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Guia de Técnicas Inmunológicas 2010 PDF
Guia de Técnicas Inmunológicas 2010 PDF
1. Interaccin antgeno-anticuerpo
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Inmunodifusin Radial
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Inmunoelectroforesis
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Citometra de Flujo
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4. Otras tcnicas
4.a. Proteinograma electrofortico
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4.b. Nefelometra
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6. Cross match
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1. INTERACCIN ANTGENO-ANTICUERPO
La unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interaccin reversible en la que estn involucrados enlaces nocovalentes. En la interaccin in vitro de un antgeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo (Ac) se
distinguen dos etapas, la interaccin primaria no visualizable y la interaccin secundaria, que sigue a la
anterior y se caracteriza por la aparicin de un fenmeno visible como la aglutinacin o la precipitacin. Por
otro lado, no siempre que se produce la interaccin primaria Ag-Ac, se produce la interaccin secundaria, ya
que, para conseguir fenmenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y caractersticas
de los Ags y Acs.
2. INTERACCIN SECUNDARIA ANTIGENO-ANTICUERPO.
Las tcnicas inmunolgicas que evidencian la interaccin Ag-Ac a travs de una reaccin secundaria
(precipitacin o aglutinacin) son, generalmente, ms econmicas y sencillas que aquellas que permiten
visualizar la interaccin primaria (ver ms adelante).
2.a. Reacciones de precipitacin
Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar lugar a
una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que
grandes complejos inmunes (CI) formados por la interaccin Ag-Ac. Tal como se observa en la figura, cuando
se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs
especficos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa
hasta alcanzar un mximo, luego del cual declina.
En un extremo de la curva de precipitacin, cuando se agregan pequeas cantidades de Ag, los CI se forman
en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de
Ag siendo pequeos y probablemente constituidos por una molcula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos
situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relacin Ag-Ac permite la formacin
de grandes redes de CI que precipitan.
Exceso
de Ac
Equivalencia
Exceso
de Ag
Cantidad de Ag agregado
La reaccin de precipitacin depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del nmero
de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de
reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla del mximo nmero de epitopes que
posee. Para que se pueda producir la interaccin secundaria Ag-Ag con la consecuente formacin del
precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos, bivalentes.
Muestra Biolgica de
concentracion desconocida
(Cx)
Rx
Halo de
precipitado
C2
C1
R1
Rx
C3
R2
R3
Curva de calibracin
C1
C2
Cx
C3
Concentracin
de la muestra
2- Inmunoelectroforesis (IEF).
La inmunoelectroforesis es una tcnica cualitativa que permite la identificacin de diferentes componentes
proteicos presentes en distintas muestras biolgicas (suero, orina, etc) a travs de arcos de precipitacin.
La tcnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas:
1)
2) Terminada la electroforesis, las protenas interaccionan con los Acs especficos aplicados en el
agar en un canal paralelo al eje de migracin. Luego de un perodo de difusin de los Acs, se
observan arcos de precipitacin cuya forma y posicin dependen de las caractersticas
inmunoqumicas y de la concentracin de cada protena.
han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar, que las reacciones de aglutinacin presentan
una menor sensibilidad que las reacciones de interaccin primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia
indirecta (ver mas adelante). Esto hace que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2
tcnicas para la deteccin de Acs contra un determinado agente patgeno. Las ventajas enumeradas hacen
de las reacciones de aglutinacin una valiosa herramienta para diversos estudios serolgicos (bsqueda de
Acs especficos contra agentes patgenos) y para la deteccin de antgenos en fluidos biolgicos.
Tipos de reacciones de aglutinacin segn las caractersticas de las partculas aglutinantes:
De acuerdo a las caractersticas de las partculas aglutinantes, las reacciones de aglutinacin pueden
clasificarse en:
- reacciones de aglutinacin activa; o
- reacciones de aglutinacin pasiva.
Las reacciones de aglutinacin activa se basan en el empleo de la partcula aglutinante como antgeno.
