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Manualtoxicología 2014
Manualtoxicología 2014
Laboratorio de Toxicologa
Laboratorio de Toxicologa
Laboratorio de Toxicologa
Laboratorio de Toxicologa
Laboratorio de Toxicologa
Laboratorio de Toxicologa
NDICE
Prlogo
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96
104
Laboratorio de Toxicologa
PRLOGO
En noviembre de 2004, el H. Consejo Tcnico de la Facultad aprob las modificaciones al plan de
estudios de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB), y en junio de 2005 fue aprobado
por el Consejo Acadmico del rea de las Ciencias Biolgicas y de la Salud (CAABYS). De tal
manera, que a partir del semestre 06-I se inici la implantacin gradual del mapa curricular del plan
de estudios 2005.
En este nuevo mapa curricular, la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con clave 1614,
qued ubicada en el 6 semestre para la carrera de QFB. El diseo del actual contenido
programtico de la asignatura fue pensado para revisar los conocimientos bsicos de Toxicologa
como: citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y
teratognesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposicin, toxocintica
y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobiticos frmacos, metales
pesados y sustancias de abuso. A travs del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al
perfil del egresado en el diseo, evaluacin y produccin de medicamentos, produccin de reactivos
para diagnstico, diagnstico de laboratorio, investigacin biomdica y conservacin del medio
ambiente.
En consecuencia, el grupo de profesores de Toxicologa, en forma colegiada, decidi realizar la
actualizacin y modificacin del curso prctico, incluyendo algunos temas de inters actual en esta
asignatura y rediseando los existentes, de acuerdo con la reforma a la enseanza experimental
(Hernndez y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prcticas con el
apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovacin y
Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo cual permiti la adquisicin de equipos, materiales
y reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura.
Con base en lo anterior, los autores presentamos este Manual de guiones experimentales para la
enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa, el cual est constituido por diez prcticas
que cubren las unidades temticas del curso (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar
los conocimientos tericos adquiridos en la asignatura. Asimismo, los guiones propician la
integracin de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como
Bioqumica, Farmacologa, Qumica Analtica, y Qumica Orgnica, as como su correspondiente
aplicacin en la resolucin de problemas de esta rea.
Laboratorio de Toxicologa
Curso laboratorio
Guin experimental
Extraccin y cuantificacin de txicos no
voltiles en una muestra problema
Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como
txico voltil, a partir de glucsidos cianognicos
Produccin de metahemoglobina por nitritos y
efecto protector del azul de metileno in vivo
Determinacin de malatin residual
Determinacin de la actividad antioxidante de la
quercetina y el cido nordihidroguayartico
Evaluacin de la actividad genotxica de la
ciclofosfamida utilizando la tcnica de
microncleos en mdula sea
Efectos txicos de plomo en ratas
Efecto del pH en la liberacin de plomo por
utensilios de barro vidriado
Determinacin de etanol en una muestra
problema
Identificacin de alcaloides y barbitricos en
muestras problema
Curso terico
Unidad temtica
Introduccin a la Toxicologa
La biotransformacin de xenobiticos
y su importancia toxicolgica
La biotransformacin de xenobiticos
y su importancia toxicolgica
La biotransformacin de xenobiticos
y su importancia toxicolgica
El estrs oxidante
Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis
Toxicidad de metales pesados
Toxicidad de metales pesados
Toxicidad de sustancias de abuso
Toxicidad de sustancias de abuso
Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales.
Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la
Enseanza Experimental, donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias
observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado
a los mismos a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las
relaciones causa-efecto de stos a travs del trabajo experimental.
Cada uno de los guiones est estructurado de la siguiente manera:
OBJETIVO ACADMICO
Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases tericas, as como
el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y tcnicas analticas empleadas
comnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobiticos.
PROBLEMA
Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante con fenmenos relacionados con el rea,
que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs
del trabajo experimental; encontrando las relaciones causa-efecto y relacionando estos
hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial toxicolgico.
Laboratorio de Toxicologa
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que
permitan resolver el PROBLEMA.
CUESTIONARIO
Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA,
resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar
el proceso cognoscitivo.
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
Este apndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante
comprenda el guin y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
En este apndice se indican las cantidades necesarias para la preparacin de los reactivos
a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL.
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
Considerando que en cada sesin de laboratorio se generan un nmero importante de residuos,
se contempl la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos, as como la manera en
que debern ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento.
Hernndez Luna, M. y Llano Lomas, M. (1994) Propuesta de Reforma de la Enseanza Experimental en Revista
del IMIQ, Ao XXV, vol. 07, pp. 5-7.
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Laboratorio de Toxicologa
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Laboratorio de Toxicologa
ARTCULO 14. En cada laboratorio deber existir un botiqun de primeros auxilios al alcance de todas las personas
que en l trabajen. El responsable del rea deber verificar, al menos una vez cada semana, el contenido del
botiqun, para reponer los faltantes.
ARTCULO 15. Los extintores de incendios debern ser de CO2 y de polvo qumico seco, segn lo determine la
Subcomisin Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; debern recargarse
cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisin o por haber sido utilizados.
ARTCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de
seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo:
-
ARTCULO 17. Los sistemas de extraccin de gases debern mantenerse siempre sin obstculos que impidan que
cumplan con su funcin, evaluarse al menos una vez cada mes y recibir el mantenimiento preventivo o correctivo
que los responsables de cada rea soliciten.
ARTCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, debern recibir el
mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten.
ARTCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y
todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este
Reglamento en su totalidad; los anaqueles y reas de almacenamiento debern contar con la proteccin adecuada
para prevenir accidentes.
ARTCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio. Los manuales de
prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de la disposicin de los residuos.
ARTCULO 21. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido
pipetear con la boca.
ARTCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea deber verificar que queden
cerradas las llaves de gas, agua, vaco, tanques de gases y aire, segn sea el caso; apagadas las bombas de vaco,
circuitos elctricos, luces, etc. En caso de requerir que algn equipo trabaje de manera continua, deber dejarse,
tanto en el interior como en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la
informacin acerca del tipo de reaccin o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de
controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo.
ARTCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias txicas, deber identificarse plenamente el rea respectiva.
Adems, se deber trabajar en rea con sistema de extraccin y equipo de proteccin personal (segn el manual
correspondiente).
ARTCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deber existir, en forma clara, visible y legible, la informacin
acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo.
ARTCULO 25. Los anaqueles, libreros, estantes, archiveros, tanques de gas y, en general, accesorios y muebles
de oficina y laboratorio, debern estar sujetos a la pared para prevenir accidentes.
ARTCULO 26. Queda prohibido que menores de edad permanezcan en el laboratorio sin la autorizacin por escrito
del responsable del rea.
ARTCULO 27. El personal (acadmicos, administrativos o estudiantes) que trabaje en los laboratorios debe
informar al responsable del rea o a su jefe inmediato, si padece enfermedades que requieran atencin especial y
puedan generar incidentes dentro del rea.
ARTCULO 28. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento
debern ser resueltas por la Direccin de la Facultad, con la opinin de la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de
Riesgos y Proteccin Civil.
ARTCULO 29. Cualquier alteracin en las condiciones de seguridad, o en el cumplimiento del presente
reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente.
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Laboratorio de Toxicologa
ARTCULO 30. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc.
propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el Artculo 2 del presente Reglamento, o de las
sealizaciones instaladas para Proteccin Civil, sern sancionadas conforme a la Legislacin Universitaria, segn la
gravedad de la falta cometida.
ARTCULO 31. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico de la
Facultad, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria.
ARTCULO 32. Si se trata de personal acadmico o administrativo, se levantarn las actas correspondientes y se
dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo.
ARTCULO 33. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad que ser de
observancia obligatoria y complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan.
ARTCULO TRANSITORIO NICO. El presente Reglamento, una vez aprobado por el Consejo Tcnico, entrar en
vigor el da siguiente de su publicacin en la Gaceta de la Facultad de Qumica.
Aprobado por el H. Consejo Tcnico en su sesin del 15 de junio de 2006.
