AGAR MANITOL SALADO

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento
de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos,
productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria.
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta
concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan
el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de
una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos,
presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias
sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio
para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona,
constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el
manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que
se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe
el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de
pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y
fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH
del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.Los
estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no
fermentar el manitol.Los estafilococos coagulasa positiva fermentan
el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una
zona
del
mismo
color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como
colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de carne

1.0

Pluripeptona

10.0

d-Manitol

10.0

Cloruro de sodio

75.0

Agar

15.0

Rojo de fenol

0.025

Suspender 111 g de polvo por

litro de agua destilada. Reposar
5 minutos y mezclar calentando
a ebullicin durante 1 o 2
minutos. Distribuir y esterilizar
en
autoclave
a
118-121C
durante 15 minutos.

pH final: 7.4 0.2

Siembra
Sembrar en superficie un inculo denso de la muestra.

Incubacin
De rutina: durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la
incubacin durante 3 das a 32 C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos

Crecimient
o
aureus Excelente

Staphylococcus
ATCC 25923
Staphylococcus
Bueno
epidermidis ATCC 14990
Escherichia coli ATCC Inhibido
25922
Klebsiella
pneumoniae Inhibido
ATCC 700603

Caractersticas
las colonias
Amarilla

de

Roja
Inhibido
Inhibido

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo
PRUEBA DE LA CATALASA
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se
encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es
Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los
siguientes gneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-).

Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las

excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de
Erysipelothrix (-)

METODOLOGA

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de

18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30%

sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

Observar la
positivo).

formacin

inmediata

de

burbujas

(resultado

Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el

agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

BAIRD PARKER MEDIO BASE.

Fundamento
En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto
de carne constituyen la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto de
levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato
estimulan
el
crecimiento
de
los
estafilococos.
Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de
potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora
acompaante. La yema de huevo permite demostrar la actividad
lecitinsica.
Frmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Peptona de casena

10.0

Extracto de carne

5.0

Extracto de levadura

1.0

Cloruro de litio

5.0

Agar

17.0

Glicina

12.0

Piruvato de sodio

10.0

Suspender 60 g del medio

deshidratado en 940ml de agua
destilada. Dejar en reposo 5 a 10
minutos.
Calentar
agitando
frecuentemente y hervir durante 1
minuto. Distribuir y esterilizar en
autoclave a 121C (15 libras)
durante 15 minutos. Enfriar a 4550C y agregar 50 ml de la
emulsin de yema de huevo y
10ml de la solucin de telurito
(Cdigo
B03-601-61).
Homogeneizar y distribuir en cajas
de Petri.

pH final: 6.8 0.2

Siembra
Dejar secar la superficie de la placa preparada y extender 0.1 ml de la
dilucin de la muestra a analizar.
Incubacin
24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismo
s
E. coli ATCC 25922

Crecimien
to
Inhibido

Apariencia
---

P. mirabilis ATCC Bueno

Colonias marrones sin zona clara u
43071
opaca alrededor
S. aureus ATCC Bueno
a Colonias negras con borde incoloro,
25923
excelente
convexas, rodeadas de una zona
opaca, con una zona clara externa.
S.
epidermidis Escaso
o Colonias
negras,
de
tamao
ATCC 14990
bueno
irregular. Zona opaca alrededor de la
colonia (no hay zona clara).
Caractersticas del medio:
Medio preparado: mbar claro opalescente (sin el agregado de yema
de huevo).

ROJO DE METILO/VOGES-PROSKAUER
Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y
permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli
y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que
utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn
aerobiamente (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el
oxgeno
del
medio,
para,
en
segundo
lugar,
continuar
metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de
dos tipos:

Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del

grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos
(cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un
fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por
el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo
por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del

grupo
Klebsiella-Enterobacter
(antiguo
aergenes).
Los
productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y
el etanol, producindose acetona como intermediario que
podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de
Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer)
que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo
caracterstico.

Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo

en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30C durante un
periodo de 3 das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las
pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que
servirn para cada uno de los ensayos.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (45) de solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para
homogeneizar y se observa la coloracin.

Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece

amarillo.

Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade:

o 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer
(alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El
medio adquiere un aspecto lechoso.
o 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer
(KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso
y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color

rosado-violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte
superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin
alguna.

AGAR TSI
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de
enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa,
sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan
los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa,
sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El
tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de
cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH,
y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en
medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el
que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico
sulfuro de hierro de color negro.
Frmula (en gramos
litro)
Extracto de carne
Pluripeptona
Cloruro de sodio
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Sulfato de hierro y
amonio
Tiosulfato de sodio

por
3.0
20.0
5.0
10.0
10.0
1.0
0.2
0.2

Instrucciones
Suspender 62,5 g del polvo
por litro de agua destilada.
Mezclar bien y calentar con
agitacin frecuente, hervir 1
o 2 minutos hasta disolucin
total. Llenar hasta la tercera
parte de los tubos de ensayo.
Esterilizar a 121C por 15

Rojo de fenol

0.02
5
13.0

minutos. Enfriar en pico de

flauta profundo.

