Produccién industrial d Acidos orginicos Resumen Durante la tiltima década ha habido una creciente presién social, ambiental (legislaciones ambientales) y empresarial (menor costo) para desarrollar métodos alternatives a la sintesis quimica que produce la gran mayoria de compuestos orgénicos del mundo. Aqui describimos el desarrollo de alternativas biotecnolégicas para la sintesis de acide aseérbico, acido glutémico, aeido citrico y salicilico por microorganismos y procesos quimicos de forma industrial, Como la ruta biosintética para la obtencién dal dcido_glutémico es muy conocida, generalmente, se utilizan cepas comerciales mutantes en el ciclo de los acidos tricarboxilicos, con un bloqueo en la a-cetogintarato deshidrogenasa, lo cual permite la acumulacién de Acido glutimico. La produccién y excrecién del exceso del Acido glutimico depende de la permeabilidad de la célula, por ello las cepas de uso comercial son bacterias seleccionadas. La sintesis quimica del Acido L-aseérbico (LAA) es un procedimiento caro y complicado que conlleva muchos pasos quimicos que parten de la D-glucosa, y un tnico paso enzimatico que implica a la enzima sorbitol-deshidrogenasa. Gracias a la tecnologia de ADN recombinante, ha sido posible aislar el gen de la 2,5-DKG-reductasa en la especie Corynebacterium y expresarlo en Erwinia berbicola. Las células de Erwinia transformadas son capaces de convertir directamente la glucosa en acido 2-KLG. En el caso de las microalgas, se da la fermentacién en una etapa utilizando Chiorelta pyrenoidosa. Pero utilizando la microalga Prototheca moriformis se consiguié la acumulacién de L-AA en el medio de fermentacién. El proceso general de obtencin de dcido citrico mediante fermentaciones es Ilevado a cabo por Aspergillus niger. Actualmente se utiliza ampliamente el cultivo en superficie, lo que exige un control extremado de la concentracién de iones Mn’ y una alta concentracién de oxigeno disuelto y tambign, es esencial mantener el pH por debajo de 2.0. También se comercializé un proceso de cultivo sumergido con levaduras del genero Candida y més adelante se estudiaron otros métodos mis eficientes de produccién con la cepa Yarrowia, que es capaz de utilizar las n-parafinas y los fcidos grasos como fuentes de earbono. El acido salicilico se emplea en varios tratamientos médicos siendo su principal uso la produceién de Aspirina®. La produccién industrial de acido acetilsalicilico se lleva a cabo mediante sintesis quimica empleando compuestos como el fenol. El modo de operaci6n es principalmente discontinuo, alcanzando el rendimiento de la reaccién valores del 90% aproximadamente.Produccién industrial de acidos organicos Introduccién La produceién microbiana de dcidos orgénicos es un método prometedor para la obtencién, de sustancias de interés comercial que est desplazando paulatinamente los métodos de sintesis quimica. Ain asi, hay algunos procesos quimicos de produccién de acidos organicos que contintian utilizindose en la industria, como el caso del dcido salicilico y acide acetilsalicilico. La ventaja de usar microorganismos para la produccién industrial © combinar su uso con procesos quimicos de sintesis, es prineipalmente la habilidad de sintetizar enantiomeros especificos, por su crecimiento a gran escala y la separacién ficil de productos y substrates, ademas, la gran diversidad _metabélica permite su aplicacion como productores de metabolitos primarios y secundarios. El hecho de conocer en profiundidad los procesos biologicos y fisiologicos de la produceién microbiana ha hecho viable la produceién a gran escala de dcidos orginieos.Se ha conseguido aumentar los rendimientos de los microorganismos aplicados en Ja industria mediante la obtencion de mutantes (técnicas de mutagénesis, recombinacién genética, fusion de protoplastos), el empleo de tecnologia de DNA recombinante (introduccién de enzimas claves para Ia utilizacion de nuevos sustratos, ete), el diseito y seleccién de medios de cultivo y fermentadores que maximicen la produccién, disminuyan los costes o faciliten la recuperacién de productos, el disetio y seleccién de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes. Produccién de acido glutamico © Elacido glutamico El Acido glutimico es uno de los aminodcidos mas importantes, tanto por su abundaneia en la composicién de las proteinas (6.3%), como por su papel en el intercambio de energia entre los tejidos y el crecimiento celular (Alberts B. ef al, 2002). Aislado del gluten de trigo por H. Ritthausen en 1866, este aminofcido, o su forma ionizada, el glutamato (abreviado Glu o E), pertenece al grupo de los Iamados aminoicidos acidos, o con carga negativa a pH fisiolégico, debido a que presenta un segundo grupo carboxilo en su cadena lateral (como se observa en la ilustracién) (Anfinsen, CB. 1992).Produccién industrial d Acidos orginicos Imagen 1, Estructura del acido glutémico, conformacién plana y tridimensional. En 1908 Ikeda descubrié que este compuesto era el responsable de Ia potenciacién del sabor e11 sopas y alimentos derivados del alga Laminaria japonica, utilizada en la cocina Taponesa. Es por ello, que hoy dia se conoce su propiedad de proporcionar un sabor peculiar denominado “umami”, considerado como “el quinto sabor”. En la industria alimentatia, el dcido glutémico se utiliza como potenciador del sabor en sazones y condimentos en forma de glutamato monosédieo (MGS o E621) (Kirimura J. ef ai. 1969). Adems de intervenir en reacciones de transaminacién y en la sintesis de diferentes aminoacidos como la prolina, hidroxiprolina, omitina y arginina, el acido glutimico es el neurotransmisor excitatorio por excelencia de la corteza cerebral humana, Normalmente, funciona como mensajero quimico en Ja sinapsis neuronal, pero por encima de unos niveles criticos, el glutamato puede convertirse en un téxico para el sistema nervioso, provocando su degeneracién y muerte, por lo que se le clasifica como excitotoxina (Palucha A. ef al. 2005), En los iiltimos 30 aiios, el uso de esta excitotoxina en la alimentaci6n ha suscitado mucha controversia a raiz de diversos articulos cientificos sobre el papel de esta sustancia en la patogénesis y la patologia de muchas enfermedades del sistema nervioso central (SNC) y ottas enfermedades agudas y cronicas. En 1968, se describieron las reacciones agudas que pueden darse poco después de ingerir alimentos que contengan glutamato (dolores de cabeza, debilidad, entumecimiento, palpitaciones, asma, problemas de sueio, dolores abdominales, calambres, hormigueo, opresién en al pecho, ete.), es decir, lo que se denominé el “sindrome de restaurante chino” (Rejane G. et al. 2002). A pesar de los numerosos estudios que han demostrado Ia toxicidad del glutamato, la legislaci6n espafola permite hasta 10g/Kg de E-621 (glutamato sédico) solo o en combinacién con otros aditivos como el E-620 0 del E-622 al E625, en su funcidn de aditivo alimentario general 