Como ejemplos podemos mencionar:
Partcula aglutinante
Glbulos rojos
Reaccin
Glbulos rojos
Coombs indirecta
Glbulos rojos
Bacterias (Brucella)
Coombs directa
Huddleson
Utilidad diagnstica
Determinacin de grupo sanguneo y factor
Rh
Determinacin de sensibilizacin
por
incompatibilidad Rh
Determinacin de eritroblastosis fetal
Bsqueda de Ac anti-Brucella en sueros
humanos (banco de sangre)
Bsqueda de Ac anti-T. cruzi en sueros
humanos (banco de sangre)
Bsqueda de Ac anti-T. gondii en sueros
humanos (banco de sangre)
Las reacciones de aglutinacin pasiva se basan en el empleo de una partcula aglutinante inerte a la cual
se la ha unido un antgeno. Como ejemplos podemos mencionar:
Partcula aglutinante
Reaccin
Glbulos rojos + lisado HAI-Chagas
de T. cruzi
Glbulos rojos + lisado HAI-Toxo
de T. gondii
Ltex + gp120
Ltex + sHBV
Ltex + estreptolisina O
ASTO
Utilidad diagnstica
Bsqueda de Ac anti-T. Cruzi en
sueros humanos (banco de sangre)
Bsqueda de Ac anti-T. Gondii en
sueros humanos (banco de sangre)
Bsqueda de Ac anti-VIH en sueros
humanos (banco de sangre)
Bsqueda de Ac anti-HBV en sueros
humanos (banco de sangre)
Bsqueda de Ac anti-estreptolisina O
en sueros humanos (infeccin por
estreptococo -hemoltico)
Como se desprende de la tabla anterior, los soportes particulados para las reacciones de aglutinacin
indirecta pueden ser glbulos rojos (en este caso se habla en general de hemaglutinacin) o partculas de
ltex. El empleo de este tipo de partculas inertes ha permitido extender el rango de utilidad de la tcnica de
aglutinacin a la determinacin de Ac contra agentes infecciosos tales como el VIH o el HBV, e inclusive para
la determinacin de Ac contra molculas solubles (estreptolisina O, protena C reactiva, etc.).
Como paso indispensable para la preparacin de este tipo de reactivos, es necesaria una etapa de incubacin
entre la partcula inerte y el antgeno soluble sensibilizante (en general, los Ag sensibilizantes son protenas,
aunque es posible inmovilizar hidratos de carbono), que permitir el pegado del mismo a la partcula. Este
procedimiento puede realizarse por simple adsorcin (unin no covalente del Ag a la partcula) o por unin
covalente. En la mayora de los casos se requiere un acondicionamiento previo de la superficie de la
partcula. Para el caso de los glbulos rojos, esto se logra por incubacin con cido tnico (proceso
denominado tanado) o con CrCl3. Una vez realizado el pegado del Ag a la superficie del glbulo rojo, las
partculas pueden ser fijadas con agentes qumicos tales como el glutaraldehdo con el objeto de darles
4
mayor estabilidad en el tiempo y a los cambios de temperatura, lo que aumenta la vida til del reactivo
diagnstico.
Tipos de reacciones de aglutinacin pasiva segn la identidad de la especie pegada a las partculas
aglutinantes:
Considerando que es posible inmovilizar muchos tipos diferentes de protenas a distintos tipos de
partculas inertes, es posible clasificar las reacciones de aglutinacin pasiva en:
- reacciones de aglutinacin pasiva directa; o
- reacciones de aglutinacin pasiva reversa.
Las reacciones de aglutinacin directa se basan en la sensibilizacin de la partcula inerte con el Ag, por
lo que resultan tiles para la deteccin y titulacin de Ac en distintos fluidos biolgicos. Como ejemplos, basta
repasar la informacin brindada en la tabla anterior.
Por el contrario, las reacciones de aglutinacin reversa se basan en la inmovilizacin del Ac (en
general, se inmoviliza un anticuerpo monoclonal AcMo-) en la superficie de la partcula inerte, siendo este
tipo de reacciones particularmente tiles para la deteccin de Ag en distintas muestras biolgicas.
