Agua destilada
4-5 g
45 mL
55 mL
Se disuelve el carmn en cido actico al 45% y la disolucin se calienta hasta ebullicin durante una hora,
teniendo la precaucin de refrigerar continuamente los vapores para no variar la concentracin; esto se
consigue calentando la mezcla en un Erlenmeyer cerrado mediante un tapn de goma perforado a travs
del cual se pasa un serpentn de refrigeracin.
CARMIN ALUMBRE DE GRENACHER
Frmula 1 (Langeron, 1947; Martoja, 1970; Gabe, 1968)
Composicin:
Sulfato alumnico potsico
Carmn (C.I. 75470)
Agua destilada
4 g
1 g
100 mL
Se disuelve en caliente el alumbre en agua se aade el carmn y se mantiene en caliente sin llegar a ebullicin
durante una hora, para lo cual es necesario colocar sobre Erlenmeyer un refrigerante, para evitar que vare
la concentracin. En cualquier caso se enrasa hasta el volumen primitivo con agua destilada.
CARMIN ALUMBRE
Frmula 2 (Johansen)
Composicin:
Sulfato alumnico amnico
Carmn (C.I. 75470)
Agua destilada
4 g
1 g
100 mL
Se procede para su preparacin como en la frmula anterior. Por la bibliografa consultada, y por los resultados obtenidos despus de utilizar ambos, nosotros nos inclinarnos por el uso del primero.
FABRIL
Composicin:
a) SOLUCIN A
Azul de anilina
Lactofenol
0.5 g
100 mL
25
b) SOLUCIN B
Fucsina bsica
Lactofenol
c) SOLUCIN C
Yodo
Yoduro potsico
Lactofenol
Se mezclan:
Solucin A:
Solucin B:
Solucin C:
0.5 g
100 mL
0.3 g
0.6 g
100 mL
80 mL
20 mL
100 mL
8 g
100 mL
1 g
5 g
10 mL
Mezclar en un mortero hasta conseguir un homogeneizado completo; una vez logrado, aadir lentamente:
Agua destilada
90 mL
Existen en el mercado formulaciones de Fucsina bsica segn Ziehl que evitan su preparacin en laboratorio.
GLICEROGELATINA.
Composicin:
Gelatina
Agua destilada
Glicerina
cido fnico
7
42
50
1
g
mL
mL
g
Calentar a bao Mara la gelatina, el agua destilada y la glicerina, hasta conseguir una disolucin homognea; aadir seguidamente el cido fnico y filtrar. Siempre que se use debe ser calentada a bao Mara y
26
Agua destilada
1000
Hematoxilina crist. (C.I. 75290) 1
Sulfato alumnico potsico
50
Iodato de sodio
~ 0,2
mL
g
g
g
Se disuelve el sulfato alumnico potsico (alumbre potsico) en 1 litro de agua destilada a temperatura
ordinaria; una vez disuelto, se le aade la Hematoxilina y el iodato sdico. Este ltimo se utiliza para la
maduracin rpida, pues es un oxidante que pasa la Hematoxilina a hematina. Este colorante presenta un
color violceo intenso cuando est maduro.
Una variante de esta frmula es el Hemalun cido. Para obtenerlo se aade a la frmula anterior:
Hidrato de cloral
cido ctrico
50 g
1 g
3 g
100 mL
El sulfato amnico frrico presenta una coloracin violeta claro; no confundir con el sulfato ferroso amnico o
sal de Mohr, que presenta cristales verdes, ni tampoco utilizar los cristales alterados de sulfato alumnico
frrico (cuando ste se ha alterado y presenta cristales amarillentos); seleccionar cuidadosamente los cristales
que presenten una coloracin violeta plido.
Colorante:
Hematoxilina
Alcohol de 90
1 g
10 mL
Una vez disuelta la Hematoxilina en el alcohol de 90 aadir agua destilada hasta completar 100 mL de
colorante.
27
LUGOL
Composicin:
Ioduro potsico (aprox.)
