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Archivo8 PEROXIDASA PDF
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TALLER
MULTIDISCIPLINARIO
DE PROCESOS
TECNOLGICOS DE
FRUTOS Y
HORTALIZAS
PRACTICA 3. DETERMINACIN
DE ENZIMAS RELACIONADAS
CON LA MADURACIN DE
PRODUCTOS VEGETALES
OBJETIVO
Determinar la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa en diversos productos
hortofrutcolas en diferentes estadios de maduracin para asociarla la actividad de estas
enzimas al tipo de manejo postcosecha del producto.
ANTECEDENTES
1. Polifenoloxidasa (PPO)
1.1. Funcin de PPO en frutas y hortalizas.
La polifenoloxidasa, conocida como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol oxigeno
oxireductasa (E.C. 1.14.18.1), cataliza la oxidacin difenoles en presencia de oxigeno
molcular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente en
plantas. La localizacin de la enzima en las clulas de las plantas depende de la especie y
estado de madurez. La distribucin de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales
puede ser diferente ya que la proporcin de enzimas solubles vara con la madurez.
Dentro de su papel en la naturaleza, la PPO es participe en la cadena de respiracin de
plantas como una de las oxidasas terminales, sin embargo esto ha sido cuestionado.
Mucho ms importante es el papel que juega en la resistencia a infecciones
microbiolgicas o virales en las plantas en un clima adverso. Participa indirectamente en
la biosntesis de auxinas. Por lo que jugar un papel importante en la regulacin del
crecimiento de las plantas junto con la enzima degradante de la auxina (POD). Tambin
participan en el fenmeno denominado pardeamiento enzimtico, el cual es consecuencia
indirecta del la accin de la PPO en alimentos procesados.
1.2 Bioqumica y mecanismos de reaccin
Es una enzima que contiene cobre y que cataliza dos diferentes reacciones: (a) la
hidroxidacin de monofenoles a o- difenoles y (b) la oxidacin de o- dihidroxifenoles a oquinonas, para llevar a cabo estas reacciones se requiere oxgeno molecular. Los
extractos enzimticos de diferentes fuentes poseen estas dos actividades en diferentes
proporciones, se ha reportado que en preparaciones de papas, manzanas, championes
posee ambas actividades y las de tabaco, mango, pltano y pera, se presenta solamente
una actividad.
El mecanismo que describe la reaccin catalizada por PPO es el siguiente:
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1.3. Sustratos
Las frutas y hortalizas poseen una amplia variedad de compuestos fenlicos, de los cuales
slo una pequea parte de estos son sustrato para la PPO.
Los ms importantes son catequinas ( 3-hidroxiflavanes), steres de cido cinmico cido
clorgenico ( 3- O-cafeoyl-D-cido quinico) el cual, es el sustrato ms encontrado en la
naturaleza, el 3,4-dihidroxipenilalanina (L-DOPA) que es el producto de la hidroxilacin de
tirosina; y la Tirosina la cual siendo un fenol y al mismo tiempo un aminocido
constituyente de protenas, se encuentra en cada tejido de las plantas. 0
1.4 pH y temperatura ptima de actividad
El valor de pH ptimo de actividad de PPO vara dependiendo la fuente de la enzima, as
como tambin el sustrato en un intervalo relativamente amplio, en la mayora de los casos
va desde pH 4.0 a 7.0. Muchas preparaciones muestran un slo pH ptimo de actividad y
en algunos casos se presenta un segundo pH ptimo que puede ser atribuido a una
insuficiente purificacin.
En cuanto la temperatura ptima de actividad que ha sido mucho menos investigada que
el pH ptimo, los datos disponibles indican que la temperatura ptima depende de los
mismos factores que depende el pH ptimo. La actividad en melocotones se incrementa
de 3C- 37C y decrece arriba de 45C.
1.5 Inhibidores
Debido a que la PPO es una metaloprotena con cobre puede ser inhibida por agentes
metalo quelantes tales como cianuro, monxido de carbn, dietil- ditiocarbamato de
sodio( DIECA), mercaptobenztiazol , dimercaptopropanol, azide o xanato metilpotasio.
Algunos de estos reaccionan tambin con las quinonas formadas.