Aglutinacin pasiva
Particula inerte
Ag soluble
Ac especfico
REVERSA
DIRECTA
Ag particulado:
cantidades constante
Suero:
Diluciones crecientes
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
AGLUTINACION
Prozona
TITULO: 32
Teniendo dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos, es posible
comparar mediante esta tcnica el ttulo de Acs en ambas muestras. Se denomina SEROCONVERSIN a la
aparicin de Acs o al aumento del ttulo de Acs en 4 veces en un periodo entre 3 y 4 semanas.
En el caso de reacciones de aglutinacin reversa, ser posible calcular una concentracin de Ag en
una muestra si se realiza en paralelo una curva de titulacin empleando una solucin estndar de Ag. Por
comparacin de la mxima dilucin de la solucin estndar que produce aglutinacin visible con la mxima
dilucin de la muestra que produce aglutinacin visible, se podr calcular la concentracin de Ag en la
muestra.
Existe adems una variante de la aglutinacin que permite calcular la concentracin de Ag en una
muestra. Dicha tcnica se denomina inhibicin de la hemaglutinacin y consiste en incubar cantidades
constantes de la partcula aglutinante sensibilizada con el Ag de inters (Ag particulado), con cantidades
constantes y aglutinantes del Ac especifico. A esta mezcla, capaz de aglutinar, se la enfrenta con cantidades
variables de Ag libre como competidor. A partir de una determinada concentracin de Ag libre, se producir
una inhibicin de la aglutinacin por competicin del Ag libre por el Ac (que de esta manera no podr unirse al
Ag particulado para aglutinar).
Inhibicin de la hemaglutinacin
Globulo rojo con Ag + Ac
(relacin aglutinante)
Sin Ag libre
Ag libre:
Diluciones crecientes
AGLUTINACION
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
Si se realiza una curva de este tipo con una solucin estndar de Ag libre se podr calcular la concentracin
(micromolar, g/ml, etc) que inhibe la aglutinacin. Luego, determinando qu dilucin de Ag libre presente en
una muestra biolgica produce dicha inhibicin de la aglutinacin, ser posible calcular la concentracin de
Ag libre en la muestra problema.
Deteccin de IgG e IgM+IgG: reacciones de aglutinacin con y sin 2-mercaptoetanol (2-ME):
Varios reactivos diagnsticos actualmente disponibles en el mercado y en los laboratorios permiten
determinar si el ttulo de Ac obtenido en una reaccin de aglutinacin directa o indirecta corresponden a IgG o
a la suma de IgM ms IgG. Esto se debe a que ambos tipos de inmunoglobulinas son aglutinantes. Por otra
parte, en muchos casos es til conocer si el paciente posee Ac de tipo IgM o IgG porque eso puede facilitar el
seguimiento del paciente o determinar un tratamiento. Para ello, se ha desarrollado la tcnica de aglutinacin
en ausencia y en presencia de 2-ME. Cuando se realiza la titulacin del suero del paciente por aglutinacin en
ausencia de 2-ME y se informa un ttulo, en realidad se est informando una actividad aglutinante que es la
suma de la actividad aglutinante de la IgM y de la IgG. Si, siguiendo el protocolo provisto por el fabricante, se
realiza la tcnica en presencia de 2-ME produce una reduccin suave/parcial de la IgM. Como la IgM
monomrica resultante no es aglutinante, el ttulo que se obtiene al realizar la tcnica de aglutinacin en
presencia de 2-ME corresponder exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG. De este modo, la
realizacin de la aglutinacin en presencia y ausencia de 2-ME permitir determinar la presencia de IgG e IgM
contra el Ag sensibilizante. En determinados casos (toxoplasmosis) es importante determinar la presencia de
IgM porque es indicio de infeccin activa. La cada en el ttulo del suero por aglutinacin en ausencia vs. en
presencia de 2-ME es indicio de la presencia de IgM especfica para el parsito.