Iodo
Agua destilada
1.5 g
0.5 g
25 mL
Los 0.5 g de Iodo se disuelven en unas gotas de alcohol; todo ello es llevado hasta 25 mL con agua destilada,
a la que se aade yoduro potsico hasta saturacin. Este reactivo se halla comercializado en el mercado a
concentraciones variables.
ORCEINA ACETICA
Composicin:
Orcena
cido actico
1-2 g
45 mL
Se disuelve la orcena en caliente a 60 C en cido actico, tomando las mismas precauciones que en el
proceso de preparacin del carmn, para evitar la evaporacin del actico. Una vez enfriada la disolucin,
aadir:
Agua destilada
100 mL
PICROFUCSINA
Fucsina cida al 1.1 % en agua destilada
cido pcrico en solucin acuosa saturada
10 mL
100 mL
100 mL
1 g
1 mL
Esta solucin, como se ha dicho anteriormente, hay que prepararla inmediatamente antes de su uso, dado
que es inestable.
28
SAFRANINA
Composicin:
Alcohol etlico de 50 C
Safranina (C.I. 50240)
100 mL
1 g
2-3 g
100 mL
Se trata de una solucin saturada de Sudn III en alcohol de 70, ya que ste es insoluble en agua. La solucin
se prepara en caliente.
TIONINA FENICADA
Composicin:
Tionina
Fenol
cido actico glacial
Agua destilada
1
2.5
20
400
g
g
mL
mL
Preparar en fro.
VERDE YODO
Composicin:
Alcohol etlico 70
Verde de yodo (C.I. 42556)
100 mL
1 g
Preparar en fro.
29
VERDE LUZ
Se puede preparar tanto en disolucin acuosa como alcohlica.
Composicin:
Verde luz (C.I. 42095)
Agua destilada
0.5 g
100 mL
50 mL
50 mL
1 g
1 g
0.5 g
100 mL
30
TINCIONES TEMPORALES
PANORMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS
Y RACES.
CLORO-IODURO DE ZINC:
ALMIDN
Los pices de cebolla, ajo, o habas secas puestas a germinar, son un buen material para observar
los cromosomas de las clulas en mitosis de los meristemas.
1. Previamente se deben introducir los pices (de 2 mm de longitud) en una solucin de HCl 0.1
M.
a. Esta solucin con los pices se pasa a la estufa a unos 60C durante 10 o 15 min.
Con ello conseguimos eliminar la lmina media de las paredes celulares para que se
desagreguen con facilidad.
2. Lavamos sumergiendo en agua destilada tres cambios de 0.5 min cada uno.
3. Pasamos los pices a orcena actica reciente, y los introducimos con el colorante en la estufa
a 60 durante 4 o 5 min.
31
4. Se pasa el pice a un porta, con una gota del mismo colorante, se tapa con el cubre y se
presiona este con el dedo para aplastar el pice y disgregar las clulas del mismo (Squash).
5. Esta preparacin puede hacerse permanente, para ello se congela durante un 4 o 5 das, se
saca del congelador y, estando la muestra congelada, se separa el porta del cubre, con
precaucin. Se vierte alcohol absoluto, para deshidratar; se cubre con xileno y se tapa con
el cubre al que se le ha agregado una gota de blsamo de Canad o similar.
FABIL:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Resultados:
Celulosa
Lignina
Ncleo y cloroplastos
Rojo
Amarillo
Rojo
32
1. Se lava 10 min en agua corriente ya que las sales, especialmente el litio, del agua corriente
hacen virar la hematoxilina a un color violeta.
2. Se pasa 10 min a picrofucsina
3. Se lava 3 o 4 veces en alcohol de 96, hasta que salga limpio.
4. Se deshidrata con alcohol absoluto.
5. Se aclara con xileno y se monta con cualquier medio de montaje.
Resultados:
Celulosa
Lignina
Ncleos
Cloroplastos
Azul
Amarillo
Azul
Rojo
33
34
ESPORANGIOS DE HELECHO
Raspamos delicadamente los soros de un helecho tierno o seco sobre una gota de goma arbiga.