3Produccién industrial d icidos organicos (Salvo en alimentos para lactantes y niflos de corta edad), mientras que en los condimentos y aderezos se permite la dosis maxima de quantum satis, es decir, un nivel méximo no especificado (BOE, 22/01/1986) © Ruta biosintética del acido glutimico Los aminoftcidos podemos clasificarlos en esenciales, que son aquellos que no somos capaces de sintetizar metabolitamente y que tenemos que incorporarlos en nuestra dieta, y los no esenciales que son aquellos que si podemos sintetizar. Los aminoacidos no esenciales se sintetizan a partir de precursores que derivan de distintas rutas metabdlicas, entre las que destacan: Rata metabdlica Precursor de aminodcido 3-Fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato Piruvato Oxalacetato a-Cetoglutarato, Pentosas-fosfato Ribosa-S-fosfato El dcido glutimico, o glutamato, es un aminodcido no esencial, que deriva directamente de un intermediario del ciclo de Krebs, concretamente el a-cetoglutarato. Esta conversién es posible principalmente gracias a la accién de enzimas como la Glutamato deshidrogenasa, capaz de catalizar la reaceién: o-cetoglutarato + NH + NADPH + H™ > glutamato + NADP Y en menor medida por otras enzimas como la Glutamato sintasa, que usa la glutamina como donadora del grupo amonio: [e-cetoghatarato + glutamina ~ NADPH = H- > 2 glutamate + NADP” O la Carbamilfosfato sintetasa, que lo sintetiza de forma indirecta: [COs + giutamina = 2 ATP > carbamil fosfato + giutamato ~ 2 ADP = P| Gracias a estas tres enzimas, podemos obtener anab6licamente el écido glutamico o su forma ionizada, el glutamato (Stryer, 2003)Produccién industrial de acidos organicos En condiciones dptimas para la produccién de glutamato a partir de glueosa, predomina la ruta de Embden-Meyerhof-Pamas 0 Glucélisis que dirige los precursores del carbono hacia el ciclo del Acido citrico o ciclo de Krebs. El NADPH + H™ formado en Ia descarboxilacién oxidativa del isocitrato a a-cetoglutarato suministra el cofactor reducido, que, junto con el NHs, se necesita para la conversién de a-cetoglutarato a glutamato por la accién de la glutamato deshidrogenasa (Lehninger, 2005), = | a= Imagen 2. Desvio de los productos de la glucélisis al ciclo de Krebs. Las cepas productoras de dcido glutémico comercial carecen del enzima g-cetoglutarato deshidrogenasa del ciclo del acido citric y por consigniente, en ausencia de iones NH” aunque con suficiente oxigeno, el Acido a-cetoglutérico se acumula (Lehninger, 2005). Los compuestos intermedios del ciclo de Krebs, necesarios para el aprovisionamiento del oxalacetato que interviene en la reaccién de condensacién de las citrato sintetasa y otras reacciones celulares, provienen de reacciones anaplerdticas, como el paso de fosfvenolpiruvato cou la adiceion de CO» a oxalacetato. Por otta parte, los compuestos intermedios del ciclo de Krebs pueden provenir del ciclo del glioxilato, Estequiométricamente a partir de 14 moles de glucosa se obtiene 1 mol de glutamato mediante el ciclo del glioxilato, mientras que la ruta que implica la fijacion del didxido de carbono bajo la accién de la fosfoenolpinnvato carboxilasa es més eficaz y produce 2 moles de glutamato por 1 mol de glucosa (Lehninger, 2005)Produccién industrial de acidos organicos Es por ello, que con el objeto de incrementar la eficacia de la conversion se han introducido en Ja produccién algunos mutantes que tienen niveles bajos del enzima isocitrato liasa del ciclo del glioxilato, En el esquema adjunto se muestra la via metabélica seguida para la produecién de glutamato a partir de glucosa, destacando las enzimas clave en el proceso (Lehninger, 2005) Sestrogenase * Produccién Industrial del acido glutamico En 1909, Saburosuke Suzuki and Ikeda levaron a cabo por primera vez la produccin industrial de L-glutamato monosédico (MSG). El primer proceso de produccién industrial consisti6 en la extraccién de glutamato a partir de proteinas vegetales, las cuales eran tratadas con Acido hidrocloridrico para romper los enlaces peptidicos. El acido -glutamico era entonces aislado desde este material y purificado como MSG. Esta produccién inicial de MSG estaba limitada debido a los problemas técnicos que presentaba el método para ser desarrollado a gran escala (Sano C., 2009), Extracci6n de tejidos vegetales La proteina vegetal hidrolizada (PVH) es fuente de glutamato procesado en la que hay concentraciones altas de dicho compuesto. Las proteinas hidrolizadas que se utilizan para realzar el sabor se preparan utilizando acidos o enzimas que permiten digerir quimicamente la harina de soja. el gluten de trigo, las cepas comestibles de levadura, etc. Este proceso, que consiste en hervir productos vegetales en un recipiente leno de Acido sulfirico durante varias horas, para Inego neutralizar el dcido con sosa céustica, descompone las proteinas en sus aminodcidos constituyentes. Asi se obtiene un fango de color marron que se recoge y se deja secar. El producto final es un polvoProduccién industrial d icidos organicos marron con altas concentraciones de glutamato, Ademés, igual que el glutamato obtenido por fermentacién, la PVH contiene las mismas sustancias cancerigenas que este tipo de glutamato, asi como las formas D y L de esta sustaneia (Sano C., 2009). ‘Mejoras en la produecién del Acido glutimico no aparecieron hasta los aos 50s. Una de estas mejoras consistia en la sintesis quimica directa, que fue utilizada para la produecion de MSG desde 1962 hasta 1973 (Sano C.,. 2009), intesis quimica El acrilonitrilo se forma cataliticamente con CO/H2 y en presencia de [Co(CO)s]2, para dar un. aldebido que mediante la reaccién de Strecker, en presencia de acido ciauhidrico y amoniaco, se transforma en el dinitrilo del acido glutamico. En medio basico se obtiene la mezela racémica del Acido glutimico, que contiene los isémeros D y L: HC=CH-CN > OHC-CH.-CH:-CN > NC-CH(NH:)-CH)-CH2-CN > acido D.L-Glutamico La separacion de Ia mezela racémica se cousigue favoreciendo la cristalizacion de acide L~ glutamico a partir de la disolucién sobresaturada de la mezela de isémeros mediante siembra con el derivado L (Sano C., 2009). Es importante hacer mencién a la estereoisomerfa del producto obtenido. El glutamato natural, que se encuentra en el organismo humano y en los productos vegetales y animales, es el acido L~ ghutamico. El glutamato procesado obtenido por procesos industriales diferentes a la fermentacin no contiene solamente Acido L-ghitémico, sino también su isémero el Acido D-ghitimico, cuya estructura difiere quimicamente. Las enzimas digestivas que metabolizan el acido L-g reconocen el Acido D-glutmico, dado que se trata de una sustancia extraiia para el organismo. El glutamato procesado siempre contiene cantidades iguales de Acido L-glutimico y Acido D- glutémico, ademas de otras sustancias cancerigenas como el acido piroglutémico, el monocloro y el dicloro propanol y las aminas heterociclicas. Para