Tcnica Inmunolgica
a- Inmunomarcacin
MARCADOR
Enzima
Fluorocromo
Sistema de deteccin
Microscopio ptico
Microscopio de fluorescencia
Citmetro de Flujo
b- Radioinmunoanlisis (RIA)
Tcnicas radioinmunomtricas
(PRIST, RAST)
c- ELISA
Istopo
Radioactivo
Contador de Radiacin
Enzima
Espectrofotmetro
3.a. INMUNOMARCACION
Las tcnicas de inmunomarcacin utilizando Ac conjugados permiten detectar la presencia de Ags en tejidos
(inmunohistoqumica) o clulas (inmunocitoqumica). La imunomarcacion de tejidos se realiza sobre cortes de
tejido fijado montado sobre un portaobjetos. A travs de estas tcnicas es posible detectar tanto Ags celulares
(de membrana, citoplasmticos o nucleares) como extracelulares (matriz extracelular, membrana basal, etc.)
La imunomarcacion de clulas puede efectuarse sobre clulas vivas o fijadas, las cuales pueden hallarse en
suspensin o adheridas a un soporte slido (portaobjetos). Esta tcnica permite detectar Ags localizados en la
membrana plasmatica, citoplasma o ncleo de la clula.
La inmunomarcacin DIRECTA es la forma mas simple de localizar un Ag y consiste en utilizar un Ac
"marcado" especfico para dicho Ag (Ac primario). Para realizar esta tcnica, se incuba la muestra con el Ac
primario "marcado" durante un determinado tiempo, a la temperatura indicada, luego del cual se retira el
exeso de Ac mediante un lavado y se procede a la deteccin de la marca.
INMUNOMARCACION DIRECTA
Ac marcado
Ag
Clula
portaobjetos
La inmunomarcacion INDIRECTA utiliza un Ac primario sin marcar que reconoce al Ag de inters y luego,
para evidenciar la presencia del Ag, emplea un segundo Ac marcado (Ac secundario) capaz de reconocer el
Ac primario. Por ejemplo, si el Ac primario es una IgG de ratn, el Ac secundario podr ser anti-IgG de ratn
hecho en conejo.
INMUNOMARCACION INDIRECTA
Ac secundario marcado
Ac primario
Ag
Clula
portaobjetos
Para realizar esta tcnica, se incuba la muestra con el Ac primario, tal como vimos anteriormente, se realiza
un lavado para retirar el exeso de Ac y luego se incuba con el segundo Ac marcado. Posteriromente se
realiza un lavado y se procede a la deteccin de la marca.
Inmunomarcacin
Directa
Indirecta
VENTAJAS
Rpida y sencilla.
Mas sensible.
Un mismo Ac secundario
puede reconocer distintos Ac
primarios (generados en la
misma especie)
DESVENTAJAS
Se necesita un Ac primario marcado
para cada Ag a detectar (los Ac
marcados son ms caros que los Ac
no marcados .
Menos sensible.
Lleva mas tiempo.
Citometra de flujo
La citometra de flujo (CMF) es un procedimiento altamente eficiente para caracterizar poblaciones celulares
que se encuentren en suspensin. En un principio, se utilizaba fundamentalmente para identificar el fenotipo
celular, es decir la expresin diferencial de antgenos en la membrana plasmtica, pero hoy da son muchos
los parmetros estructurales y funcionales que se pueden medir por CMF (Figura 1). Entre las muchas
ventajas que presenta en relacin a la microscopa de fluorescencia se encuentran la posibilidad de analizar
un nmero muy elevado de clulas en pocos segundos y la posibilidad de cuantificar la intensidad de
fluorescencia. La principal desventaja radica en el alto costo de la adquisicin y mantenimiento del citmetro
de flujo.
Figura 1:
Citmetro de flujo:
Se define como citmetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de clulas y
organelas celulares (partculas biolgicas) que fluyen en una suspensin celular. Los cell sorters tienen las
mismas prestaciones y posibilidades que los citmetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar
partculas selectivamente de la suspensin lquida.
