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Espectroscopia Luminiscente
Espectroscopia Luminiscente
han desapareado y, por tanto, estn paralelos. Estos estados pueden representarse
como sigue, donde las flechas representan la direccin del espn.
inversamente
con
la
absortividad
molar
del
pico
de
absorcin
Procesos de desactivacin
Fosforescencia
La desactivacin del estado electrnico excitado tambin puede incluir la
fosforescencia. Despus del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado, la
desactivacin posterior puede tener lugar por conversin interna o externa o por
fosforescencia.
Una transicin triplete singulete es mucho menos probable que una conversin
singulete/singulete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio de un estado triplete
excitado respecto a la emisin oscila entre 10-4 y 10 s o ms. Por tanto, la emisin
causada por una transicin de este tipo puede persistir durante algn tiempo despus
que la irradiacin se haya interrumpido.
Las conversiones externas e internas compiten con tanto xito con la fosforescencia
que este tipo de emisin se observa normalmente slo a bajas temperaturas, en
medios altamente viscosos o por molculas que estn adsorbidas sobre superficies
slidas.
Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entorno qumico van a influir en que una
sustancia sea o no luminiscente; estos factores tambin determinan la intensidad de
emisin cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.
Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico, o la eficacia cuntica, de fluorescencia de fosforescencia es
simplemente la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia
respecto al nmero total de molculas excitadas. Para molculas altamente
fluorescentes como la fluorescena, la eficacia cuntica, bajo determinadas
condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies qumicas que no presentan una
fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.
Tipos de transiciones en fluorescencia
Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorcin
de radiacin ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya que tal radiacin es
suficientemente energtica como para producir la desactivacin de los estados
excitados por predisociacin o disociacin. Por ejemplo, una radiacin de 200 nm
corresponde a aproximadamente 140 kcal/mol; la mayora de las molculas tienen al
menos algn enlace que se puede romper con energas de esta magnitud.
no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con stas
normalmente s la presentan. En los heterociclos con nitrgeno, se cree que la
transicin electrnica de ms baja energa implica a un sistema n * que
rpidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.
Sin embargo, la condensacin de anillos bencnicos para dar ncleos heterocclicos,
da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorcin. En estas
estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es ms corto, as, se observa
fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indo!.
Filtro o
Monocromador
Radiacin dispersada
de excitacin
Muestra
Fuente
Filtro o
Atenuador
del haz
Monocromador
Fotomultiplicador
de referencia
Fotomultiplicador
de la muestra
de emisin
Amplificador
diferencial
Dispositivo de lectura
Lmparas.
La lmpara ms comn para los fluormetros de filtro es la lmpara de arco de
mercurio a baja presin equipada con una ventana de slice fundida. Esta fuente emite
lneas tiles para producir la excitacin previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546,
578, 691 y 773 nm. Las lneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia
o absorcin adecuados. Ya que, en la mayora de los compuestos fluorescentes, la
fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes de onda, al menos una de las
lneas del mercurio suele resultar adecuada.
Lseres.
Desde los comienzos de los aos setenta, se utilizan tambin diversos tipos de lseres
como fuentes de excitacin para medidas de fotoluminiscencia.
Un particular inters tienen los lseres sintonizables de colorante que utilizan, como
sistema de bombeo, un lser de nitrgeno pulsante o un lser de Nd:YAG.
La mayora de los espectrofluormetros comerciales utilizan lmparas (ya descritas)
como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las
fuentes de lser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1)
cuando las muestras son muy pequeas como en cromatografa con microcolumnas y
en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2)
en los sensores de control remoto, como en la deteccin fluorimtrica de radicales
hidroxilo en la atmsfera de clorofila en seres vivos acuticos, donde la naturaleza
colimada de los haces de lseres vital: o (3) cuando se requiere una radiacin de
excitacin altamente monocromtica para minimizar los efecto de las interferencias
fluorescentes.
Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorcin se han utilizado en los
fluormetros para la seleccin de la longitud de onda del haz de excitacin y de la
radiacin fluorescente resultante, mayora de los espectrofluormetros estn equipados
con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.
Detectores
La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por ello, para su medida se
necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los
detectores ms utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar
en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relacin seal/ruido. Tambin
se utiliza, a veces, la refrigeracin de los detectores para mejorar la relacin
se utilizan
como
rectangulares, fabricadas con vidrio o con slice. Se debe tener cuidado en el diseo
del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiacin dispersada que
llega hasta el detector. Con este propsito, a menudo se introducen deflectores en el
compartimento incluso ms importante que en las medidas de absorbancia, es evitar
dejar las huellas dactilares en las cubetas y, a que la grasa de la piel con frecuencia
flurese.