Esparcimos el material con una aguja enmangada.
Se deja secar la goma arbiga y se coloca una gota de blsamo de Canad para cubrir, acto
seguido con el cubre.
Al hacer la observacin microscpica, veremos esporangios: Unos enteros, los otros rotos; as como
esporas dentro de los esporangios o bien libres. Estas ltimas hay que verlas a grandes aumentos.
ESPORAS DE HONGOS
Si el material es fresco, es necesario disgregar las laminillas sobre un portaobjetos, dentro de una
gota de goma arbiga, y seguir la tcnica descrita.
Si el material es seco, hay que dejar los trozos de lminas dentro de amonaco durante unos minutos
(5 o 10), con ello se hinchan. Seguidamente se lavan con agua abundante y se procede a montarlos
como en el caso anterior.
POLEN
Para el estudio del polen, este debe ser previamente acetolizado previamente (Erdtman, 1969), as
se consigue eliminar el contenido celular y la intina del grano de polen, lo que hace fcil la observacin de la esporodermis. Esta tcnica se lleva a cabo sobre portaobjetos segn el protocolo siguiente:
1. Se desmenuzan las anteras sobre el pota.
2. Se dejan los granos de polen y se retira el material detrtico.
3. Se agrega la mezcla acetoltica (anhdrido actico-cido sulfrico 9:1) en caliente, utilizando
la llama de un mechero.
4. Se lava y se monta con glicerogelatina.
Los granos de polen suelen tener una pigmentacin variable de la exina por lo que no es necesario
teirlos.
Es recomendable la observacin de granos de polen de pino por los flotadores que tiene, as como
los de calabaza, por su morfologa y la observacin de los poros germinativos operculados.
TRICOMAS
Los tallos y las hojas estn cubiertas, a menudo, de pelos, ms o menos abundantes, extraordinariamente polimorfos, con un gran valor en taxonoma. Pueden ser pelos peltados, estrellados, escuamiformes, etc.
Su estudio nos permite comprobar, una vez ms el elevado grado de polimorfismo celular.
35
Cabe escoger, como material de estudio, plantas pubescentes, velludas; Sus hojas y tallos se rascan
suavemente, y se puede hacer un montaje al aire o con el mtodo de la goma arbiga y el blsamo
de Canad, antes citado.
No suele ser necesaria la fijacin, ya que los tricomas suelen estar formados por clulas muertas.
Son especialmente curiosos los tricomas de Eleagnus angustifolia, Olea europaea, Quercus
sp., Lavandula sp., Cistus clusii, C. albidus...
ESTOMAS
Es particularmente interesante el estudio de las epidermis foliares. Para ello basta con arrancar con
cuidado la epidermis de las hojas; las paralelinervias (monocotiledneas) nos permiten hacerlo bastante bien, tambin es fcil arrancar la epidermis de las hojas de lechuga en su zona central.
1. La epidermis arrancada se pasa a etanol de 70 para su fijacin, su delgadez hace que
basten 10 min para completar el proceso.
2. Conviene teir, en vidrio de reloj con hematoxilina al 1%, azul de metileno al 1%, violeta de
genciana al 1.5 %, o cualquier otro colorante nuclear y de la celulosa, durante 5 min.
3. Se lava sumergiendo en un tubo con agua destilada durante 5 min.
4. Se contrasta tiendo con eosina 5 min, y se vuelve a lavar durante otros 5 min.
5. Pasamos la muestra extendida al porta y cubrimos con etanol absoluto, dos veces, para
deshidratar. Se cubre inmediatamente con xileno y se coloca el cubreobjetos con una gota
de blsamo de Canad.
Resulta especialmente interesante la observacin de los estomas de Agave americana y de plantas
semejantes.