Debido a las especiales caractersticas de los citmetros de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en
forma de suspensin monodispersa. Hay muestras como la sangre perifrica, mdula sea, u otros fluidos
biolgicos, que precisan de un mnimo procesamiento; en cambio los tumores slidos o las muestras
parafinadas necesitan de una disgregacin ms o menos intensa (mecnica, enzimtica, etc.).
Para su anlisis, las clulas en suspensin son forzadas a pasar, de a una por vez, a travs de un filamento
muy delgado. Un haz de rayo lser incide en cada clula lo que resulta en la dispersin de la luz en distintas
direcciones. Una serie de tubos fotomultiplicadores (FM) detectan la luz dispersada brindando informacin
acerca del tamao, la granularidad o complejidad celular, como as tambin de la emisin de fluorescencia en
el caso de que la clula haya unido un anticuerpo marcado con un fluorocromo.
A continuacin, se muestra un esquema de un citmetro de flujo:
Clulas
marcadas con
Acs
fluorescentes
Ac con
fluorocromo
verde
Ac con
fluorocromo
rojo
FM para
fluorescencia verde
Corriente de flujo
con las clulas
pasando de a una
FM para fluorescencia roja
Computadora
que analiza
los datos
FM para granularidad
FM para tamao
Granularidad (SSC)
Neutrfilos
Monocitos
Linfocitos
Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre perifrica humana en el que se diferencian claramente las
regiones correspondientes a los neutrfilos (de mayor complejidad granular por la presencia de lisosomas),
monocitos (de complejidad intermedia, pero mayor tamao) y linfocitos (pequeos y sin grnulos en el
citoplasma). En este caso no se utiliz ningn anticuerpo para marcar las clulas.
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2) Histograma de fluorescencia:
Clulas CD18
positivas
Nmero de clulas
Clulas no marcadas
(control de isotipo)
CD18-FITC
fluorescencia verde (FL1)
Se muestra un ejemplo de clulas de estirpe monoctica marcadas con un anticuerpo monoclonal dirigido
contra el antgeno CD18. El anticuerpo est marcado con isocianato de fluorescena (FITC) (fluorescencia
verde) y es de isotipo IgG1 murino. Como control de pegado inespecfico, las clulas se incuban, por otro
lado, con IgG1 murina marcada con FITC pero que no est dirigida contra ningn antgeno celular (control de
isotipo).
3) Grfico dot plot de fluorescencia verde (FL1) versus fluorescencia roja (FL2):
CD8-PE
CD4-FITC
Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre perifrica de un paciente con leucemia linftica crnica de
clulas B que fueron marcados simultneamente con 2 anticuerpos: anti-CD4 marcado con FITC y anti-CD8
marcado con ficoeritrina (PE) (fluorescencia roja, FL2). Se distinguen 3 poblaciones: en el cuadrante superior
izquierdo se encuentran los linfocitos T CD8 positivos, en el cuadrante inferior derecho, los T CD4 positivos y
en el cuadrante inferior izquierdo las clulas que no expresan ni CD8 ni CD4 (linfocitos B, clulas NK). La
ausencia de puntos en el cuadrante superior derecho indica que no hay clulas que expresen
simultneamente CD4 y CD8. Si se hubiesen marcado clulas de timo, la mayora de los puntos se
encontraran en el cuadrante superior derecho.
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Ag
Ag
Ag-Ac
Ag Ag Ag
Ag-Ac
Ag Ag Ag
Ag-Ac
Ag Ag
Ag-Ac
Ag Ag
Ag-Ac
Ag-Ac
Ag Ag
Ag
Ag
Ag-Ac
Ag Ag
Ag-Ac
Ag
Ag
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PRIST
Disco de papel con
Ac.de captura anti-IgE
IgE presente en el
suero del paciente
Acs anti-IgE marcado
radioactivamente
Lectura de
radioactividad
RAST
Disco de papel con
alergeno adsorbido
IgE especfica
presente en el suero
del paciente
Lectura de
radioactividad
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4.b. NEFELOMETRIA.