Diseos de instrumentos
Fluormetros
Los fluormetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de
llevar a cabo anlisis cuantitativos por fluorescencia. Como ya se ha sealado para
seleccionar las longitudes de onda de la radiacin de excitacin y de emisin se
utilizan filtros de interferencia y de absorcin. Generalmente, los fluormetros son
compactos, robustos y fciles de usar.
La Figura muestra un esquema de un fluormetro de filtros caracterstico que consta
de una lmpara de mercurio para la excitacin de la fluorescencia y un par de tubos
fotomultiplicadores como detectores. El haz que sale de la fuente se divide cerca de
ella en un haz de referencia y en un haz de muestra. El haz de referencia se atena
mediante el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente la misma
que la intensidad de fluorescencia. Ambos haces pasan a travs del filtro primario y a
continuacin el haz de referencia se refleja hacia el tubo fotomultiplicador de
referencia.
El haz de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y provoca la
emisin de fluorescencia. La radiacin emitida pasa a travs de un segundo filtro que
posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador. Las seales de
salidas elctricas de los dos detectores se dirigen hacia un divisor analgico, para
obtener la relacin entre las intensidades de la muestra y de referencia, que sirve
como parmetro analtico.
Espectrofluormetros
Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluormetros capaces de obtener
los espectros de excitacin y los de emisin. En la Figura se muestra el diseo ptico
de uno de ellos, que utiliza dos monocromadores de red. La radiacin que procede del
primer monocromador se divide en dos, una parte se dirige hacia el fotomultiplicador
de referencia y la otra hacia la muestra. La radiacin fluorescente resultante, despus
de ser dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo
fotomultiplicador.
Un instrumento como el que se muestra en la Figura suministra perfectamente
espectros satisfactorios para el anlisis cuantitativo. Sin embargo, los espectros de
emisin obtenidos no son necesariamente comparables con los de otros instrumentos,
ya que la seal de salida depende no slo de la intensidad de fluorescencia sino
tambin de las caractersticas de la lmpara, del detector y de los monocromadores.
Todas estas caractersticas instrumentales varan con la longitud de onda y difieren de
un instrumento a otro. Se han desarrollado varios mtodos para obtener el espectro
corregido, que es el verdadero espectro de fluorescencia, libre de efectos
instrumentales; muchos de los instrumentos comerciales modernos y ms sofisticados
estn preparados para obtener directamente los espectros corregidos.
Fosformetros
Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseos
similares a los fluormetros y a los espectrofluormetros antes considerados, slo
difieren en que requieren dos componentes adicionales. El primero es un dispositivo
que irradia alternativamente la muestra y, despus de un retraso en el tiempo
adecuado, mide la intensidad de fosforescencia. El retraso en el tiempo es necesario
para diferenciar la emisin fosforescente de larga vida de la emisin fluorescente de
corta vida que podran originarse en la misma muestra. Se utilizan dispositivos
mecnicos y electrnicos y muchos instrumentos de fluorescencia comerciales tienen
accesorios para medidas de fosforescencia. Un ejemplo de un tipo de dispositivo
mecnico se muestra en la Figura.
los
mtodos
fosforescentes
son
menos
precisos
que
sus
Reactivos fluorimtricos
Los reactivos fluorimtricos de ms xito en el anlisis de cationes son los que
presentan estructuras aromticas con dos o ms grupos funcionales dadores que
permitan la formacin de quelatos con el ion metlico. A continuacin se muestran
Mtodos fosforimtricos
Los mtodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser complementarios, ya que los
compuestos fuertemente fluorescentes presentan una dbil fosforescencia y viceversa.
Por ejemplo, entre los hidrocarburos aromticos con anillos condensados, aquellos
que contienen tomos pesados como halgeno s o azufre, con frecuencia presentan
una fuerte fosforescencia; por otro lado, los mismos compuestos sin la presencia del
tomo pesado tienden a presentar fluorescencia en lugar de fosforescencia.
La fosforimetra se ha utilizado para determinar una gran variedad de especies
orgnicas y bioqumicas que incluyen sustancias como cidos nucleicos, aminocidos,
pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos del petrleo y pesticidas. Sin embargo, el
BIBLIOGRAFA
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