Agar
pH final: 7.3 0.2
Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y
extendiendo sobre la superficie del medio.
Incubacin
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el
microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el
microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo
es no fermentador de azcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que
el microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo
produce cido sulfhdrico.
Microorganismo

Pico/Fondo

Produccin de
gas

E. coli ATCC 25922

K. pneumoniae
ATCC 700603
P. mirabilis ATCC
43071
S. typhimurium
ATCC 14028
S. enteritidis ATCC
13076
S. flexneri ATCC
12022
P. aeruginosa ATCC
27853
A: cido
K: alcalino

A/A
A/A

+
+

Produccin
decido
sulfhdrico
-

K/A

K/A

K/A

K/A

K/K

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

LISINA HIERRO AGAR.

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos,
especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin /
desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan
los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato
de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para
detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El
citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores
de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el
indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2,
y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que
alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color
violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por
lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los
microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del
medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se
observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y
el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de
hierro.Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas
de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-cetocarbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno
forma un color rojizo en la superficie del medio.
Frmula (en gramos
litro)
Peptona de gelatina
Extracto de levadura
Glucosa
Lisina
Citrato de hierro y
amonio
Tiosulfato de sodio
Prpura de
bromocresol

por
5.0
3.0
1.0
10.0
0.5
0.04
0.02

Instrucciones
Suspender 35 g del medio
deshidratado en un litro de
agua destilada. Dejar
embeber unos 15 minutos.
Calentar cuidadosamente,
agitando con frecuencia y
hervir durante un minuto
hasta la disolucin completa.

Agar

15.0

Distribuir y esterilizar a
121C durante 15 minutos.
Enfriar en pico de flauta
dejando un fondo vertical
apto para la puncin.

pH final: 6.7 0.2

Siembra
Por puncin profunda con aguja de inoculacin.
Incubacin
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.
Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus,
Providencia y alguna cepas de Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el
lmite del pico y fondo)
Microorganismos

Color en el
pico de flauta
Rojo

Color en la
base del
tubo
Amarillo

Ennegrecimie
nto del
medio
Negativo

Proteus mirabilis ATCC

43071
Salmonella typhimurium
ATCC 14028
Salmonella enteritidis ATCC
13076
Providencia spp.

Prpura

Prpura

Positivo

Prpura

Prpura

Positivo

Rojo

Amarillo

Negativo

Citrobacter freundii

Prpura

Amarillo

Positivo

Morganella spp.*

Rojo

Amarillo

Negativo

Edwarsiella spp.

Prpura

Prpura

Positivo

Klebsiella pneumoniae ATCC Prpura

700603
Escherichia coli ATCC 25922 Prpura

Prpura

Negativo

Prpura

Negativo

*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la

lisina.
Caractersticas del medio
Medio preparado: color violeta

VERDE BRILLANTE BILIS 2% CALDO.

Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales
y fecales, por la tcnica del nmero ms probable.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios
para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son
los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es
el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo
coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y
gas.
Frmula (en gramos
litro)
Bilis de buey
deshidratada
Lactosa
Peptona
Verde brillante

por
20.0
10.0
10.0
0.01
33

Instrucciones
Suspender 40 g del polvo
deshidratado por litro de
agua destilada. Disolver y
distribuir 10 ml por tubo con
campanita de Durham.
Preparar adems, el medio a
doble concentracin.
Esterilizar en autoclave a
121C durante 15 minutos.

pH final: 7.2 0.2

Siembra
a.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar
por triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en
caldo simple concentracin.
Nmer
o
de
tubos

Volum
Volum
Concentra
en de
en de
cin
la
medio
del medio
muestr
a
3
10 ml
10 ml
Doble
3
1 ml
10 ml
Simple
3
0.1 ml
10 ml
Simple
b.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras slidas
(alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10 -1,

10-2 y 10-3 y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo

simple concentracin.
Nmer
o
de
tubos

Diluci
n dela
muestr
a

Volum
Volum
Concentra
en de
en de
cin
la
medio
del medio
muestr
a
3
10-1
1 ml
10 ml
Simple
-2
3
10
1 ml
10 ml
Simple
-3
3
10
1 ml
10 ml
Simple
c.- Para anlisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo
en el test presuntivo de coliformes totales (proveniente de Verde
Brillante y Bilis 2% Caldo Mac Conkey Caldo Lauril Sulfato,
utilizando la tcnica del NMP), o a partir de colonias presentes en
diferentes medios, que se presume sean coliformes, transferir una
ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2% caldo fresco,
incubando a 45 +/- 0.5 C y otra en Agua Triptona con incubacin a
35-37 C, para detectar la produccin de indol.
Incubacin
a- Para de coliformes totales: a 35-37 C durante 24 horas.
b- Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 C durante 24 horas.
Resultados
-Positivo: presencia de gas.
Con el nmero de tubos positivos, calcular el nmero mas probable. El
resultado se expresa por gramos 100 ml de producto
-Negativo: ausencia de gas.
Microorganismos

Crecimient
o
+
+
+

Escherichia coli ATCC 25922

Enterobacter spp.
Klebsiella pneumoniae ATCC
700603
Salmonella typhimurium ATCC
+
14028
Bacterias no fermentadores de
+
lactosa
Staphylococcus aureus ATCC
25923
+* -* 10-25% de cepas negativas o positivas
# a partir de Agua Triptona

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde esmeralda, transparente

Gas

Indol#

+*
+
+*

+*
-*
-*

Variable