Las inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA tambin pueden cuantificarse por nefelometra. Para ello, el suero
incgnita deber ser incubado con exceso del anticuerpo especfico (anti-IgM, anti-IgG o anti-IgA) a fin de que
se produzca la formacin de complejos inmunes. Esta tcnica, es un mtodo ptico que cuantifica la luz
dispersada por los complejos inmunes formados, la cual es proporcional a la concentracin del antgeno
especfico (en nuestro caso, la IgM, IgG o IgA del suero incgnita).
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Protenas
con SDS
Direccin de
la migracin
Gel de
poliacrilamida
La membrana
posteriormente se marca
con los Acs especficos
Gel de poliacrilamida
Agregado del
primer Ac
Lavado y
agregado del
Ac conjugado
a una enzima
membrana
sustrato
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Variantes de la tcnica:
Mtodo de la anti-inmunoglobulina
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento de clulas mononucleares (centrifugacin en gradiente de Ficoll)
3. Siembra de clulas en fosas de placas de Terasaki*
4. Incubacin (unin de los Ac a las molculas de clase I del HLA)
5. Incubacin con IgG de conejo anti-inmunoglobulinas humanas
6. Agregado de fuente de complemento
7. Incubacin y lisis de clulas que unieron Ac
8. Agregado de un colorante de contraste para diferenciacin de clulas vivas y muertas (diacetato de
fluorescena)
9. Observacin microscpica y clasificacin o "scoring"
Consideraciones:
Origen de los sueros:
1. Suero de mujeres multparas (4 o ms hijos del mismo padre), dado que durante el parto se produce
pasaje de sangre del feto a la madre y eso permite que clulas fetales semialogeneicas acten como
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inmungenos en la madre, quien montar una respuesta inmune contra los alelos del HLA del padre que
las clulas fetales expresen.
2. Sueros de pacientes que hayan rechazado un transplante previo, donde en general se observa una
respuesta inmune humoral (y celular) dirigida contra los alelos del HLA que el transplante expresaba.
3. Sueros de pacientes politransfundidos, dado que en la sangre transfundida hay leucocitos de los
donantes, que actuarn como inmungenos en el paciente transfundido.
Ventajas:
Tcnica sencilla que requiere poco equipamiento sofisticado (microscopio invertido de epifluorescencia)
Desventajas:
La tcnica debe realizarse sin interrupcin desde su inicio hasta su finalizacin, dado que se trabaja con
clulas viables.
No se detectan Ac no fijadores de complemento, excepto en la variante que emplea la anti-inmunoglobulina
Alto costo
Baja resolucin
No existen sueros contra alelos poco frecuentes
La mayora de los sueros no son monoespecficos y adems presentan reactividad cruzada con otros alelos.
La alta homologa e identidad entre muchos epitopes de las molculas de clase I y de clase II del HLA permite
agrupar a estas molculas en "grupos de reactividad cruzada" o "CREGs"
No adecuado para tipificacin de donantes cadavricos (en especial en el caso de transplante de mdula
sea)
Interpretacin difcil por escasez de sueros monoespecficos y reactividades cruzadas
No se detecta homocigosis (en general se informa 1 alelo y el otro se informa como "blanco")
Ambigedades (no se pueden definir determinadas combinaciones de alelos)
5.b. TCNICAS MOLECULARES:
SSP
Fundamento:
En este mtodo se realiza una reaccin de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN
extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se
emplean combinaciones de oligonucletidos especficos para diferentes alelos del HLA. De esta manera se
logra la amplificacin de fragmentos de ADN de diferente longitud. El patrn de fragmentos de ADN obtenido,
que se analiza en una electroforesis en gel de agarosa, permite asignar alelos a la muestra analizada. Esto
implica que para cada muestra se deben realizar un nmero considerable de reacciones de PCR (tantas
como pares de "primers" se estn empleando, lo que a su vez se reflejar en el grado de resolucin
alcanzado).
Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento del ADN
3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes combinaciones de "primers"
4. Electroforesis en geles de agarosa conteniendo bromuro de etidio
5. Observacin del patrn de bandas de ADN amplificadas en la PCR bajo luz UV
6. Integracin de los resultados obtenidos
7. Asignacin de alelos a la muestra analizada
Esquema general de la tcnica
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Consideraciones:
Ventajas:
Tcnica sencilla que requiere poco equipamiento sofisticado (mquina para PCR)
No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera)
Resolucin mayor que las tcnicas serolgicas ("Resolucin intermedia", lo que significa que no se pueden
resolver determinadas combinaciones de alelos)
Costo relativamente bajo
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos (luego de la extraccin del ADN, luego de la PCR o luego
de la electroforesis)
Permite la deteccin de alelos "nulos"
Desventajas:
No es adecuado para tipificacin de donantes cadavricos (en especial en el caso de transplante de mdula
sea) debido a que la resolucin alcanzada es intermedia
Ambigedades (no se pueden definir determinadas combinaciones de alelos)
Cada par de "primers" permite amplificar uno o unos pocos alelos del HLA, por lo que debido al elevado
polimorfismo de este sistema, ser necesario el empleo de un gran nmero de pares de "primers" con el fin de
obtener una resolucin aceptable en la asignacin de alelos a la muestra. Por lo tanto, cada muestra requiere
de un nmero elevado de reacciones de PCR (que se realizan en forma simultnea). De esta manera el
mtodo no resulta prctico para anlisis simultneo de un gran nmero de muestras.
No se detecta homocigosis.
SSOP
Fundamento:
En este mtodo se realiza una reaccin de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN
extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se
emplean pares de oligonucletidos especficos para diferentes loci del HLA (se amplifica por separado el
locus HLA-A, el locus HLA-B, el locus HLA-C, etc). Los fragmentos de ADN amplificados son luego
inmovilizados sobre membranas de nylon e hibridizados con sondas (oligonucletidos) marcadas, especficas
para diferentes alelos del HLA. El patrn de seales obtenidas de acuerdo a las sondas que reaccionaron se
detecta con placas de autorradiografa, lo que permite asignar un alelo a la muestra analizada.
Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
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Consideraciones:
Ventajas:
No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera)
Alta resolucin
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos
Empleando un nmero suficientemente alto de sondas, es posible detectar homocigosis
Adecuado para tipificacin de donantes cadavricos
Utilizando sondas marcadas con digoxigenina y anticuerpos anti-digoxigenina marcados con perioxidasa, se
puede realizar la deteccin por quimioluminiscencia, por lo que no se generan desechos radiactivos
Permite la deteccin de alelos "nulos"
Permite el anlisis simultneo de un nmero grande de muestras
Desventajas:
Interpretacin compleja (reactividad cruzada entre sondas, deteccin de determinadas combinaciones de
alelos producen patrones similares en las placas de autorradiografa)
Las condiciones de lavado de las diferentes sondas pueden ser diferentes, lo que complica en
procesamiento simultneo de muchas muestras
A pesar de su elevada resolucin, siguen existiendo ambigedades (aunque son muchas menos que en las
tcnicas anteriores)
Tcnica compleja y costosa que requiere equipamiento algo ms sofisticado (mquina para PCR, horno para
hibridizaciones, infraestructura para manipulacin de radioistopos)
Generacin de desechos radiactivos
SBT
Fundamento:
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En este mtodo se realiza una reaccin en cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN
extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se
emplean pares de oligonucletidos especficos para diferentes loci del HLA (se amplifica por separado el
locus HLA-A, el locus HLA-B, el locus HLA-C, etc). Los fragmentos de ADN amplificados son luego
secuenciados directamente mediante el empleo de un secuenciador automtico de ADN, que adems analiza
las secuencias obtenidas y por comparacin con una base de datos interna, realiza la asignacin de alelos de
HLA a la muestra analizada.