eliminar el ismero D, tendriamos que realizar técnicas de resolucion de la mezela racémica de los isomeros (Sano C., 2009). En 1956 se desarroll6 un método de fermentaci6n para la producci6n del éeido glutémico. Las ventajas de la fermentacién (reduccién de los costes de produccién, reduccién del impacto medioambiental, etc.) eran lo suficientemente buenas como para hacer que todos los fabricantes de glutamato adoptaran el nuevo método. Hoy en dia, la produccién mundial total de MSG mediante fermentacién es de unos 2 millones de toneladas anuales (2 billones Kg/aito), (Sano C., 2009).Fermentacién Industrial Trane rreaze Antceciny [ decor Fermertectn + Evaorcn Cencertecon I Chetateaen sesieacon + Seren Separacin I sweats Neuraeacn I treone — Produccién industrial d icidos orginicos De todos los procesos de produceién de aminodcidos, el del dcido L-glutimico es probablemente el més importante en téminos cuantitatives. En el esquema, observames un diagrama de flujo del proceso de produecién industrial que a continuacion detallaremos. El primer paso en la produceién industrial de Acido glutamico es la preparacién del medio de cultivo, que va a estar formado principalmente por melazas, producto liquido espeso derivado de la cala de aziicar y en menor medida de la remolacha azncarera, obtenido del residuo restante en las cubas de extraccién de los aziicares. Para ello, en fermentadores a escala industrial (tanques reactores de 450 m? de acero inoxidable con agitacién) se mezcla las melazas con amoniaco para formar un caldo o extracto que sera fermentado aerébicamente durante 30-40 horas a una temperatura de 30-37° C (dependiendo del microorganismo utilizado). Este proceso, con generalmente una configuracién productiva en lote, es realizado para cultivar bacterias capaces de convertir el carbono presente en la melaza en n de fcido glutamico (Tsao JH. ef al. 1991). alutamina necesaria para la produeci Se conocen numerosos microorganismos capaces de produeirlo a partir de diferentes fuentes de carbono, entre los més importantes se encuentran, © Arthrobacter globiformis (Veldkamp H. ef al, 1963). © Brevibacterium sp. (K. Madhavan Nampoothiri, 1996). © Corynecabrerium glutamicum (Delaunay S. et al. 2002). En todos los casos se aleanzan concentraciones de 100 g/l o superiores, lo que supone un rendimiento de produceién del 48.6% y uma conversi6n de Acido glutémico a glutamato monosédico del 92% aproximadamente.Produccién industrial de acidos organicos Moises rie ‘one Arve) Tone Imagen 3: Diagrama esquemético del sistema de fermentacion A partir de este diagrama general de Ja fermentacién, iremos detallando los componentes necesarios para aleanzar un rendimiento adecuado en la produccién de Acido glutamico por este procedimiento (Tsao J.H. ef al, 1991). La fuente de nitrégeno (sales aménicas, urea o amonio) es aiiadida lentamente para evitar la inhibicién de la produccién de L-glutamato. La concentracién de los iones amonio debe mantenerse a un nivel bajo en el medio, puesto que las concentraciones altas son perjudiciales para el crecimiento celular y la formacién de producto. El pH es mantenido de 7-8 por la adiccién de tampones basicos, de otra manera el pH progresivamente iria cayendo conforme el Acido glutamico fuera secretado y el ién amonio asimilado. Para evitarlo se aliade amoniaco gaseoso con objeto de controlar simultaneamente el nivel de nitrégeno del medio y mantener un pH estable. Aparte de las fuentes de C y N, el medio de fermentacién debe contener sales inorganicas, que proporcionan Mg’ , Mn", PO,° y K”, y por iiltimo, niveles limitantes de biotina (Tsao JH. ef al. 1991). Todas las cepas productoras de Acido glutimico necesitan para su crecimiento biotina que es una coenzima esencial en la sintesis de Acidos grasos. La acumulacién del aminodcido en cuestion es maxima a una concentracién de biotina eritica de 0.5 yg/e de céhulas (secas), que es subéptima para un crecimiento maximo. La biotina es un cofaetor de la acetil CoA earboxilasa, primer enzima en Ia muta biosintética del écido oleico (Cie:, insaturado) y su posterior incorporacién a los fosfolipidos. Si la bacteria erece en altas concentraciones de biotina, se aumenta la sintesis de 4cido oleico y se tiene un alto contenido de fosfolipidos en la membrana celular. El alto contenido deProduccién industrial d icidos organicos fosfolipidos impide la excrecién del Acido glutimico originando que la sintesis intracelular se detenga por retroinhibicién. Si la cepa erece en un medio deficiente en biotina se reduce la sintesis de fosfolipidos y la membrana se daiia Hevando a una relacién diferente entre Acidos grasos saturados y no saturados. En estas condiciones el dcido glutimico intracelular se excreta ficilmente (Tsao LH. ef al, 1991), La fuente de carbono preferida son los carbohidratos, preferiblemente glucosa © sacarosa, pero en Ia actualidad se esti optando por los tallos 0 melazas de remolachas. Cuando se utiliza esta fuente de carbono, el medio requiere modificaciones como la de Los niveles de biotina, que tienden a ser demasiados altos. Esto puede arreglarse por la adiccién de acidos grasos saturados, penicilina © surfactantes con los que se ayuda a secretar el producto. Los acids grasos saturados de 16 y 18 atomos de carbono inhiben la acetil CoA earboxilasa. Los fosfolipidos regulan la permeabilidad de la célula al glutamato y las concentraciones subéptimas de biotina 0 los acids grasos de fosfolipidos en la célula, y por tanto aumentan la permeabilidad de la célula al glutamato, La penicilina inhibe la sintesis de las paredes bacterianas y la acumulaci6n intensificada de glutamato. Se cree que esto se produce porqne las células se hinchan y las paredes se debilitan, daitando la barrera de permeabilidad de la membrana celular Morfologica y fisiolégicamente todas las cepas usadas son muy parecidas a C. glutamicum, es decir, son gram-positivas que no esporulan y que no tienen motilidad. Todos los productores de Acido glutamico requieren de bictina, y carecen o tienen poea actividad de 1a enzima a-cetoglutarato deshidrogenasa y una alta actividad de glutamato deshidrogenasa. Se puede usar, las células en solucién, si se usan medios viscosos como las melazas, o inmovilizada en poliacrilamida si se usan medios, menos viscosos como soluciones de azticares. La muta biosintética para la obtencién del Acido glutamico es muy conocida. Usando glucosa como fuente de carbono, se usa la ruta Embden-Meyethof-Pamas y el ciclo pentosa-fosfato, canalizindolos al cielo de los acidos tricarboxilicos. Generalmente, se utilizan cepas comerciales mutantes en este diltimo ciclo, con un bloqueo en Ia g-cetoglutarato deshidrogenasa, lo cual permite Ja acumulacién de acido glutamico. La estequiometria de la reaccién con base en glucosa es de 1 mol de aminodeido por 1.4 mol de glucosa, 10Produccién industrial de acidos organicos La produecién y exerecion del exceso del fcido glutamico depende de la permeabilidad de la célula, por ello las cepas de uso comercial son bacteria seleccionadas a través de los siguientes mecanismos: © Deficiencia de biotina * Deficiencia de acido oleico en auxétrofos de fcido oleico. A través de la adiccion de acidos grasos saturados. © Através de la adiccién de penicilina * Deficiencia de glicerol en auxétrofos de glicerol. 