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Laboratorio de Toxicologa
ARTCULO 7. Los restos de desechos biolgicos (animales de laboratorio), generados durante las sesiones
experimentales, debern ser colocados en bolsas de plstico y enviados al Bioterio de la Facultad. No debern ser
desechados directamente en la basura.
ARTCULO 8. Las sustancias txicas, voltiles o inflamables debern ser utilizadas dentro de las campanas de
extraccin.
ARTCULO 9. Cualquier muestra que se guarde en los refrigeradores deber estar etiquetada con la siguiente
informacin:
a) Nombre completo del alumno.
b) Fecha y periodo que se mantendr almacenada.
c) Tipo de muestra.
d) Nombre de la asignatura o proyecto de tesis.
e) Profesor responsable de la asignatura o proyecto.
ARTCULO 10. No se admitir a nadie que llegue extraoficialmente de visita.
ARTCULO 11. Los sistemas de extraccin de gases y campanas debern mantenerse siempre sin obstculos que
impidan el cumplimiento de su funcin.
ARTCULO 12. Cuando un extintor est vaco por haber sido utilizado, deber ser removido de su lugar para evitar
confusiones en caso de necesitarlo. El responsable del rea deber hacer la solicitud de recarga o reemplazo a la
brevedad posible, para que se cumpla con lo establecido en los Artculos 3 y 15 del Reglamento de Higiene y
Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica.
ARTCULO 13. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea, el profesor o el laboratorista (el
ltimo en salir del laboratorio), deber verificar que se cumpla el Artculo 22 del Reglamento de Higiene y Seguridad
para los Laboratorios de la Facultad de Qumica.
ARTCULO 14. Este Reglamento se dar a conocer a todos los alumnos al inicio del semestre lectivo y se recabarn
sus firmas de enterados. Asimismo, deber estar en un lugar visible en el laboratorio, al igual que el Reglamento de
Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM.
Artculo Transitorio nico
El presente Reglamento, una vez aprobado por el Consejo Tcnico, entrar en vigor el da siguiente de su
publicacin en la Gaceta de la Facultad de Qumica.
Aprobado por el H. Consejo Tcnico en su sesin del 5 de octubre de 2006.
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Laboratorio de Toxicologa
Cantidad empleada
Observaciones
VIGILANCIA DE EQUIPO
Equipo
Hora de inicio
Hora final
Observaciones
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Tratamiento de residuos
Observaciones
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Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente
txicos no voltiles de naturaleza cida y bsica en una muestra problema, y concluya qu
mtodo de extraccin es el ms eficiente.
PROBLEMA
Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin mayor o igual al 90%
de los txicos no voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico [AAS] y cafena) presentes
en una muestra problema. La muestra deber trabajarla en medio cido y medio bsico.
Reactivos
- cido tartrico
- Hidrxido de sodio (NaOH)
- Nitrato frrico (Fe(NO3)3)
- cido clorhdrico (HCl)
- Bicarbonato de sodio (NaHCO3)
- Cafena
- Cloroformo (CHCl3)
- Salicilato de sodio
- Cloruro mercrico (HgCl2)
- Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
Equipo
- Espectrofotmetro
- Rotaevaporador
- Balanza analtica
- Vrtex
Material
Material por equipo
- Gradilla
- Tubos de ensayo 13 x 100
- Matraz aforado de 10 mL
- Matraz aforado de 25 mL
- Embudo de separacin de 250 mL
- Matraz Erlenmeyer de 250 mL
- Matraz Erlenmeyer de 50 mL
- Anillo metlico
1
4
2
2
2
1
2
2
1
2
2
1
1
2
2
1
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Laboratorio de Toxicologa
1
5
5
10
1
1
1
DESARROLLO EXPERIMENTAL
El profesor proporcionar 30 mL de muestra problema, la cual deber dividirse en dos
porciones de 15 mL para realizar a una de ellas la extraccin en medio cido; y a la otra, la
extraccin en medio bsico. La cuantificacin de cido acetilsaliclico (AAS) y cafena se
determinar siguiendo los apndices correspondientes.
A) Proceso de extraccin en medio cido para txicos no voltiles
1. Agregar cido tartrico hasta un pH = 2.
2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3, separando las fases
orgnicas y reunindolas en un matraz.
3. La fase acuosa se guarda, etiquetndola como fraccin A.
4. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se renen las
fases acuosas con la fraccin A.
5. Tratamiento de la fase orgnica. Esta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de
NaHCO3, se separan las fases. Etiquetar la fase acuosa como fraccin B. Tratar esta
fraccin como se indica en el inciso C.
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA
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Laboratorio de Toxicologa
5.1. Extraer la fase orgnica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante,
etiquetarla como fraccin C y trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgnica
resultante marcarla como R1.
6. Tratamiento de la fraccin A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH = 10
con NaOH 2.5 N.
6.1. Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases.
Desechar la fase acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.
6.2. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad en el rotaevaporador. Etiquetar como
fraccin D y tratarlo como se indica en el inciso D. El disolvente orgnico resultante que se
encuentra en el matraz de condensacin debe ser desechado en el contenedor etiquetado
como R1.
B) Proceso de extraccin en medio bsico para txicos no voltiles
1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N.
2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl3 de 15 mL, separando las fases.
3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E y
se trata como se indica en el inciso D.
4. La fase acuosa se etiqueta como fraccin F y se trata segn el inciso C.
C) Cuantificacin de cido acetilsaliclico
Tratamiento de la muestra (fracciones B, C y F)
1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada
una 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice II), agitar, esperar 2 min.
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Alcuota de la
solucin patrn
(mL)
0.5
1
3
5
7
Concentracin
(g/mL)
10
10
10
10
10
50
100
300
500
700
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Laboratorio de Toxicologa
D) Cuantificacin de cafena
Tratamiento de la muestra (fracciones D y E)
1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N.
Transferirlo a un matraz volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N.
2. Determinar la absorbancia de la solucin anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N
como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y
Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N.
3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de
absorbancia en la curva patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones
D y E se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R2.
Curva patrn
1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL). Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL
de NaOH 0.1 N y aforar con la misma solucin a 100 mL.
2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se
describe a continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn.
Alcuota de la
solucin patrn
(mL)
1
2
3
4
5
Concentracin
(g/mL)
25
25
25
25
25
4
8
12
16
20
3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero
con un blanco (NaOH 0.1 N).
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA
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Laboratorio de Toxicologa
CUESTIONARIO
1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar
cido tartrico adems de ajustar el pH.
2. Una vez desarrollado el guin para una eficiente extraccin de un xenobitico, qu
puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son crticos?
3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresin lineal de cada curva.
AAS
[g/mL]
Abs*
Abs*
curva
curva
cafena
[g/mL]
50
100
300
12
500
16
700
20
Pendiente (m)
Pendiente (m)
Coeficiente de
Coeficiente de
Abs*
Abs*
curva
curva
*Abs: Absorbancia.
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Laboratorio de Toxicologa
Equipo
1
2
3
Tabla 2. Lecturas de muestras.
cido acetilsaliclico
Equipo
Concentracin
Rendimiento
Concentracin
Rendimiento
(g/mL)
(%)
(g/mL)
(%)
1
2
3
Tabla 3. Resultados grupales AAS.
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Laboratorio de Toxicologa
Cafena
Equipo
Concentracin
Rendimiento
Concentracin
Rendimiento
(g/mL)
(%)
(g/mL)
(%)
1
2
3
Tabla 4. Resultados grupales cafena.
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Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Casarett, L.J. Caffeine biotransformation en Casarett & Doulls Toxicology: The basic
science of poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p. 1071.
____________Salicylic acid, biotransformation en Casarett & Doulls, Toxicology: The
basic science of poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p. 203.
Clarke, E.G.C. Screening Tests for Common Drugs en Isolation and identification of
drugs in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. Vol. 1,
Pharmaceutical Press, London, 1974, pp. 3-15.
____________Extraction Methods in Toxicology en Isolation and identification of drugs
in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. Vol. 1, Pharmaceutical
Press, London, 1974, pp. 16-30.
____________Colour Tests en Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals
body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974,
pp. 123-134.
Florey, K. Aspirine en Analytical Profiles of drug substances. Vol. 8, Florey, K. (Ed.).