EPIDERMIS CERIFICADA
EPIDERMIS MINERALIZADA
36
EPIDERMIS SUBERIFICADA
PARNQUIMA CLOROFLICO
Hojas:
o En el haz, parnquima en empalizada.
o En el envs, parnquima de clulas redondeadas
Tallos: Normalmente bajo la epidermis hay una o dos capas de colnquima, y todo seguido
viene el parnquima cloroflico de clulas redondas.
COLNQUIMA
Hojas: Poco frecuente, aunque se puede ver en los nervios centrales de Ficus y Rhamnus.
Tallos: Muy frecuente, acostumbra a situarse bajo la epidermis formando una o dos capas.
Los tallos festoneados suelen presentar en cada saliente acmulos de colnquima de tipo
perifrico o de tipo angular. Son buenos los tallos de perejil, apio, ortiga...
ESCLERNQUIMA
Hojas: Casi nunca; en la hoja de pino, bajo la epidermis, hay una capa de esclernquima
bien desarrollada. Tambin hay entre la epidermis y los haces conductores de las monocotiledneas en general. En el nervio central de la hoja de magnolio encontramos un magnfico
anillo de esclernquima envolviendo a los haces vasculares.
Tallos: Muy frecuente bajo la epidermis (hinojo) o bien entre los vasos leosos, donde constituyen una franja continua (vid). En general podemos afirmar que los haces vasculares de la
mayora de los vegetales suelen ir acompaados de tejidos esquelticos protectores: colnquima y esclernquima.
CLULAS PTREAS.
Hojas: No suele ser frecuente, podemos verlas en Camelia japnica, Cephalotaxus, y en frutos
carnosos tales como la pera y el membrillo.
Observando detenidamente de las paredes y contrastando con el diafragma, es fcil observar los plasmodesmos de estas clulas petrosas.
VASOS CONDUCTORES.
Hojas, tallos y races.
o Son interesantes las secciones transversales de plantas de hojas no paralelinervias ya
que nos permiten ver en el mismo corte cortes longitudinales y transversales de los vasos.
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o Los cortes longitudinales de los tallos y peciolos, especialmente los de las cucurbitceas,
son muy interesantes para ver la morfologa de los vasos del xilema (espiralados, anillados, punteados, escalariformes, etc.), as como para poder ver las cribas de los vasos
de floema, sobre todo al teirlos con el azul de anilina o el azul de lactofenol.
CONDUCTOS RESINFEROS
Hojas y tallos de Pinus sp. y Abies sp.
CONDUCTOS ESENCIALES
Tallos y hojas de plantas aromticas (Rosmarinus sp., Lavandula sp., Petroselium sativum ...)
BOLSAS DE ESENCIA
Hojas de naranjo, limonero, eucaliptus...
GLNDULAS PELTADAS
Epidermis de hojas y tallos jvenes de Rosmarinus sp., Lavandula sp., Cistus clusii, etc.
GLNDULAS SSILES
Epidermis de hojas y tallos jvenes de Rosmarinus sp, Pelargonium sp....
CMARAS ESTOMTICAS
Cortes transversales de hojas de Cycas revoluta, Nerium oleander.
LENTICELAS
Epidermis suberificada de tallos, especialmente rosales y patata.
ALMIDN
Tubrculos y otros rganos de reserva: patata, zanahoria, pltano...
ALEURONA
Simientes de ricino
INCLUSIONES CRISTALINAS
Cistolitos: Cortes de hojas de Ficus sp., Parietaria officinalis, Urtica dioica...
Drusas de carbonato y oxalato clcico: Hojas, tallos y races de Magnolia sp., Lonicera sp.,
Vitis sp., Cistus sp., Rhamnus alaternus...
Rafidios: Hojas, tallos y races de Vitis vinifera, Ophris sp.
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PUNTEADURAS
En las paredes celulares de la mdula de sauco (Sambucus nigra), de Ruscus aculeatus, etc.) Encontraremos las punteaduras simples. Para observar las areoladas, hay que recurrir a los cortes de
madera de conferas en donde son especialmente abundantes.
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