8 gin?) —— Initial glutamic ecid production found ol oooe § °C ofttnenecrrenent $s] 3 aq 3 i. 3 ° . 8 2 woh 20 Time t Imagen 4: Estimacién de la concentracion de écido glutamico En la grifica se observa como se logra alcanzar concentraciones de mas de 50 Kg/m? de acido alutamico tras 20 horas de fermentacién, esto se puede extender a cualquiera de las cepas anteriormente citadas (Isao J.H. ef al. 1991). Una vez fermentado, el caldo concentrado es acidificado para producir acido glutamico en fonma de cristales, Este proceso es realizado por medio de la bajada del pH hasta su punto isoeléctrico (pl 3.2) afiadiendo acido clorhidrico a través de una serie de tanques de enftiamiento diseftados para reducir gradualmente la temperatura y el pH del caldo Posteriommente, este caldo concentrado en acido glutimico cristalizado es neutralizado aitadiendo cenizas de sosa (hidroxido de sodio, NaOH) para producir glutamato monosddieo (MSG) de forma cruda, La solucién de MSG sera refinada y decolorizada para luego ser transferida a un evaporador donde sera concentrada para la iltima etapa La etapa final consiste en centrifugar los cristales de MSG para la eliminacién total del agua Por tltimo, los cristales de MSG refinados son secados y empaquetados en cajas de carton. itProduccién industrial de acidos organicos Produccién de acido ascérbico © Elacido ascérbico El acido ascérbico es un acido de azticar, nutriente fundamental para los humanos y otros animales. El nombre de "asc6rbico" le viene del prefijo a- (que significa "no") y de la palabra latina scorbuticus (escorbuto), una enfermedad causada por la deficiencia de vitamina C. Sin embargo, en el momento de su descubrimiento, en los aitos 20, fue Hamado Acido hexurénico por algunos investigadores. Su aspecto es de polvo o cristales de color blanco-amarillento y es soluble en agua. May fragil en solucién, se destrnye al contacto con el aire, por la luz o el calor HO, HO: HO ‘OH Imagen 1. Estructura molecular y tridimensional del acido L-ascérbico, En 1937, Walter Haworth recibié el Premio Nobel de Quimica por su trabajo en la determinacién de la estructura del Acido ascérbico (compartido con Paul Karrer, que recibié su premio por el trabajo con las vitamins), Ese mismo aiio el premio de Fisiologia y Medicina fue para Albert Szent-Gydrayi por sus estudios de las funciones bioldgicas del acido L-ascérbico. El enantiémero L de este dcido, acido L-aseérbico (L-AA), se conoce populamente como vitamina C, y tiene importantes propiedades antioxidantes, ya que reacciona con radicales libres de oxigeno (ROS) muy reactivos, como el anién superdxido y los radicales hidroxilos, que estan implicados en muchas enfermedades crdnicas, incluyendo el cancer y las enfermedades cardiovasculares. Su funcién antioxidante es posible porque la molécula de Acido L-ascérbico esta disponible para una oxidacién energéticamente favorable. Los ROS contienen electrones no emparejado, por lo que son muy reactivos y perjudiciales a nivel molecular porque interaceionan con los fcidos nucleicos, proteinas y lipides, alter’ndolos.El ascorbato actiia oxidando a los ROS, 12Produccién industrial de acidos organicos formando primero monodehidroascorbato y Iuego dehidroascorbato, Las especies reactivas de oxigeno son reducidas a agua, mientras que las formas oxidadas del ascorbato son relativamente estables y no reaetivas, por lo que no causan daito celular (Sauberlich, 1994), A nivel fisiolégico, el acido L-aseérbieo actiia como cofactor para un gran nfimero de metaloenzimas. Es necesario para la sintesis de coligeno y los globulos rojos, y contribuye al buen funcionamiento del sistema inmunitario. También juega un papel en el metabolismo del hierro, en la transformacién de dopamina en noradrenalina y en la biosintesis de camitina (Hancock R.D. er al. 2001). H,0# 0 — om Disproportionation = L-Ascorbie acid eH « Dehydroascorbate chow *H,0 Oyo. ° Monodehydroascorbate © nou — 2,3-Diketo-L-wulonic acid -Erythroascorbie acid Imagen 2. Acido L-ascérbico, los productos resultantes de su oxidacién y otros compuestos relacionados. El fcido L-ascérbico se oxida a monodehidroascorbato (MHDA), que se reorganiza dando dehidroascorbato (DHA). Ambos compuestos se pueden volver a reducir para generar el Acido L-ascérbico. El DHA es muy inestable y suele hidrolizarse dando 2,3-diketo. gulonic acid,Produccién industrial d icidos organicos El Acido ascérbieo y sus sales de sodio, potasio y calcio suelen usarse como aditivos antioxidantes de los alimentos. Estos compuestos son solubles en agua y, por tanto, no pueden proteger a las grasas de la oxidacién, Para este iiltimo fin pueden usarse como antioxidantes los Esteres de fcido ascérbico solubles en grasa, con acidos grasos de cadena larga, como el palmitato de ascorbilo 0 el estereato de ascorbilo. El eédigo de aditivos E que se usan en Europa con este Acido organico son (Garcia J.M., 2009). © E300: Acido aseérbico, Ascorbato de sodio. o E302: Ascorbato de calcio. © E303: Ascorbato de potasio. © E304: Acidos grasos ésteres de Acido ascérbico: (i) palmitato de ascorbilo y (ii) estereato de ascorbilo, Como ya hemos destacado, su principal fiuncién es la de antioxidante, y con este fin, también se emplea la forma R del Acido aseérbico, Ia cual, al contrario que la forma L, no presenta actividad vitaminica. * Rutab tética del 4 lo ascorbico El deido ascérbico se encuentra en animales, plantas y microorganismos, ya que todos los seres vivos lo necesitan, Aunque el aeido ascérbico sea un nutriente eseneial para el ser humano (por lo que es Iamado vitamina C), en realidad es un metabolito natural producido en el higado en la mayoria de los animales. En el caso de Los animales, los reptiles y los érdenes mas antignos de aves sintetizan el dcido ascérbico en los riliones. Los érdenes recientes de aves y la mayor parte de mamiferos sintetizan el Acido ascérbico en el higado, donde la enzima L-gulonolactona oxidasa convierte la glucosa en Acido ascérbico. Los bumanos y algunos primates no son capaces de sintetizar la L-gulonolactona oxidasa debido a un defecto genético, y son por tanto incapaces de fabricar acido ascérbico en el higado (Hancock R.D. ef a/. 