Academic Press Inc., London, 1991, pp. 1-11.
Goodman & Gilman. Las bases farmacolgicas de la teraputica. Vol. I, (9 ed.) McGrawHill, Mexico, 1996, pp. 669-677 y 721-727.
Klaassen, C.D., Analytic Toxicology en Toxicology the basic science of poisons. (5 ed.)
McGraw-Hill, 1996, pp. 952 y 953.
Zubair, M.C., Hassan, M.A. y Al-Meshal, I.A. Caffeine en Analytical Profiles of drug
substances, Vol. 15. Florey, K. (Ed.). Academic Press Inc., London, 1991, pp. 71-150.
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Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Efectos txicos del cido acetilsaliclico (AAS) y de la cafena.
2. Relacin entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra
disuelto.
3. Estructura de la forma inica y no inica del AAS y de la cafena.
4. Reaccin de hidrlisis del AAS.
5. Valores de pKa del AAS, cido saliclico, cido tartrico, cido actico y de la cafena.
6. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y disolvente orgnico.
7. Densidad de los disolventes a emplear.
8. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.
9. Sustancias que pueden precipitar protenas.
10. Esquema de los procesos de separacin empleados tanto en medio cido como en medio
bsico, especificando qu especies qumicas se encuentran en cada una de las fases.
11. Propsito de lavar la fase orgnica con dos porciones de agua destilada en la extraccin
en medio cido.
12. Propsito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la particin con CHCl3 con la
fraccin A en el proceso de extraccin en medio cido.
13. Objetivo de adicionar NaHCO3 y NaOH 0.1N en el proceso de extraccin cida.
14. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones.
15. Dibujo de la reaccin de identificacin y cuantificacin del AAS.
16. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer.
17. Razn por la cual se determinan la cafena y el AAS a diferentes longitudes de onda.
18. Forma de obtener el rendimiento de la extraccin de una sustancia.
19. El anlisis de una muestra biolgica de 20 mL para determinar la presencia de
salicilatos y/o cafena arroj las siguientes lecturas de absorbancia:
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Laboratorio de Toxicologa
Absorbancia a
= 540 nm
fraccin B = 0.613
fraccin C = 0.456
Volumen
(mL)
15
7
Absorbancia a
= 275 nm
fraccin D = 0.785
Volumen
(mL)
6
Las lecturas de absorbancia de las curvas patrn para AAS y cafena son las que se
muestran a continuacin:
AAS
Concentracin
Cafena
A= 540 nm
[g/mL]
Concentracin
A = 275 nm
[g/mL]
50
0.060
0.184
100
0.133
0.484
300
0.421
12
0.684
500
0.713
16
0.885
700
0.970
18
1.000
b = 5.8 x 10-3
b = 9.2 x 10-3
m = 1.409 x 10-3
m = 0.0566
r= 0.999
r =0.996
Tabla 2. Curva patrn.
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Laboratorio de Toxicologa
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Reactivo para desarrollar color:
Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar
hasta su total disolucin. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades
adicionales para el blanco y curva patrn).
Solucin de hidrxido de sodio 2.5 N
Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.
Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N
Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.
Solucin de cido clorhdrico 1 M
Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.
Solucin de cido tartrico al 10%
Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.
Solucin saturada de bicarbonato de sodio.
Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua
destilada, hasta que no se pueda disolver en fro.
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Laboratorio de Toxicologa
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
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Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de
glucsidos cianognicos presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y
animales, y relacione la concentracin con su potencial toxicolgico.
PROBLEMA
Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie
de 2 muestras de semillas o plantas, y concluya cul de estas muestras presentan riesgo de
toxicidad para el humano, con base en la cantidad de HCN que est presente en el consumo
de 100 g de muestra.
Reactivos
- Reactivo de Guignard *
- Cloroformo (CHCl3)
- cido pcrico
Equipo
- Espectrofotmetro
- Termmetro
- Estufa
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Laboratorio de Toxicologa
- Tijeras
- Pinzas
tapn de hule
- Cajas Petri
- Mortero con pistilo
- Tiras de papel filtro cualitativo
(filtracin rpida) de 2 x 10 cm
hule
- Pipeta volumtrica de 25 mL
- Pipeta graduada de 1 mL
- Probeta de 50 mL
- Matraces volumtricos de 25 mL
- Pipeta graduada de 1 mL
Material de estudio
Traer por equipo aproximadamente 1g de una de las siguientes muestras: almendra de
durazno, semillas de manzana roja, almendra de ciruela pasa, semillas de lima, almendra
de capuln, almendra de cereza.
30
Laboratorio de Toxicologa
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Cada equipo trabajar con 2 muestras problema de plantas o semillas segn la lista
mencionada, una de las cuales ser proporcionada por el profesor.
NOTA: La solucin patrn de cianuro de potasio, el cido clorhdrico 0.5 N y el agua destilada
deben estar en bao de hielo antes de realizar la parte experimental.
1. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. El equipo que prepare curva patrn de HCN
deber preparar 6 tiras adicionales.
2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas, colocndolas
para su secado sobre una caja de Petri.
3. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50 y
55oC, dejndolas aproximadamente 10 min, cuidando que estn humedecidas.
NOTA: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra debern tener todos los reactivos
necesarios dentro del matraz, as como lista la tira reactiva, tanto para su muestra como para la
curva patrn.
31
Laboratorio de Toxicologa
Semilla o almendra
Peso en mg
Manzana
250
Durazno
200
Pern
150
Capuln y cereza
30
Mamey
200
TAPN DE HULE
PAPEL FILTRO
(TIRA ACTIVA)
MUESTRA
32
Laboratorio de Toxicologa
Alcuota de la solucin
patrn de KCN (mL)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Concentracin de HCN
(g/mL)
Blanco
0.4
0.8
1.2
1.6
2
33
Laboratorio de Toxicologa
34
Laboratorio de Toxicologa
CUESTIONARIO
1. Reporte, en la siguiente tabla, los valores de absorbancia obtenidos e indique los valores
de la regresin lineal.
HCN
[g/mL]
Absorbancia
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal (r)
Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn.
35
Laboratorio de Toxicologa
Equipo
Material
Concentracin de HCN
mg HCN/100 g
Riesgo de
vegetal
(g/mL)
de muestra
toxicidad*
36
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Conn, E.E. (1969). Cyanogenic glucosides en Journal of Agricultural and Food
Chemistry 17, pp. 519-526.
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(2 ed). National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1973, pp. 290-308.
Eyjolfsson, R. (1970). Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides en
Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe 28, 74-108.
Fabre, R. y Truhaht, R. Tratado de toxicologa. Vol. I. Paraninfo, S.A., Madrid, 1976,
pp. 311-332.
Francisco, I.A. y Pimenta-Pinotti, M.H. (2000). Cyanogenic Glycosides in Plants en
Brazilian Archives of Biology and Technology 43, 487-492.
Harborne, J.B. Cyanogenic glucosides and their function en Phytochemical ecology,
Academic Press, London, 1972, 104-123.
Linder, E. Toxicologa de los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1978, pp. 15-19.
Lucas, B., Sotelo, A. (1984). A simplified test for the quantitation of cianogenic
glucosides in wild and cultivated seeds en Nutrition Reports International 29,
pp. 711-719.
Montgomery, R.D. Cyanogens en Toxic constituent of plant foodstuff, Liener, I.E., (Ed.)
Academic Press, New York, 1980, pp. 143-160.
Speijers, G.J. y Egmoad, H.P. Natural Toxins III. Inherent Plant Toxins en International
Food Safety Handbook: Science, International Regulation, and Control. Younes,
M., Fishbein, L., Miller, S., (Eds.). Marcel Dekker, Inc, New York, 1999, pp. 368380.
Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides en Toxicon 38, 11-36.
37
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Argumento por el cual la tira reactiva no debe tocar la solucin en que se encuentra la
muestra.
7.
Razn por la que se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto
con la muestra.
8.
Causa por la cual es necesario colocar en bao de hielo las soluciones de cianuro de
potasio y el HCl 0.5N empleadas en la preparacin de la curva patrn.
9.