1.6 Extraccin y purificacin
Existen tres problemas para extraccin de PPO (1) latencia, (2) solubilizacin de la
actividad lmite de la clula, y (3) prevencin de la oxidacin inducida de la enzima y la
subsecuente polimerizacin y precipitacin en la protena enzimtica, o fenoles
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2. Peroxidasa (POD)
2.1Funcin en fruta y hortalizas
La peroxidasa (EC 1.11.1.7; Donador; Perxido de hidrgeno oxirreductasa, POD) es
similar a la PPO, ya que pertenecen al grupo de oxidoreductasas. Las cuales descomponen
perxido de hidrgeno en presencia de un donador de hidrgeno es una de las enzimas
que controlan el crecimiento fisiolgico de las plantas, su diferenciacin y desarrollo. Es
bien conocido, que esta enzima participa en la construccin y lignificacin de la pared
celular, la biosntesis de etileno a partir del cido 1- aminociclopropanocarboxlico y
perxido de hidrgeno (H2O2), la regulacin de niveles de auxina, la proteccin contra el
deterioro de tejidos e infeccin por microorganismos patgenos, la oxidacin de cido
indolactico, etc. . Por otro lado, hoy da existe un gran inters por la POD debido a sus
mltiples aplicaciones prcticas (industria maderera, industria de alimentos, bioqumica
clnica, etc.).
Se encuentra presente en animales, plantas y microorganismos. En las plantas localizada
en la clula parcialmente en forma soluble y en el citoplasma de manera insoluble. La
fraccin de POD soluble, puede ser extrada de tejidos homogenizados con un buffer de
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fuerza inica baja La POD se encuentra ampliamente distribuida en las plantas, sin
embargo, en la actualidad, la POD de la raz de rbano silvestre (Armoracia lapothifolia) es
la nica que tiene aplicacin prctica debido a que es la fuente que posee la mayor
actividad de esta enzima.
2.2 Bioqumica y mecanismo de reaccin
La peroxidasa cataliza cuatro tipos de reaccin: (a) Peroxidativas (b) Oxidativas (c)
Cataliticas y (d) de hidroxilacin.
La ecuacin global del mecanismo de reaccin es el siguiente:
ROOH
Donde:
AH 2
POD
H 2O
ROH
Perxido
POD es altamente especfica al perxido, por lo tanto su principal sustrato es H 2O2, sin
embargo la enzima es inactivada por altas concentraciones de perxido.
Sustrato donador
La POD tiene una baja especificidad por los sustratos donadores de hidrgeno: esto es
interpretado como resultado de las diferentes especificidades de las isoenzimas de POD
presentes en las plantas. Alguno de estos sustratos son: guayacol, o-dianisedina, ofenildiamina, o-tolidina,3-amino-9-etil-carbazol, 3, 3-diaminobencidina tetraclorada(DAB)
p-fenildiamina y o-toludina.
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EQUIPO:
Espectrofotmetro
Centrifuga
Agitador Vortex
Balanza analtica
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MATERIAL:
2 Esptulas
12 Tubos de Microcentrfuga de 1.5 ml
1 Micropipeta 1000 l
1 Micropipeta de 200 l
1 Micropipeta de 100 l
Puntas de micropipeta.
1 Cronmetro
4 Celdas para espectrofotmetro.
Hielo
10 Tubos de ensaye 20ml
Gradilla
1 Guantes
Parafilm
MUESTRAS Y REACTIVOS:
Una o dos especies del producto hortofrutcola en tres estadios de madurez por equipo.
Buffer fosfatos 0.2 M, pH 7
Buffer fosfatos 10mM, pH 7.5
Buffer fosfatos 0.05M, pH 5
Dopamina hidroclorada 0.07M
Perxido de hidrogeno (15ml/l)
p-fenilendiamina (10mg/ml)
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Tartrato de Na y K al 2%
Reactivo de Folin-Ciocalteu
Reactivo A
Reactivo B
PROCEDIMIENTO:
Preparacin de los extractos crudos.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
-8-
Determinacin de Protena.
La cantidad de protena de los extractos se determinar utilizando el mtodo de Lowry.
Preparacin del reactivo A y reactivo B.
Para el reactivo A: se prepara mezclando 100 partes de Na2CO3 (2%) en NaOH
0.1M, una parte de CuSO4.5H2O (1%) y una parte de Tartrato de Na y K (2%).
Para el reactivo B: Esta solucin se prepara al momento de utilizarla. Reactivo
de Folin-Ciocalteu al 40% (v/v), se mantiene en agitacin hasta el momento de
su uso.
1. Construir la curva patrn utilizando como estndar albmina srica bovina (ASB).
Para lo cual en tubos de ensaye se van colocar las cantidades de la solucin de ASB
y agua destilada que se muestran en la tabla 1.
2. Agregar 1 ml del reactivo A, agitar en el vortex y dejar a temperatura ambiente
durante 10 min.