2001). Esta mutacion genética ocurrié hace aproximadamente 63 millones de aftos y hubiese tenido consecuencias letales para los primates si no fuera porque muchos de los productos alimenticios que consumian contenian acido ascorbico (Chatterjee 1973), 14Produccién industrial de acidos organicos LeAscotic aid CC Inversion = C1 bosomes C5 according to tales of atbhydrnenomesclatere oronico reductasa; 2 L sn 3. Ruta biosintética de Acido ascérbico a partir de D- gulono-1,4-lactona hidrolasa: 3 L osa en animales. Enzimas: 1 D~icido lono-1_4-lactona oxidasa La ruta biosintética del dcido ascérbico en plantas, juega un papel crucial en la detoxificacion del peroxido, ozono y radicales libres, y es esencial para la actividad fotosintética porque regenera Jos antioxidantes solubles de In membrana y permite el control del pH a través del complejo fotosintético PS II de los cloroplastos. Las células vegetales acummlan grandes cantidades de acido L-ascérbieo, sobretodo en los tejidos verdes y los érganos de almacenamiento (Hancock R.D. et al. 2001). Dr-ptamo omest | a - PathwayProduccién industrial d icidos orginicos Imagen 4. Ruta biosintética del Acido L-ascérbico en plantas. Enzimas: | hexokinasa; 2 hexosa fosfato isomerasa; 3 fosfomanosa isomerasa; 4 fosfomanosa mutasa; 5 GDP-manosa pirofosforilasa; 6 GDP manosa- 3,5-epimerasa; 7 L-galactosa deshidrogena ctono-1,4-lactona deshidrogenasa; 9 D-arabinosa deshidrogenasa; 10 D-arabinono-1,4-lactona oxidasa. Las enzimas que intervienen en la hidrolisis de GDP- L-galactosa no han sido aun determinadas. © Produccién Industrial de acido ascorbico Actualmente, la produccién mundial de Acido L-ascérbieo es de 80,000 toneladas al aiio, generando beneficios de unos $ 6000 millones en el mercado global, y hasta la fecha su produccion presenta una tasa anual de crecimiento de entre el 34%, Aproximadamente el 50% del Acido ascérbico sintetizado se emplea para la prtoduccién de suplementos vitaminicos y ottas preparaciones famacéuticas. Pero esta creciendo la demanda de este compuesto para la elaboracion de productos cosméticos, debido 2 sus potentes propiedades antioxidantes, y a estimulacion que produce en la sintesis de colageno. El 25% de la prodnecién mundial se destina a la industria alimentaria, como aditivo, y el 15% a la fabricacion de preparados para la prevencion de la decoloracion de los productos, la proteccién del aroma y el sabor, y para mejorar su contenido nutricional. Se estima que entomo al 10% de la produccién total se destina a la fabricacién de piensos animales, a pesar de que para los animales de granja no es un nutriente esencial, ya que pueden sintetizarlo ellos mismos. Donde si es importante es en acuicultura, ya que algunas especies de peces como el salmén no son capaces de sintetizar el Acido ascérbico de nove (Hancock R.D. et al. 2002). Aislado originariamente de citricos, la primera sintesis de deido L-asc6rbico a partir de L~ xilosona se consiguid en 1933 (Reichstein er al., 1933). Ya en 1934, se desarrollé el proceso que permitia su produceién a partir de D-glucosa (Reichstein and Grissner, 1934). Hoy en dia, este proceso denominado sintesis de Reichstein-Grilssner se sigue utilizando actualmente con pequetlas modificaciones, El proceso consta de varias etapas quimicas y una conversion enzimética, se trata por tanto de un proceso mixto fermentacién/quimico. La etapa de oxidacién desde D-sorbitol a L- sorbosa se lleva a cabo mediante Acetobacter suboxydans en. un proceso sumergido a 30-35°C, con agitacion y aireacién vigorosas. El sorbitol se afiade a una concentracién inicial del 20% en una solucién nutritiva que consiste en 0.5% de extracto de levadura o liquido de maceracién de maiz y CaCO, La conversion esta completada en 24h; concentraciones mis altas de sorbitol prolongan el tiempo de conversion. En el proceso global se produce aproximadamente 1 kg de acido L-aseérbico a partir de 2 kg de glucosa (Hancock RD. et al. 2002) 16Produccién industrial de acidos organicos D-Glucose Ni 80-125 atm ZL 140-150°C ewes) p-Sorbitol [Fermentation L-Sorbose CHyCOCHs cone HzSO4 pre S04) Ceseoe | 2 Diacetone-t-sorbose Pa 2-Keto--gulonic acid HCI (CH3OH A Jat) 2-Keto--gulonic acid methylester (C2Hg0H ___1008¢ L-Ascorbie acid TRENDS Bao Imagen 5. Proceso de Reichstein-Griissner para la produccién industrial de acido L-ascérbico. La sintesis quimica del fcido L-ascérbico es un procedimiento caro y complicado que coulleva muchos pasos quimicos que parten de la D-glucosa, y un tnico paso enzimético que implica a la enzima sorbitol-deshidrogenasa, La iiltima etapa del proceso es Ja transformacién catalizada del acido 2-ceto-L-gulcénico en Acido L-aseérbico, ‘Actualmente la mayor parte de la vitamina C producida se fabrica mediante fermentacién con Ja ayuda de microorganismos modificados genéticamente, ya que es mas barato que la sintesis quimica o mixta (Bremus C. ef al. 2006). 7Produccién industrial de acidos organicos Se ha observado que, en la naturaleza, algunas bacterias como Acetobacter, Gluconbacter y Enwinia, son capaces de transformar la glucosa en acido 2,5-diceto-D-gulénico (2,5-DKG), mientras que otras, Corynebacterium, Brevibacterivm y Arthrobacter, son capaces de transformar el Acido 2,5-DKG en dcido 2-KLG gracias a la enzima 2,5-DKG-reductasa. Gracias a la tecnologia de ADN recombinante, ha sido posible aislar el gen de la 2,5-DKG-reductasa en la especie Corynebacterium y expresatlo en Erwinia berbicola, capaz de transformar la glucosa en 2,3-DKG ‘gracias a tres enzimas. Las células de Erwinia transformadas son capaces de convertir directamente Ja glucosa en acido 2-KLG (Bremus C. et al, 2006). (0) inv Rechte Grosser method [> Damenaertane —>“cletone 00 (sper Hexine ——+ vse: 2220". serpoge FADS. serposone reo sen | Gus miBS8i| £ ea ‘-Gulnate roosion Fee 5 xtc ghnonate Poo () Gray —— oe eas Grune, a not, nen Pomona Omcomte SHEA gee eS ancobic acid Pantoos FAD. (i) Sonoyara PHO eon oe ee ° Be as elt | GAO " 2so%an i Imagen 6. Comparacién entre la produccién de Acido L-ascorbico utilizando microbacterias 0 mediante el método clésico de Reichstein. (i) Método quimico de Reichstein y Gritssner (1934) en el que se introdujo la biotransformacién de D-sorbitol a L-sorbosa. (ii) Métodos que emplean las enzimas L-sorbasa deshidrogenasa (Sugisawa et al., 1990; Saito et al., 1997, 1998). (ii) 2-KLGA sintesis a partir de D-glucosa (Sonoyama et al, 1982: Anderson et al., 1985). (iv) Conversién de D-glnconato mediante 5-ceto-D- gluconato (Gray, 1945) Los principales requerimientos para sintesis de vitamina C se pueden resumir en la quiralidad del producto, ya que sélo el L-enantiémero del dcido ascérbico es activo biolégicamente, y que la ctapa final del proceso no sea oxidativa debido ya que el ascorbato es muy ficilmente oxidable. En 1982, Sonoyama desarrollé un proceso de fermentacién en dos etapas. La primera etapa implica la oxidacién de la glucosa por una especie del género Erwinia a acido 2,5 diceto-D- glueénico (2,5-DKG). Durante una incubacién de 26h se forman 328 g/l de 2,5-DKG caleieo con 18,Produccién industrial d icidos orginicos una eficiencia del 94%, La segunda etapa, una reduecion de 2,5-DKG a Acido 2-ceto-L-gul6nico (2- KLG), la lleva a cabo Corynebacterium. En este proceso, una vez que Corynebacterium ha erecido