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Reactivo de Guignard
Colocar 2.5 g de cido pcrico en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y disolver con 200 mL
de agua destilada. Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar
cuidadosamente para disolverlo. Llevar la solucin a un volumen de 500 mL con agua
destilada.
NOTA: Manejar con cuidado el cido pcrico, ya que esta sustancia es cancergena y se absorbe
fcilmente por la piel.
38
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
39
Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno observe la formacin de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la
administracin de nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno.
PROBLEMA
Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO2, la reduccin en el porcentaje
de MHb debida a la administracin de azul de metileno.
Reactivos
- Heparina 1000 UI o EDTA al 10%
- ter dietlico
Equipo
- Espectrofotmetros UV-Vis
- Centrfugas
- Balanza para pesar animales
40
Laboratorio de Toxicologa
Material
- Jeringa de insulina (traer por equipo)
- Tijeras de diseccin
- Pinzas de diseccin
- Tabla de diseccin
- Caja de contencin
- Rejilla
- Pipeta graduada de 5 mL
- Pipeta graduada de 1 mL
Animales de experimentacin
3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo).
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Anestesiar a cada rata con ter, colocarla en la tabla de diseccin y extraer de cada una,
por puncin cardiaca, 1 mL de sangre.
8.
9.
Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgicoinfecciosos (RPBI). Envolver los restos de los animales de experimentacin en una
41
Laboratorio de Toxicologa
42
Laboratorio de Toxicologa
NOTA: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguneas deber ser
inactivado con NaClO previamente a su lavado.
11. Clculos:
Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4
Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A1 - A2) 23.4
Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt) x 100/Hbt
43
Laboratorio de Toxicologa
CUESTIONARIO
1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas:
SSI
Equipo
A1
A2
NaNO2
A3
A1
A2
A3
Azul de metileno
+ NaNO2
A1
A2
A3
1
2
3
Tabla 1. Lecturas espectrofotomtricas.
SSI
Eq
NaNO2
Hbt
MHbt
Hbt
(g/100 mL) (g/100mL) (g/100 mL)
MHbt
(g/100mL)
Azul de metileno +
NaNO2
Hbt
MHbt
(g/100 mL) (g/100mL)
1
2
3
Prom
SD
%CV
Tabla 2. Determinaciones de Hb y MHb totales.
Equipo
SSI
NaNO2 Azul de metileno + NaNO2
%MHbt %MHbt
%MHbt
1
2
3
Prom
SD
%CV
Tabla 3. Comparacin del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos.
44
Laboratorio de Toxicologa
45
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Dreisbach, R.H. y Robertson, W.O. Tratamiento de los envenenamientos en Manual de
toxicologa clnica, prevencin diagnstico y tratamiento, Editorial El Manual
Moderno (6 ed.), Mxico, D.F., 1988, pp. 68-70.
Hall, R.; Malia, R.G. Investigation of hemolitic anaemias en Medical Laboratory
Hematology. Ed. Butterworths, Gran Bretaa, 1984, pp. 327-333.
Klassen, C.D.; Watkins, J.B; Casarett & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill
Interamericana (5 ed.), Mxico, 2001, pp. 394 y 395.
Stahr, H.M. Inorganic and other Analisis en Analitical Methods in toxicology. Ed. John
Wiley and sons, inc., USA, 1991, pp. 5-7.
46
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Efectos txicos de una intoxicacin por nitritos.
2. Efectos txicos de una intoxicacin con azul de metileno.
3. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicacin por
nitritos.
4. Fundamento de los mtodos analticos para determinar hemoglobina total y
metahemoglobina en sangre.
5. Especies que se determinan en A1, A2 y A3.
6. Propsito de agregar la solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, NH4OH en el paso
k de su tcnica, K3[Fe(CN)6] y KCN.
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
NOTA: Tanto el cianuro de hidrgeno como los cianuros slidos o en disolucin son txicos por
absorcin por la piel, ingestin e inhalacin.
47
Laboratorio de Toxicologa
EDTA al 10%. (Preparar slo en caso de no haber heparina, consultar con el laboratorista
o el profesor)
Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL.
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
48
Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobitico empleando sus
propiedades cido-base y reacciones de degradacin.
PROBLEMA
Material
Material vegetal
Traer por equipo 50 g de cscara de limn, calabaza o chayote; o bien 50 g de hojas
externas de col o coliflor.
- Probeta graduada de 25 mL
- Pipeta volumtrica de 10 mL
- Pipeta graduada de 1 mL
- Pipeta graduada de 5 mL
- Propipeta
- Pipeta graduada de 10 mL
49
Laboratorio de Toxicologa
- Pipeta graduada de 5 mL
Reactivos
- Sulfato de sodio* (Na2SO4)
- Malatin al 50%
- Fenolftalena*
- Etanol (EtOH)
- Acetona
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.
2.
Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL. Medir el volumen exacto con una probeta.
3.
Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocndolo sobre un papel peridico,
identificar como R1 y colocar en la campana. Al finalizar la sesin, los responsables de
seguridad e higiene debern colocar R1 en una bolsa de plstico y cerrarla.
4.
Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado, midiendo con pipeta
volumtrica. Adicionar a cada tubo 0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5% y 5 mL de
etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de separacin y agitar suavemente.
5.
50
Laboratorio de Toxicologa
6.
7.
Aadir 5 mL de etanol, agitar y aadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5
minutos, dejar reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solucin de Na2SO4 al 9%.
Mezclar, separar las fases, recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgnica
etiquetndola como R3.
8.
9.
10. Aadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0.3 mL de solucin de CuSO4 al 3.5% y agitar.
Colectar la fase orgnica y desechar la fase acuosa etiquetndola como R4.
11. Leer la fase orgnica en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustando previamente a 100%
de transmitancia con CCl4.
12. Una vez que se obtengan los resultados finales, desechar la fase orgnica, etiquetndola
como R5.
51
Laboratorio de Toxicologa
Tubo
Reactivos
Concentracin
8 g/mL
20 g/mL
40 g/mL
52
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Adrien, A. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. Ed. Chapman and Hall
(6a ed.), London, 1979, pp. 455-463.
CremLyn, C. Pesticides and mode of action, John Wiley & Sons, New York, 1978.
Katzung, B. Farmacologa Bsica y Clnica. Ed. El Manual Moderno (7 ed.), Mxico,
1999, pp. 119-121.
Klassen, C.D.; Watkins, J.B. Casarette & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill
Interamericana, Mxico, 2001, pp. 615-618, 624-634, 937.
Morifusa, E. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. CRC Press,
Cleveland, 1979, pp. 62-77, 103, 196-199.
Negherban, O.W. Handbook of toxicology: Insecticides. W.B. Saunders Comp., E.U.A.,
1959, pp. 451-464.
Norris, M.V.; Voil, W.A.; Averall, P.R. Colorimetric estimation of malation residues en
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1954, 2, p. 570.
Robertson, W.O., Dreishbad, R.H. Manual de Toxicologa Clnica. Prevencin,
Diagnstico y Tratamiento. El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, 1987, pp. 95-104.
White-Stevens, R. Pesticides in the Environment, Part I and II, Marcel Dekker, Inc., New
York, 1971.
53
Laboratorio de Toxicologa
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:
Malatin (g/mL) %Transmitancia Absorbancia
8
20
40
Muestra 1
Muestra 2
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal (r)
Tabla 1. Resultados.
Material
vegetal
Malatin
(g/mL)
Rendimiento
Malatin en la
muestra (ppm)
Riesgo
txico*
1
---
2
---
3
--* Alto 8 ppm; bajo < 8 ppm
5. De acuerdo con los resultados obtenidos, concluya si existe un riesgo toxicolgico por el
consumo del material vegetal analizado.
54
Laboratorio de Toxicologa
6. En caso de encontrar una baja concentracin en alguna de las muestras, comente cmo
influira cada uno de estos factores en el resultado del anlisis: A) estabilidad del
compuesto, B) el desarrollo experimental realizado, C) cumplimiento de las normas de
aplicacin del pesticida en cuestin.
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
55
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Solucin patrn de malatin 40 g/mL
Medir 0.1 mL de malatin al 50% y aforar con etanol a 100 mL. De esta solucin medir
8 mL y aforar a 100 mL con etanol.