3. Posteriormente agregar 10 l del reactivo B, agitar en vortex y dejar a temperatura
ambiente 1 hora.
4. Realizar la lectura en espectro a 750 nm.
5. Registrar los resultados para clculos posteriores.
Tabla 1. Preparacin de tubos para la construccin de la curva patrn de protena
Muestra
Solucin de ASB ( l)
Agua destilada ( l)
Blanco
0
100
1
10
90
2
20
80
5
50
50
7
70
30
10
100
0
Muestra PROBLEMA
80
Alcuota 20 l
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Calculo de protena.
Los valores de concentracin de protena se determinarn por interpolacin grfica en la
curva patrn obtenida.
Partiendo de la ecuacin de la recta
Protena (mg/ml) = (Absorbancia b) / pendiente * el factor de dilucin.
Factor de dilucin= V final / V inicial
Diagrama:
Muestras problema
Muestras
almacenadas
Muestras
congeladas
Hacer observaciones,
Apariencia (peso, color).
Tomar muestras
Pesar muestras
Preparacin de los
extractos crudos
Determinacin
actividad de
Polifenoloxidasa
Determinacin
actividad de
Peroxidasa
Realizar clculos
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Determinar
protena
Hoja de resultados.
Tabla de resultados de muestras almacenadas (Apariencia).
Condicin de almacenamiento
Peso (g)
Color
Defectos
Observaciones
1
2
3
Tabla de peso de muestras para enzimas y protena.
Num. De Muestra
1
2
3
4
5
6
Peso (g)
Num. Muestra
Actividad Polifenol
oxidasa
Actividad de
Peroxidasa
Protena
1
2
3
4
5
6
0.004
0.0035
420/mg.prot.*min.
0.004
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
Abs
Abs
420/mg.prot.*min.
0.001
0.0005
0.003
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
preclimaterio
inicio climaterio
mximo climaterio
Estadios
S/envase
Bolsa
Caja PET
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CUESTIONARIO:
1) Cmo actan las polifenoloxidasa en los frutos y vegetales?
2) Qu funcin fisiolgica tienen estas enzimas en los productos vegetales?
3) En qu productos vegetales se encuentran presentes estas enzimas ms
frecuentemente?
4) La actividad de estas enzimas cambia con la maduracin? Por qu?
5) Qu sustratos para estas enzimas se encuentran presentes en su producto?
6) La actividad de estas enzimas cambia con las condiciones de almacenamiento?
Por qu razn? Explique.
7) Qu importancia tiene el conocer la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa
bajo diferentes condiciones de almacenamiento?
8) Sera benfico o contraproducente la inhibicin de estas enzimas durante el
proceso de los productos vegetales?
9) En qu casos es deseable la accin de estas enzimas y en que casos no lo es?
10) Qu mtodos crees que inhiben la accin de estas enzimas? Proponga una
metodologa para inhibirlo para el caso de su producto.
11) Por qu es importante la inhibicin de estas enzimas en los procesos
industriales?
12) Qu otras enzimas sera importante determinar en productos vegetales? por
qu razn?
13) Qu mtodos para la determinacin de actividad enzimtica existen?
Descrbalos.
14) Qu otros mtodos para la determinacin de protena en productos vegetales
conoce? Qu ventajas y desventajas tiene el mtodo de Lowry contra otros
mtodos utilizados para determinar protena?
15) Explique el principio del funcionamiento del espectrofotmetro?
16) A qu se debe el aumento en la absorbancia durante la determinacin de la
actividad de estas enzimas?
17) Investigue que tipo de compuestos se determinan en el intervalo del espectro de
420, 485 y 750 nm y si corresponde al intervalo utilizado para la determinacin en
la prctica.
REPORTE POR EQUIPO:
Antecedentes: Breve Informacin relativa al producto con el cual se trabajo, fundamentos
de las tcnicas utilizadas.
Resultados: Tablas que contengan los resultados obtenidos en cada determinacin,
CLCULOS, anlisis de estos y discusin con respecto a lo que se encuentra reportado en
la bibliografa.
Cuestionario.
Bibliografa consultada.
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REFERENCIAS
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ripening and chilling stress in Manila mangoes, Journal of Horticultural Science &
Biotechnology, 78,1:104-107
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Material elaborado como parte del proyecto PAPIME: Elaboracin de materiales educativos para
fortalecer la enseanza en el taller multidisciplinario de ingeniera en alimentos-procesos
tecnolgicos de frutas y hortaliza de la carrera de ingeniera en alimentos (PE 202610).
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