durante 16h, se le suplementa con el cultivo anterior de Erwinia esterilizado. Después de 66h de incubaciou se obtiene 2-ceto-L-gulonate cAlcico con una eficiencia del 92%. Este ultimo producto es transformado quimicamente con facilidad (mediante dos reacciones quimicas similares a las del proceso Reichstein) a fcido L-ascérbico siendo el balance total, basado en consumo de glucosa, del 86%, Este método es mis econémico que el método Reichestein y permite reducir el consumo de solventes téxicos, lo que coulleva a una menor cantidad de productos de deshecho (Bremus C. ef al. 2006), ‘No obstante, el mejor camino para convertir la glucosa en 2-KLG deberia ser el utilizar un tinico microorganismo que fuviera todos los enzimas que se requieren en esta conversion. Puesto que la conversion de D-glucosa en 2.5-DKG por Erwinia herbicola incluye varios pasos enzimaticos, mientras que la transformacién de 2,5-DKG a 2-KLG por Corynebacterium requiere sélo uno, a estrategia mas simple para convertir D-glucosa en 2-KLG seria aislar el gen de la 2 DKG reductasa de Corynebacterium y expresarlo en Erwinia herbicola. Esto es lo que hicieron los cientificos de la compaitia Genentech en 1985, abriendo la posibilidad de realizar un proceso de produccién mediante fermentacién en una sola etapa a partir de ghicosa a Acido 2-ceto-L-gulénico (Bremus C. ef ai, 2006), on Erwinia yp Goss Conynabnocteriom wp 2, S-Diheto-0-ghrconic acid et) eno oon 0} Ho. ‘OM Conynabocteriom sp. HO © Okcoe 2-Kato-t-qdont ood (2810) Imagen 7. Comparacién entre la conversion de D-glucosa en 2-KLG realizado en una fermentacién en dos pasos, wlilizando Erwinia y Corynebacterium, o en wma fermentacién simple, empleando la cepa E. herbicola expresando al enzima 2,5-DKG reductasa de Coryne! icterium. 19Produccién industrial de acidos organicos \Z faa Imagen 8. Metabolismo de la glucosa en la cepa recombinante de &. herbicola, en el que se producen los precursores para la produccién de acido L-ascérbico. Por otra parte, las levaduras no son capaces de sintetizar Acido ascérbico, pero si producen un compuesto llamado Acido D-eritroascérbico (D-EAA). Esta sustancia tiene caracteristicas redox, similares y puede ser utilizada como antioxidante en aplicaciones industriales. Es interesante que los dos titimos pasos de la sintesis de D-EAA se parecen a la ruta de sintesis de L-Acido glutémico ex plantas (Bremus C. er al. 2006). Wenn a OL Xe Nou - # x Galactose Vtitoned scion ei oH owed DALOe 0 Ty NN ry ds NADP NADPH HO, — A P-Arabinono-t lactone DErythroascorbic acid Imagen 9. Comparacién entre la ruta biosintética de acido L-ascérbico en plantas y la produccién de Acido D-critroascorbico en levaduras. En el caso de las microalgas, se da la fermentacién en una etapa utilizando Chlorella pyrenoidosa, Se consiguieron unos 40 mg/L de L-Acido aseérbico (L-AA) cultivando la especie 20Produccién industrial de acidos organicos silvestre, Tras ciclos de mutagénesis quimica se llegaron a producir hasta 2g/L de L-AA (imas 70 veces mis). En este proceso el L-AA permanece en el interior celular. La acumulacién de L-AA en el medio de fermentacién se consiguié utilizando la microalga Protorheca moriformis. Se observé que reduciendo el pH se podia estabilizar el L-AA en el caldo de fermentacién y recogerlo del medio. El nivel de L-AA estaba comrelacionado con la actividad de la enzima GDP-D-Man-3.3- epimerasa, que cataliza la conversion de GDP-D-Man a GDP-L-Gal. En la imagen siguiente, podemos apreciar el detalle de esta reaccion (Bremus C. ef al. 2006). CH,OH (gr0H 4 H cy Q 0, Q nf 4 4A 4 Hanon Ni n/onon \Y OXgH ou oH O-soP He NY oH Ho OH Hoon oo On DGlucose —r—>—» GDP-Mannose —» GDP-LGslectose —> L-Golactose Imagen 10. Ruta propuesta para la sintesis de acido L-ascérbico a partir de D-glucosa en P. moriformis. Solo se nuestran las 5 iiltimas reacciones, Produccién de Acido citrico © Elacido citrico El Acido co citrato, su forma ionizada, es un Acido orginico tricarboxilico ampliamente distribuido en la naturaleza (MacKee, 2003), ya que se encuentra en la mayoria de las firutas, especialmente en los citricos como el limén y la naranja. (Grewal, 1995). Su nomenclatura, segtin la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), es (Acido) 3- hidroxi-1,3,5-pentanotricarboxilico y su formula qnimica general corresponde a Cély07, siendo su estructura la del modelo anexo. (Lehninger, 2005)Produccién industrial d dos organicos Imagen 1. Estructura del 4cido citrico En bioquimica aparece como un metabolito intermediario en el ciclo de los Acidos tricarboxilicos, una ruta que es realizada por la mayoria de los seres vivos. (Lehninger, 2005) El cittato tiene gran nimero de aplicaciones industriales. Un uso muy habitual es como aditive en muchos tipos de bebidas y alimentos (principalmente en la industria de la reposteria), proporeionando un gusto Acido o afiutado. También puede usarse como plastificador y como antiespumante (inhibidor de la formacién de espuma) en la fabricacién de ciertas resinas, como mordiente para colores brillantes y como antioxidante para conservar las propiedades organclépticas de los alimentos (G. Calabuit, 2004). Ademas, gracias a sus tres grupos carboxilos cargados negativamente, el citrato es un buen quelante de iones metélicos. Esto tiene un gran interés en el terreno agricola, ya que en el suelo existen cantidad de iones metalicos que pueden ser toxicos para ciertas plantas (este es el caso del Al’) (Turgut, 2004). Si se consigniera por ingenieria genética que la planta sensible a este ién sintetizara grandes cantidades de Acido citrico, podria ser resistente en este medio, y la produccién aumentaria en un alto porcentaje. * Ruta biosintética del Acido Citrico, El ciclo del Acido citrico es la via final comin para Ja oxidacion de las moléculas energéticas: carbohidratos, acidos grasos y aminofcidos, ete. entrando la mayoria en el cielo como acetil-coenzima A, que es generado a partir de la descarboxilacion oxidativa del pirvato que se obtiene de la glucosa en condiciones aerobias. (JM. Berg 2007) El ciclo comienza con la condensacién de oxalacetato (Cs) y acetil-CoA (C2) para dar citrato (Ce) que se isomeriza a isocitrato (Cs). La descarboxilacion oxidativa de este intermediario produce a- cetoglutarato (Cs). La segunda molécula de diésido de carbono se desprende en la reacci6a siguiente, en la que el a-cetoglutarato se descarboxila oxidativamente generando succinil-CoA. El enlace tioéster del succinil-CoA se rompe por el ortofosfato para producir succinato, y se genera simultineamente un enlace fosfato de alta energia en forma de GTP. El succinato se oxida hasta fumarato (C.), que se hidrata para formar malato (C,). Finalmente el malato se oxida para regenerar el oxalacetato (C4). Asi pues, dos étomos 22Produccién industrial de acidos organicos de carbono en forma de acetil-CoA entran en el ciclo y dos étomos de carbono dejan el ciclo en la forma de CQ; en las descarboxilaciones sucesivas catalizadas por Ia isocitrato deshidrogenasa y In a-cetoghutarato deshidrogenasa. Este ciclo se describe detalladamente en la siguiente imagen. (Lehninger. 