Nota: El malatin es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fcilmente por piel y vas
respiratorias, se debe extremar cuidado con su contacto directo. Sus efectos agudos incluyen
convulsiones, coma y fallo respiratorio.
Nota: El CS2 es altamente txico, se absorbe por piel y vas respiratorias. Sus efectos txicos
incluyen irritacin de membranas, nusea, vmito, prdida de conocimiento y convulsiones.
56
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
57
Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar la capacidad antioxidante de sustancias qumicas.
PROBLEMA
Determinar la capacidad antioxidante de la quercetina y el cido nordihidroguayartico
mediante la reduccin en la produccin de anin superxido, utilizando el sistema xantinaxantina oxidasa-nitroazul de tetrazolio.
Reactivos
- Xantina (Xan)
- Xantina oxidasa (XO)
- Nitroazul de tetrazolio (NAT)
- Quercetina
- cido nordihidroguayartico (ANDG)
Equipo
- Balanza analtica
- Espectrofotmetro
- Potencimetro
4
1
1
1
- Gradilla
- Esptula de cromo nquel
- Nave de pesado
- Matraces de 250 mL
1
1
1
2
58
Laboratorio de Toxicologa
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Todo el material de vidrio deber ser enjuagado previamente con EDTA.
2. Marcar 4 tubos Eppendorf como control positivo (C+), control negativo (C-), quercetina
y ANDG.
3. Preparar los tubos de acuerdo con la siguiente tabla, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna reactivo.
Tubo
Reactivo
a. Xantina
b. EDTA
c. Solucin
amortiguadora
d. NBT
e. Antioxidante
f. XO*
g. Agitar e Incubar **
h. Cu(NO3)2
Control
positivo
(L)
100
100
Control
negativo
(L)
100
100
300
300
300
1h
200
Antioxidante 0.25 M
quercetina (L)
ANDG (L)
100
100
100
100
600
200
200
300
1h
200
300
100
300
1h
200
300
100
300
1h
200
4. Transcurrido el tiempo de incubacin, leer las diferentes muestras a 560 nm, empleando
como blanco una solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que el control positivo representa el
100% de formazn en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo con la siguiente frmula.
% atrapamiento= 100 - [(AM) x100/A C+]
En donde:
AM= absorbancia de la quercetina y/o ANDG
AC+= absorbancia del control positivo
59
Laboratorio de Toxicologa
6. Una vez obtenidos los resultados, desechar el contenido de los tubos en un frasco
etiquetado como R1.
7. Depositar las puntas y los tubos Eppendorf en un contenedor proporcionado por el profesor.
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:
Control positivo (C+)
Quercetina
ANDG
Absorbancia
% Atrapamiento
0%
Tabla 1. Resultados por equipo.
2. Cul de los dos antioxidantes muestra una mayor capacidad atrapadora del radical O2-?
3. Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el
estrs oxidante? Justifique su respuesta.
4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:
Equipo
% de Atrapamiento
Quercetina
ANDG
1
2
3
4
Promedio
Desviacin estndar
5. En caso de que los resultados grupales muestren una elevada variabilidad, discutan a qu
factores se podra atribuir dicho comportamiento.
60
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Cadenas, E.; Packer, L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002.
Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia
bsica de los txicos, (5 ed.), McGraw-Hill, Mxico, 2001.
Klassen, C.D. Casarett and Doulls Toxicologa: la ciencia de los venenos, (6a ed.), Ed.
Mc Graw-Hill, Interamericana, 2001.
Martnez-Flrez, S.; Gonzlez-Gallego, J.; Culebras, J.M., y Tun, M.J. (2002). Los
flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes en Nutricin Hospitalaria. XVII,
271-278.
Owena, P.L.; Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north
American plant remedies used for gout en Journal of Ethnopharmacology 64, 149-160.
Tsutomu, K.; Susumu, T.; Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological
antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower en Life Sciences 74, 87-97.
Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative
and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects en
Free Radical Biology & Medicine 43, 995-1022.
World Health Organization monographs on selected medicinal plants, Volume 1, 1999,
Geneva, pp. 16-32.
61
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Definicin del proceso de estrs oxidante.
2. Reaccin catalizada por la XO.
3. Nocin de radical libre y especies reactivas.
4. Concepto de antioxidante.
5. Reaccin de Fenton.
6. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de
carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2.
7. Completar los productos en el siguiente diagrama.
62
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Xantina 1.5 mM
Pesar 22.7 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con
solucin amortiguadora de carbonatos.
EDTA 0.1 mM
Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1 L.
Xantina oxidasa
La enzima se preparar durante la sesin de laboratorio de acuerdo con la indicacin de los
profesores.
63
Laboratorio de Toxicologa
ANDG 0.25 M
Pesar 1.3 mg de ANDG y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH
10.2 (solucin stock).
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2,
nitroazul de tetrazolio, quercetina, cido nordihidroguayartico, Cu(NO3)2, formazn, cido
rico, H2O2.
64
Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotxica de un xenobitico
empleando la tcnica de cuantificacin de microncleos en mdula sea de ratn.
PROBLEMA
Identificar la presencia de microncleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos
policromticos de mdula sea murina.
Animales de experimentacin
Un ratn ICR por equipo, administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de
40 mg/Kg i.p. o un ratn ICR control negativo no tratado.
2
2
4
2
- Portaobjetos
- Pipeta Pasteur
- Contador de clulas
6
4
1
Reactivos
- Solucin salina isotnica (SSI)
- Aceite de inmersin.
- Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8
- Colorante de Giemsa 2 %
- Etanol (EtOH)
65
Laboratorio de Toxicologa
DESARROLLO EXPERIMENTAL
NOTA: El siguiente protocolo requiere que no pasen ms de 30 minutos entre los pasos 1 y 9.
4. Diseccionar y extraer el fmur cortando por arriba de la cresta iliaca (en la cadera) y por
debajo de la rodilla.
66
Laboratorio de Toxicologa
5. Limpiar cuidadosamente cada fmur con papel hasta eliminar totalmente todo el tejido
muscular. Para facilitar la eliminacin del tejido muscular, tomar la parte que queda
debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario del movimiento natural de la articulacin
de la rodilla y el fmur.
6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epfisis y lavar el interior del fmur con 3
mL de SSI empleando una jeringa de 3 mL con aguja del nmero 21. Recolectar y reunir
en un mismo tubo de 13 x 100, la mdula de cada fmur.
7. Envolver los restos del animal de experimentacin en una hoja de papel peridico,
colocarlos en la caja de contencin para incinerarlo posteriormente.
67
Laboratorio de Toxicologa
8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la mdula (tubo del inciso 6),
extraer el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur, y resuspender el botn
en una gota de SSI. Depositar el sobrenadante en una solucin de hipoclorito de sodio.
9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una
gota de la suspensin de mdula sea y un segundo portaobjetos justo atrs de la gota en
ngulo de 45. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente
para formar una delgada capa de clulas.
68
Laboratorio de Toxicologa
12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante de Giemsa 2% y cubrir con un
cubreobjetos. Dejar reposar durante 10 minutos.
14. Cubrir la laminilla con solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos.
15. Enjuagar la laminilla una vez ms con agua destilada y secar al aire.
16. Observar al microscopio con aceite de inmersin, y registrar los siguientes datos:
- El nmero de eritrocitos policromticos por cada 200 eritrocitos totales.
- El nmero de eritrocitos policromticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos
policromticos.
69
Laboratorio de Toxicologa
Eritrocito
policromtico
micronucleado
Eritrocito
normocromtico
Eritrocito
policromtico
Eritrocito normocromtico
micronucleado
NOTA: Debido a que el conteo de los microncleos se debe realizar al ciego, el alumno no sabr
hasta el final de la prctica si el animal de experimentacin proporcionado ha sido tratado o no
con ciclofosfamida.
CUESTIONARIO
1. Con base en la experiencia adquirida, indique dos caractersticas que le permitan
identificar un microncleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tincin.
2. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:
EPCa/ ETb
Laminilla 1
Laminilla 2
Laminilla 3
Laminilla 4
Sumatoria
/200 ET
EPCMNc/ EPC
/1000 EPC
*EPC: Eritrocitos policromticos, b ET: Eritrocitos totales, c EPCMN: Eritrocitos policromticos micronucleados.
70
Laboratorio de Toxicologa
Ciclofosfamida
Promedio
EPCa/ ETb
/200 ET
EPCMNc/ EPC
/1000 EPC
4. Realice una comparacin estadstica mediante (t-Student) entre los dos grupos y
concluya si existen diferencias significativas como para considerar un dao genotxico.
71
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
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Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 392, 243-249.
72
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Definicin de eritropoyesis.
2. Concepto de microncleo y proceso de formacin.
3. Diferencia entre dao clastognico y aneuploidgeno, y cmo se pueden diferenciar con
la tcnica de microncleos.
4. Fundamento de la tincin de Giemsa.
5. Coloracin que adquieren los eritrocitos maduros, inmaduros y micronucleados con el
colorante de Giemsa.
6. Mecanismo de accin genotxica de la ciclofosfamida.
7. Usos clnicos de la ciclofosfamida.
8. Propsito de adicionar EtOH y solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8.
9. Se determin la actividad genotxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre
perifrica de ratn, administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. Los
xenobiticos en estudio se administraron a 2.5 mg/kg, mientras que el grupo control fue
administrado con SSI, obteniendo los siguientes resultados:
Grupo
Microncleos/1000 clulas
SSI
0.5 0.33
Daunorrubicina
18.6 0.62
Apigenina
1.6 0.80
73
Laboratorio de Toxicologa
Realice una comparacin estadstica (t-Student) de los grupos tratados con especto al
control, y concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de dao
genotxico.
Sp =
y1 y2
t =
0
Sp *
+ 1
n1 + n2
74
Laboratorio de Toxicologa
Grados
de
libertad
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.025
0.01
0.005
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
40
60
120
1.000
0.816
0.765
0.741
0.727
0.718
0.711
0.706
0.703
0.700
0.697
0.695
0.694
0.692
0.691
0.690
0.689
0.688
0.688
0.687
0.686
0.686
0.685
0.685
0.684
0.684
0.684
0.683
0.683
0.683
0.681
0.679
0.677
0.674
1.376
1.061
0.978
0.941
0.920
0.906
0.896
0.889
0.883
0.879
0.876
0.873
0.870
0.868
0.866
0.865
0.863
0.862
0.861
0.860
0.859
0.858
0.858
0.857
0.856
0.856
0.855
0.855
0.854
0.854
0.851
0.848
0.845
0.842
1.963
1.386
1.250
1.190
1.156
1.134
1.119
1.108
1.100
1.093
1.088
1.083
1.079
1.076
1.074
1.071
1.069
1.067
1.066
1.064
1.063
1.061
1.060
1.059
1.058
1.058
1.057
1.056
1.055
1.055
1.050
1.046
1.041
1.036
3.078
1.886
1.638
1.533
1.476
1.440
1.415
1.397
1.383
1.372
1.363
1.356
1.350
1.345
1.341
1.337
1.333
1.330
1.328
1.325
1.323
1.321
1.319
1.318
1.316
1.315
1.314
1.313
1.311
1.310
1.303
1.296
1.289
1.282
6.314
2.920
2.353
2.132
2.015
1.943
1.895
1.860
1.833
1.812
1.796
1.782
1.771
1.761
1.753
1.746
1.740
1.734
1.729
1.725
1.721
1.717
1.714
1.711
1.708
1.706
1.703
1.701
1.699
1.697
1.684
1.671
1.658
1.645
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
2.447
2.365
2.306
2.262
2.228
2.201
2.179
2.160
2.145
2.131
2.120
2.110
2.101
2.093
2.086
2.080
2.074
2.069
2.064
2.060
2.056
2.052
2.048
2.045
2.042
2.021
2.000
1.980
1.960
31.821
6.965
4.541
3.747
3.365
3.143
2.998
2.896
2.821
2.764
2.718
2.681
2.650
2.624
2.602
2.583
2.567
2.552
2.539
2.528
2.518
2.508
2.500
2.492
2.485
2.479
2.473
2.467
2.462
2.457
2.423
2.390
2.358
2.326
63.657
9.925
5.841
4.604
4.032
3.707
3.499
3.355
3.250
3.169
3.106
3.055
3.012
2.977
2.947
2.921
2.898
2.878
2.861
2.845
2.831
2.819
2.807
2.797
2.787
2.779
2.771
2.763
2.756
2.750
2.704
2.660
2.617
2.576
Tabla 2. t-Student.
75
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Giemsa al 2%
Tomar 2 mL de Giemsa comercial y diluir en 100 mL de agua destilada.
76
Laboratorio de Toxicologa
EFECTOS TXICOS
DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno visualice el dao macroscpico ocasionado en hgado y bazo de ratas
administradas de forma sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por va i.p.
Relacionar dicho dao con las alteraciones que se presentan en la morfologa de los eritrocitos y
en los valores del hematocrito (Hto), hemoglobina total (Hbt) y hemoglobina libre (Hbl).
PROBLEMA
Identificar cul de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor dao en las ratas, al
relacionar los resultados encontrados macroscpicamente en el hgado y bazo, con los
encontrados microscpicamente en los eritrocitos y en la cuantificacin del Hto, Hbt, y Hbl.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
El trabajo experimental se desarrollar por equipos en 4 sesiones de laboratorio.
Animales de experimentacin (por equipo para las cuatro sesiones)
3 ratas del mismo sexo y peso entre 180 y 300 g.
Material por equipo
- Balanza para animales
- Caja de contencin
- Algodn
Reactivos
- Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2)
- Solucin salina isotnica (SSI)
- Hipoclorito de sodio al 6% (NaClO)
- ter etlico
- Etanol (EtOH)
77
Laboratorio de Toxicologa
2.
Nota: El profesor indicar el color con el que se deber marcar las colas de las ratas en cada
equipo y qu numeracin se asignar a cada una de las ratas, de acuerdo con el siguiente cdigo.
10
78
Laboratorio de Toxicologa
1
1
1
1
5
8
16
2
1
1
- Pinza de diseccin
- Tubos de ensayo de 13 x 100
- Tabla de diseccin
- Pipetas graduadas de 10 mL
- Tubos de ensayo de 16 x 150
- Vasos de precipitados de 100 mL
- Algodn
- Celdas de vidrio
- Cajas de Petri
- Pipeta graduada de 1 mL
1
15
1
2
5
2
2
4
1
Reactivos
- Nuevo azul de metileno
- Solucin de heparina 1000 UI o EDTA al 10%
- Colorante de Wrigth
- Solucin patrn de cianometahemoglobina
(CNMHb)
- Perxido de hidrgeno al 1% (H2O2)
- Reactivo de Drabkin
- ter etlico
- Etanol (EtOH)
- Bencidina al 1%
-Solucin salina isotnica
(SSI)
Equipo
- Centrfuga para microhematocrito
- Microscopio de ptico(s) con objetivo de inmersin
- Espectrofotmetro
- Centrfuga
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.
2.
3.
Anestesiar las ratas con ter etlico y, mediante puncin cardiaca, obtener un volumen
de 3 mL de sangre de cada una de las ratas.
79
Laboratorio de Toxicologa
4.
5.
6.
Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito
de acuerdo con lo indicado en la seccin de tcnicas experimentales.
7.
Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante de Wright de
acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales.
8.
Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante nuevo azul de
metileno (NAM) de acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales.
9.
10. Hacer una incisin en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hgado de cada
rata. Colocar los rganos en cajas de Petri con SSI, para evitar su deshidratacin.
Observar y comparar los rganos con respecto a la rata control.
11. Envolver los restos de los animales de experimentacin en una hoja de papel peridico
y colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin.
12. Los animales que no fueron empleados debern ser devueltos al bioterio.
Tcnicas experimentales
Tcnica de microhematocrito
1.
Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Realizar esta
operacin por duplicado.
2.
3.
Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la
centrfuga para microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min.
80
Laboratorio de Toxicologa
4.
Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) en relacin con la
altura total de la muestra (M1) y expresarla en %.
M1 _________ 100 %
M2_________ X%
M
2
M1
M2
_
_
_
_
5.
Una vez obtenido los resultados, depositar los capilares en el contenedor para residuos
_
_
Tincin de Wright
1.
Muestra de sangre
%
1
B.
Mediante
un
movimiento uniforme
deslizar el portaobjetos
2 sobre el 1.
81
M
2
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Laboratorio de Toxicologa
2.
3.
Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire.
Repetir esta operacin durante 5 minutos.
4.
5.
Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.
Agregar con una pipeta Pasteur 3 gotas de sangre y 3 de colorante a un tubo de 13 x 100 y
mezclar. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
2.
3.
Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.
4.
Tubo
Blanco
Referencia*
SSI
SOLUCIN DE REFERENCIA
----
0.02
----
----
----
MUESTRA
-----
----
DRABKIN
REACTIVO (mL)
82
Laboratorio de Toxicologa
2.
3.
Hbt = Aprob*(Cref./Aref.)
Donde:
Cref. = concentracin de la solucin de referencia (g/dL)
Aprob = absorbancia del problema
Aref. = absorbancia de la solucin de referencia
4.
Una vez ledos, colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R2.
SSI
Solucin
Blanco
Estndar*
Bencidina 1%
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
Plasma
0.02 mL
0.02 mL
0.02 mL
------
------
Estndar
------
------
------
0.02 mL
------
Agua destilada
------
------
------
------
0.02 mL
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
H2O2 1%
actico 10.0 mL
10.0 mL 10.0 mL
10.0 mL
10.0 mL
10%
*Preparar una solucin estndar de hemoglobina con una concentracin de 150 mg/L a partir de la solucin
estndar de hemoglobina total.
83
Laboratorio de Toxicologa
2.
Clculos:
3.
Una vez ledos, colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R3.
CUESTIONARIO
1.
Hematocrito* (cm)
Rata Absorbancia Hbt Absorbancia Hbl M1 M2 M1 M2
SSI
A
B
*M1 = altura total de las muestras, M2 = altura del paquete globular.
2.
Con los datos de la tabla anterior, calcule segn la seccin de tcnicas experimentales:
Hto, Hbt, Hbl y reporte sus resultados en la siguiente tabla:
Rata
rganos*
Hgado Bazo
Frotis*
Wrigth
NAM
Hto
Hbt
Hbl
Efecto*
g/dL
mg/L
Txico
A
B
SSI
*En los espacios para hgado, bazo, frotis Wrigth, NAM y efecto txico, calificar con cruces el efecto txico,
siendo (++) para el de mayor efecto, (+) para el menor y (-) para la ausencia de efecto.
84
Laboratorio de Toxicologa
3.
Cules fueron las diferencias en las alteraciones morfolgicas en hgado y bazo para
cada tratamiento?
4.
Cules fueron las diferencias observadas en las clulas sanguneas, con respecto al
control utilizando las tinciones de Wright y NAM?
5.
6.
7.
8.
Qu relacin observ entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las ratas?
9.
85
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Blanke, R.V.; Decker, W.J. Analysis of toxic substances en Textbook of clinical
chemistry. Ed. Saunders. Philadelphia. 1986, pp. 1670-744.
Clark, E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Ed. Pharmaceutical Press,
London. 1972
Klaassen, C.D. Casarett y Doulls Toxicology. The Basic Science of Poisons. (6a ed.).
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Torres-Snchez, L.; Lpez-Carrillo, L.; Ros, C. (1999). Eliminacin del plomo por curado
casero en Salud Pblica, Mxico 41, 5106-5108.
86
Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Efectos que ocurren en los eritrocitos cuando la concentracin de plomo rebasa el valor
de 80g/dL y qu es lo que provoca esta manifestacin.
7.
8.
9.
Influencia de la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos.
10. Efectos que producen la anemia que se manifiesta por la intoxicacin por plomo.
11. Vida media del plomo en sangre y huesos. Papel que juegan los eritrocitos en la
relacin de concentracin plasma/orina en la eliminacin del mismo.
12. Caractersticas en una intoxicacin crnica (30-50 g/dL) por plomo en los nios.
13. Papel que juega la sal Na2CaEDTA, en dosis de 40 mg/Kg en el diagnstico por
intoxicacin por plomo.
14. Medidas teraputicas que se toman en una intoxicacin por plomo y que concentracin
plasmtica del mismo debe de estar presente para que se aplique a los nios.
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Solucin salina isotnica (SSI)
Puede utilizarse la solucin comercial o preparar una solucin de cloruro de sodio al 0.9 %.
Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua
destilada.
87
Laboratorio de Toxicologa
1.0 g
0.20 g
0.05 g
Saponina
0.1 g
1000 mL
0.5 g
Oxalato de potasio
1.40 g
Cloruro de sodio
0.80 g
100 mL
Solucin de bencidina al 1%
Solubilizar 1 g de bencidina en 100 mL de cido actico al 10%.
Perxido de hidrgeno al 1%
cido actico al 10%
Colorante de Wright (preguntar al profesor si ya est preparado)
88
Laboratorio de Toxicologa
Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos
mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar
bien tapado para evitar la evaporacin, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres
semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo.
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
89
Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cermica
a diferentes valores de pH.
PROBLEMA
Realizar un anlisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas
de barro vidriado y sugerir cul de ellos presenta mejores resultados para reducir el
contenido de plomo en estos recipientes. Discutir el riesgo de exposicin al plomo liberado
por recipientes de barro vidriado en los seres humanos.
Materiales
- Vasija de barro vidriado*
- Tubos de ensayo 13x100
- Anillo metlico
- Papel pH
- Probeta de 100 mL
6
10
3
3
1
- Mechero
- Rejilla de asbestos
- Gradilla
- Pipetas de 1 mL
- Pinza para tubos
3
3
1
3
1
*Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos
con una capacidad mxima aproximada de 250 mL.
REACTIVOS
- Agua destilada
- Hidrxido de sodio 1 N (NaOH)
- Yoduro de potasio (KI)
90
Laboratorio de Toxicologa
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Previo a la sesin, el profesor indicar a los alumnos los tratamientos de curado a
realizar a 3 de las 6 vasijas:
Vasija 1 - Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija
de barro y dejar reposar por un da antes de lavarla con jabn eliminando cualquier
residuo que se haya formado, secar.
Vasija 2 - Vinagre: Llenar partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante
1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar.
Vasija 3 - Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO3 comercial por cada 100
mL de agua y hervir durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta
operacin. Lavar y secar.
2. Marcar las vasijas no curadas como A, B y C y reunirlas con las vasijas curadas 1, 2 y 3
3. Colocar el volumen necesario en cada una segn el diseo de la siguiente tabla.
A
Solucin HCL, pH 2
Solucin NaOH, pH 10
Agua destilada
X
X
91
Laboratorio de Toxicologa
92
Laboratorio de Toxicologa
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla, indicando la presencia de plomo con cruces:
negativo (-), bajo (+), medio (++), alto (+++). Utilice el control negativo como referencia.
Vasija
pH inicial pH final Presencia de plomo
A
HCl
B
NaOH
C agua destilada
1
ajo
2
vinagre
3
cal
Tabla 1. Resultados.
93
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
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NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993.
Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo.
www.kdhe.state.ks.us
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Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Proceso de vidriado de utensilios de barro.
2. Reacciones que se llevan a cabo en las vasijas de barro vidriado A y B durante el
proceso de extraccin e identificacin.
3. Precauciones que se pueden aplicar en casa para reducir el riesgo de exposicin a plomo
por consumo de alimentos.
4. Cinco alimentos de naturaleza cida y cinco de naturaleza alcalina.
5. Lmite mximo permitido de plomo en utensilios de barro vidriado por la NOM vigente.
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Solucin de HCl pH 2 y solucin de NaOH pH 10
Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de pH = 2 con HCl y la solucin de
pH 10 con NaOH.
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
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Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno realice la determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras
problemas mediante un mtodo indirecto.
PROBLEMA
Cuantificar al menos el 80% de la concentracin de etanol en mg/dL en dos muestras
problema y mediante los resultados obtenidos indicar el grado de intoxicacin de los
sujetos de los cuales provienen las muestras analizadas.