Etapas:
1. Extraccin de sangre del paciente
2. Aislamiento del ADN
3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes "primers" especficos para diferentes loci del
HLA
4. Electroforesis en geles de agarosa para chequear la calidad de la reaccin de PCR
5. Realizacin de la reaccin de secuencia mediante el empleo de "primers" marcados con fluorocromos
adecuados para el tipo de detector que posee el secuenciador
6. Anlisis de las secuencias obtenidas
7. Comparacin con la base de datos de secuencias que posee el aparato e integracin de los resultados
obtenidos
8. Asignacin de alelos a la muestra analizada
Consideraciones:
Ventajas:
No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera)
Alta resolucin (se alcanza el mximo de resolucin posible)
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos
Ideal para la deteccin de homocigosis
ptimo para tipificacin de donantes cadavricos
Interpretacin automatizada
Permite la deteccin de alelos "nulos"
Desventajas:
Tcnica sofisticada que requiere equipamiento complejo y altamente costoso (secuenciador automtico de
ADN)
Elevado costo (todava)
Se puede analizar un nmero reducido de muestras simultneamente (dependiendo esto del tipo de detector
que posee el secuenciador)
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6. CROSS MATCH.
Objetivo:
Determinar la presencia de anticuerpos especficos contra alelos del HLA en suero de pacientes en lista de
espera para transplante de rganos slidos vascularizados.
Modalidades:
6.a. Cross-match final contra dador:
Tiene por objeto analizar la presencia de anticuerpos sricos dirigidos especficamente contra los alelos del
HLA de un posible donante. El anlisis de la presencia o ausencia de estos anticuerpos es fundamental para
decidir si el transplante se realiza o no. Esto se debe a que la presencia de este tipo de anticuerpos
preformados en el receptor de un transplante lleva inevitablemente a un rechazo hiperagudo.
Esta tcnica puede realizarse por microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki o citometra de flujo. En el
primer caso se enfrenta suero del receptor con clulas de sangre perifrica del posible donante (si es donante
vivo) o con clulas de bazo o ganglio linftico (si es donante cadavrico). Luego de una etapa de incubacin,
se agrega fuente de complemento y se prosigue con la tcnica tal como se describi en
"Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki".
En el caso del cross-match final contra dador por citometra de flujo, se enfrentan clulas mononucleares de
sangre perifrica o de bazo o ganglio linftico del posible donante, con suero del receptor. Luego de una
incubacin, se revela el sistema con inmunoglobulinas de cabra o conejo anti-inmunoglobulinas humanas,
marcadas con fluorocromos (en general se emplea isotiocianato de fluorescena). Finalmente, se analizan las
clulas en un citmetro de flujo.
6.b. Cross-match contra panel:
Tiene por objeto analizar la presencia de anticuerpos sricos dirigidos contra diferentes alelos del HLA de un
posible donante. Esta tcnica suele realizarse por microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki, donde se
enfrenta suero del receptor con clulas de sangre perifrica del diferentes individuos cuyos alelos del HLA
sean representativos de la poblacin (en general de emplean 20 individuos heterocigotas de manera de cubrir
40 alelos de cada locus). Luego de una etapa de incubacin, se agrega fuente de complemento y se prosigue
con la tcnica tal como se describi en "Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki". Mediante esta tcnica
se calcula el porcentaje de clulas que son lisadas en el ensayo, lo que es equivalente al nmero de alelos
contra los cuales el paciente posee Ac especficos, expresado como porcentaje respecto del nmero total de
alelos analizados en el ensayo. El parmetro calculado se denomina PRA ("panel reactive antibodies") y se ha
observado que existe una relacin entre el PRA y la probabilidad de xito o fracaso de un transplante renal.
*El agar es un medio de cultivo nutritivo (parece gelatina). En particular, el agar sangre est enriquecido con sangre y sirve para
detectar ciertas bacterias como Staphylococcus aureus, que liberan exotoxinas llamadas hemolisinas que son capaces de lisar los
glbulos rojos.
% Muerte
Bacteriana
tiempo
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