2005) Imagen 2. Esquema del cielo del ée. Citrico En Jas cuatro reacciones de oxidacion-reduceion que tienen lugar en el ciclo se transfieren tres pares de electrones al NAD* y un par al FAD. Estos transportadores de electrones reducidos son oxidados a continuacién por Ia cadena de transporte de electrones para generar aproximadamente 9 moléculas de ATP. Ademas, en el ciclo del acido citrico se forman directamente un enlace fosforilo de alta energia de transfierencia. De aqui que por cada fragmento de dos carbonos oxidado completamente hasta HO y COz se generen un total de 10 moléculas de compuestos con enlaces fosforilo de alta energi. (JM. Berg 2007) El cielo del decide cittico opera solamente en condiciones aerSbicus porque requiere el suministro de NAD” y FAD, La irreversible formacién de acetil-CoA a partir de piruvato ¢s un punto de regulacién importante para Ia entrada en el ciclo del pirtvato derivado de la plucosa. La actividad del complejo pirnvato deshidrogenasa esta estrictamente controlada mediante fosforilacion reversible, Los aceptores de electrones se regeneran cuando NADH y FADH: tuansfieren sus electrones al O: en la cadena de transporte de electromes, con la subsiguiente formacién de ATP. En consecuencia, la velocidad del ciclo del Acido citrico depende de las necesidades de ATP. En los euicariotas, oto punto importante de control es la regulacién de ta actividad de dos enzimas del ciclo, Una carga energética clevada disminuye Ia actividad de ta isocitrato deshidrogenasa y de la g-cetoglutarato deshidrogenasa. Estos mecanismos se complementan entre si, reduciendo Ja velocidad de formacién de acetil-CoA cuando la cargaProduccién industrial de acidos organicos energética de Las células es alta y cuando los intermediarios biosintéticos som abundantes. (J.M. Berg. 2007) ‘Cuando ta eétula dispone de energia suficiente, el cielo del deido eitrico puede servir como fuente de precursores de biomoléculas importantes. tales como las bases de los nucledtidos, las proteinas, y los grupos hemo. Esta utilizacién consume los intermediarios del ciclo, Cuando en el ciclo nuevamente se precisa x tabolizar moléculas energéticas, las reacci eS anaplexsticas reponen los intermediarios que se necesitan. (J.M. Berg 2007) + Produccidn Industrial de] Acido Citrico Inicialmente se extvaia del zumo de limén, posterionmente se sintetizaba a partir de glicerol y de otros compuestos quimicos, y finalmente, desde 1923, se obtiene por fermentacién industrial (King and Cheetham, 1987). En 1933, la produecion mundial anual supers las 10,000 toneladas, de Jas cuales, mis del 80% se obtuvieron por fermentacién. Con Ia sustitucién de los polifosfates por el citrato de sodio en los detergentes en 1970, el mercado anual crecié ripidamente y actualmente se estima que se producen aproximadamente 1.6 millones de toneladas anuales (Berovie, 2007). Jnicialmente se utilizaron métodos de cultive en superficie con Aspergillus niger, después de la Segunda Guerra Mundial se introdujeron procesos de cultive sumergidos también con . niger. Aproximadamente en 1977 se comercializ6 un proceso de cultivo sumergido con levaduras del genero Caveida (Betancourt, 2003) y mas adelante se estudiaton ottos métodos de produceiéa con Ja cepa Yarrowia (Papanikolaou, 2008), En.2004 comenzaron a desarrollarse investigaciones con el objetivo de encontrar microorganisms productores de dcido eitrico y que, a diferencia de A. niger pudieran acceder a las n-parafinas (Crolla, 2004) y los sicidos grasos (como las grasas an wiles) (Papanikolaou, 2006) para utilizazlos como fuentes de carbouo. La levadura Yarrowia lipolytica cumple este perfil y ademas resulta eficiente en la produccién de acide citrico de otras fuentes. tales como la ghucosa y sacarosa (Foster, 2007), Dadas estas condiciones, Y. lipolytica es utilizada a escala industrial, aunque poco se conoce sobre los detalles de Jos métados o los voltimenes de produccién, ya que su desarrollo atin se encuentra en estadios muy tempranos, (Sauer. 2008) El proceso general de obtencién de Acido citrico: mediante fermentaciones Ievada a cabo por A. niger tiene varias fases:Produccién industrial de acidos orginicos A. niger puede utilizar como sustrato sacarosa, glucosa, finctosa y maltosa, (Drysdale, 1995), El primer paso consiste en acondicionar las melazas obtenidas de la caiia de azicar ola remolacha, que consiste en mezelar el jarabe com agua para diluirlo y pasarle por un filtro de vacio para eliminar los sélidos suspendidos y Ins impurezas de la melaza, (Citrie Acid Production, Patented Nov. 15, 1966) Preparacién del inéculo: dejar erecer pellets de A. niger en agitacién y buenas condici nes de aiveacién a una temperatura de 27 °C durante 2-3 dias ea un medio de la misma composicion que el medio de produceién (Darouneh, 2009) Fermentacidn aerdbiea del sustrato + Cultivo en superficie: se siembra el inéculo en la superficie del medio de eultivo en bandgjas de acero inoxidable w otto tipo de superficies planas. Estas bandejas se apilan en las salas de fermentacion, donde se suministra aire filtrado que sirve tanto para el suministro de oxigeno como para controlar In temperatura de fermentacién. (Meers & Milson, 1987) + Cultive sumergide: Los microorganismos se crecen en el caldo de fermentacién directamente, al cual hay que ajustarle el PH y afiadir autrientes. La fermentacién se leva a cabo en tanques reados y agitados de acero inoxidable en tes que ia transferencia de oxigeno se realiza mediante burbujas de aire, lo cual también asegura una homogeneizacién de la mezela en el fermentador. (Darotmel, 2009) ‘Cuando s¢ aleanza la concentracion maxima de Acido eitrie en el cu de A. niger se separan del caldo de fermentacion mediante filtracién, (Darouneb, 2009), La biomasa obtenida se lava con agua para eliminar los restos de acide citrico yell agua de lavado se ailade al licor prinsipar, (Darouneh, 2009) EL Acido eitrico debe ser separado de la biomasa, el aziicar residual (restos de sustrato), las Proteinas prodkicidas por la fermentacion y otras impurezas solubles. Este proceso se puede llevar a cabo mediante varias operaciones, por ejemplo mediante la adicion de hidroxide calcico con la comsecuente formacion de un precipitado insoluble en forma de grimulos que se compone principalmente de citrato célcico ademas de células, (Rottigni, 1981)Produccién industrial de acidos orginicos Adicion de Acido sulfiico para descomponer el citrato de calcio. $e forma sulfato de calcio el cual es retiredo de la solucién por medio de un filtro rotatorio al vacio y se coustituye como un desperdicio o como un subproducto del proceso. (Grewal, 1995) Eliminacién de impurezas eon earbon activade y resinas de intercambio ionice (Grewal, 1995) Concent i del