Reactivos
- Dicromato de potasio* (K2Cr2O7)
- cido sulfrico (H2SO4)
2
3
4
6
2
- Matraz volumtrico de 10 mL
- Pinzas para tubo de ensayo
- Papel filtro (2 x 5 cm)
- Pipeta graduada de 5 mL
- Pipeta graduada de 1 mL
- Pipeta Pasteur con globo
3
3
1
3
3
4
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Laboratorio de Toxicologa
DESARROLLO EXPERIMENTAL
A cada alumno se le proporcionarn 2 muestras problema a las cuales se les realizar la
determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol.
I.
Centro de vidrio
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Laboratorio de Toxicologa
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
CUESTIONARIO
1. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra.
Muestra
Coloracin
Resultado (+/-)
1
2
Control negativo
Control positivo
Tabla 1. Resultados presuntivos.
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Muestra
Absorbancia
Dilucin*
Concentracin
(mg/dL)
1
2
Solucin de
referencia
*En caso de haberse realizado.
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Concentracin
Observaciones clnicas
(mg/dL)
50 a 150
150 a 300
300 a 500
500
6. Cul es la concentracin mxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo?
7. Qu resultados esperara si la concentracin de EtOH en la muestra es mayor a la
concentracin mxima que puede determinar el protocolo?
100
Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Fister, H.J. Ethyl alcohol. Manual of standardized procedures for spectrophotometric
chemistry. E-10a.1-E-10b.3 (1950) U.S.A. Standard scientific supply corporation. U.S.A.
Hobbs, W.H.; Rall, T.W.; Verdoorn, T.A. Hipnticos y sedantes: etanol en Goodman &
Gilman. Las bases farmacolgcas de la teraputica. 1. 9a ed. Ed. McGraw-Hill
Interamericana, Mxico D.F., 1996, pp. 411419.
Klassen, C.D.; Watkins, J.B. Efectos de los solventes y vapores en Toxicologa Clnica
en Casarett & Doull, Manual de Toxicologa, la ciencia bsica de los txicos. (5 ed.)
McGraw-Hill Interamericana, Mxico D.F. 2001, pp. 739-744, 934-935.
Pesce, A.J., y Kaplan, L.A. Alcohol por Schroeder, T.J. Methods in clinical chemistry.
The C.V. Mosby Company. U.S.A., 1987, pp. 324-329.
Sunshine, I. Ethanol en Methodology for Analitical Toxicology. CRC Press, Inc., 1978,
pp. 145-154.
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Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Balanceo de la siguiente ecuacin:
CH3OH
+ K2Cr2O7
Cr3+
+ R-COO -
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APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
APNDICE III
DISPOSICIN DE RESIDUOS
R1: EtOH, K2Cr2O7, H2SO4, CH3COOH, Cr(SO4)3, K2SO4, K2CO3
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Laboratorio de Toxicologa
OBJETIVO ACADMICO
Con base en los conocimientos adquiridos en los guiones anteriores, que el alumno
proponga un proceso de extraccin e identificacin para alcaloides y barbitricos.
PROBLEMA
Aislar e identificar escopolamina y/o cido barbitrico de una muestra problema.
Reactivos
- Hidrxido de amonio (NH4OH)
- Metanol (MeOH)
- cido actico glacial
- Carbonato de bismuto (Bi2(CO3)3)
- Acetato de cobalto tetrahidratado
- cido barbitrico
- Cromatofolios de aluminio
- Yoduro se sodio (NaI)
- Acetato de etilo
- Isopropilamina
- Escopolamina
Equipo
- Rotaevaporador
- Lmpara de luz ultravioleta
- Bomba de aspersin
Material
- Embudo de separacin de 250 mL
- Embudo de cola corta
- Matraz Erlenmeyer de 125 mL
- Matraz de bola de 50 mL
- Vaso de precipitado de 250 mL
- Vaso de precipitados de 100 mL
- Pipeta Pasteur
2
2
3
2
3
4
3
- Agitador de vidrio
- Probeta de 10 mL
- Pipeta graduada de 10 mL
- Anillo metlico
- Tubos de ensayo
- Anillos de corcho
- Tubo capilar
1
1
2
1
4
2
2
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DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. El profesor proporcionar una muestra que contiene escopolamina y/o cido barbitrico.
El alumno desarrollar el procedimiento que proponga para aislar la forma no ionizada de
los compuestos antes mencionados.
2. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias, evaporar a sequedad en un
rotaevaporador. Dejar enfriar y reconstituir cada uno de los residuos con 0.5 mL (3 o 4
gotas) de metanol. Etiquetar cada uno de ellos con el nombre de la sustancia que espera que
contenga.
3. Para el proceso de identificacin, solicitar a los profesores dos placas para cromatografa
en placa fina. En una de ellas (placa 1) del lado izquierdo tendr aplicada previamente la
referencia de escopolamina, y en la otra (placa 2) la de cido barbitrico. Una muestra del
residuo reconstituido previamente ser aplicada del lado derecho de cada una de las placas
de acuerdo con el siguiente esquema.
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Alcaloides
a) Colocar 2 gotas del residuo reconstituido correspondiente, y agregar 2 gotas de HCl
1N ms 2 gotas de solucin stock del reactivo de Dragendorff.
b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con
agua) para esta reaccin.
Barbitricos
a) Colocar tres gotas del residuo reconstituido correspondiente y agregar tres gotas del
reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi).
b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con
agua) para esta reaccin.
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Laboratorio de Toxicologa
CUESTIONARIO
1. Reporte el diagrama de separacin que utiliz para esta prctica y justifique los
cambios, si los hubo, con relacin al diagrama diseado en los conocimientos previos.
2. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de
identificacin. Marque con una cruz si la reaccin fue positiva.
Referencia
escopolamina
Residuo
reconstituido de
escopolamina
Referencia
Residuo
de cido
reconstituido
barbitrico
de cido
barbitrico
Dille-Koppanyi
Dragendorff
Rf
Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin.
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Laboratorio de Toxicologa
Referencias bibliogrficas
Benko, A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone
Tissue en Journal of Forensic Sciences 30, 708-714.
Blanke, R.V.; Decker, W.J. Analysis of Toxic substances en Textbook of clinical
chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986, pp. 1670-1744.
Bowman y Rand. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Editorial
Interamericana, Mxico, 1984. 42.25-42.32.
Bruneton, J. Alcaloides, Generalidades en Farmacognosia. Fitoqumica. Plantas
Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, Espaa, 2001, pp. 775-792.
Clark, E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press,
London, 1972.
Cochin, J.; Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of
Drugs. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics
from Urine, Blood and Tissues en Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics 139, 154-159.
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Laboratorio de Toxicologa
APNDICE I
CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Propiedades cido-base (pKa) de la escopolamina y el cido barbitrico.
2. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.
3. Diagrama de separacin para aislar escopolamina y cido barbitrico presentes en
una muestra problema, justificando en cada etapa el uso de los reactivos sugeridos.
4. Indicar en el diagrama anterior la recoleccin y almacenamiento de los desechos
generados.
5. Fundamento de la reaccin de Dragendorff.
6. Bases de la reaccin de Dille-Koppanyi.
7. Fundamento de la cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de
sustancias qumicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como
reveladores.
APNDICE II
PREPARACIN DE REACTIVOS
Reactivo de Dragendorff (solucin patrn)
Solubilizar 2.6 g de Bi2(CO3)3 y 7.0 g de NaI en 25 mL de cido actico glacial, calentar por
10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la
solucin. Mezclar 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) con 8 mL de acetato de etilo, la solucin
anterior se guarda en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses).
Reactivo de Dragendorff (solucin reveladora)
Mezclar 10 mL de la solucin patrn con 25 mL de cido actico glacial y 60 mL de
acetato de etilo.
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Reactivo A (Dille-Koppanyi)
Solubilizar 0.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de MeOH absoluto y
agregar 0.2 mL de cido actico glacial.
Reactivo B (Dille-Koppanyi)
Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 25 mL de MeOH absoluto.
NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 das.
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