licor mediante evaporacidn (aproximadamente a 40°C) Finalmente, s¢ leva a cabo la cristalizacién (20-25°C), obteniéndose cristales de Acido citrico hidratados que se someten a deshidratacion y se empaquetan para su distribucién. (Grewal, 1995) Para recuperar el Acido citrico del cultivo, también se han utilizado métodos de extraccién con solventes como el 2-butanol o el tributil-fosfato, (Colins, 1960) (Colins, 1962). La “Food & Drugs Administration” de EEUU recomienda como solvente para extraccién una mezcla de n-octil aleohol y tidodecilamina. (U.S. Food & Drugs Administration, 1975), ‘Tratamiento Cristalizacion [> tataciéu del sustrato = Deshidratacion | Eliminacion | Fermentacion de impurezas Empaquetado + Separacion Imagen 4.: Diagra del proceso de produccién de acido citricaProduccién industrial de acidos orginicos Imagen 5.: Diagrama de flujo de la produccién del Ac. Citrico realizado con cl programa Aspen Plus En In siguiente tabla se nmestran las principales caracteristicas de los procesas industriales jimplicadas: Fermentaciones industriales de cid cliriew Aspens Amwereitos mar vain Cuno en super Cultivo i prolu Sahu pst ai Son 200500 ar Conkaavespoms Insel vegeraning Ind. prepare co uonEs roparado ced end fermentor 20 Eimemtagor cee werntwa ators ‘cman inal Sin de cposan Fermensacioa pH Incitmente$0-70para le germinaciéa/ pH 45-65 para of ‘cwcimiento de AL niger. Caida por erecrlenio, Pur ‘dcbnjo de 20 para la fave de produc: de perverse ae ‘ion de crate Sescienda hasta 38 ara ia peo sdactid de Gia moe r 27Produccién industrial de acidos organicos ‘Aivescibn “anslerencia OS erm firansfe: O84 vem (ante suncdoy de oigens, encia de oxigeno, sencia de oxigen, fenirnmiento ——meclado en el reac mmactado en fom for aptado por ine, tor agitad ‘ensiim de Os ele por aive ada > 140m ba, La fermencacisn ‘es muy seasibe sl onigene. Media Melaras 0 jarabes de plucoia ademds de nutes iso ign 40 20 gam? as 20 ge? Preisiamioios La somssotracin tabs en mangncso Nose ace pee- “Id neck cnige que el mec se pre-uiecombe-tmumlenio con racianoferate 0 tones sobre tons ceaicos uns datos ELNNY estimuta a prodiccibn de 1a iit, de itd ry 19 deere a ssumul. de digo Morfolosa mice- La tains ness tana en forma ‘fia para ls acura de griloe Ince de seis ‘wen = colimen ale por ida de volomen Gr mee por mle Imagen 6: Pardmctros relevantes cn la produccién de Acido citrieo Actualmente ain se utiliza ampliamente el cultive en superficie con 4. niger, puesto que, aunque es un proceso que requiere mds trabajo que el de cultive sumergido, las necesidades energéticas son menores. Ea los procesos suumergidos se prefieren fermentadores agitados por aire, que permiten utilizar recipientes de mayor tamaiio, ya que este producto es de un volumen de produecién alto entre los obtenidos por fermentacién. (Darouneh, 2009) La materia prima que mas se utiliza para la produecién de citrato, las melazas, tiene el problema de 1a gran variabilidad del material. En las fermentaciones sumergidas con 4. niger Ins concentraciones elevadas de azticar estimulan la producci6n de citrato obteniéndose rendimientos Dajos cuando la concentracién de aziicar es infévior a M0 kein’, En general, se suminisua nitrgeno a una concentracién de 0.1 - 0.4 g/L. La adicién de NH." durante Ia fermentaci aumenta Ia produceién de citrato. (Sauer, 2008) La produceién de sicido citric con 4. niger es extremadamente sensible a la concentraci de jones Mu, de forma que su produccién se ve ya dristicumente reducida a un nivel de manganeso del orden de 3 mg/L (Papagianni, 2007) Por tanto, es necesario pretratar las melazas con agentes que acomplejen o precipiten este metal, por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) 0 con eobre, que contrarresta el efecto del manganesa al hibir su absoreién por las células. Las condiciones deficientes en manganeso también favorecen la produecion de pequeios erinulos aivelianos con supetficies lisas y compactas, caracteristicos de las bueuas fermentaciones fiimgicas de citrate, Cuando la concei m dé manganeso aumenta, la morfologia fiimgica se vuelve 28Produccién industrial de acidos organicos filamentosa, incrementando drésticamente Ia velocidad del cultivo y disminuyendo rapidamente de forma concomitante Ia tensién de oxigeno disuelto. Como 1a produccién de Acido citrico necesita oxigeno, la velocidad de produceién de deido aumenta a medida que aumenta la cantidad de oxigeno disuelto, Ademas, una corta intertupcién del suministro de oxigeno puede condueir al ease ureversible de la produccion de citrato, Para la biosintesis de citrato es esencial mantener el pH por debajo de 2.0, puesto que pH superiones, 4. niger acumula dcido glucdnieo en ver de citvato. (D.S. ‘Clarek, 2004) Las cepas de levadura que se usan actualmente o fueron empleadas alguna vez en procesos industriales de produccién de Acido citrica som: ffbrae, subtropicales, fipolitica, oleophila, sevlonoides y, en mayor medida, guifliermonali, La produccion de eitrato con Ceirclider difiere em varios aspectos del proceso sumergida con 4. niger.. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no 85 un prerrequisito, siendo innecesaria una etapa de pretratamiento para eliminar este metal del medio; el citrato se produce a un pH superior (4.0-7.0). (Rottigni, 1981) Ademés, la limitacién de nitrogeno provoca la acummulacién de Acido. La principal ventaja del proceso que emplea Candice respecto al que emplea 4. niger consiste en que la productividad global de In fermentacion es superior, ya que se pueden utilizar eoncentraciones de aziiear mis altas debido-a Ia uaturaleza aniis ‘osmotolerante de los organismos y adems la fermentacion es unas ripidda, (Grewal, 1995) El proceso metabélico que conduce a la acumulacién de eitrato implica a) La descomposicion de las hexosas a piruvato y aeetil-Coa. b) La formacidn anaplerética de oxalacetato a partir de piruvato ¥ COs c) La acumulacién de citrato dentro del ciclo de los acidos tricarboxilicos. En este esquema no deberia eliminarse CO; durante 1a produceién de citrato, puesto que el CQ) liberado en la descarboxilacién oxidativa del pimvato a acetil-CoA deberia utilizarse en la sonversién de piruvato en oxalacetato. La enzima clave que eataliza esta reaecion, la pirwvato carboxilasa, la producen intrinsecamente las especies Aspergillus. Las concentraciones elevadas de aziicar aumentan ademas la actividad de esta enzima asi como la de las enzimas glucoliticas y pueden inhibir algunas de las enzimas del cielo de los feidos tricarboxilicos. Para que se acumule citrate es necesario que al menos una de las enzimas de este ciclo resulte inhibida. Las evidencias recientes sugieren que la principal etapa reguladora es al de a-cetoglutarato deshidrogenasa, etapa Timitante de la velocidad en el ciclo y la tinica reaccién ineversible. Esta enzima se inhibe al incrementar Ins concentraciones fisiolégicas de oxalacetato y NADH durante la produccién de