LECCIN 2: MTODOS DE ESTUDIO EN BIOLOGA CELULAR I.

MICROSCOPA DE LUZ. PREPARACIN DE MUESTRAS. MTODOS DE

TINCIN.
MICROSCOPA DE LUZ

El microscopio de luz: Este instrumento consta bsicamente de un sistema

mecnico, de un sistema de iluminacin y de un sistema de lentes o sistema ptico
que conocern con detalle en la primera prctica. El sistema ptico se compone de un
condensador, para mejorar la iluminacin del objeto a observar, los objetivos, situados
en un revlver mvil, y los oculares. Es necesario recordar que los aumentos que se
pueden conseguir con un sistema ptico no es un dato fiable sobre la calidad de las
imgenes. Lo que define la calidad de imagen, su claridad y detalle, es su resolucin. El
poder de resolucin de un microscopio se define como la capacidad de mostrar como
separados dos puntos prximos. Es decir, que con un microscopio con un poder de
resolucin de 0,2 m, veremos como diferentes dos puntos que estn separados 0,2 m
o ms. El poder resolutivo del ojo humano es de 0,1-0,2 mm.
La frmula simplificada para calcular el poder resolutivo (d) de una lente es:
d=

061.
n . sen

Donde es la longitud de onda de la luz, unos 500 nm. (la luz visible abarca de
400 a 700 nm), n es el ndice de refraccin del medio y sen es el seno del semingulo
del cono de luz que es capaz de captar el objetivo. Al producto n . sen se conoce como
apertura numrica: (AN). En total y en las mejores condiciones posibles, siendo el
medio vidrio con n=1.5.
d=

061 x 500
200 nm
15 x 092

Con una AN de 14, el poder resolutivo del microscopio de luz es de

aproximadamente 200 nm. nicamente puede aumentarse de manera apreciable esta
capacidad de resolucin con el tratamiento informtico de las imgenes. Para los
objetivos de nuestros microscopios de prcticas, el clculo aproximado del poder
resolutivo es:
4/0.10..3m
10/0,251.2 m
40/0.650.5 m
100/1.30....0.25 m

En este curso se mostrar el manejo del microscopio ms comn, es decir, el de

campo claro y adems consideraremos los fundamentos y aplicaciones del microscopio
invertido, del contraste de fases, de campo oscuro y de fluorescencia.
El microscopio invertido tiene su mxima utilidad en el estudio de cultivos
celulares, sin necesidad de abrir las placas de cultivo ni de interrumpir el proceso. La
diferencia bsica con el ya descrito es la diferente disposicin de los elementos que lo
forman. Esencialmente la fuente de iluminacin y el condensador se sitan sobre el
objeto y los objetivos y oculares, debajo del objeto a observar (Fig. 2-1 ).

Fig. 2-1: Esquemas de microscopio de luz convencional (A), invertido (B), electrnico de transmisin (C)
y de barrido (D). 1: Sistema de iluminacin. 2: Condensador. 3: Objetivos. 4: Oculares. l' :Emisor de
electrones (ctodo y nodo). 2': Condensadores. 3': Objetivo. 4': Lente proyectora. 5': pantalla
fluorescente. 6': Lupa binocular. 7': Generador de barrido. 8': Fotomultiplicador. 9': Monitores de
observacin y fotografa.

El microscopio de contraste de fases utiliza un condensador y unos objetivos

especiales. Se utiliza preferentemente para la observacin de preparaciones sin teir o
de clulas vivas en cultivos celulares ya que permite la visualizacin de estructuras que
carecen de color y de contraste en la microscopa de campo claro. Las estructuras
histolgicas no teidas, aunque no absorben ni reflejan luz suficiente como para ser
visibles, producen un desfase en las ondas luminosas por tener diferente ndice de
refraccin. Estas diferencias de fase en las ondas luminosas se transforman, en este
microscopio, en diferencias de intensidad luminosa que puede ser captada por el ojo
humano como diferentes tonos de gris.
El microscopio de campo oscuro utiliza un condensador especial con la zona central
opaca de forma que la luz atraviesa el condensador por una zona perifrica. As la luz
que alcanza el objeto lleva una trayectoria muy oblicua y la mayor parte de la luz no
alcanza la lente objetivo ni el ojo del observador. Si en la preparacin hay alguna

partcula de estructura cristaloide, la luz puede difractarse en ella, alcanzar la lente

objetivo y ser vista.

Fig. 2-2: Diferentes imgenes de un fibroblasto en cultivo fotografiado con microscopa de luz
de campo claro (A), contraste de fases (B) y campo oscuro (D).

El microscopio de fluorescencia se basa en que las sustancias fluorescentes

cuando son iluminadas con luz ultravioleta, no visible al ojo humano, emiten
longitudes de onda ms larga, ya en el espectro visible, que puede ser azul, verde,
amarilla, naranja o roja. La iluminacin con luz ultravioleta puede hacerse, como en el
microscopio de campo claro usual, desde la base del microscopio, es decir, atravesando
la preparacin, denominndose microscopa de fluorescencia transmitida. Ms
recientemente y con mejores resultados se ha utilizado la epi-fluorescencia o
fluorescencia de luz incidente en la que la luz penetra concntricamente por el objetivo,

se refleja en el objeto y vuelve a entrar por la zona central del objetivo para alcanzar el
ojo del observador. Aunque algunas sustancias naturales que pueden hallarse en las
preparaciones histolgicas son fluorescentes, lo habitual es que se utilicen compuestos
fluorescentes, denominados fluorocromos, que pueden inyectarse en las clulas,
conjugarse con anticuerpos o usarse como colorantes. La microscopa de fluorescencia
se usa frecuentemente para inmunocitoqumica.
En la actualidad se utiliza con resultados muy interesantes el microscopio de
fluorescencia lser confocal. Es un microscopio confocal, es decir utiliza diafragmas
muy pequeos que producen planos focales muy estrechos (muy poca profundidad de
campo). Adems es un microscopio de fluorescencia con luz lser para disminuir las
aberraciones. Las imgenes obtenidas son individualmente poco tiles pero, con ayuda
de un programa informtico, pueden combinarse muchas de ellas y formar una imagen
de gran definicin y riqueza de detalles.
PREPARACION DE MUESTRAS PARA MICROSCOPA DE LUZ
Para observar una muestra con el microscopio, sta ha de ser lo suficientemente
delgada como para permitir que la luz la atraviese y alcance el ojo del observador.
La manera ms sencilla de estudiar clulas con microscopa de luz, consiste en
observar un cultivo o una extensin de una suspensin celular, por ejemplo: sangre o un
cultivo celular, con microscopa de contraste de fase. Tambin muy sencillo es teir
estos cultivos o extensiones y observarlos con microscopa de campo claro. Igualmente
sencillos son los denominados frotis, (vaginales, bucales etc.) y las improntas. En los
frotis, mediante una torunda de algodn se extienden las clulas en el portaobjetos,
mientras que las improntas se realizan apoyando suavemente un trozo del rgano
fresco, por ejemplo de un ganglio linftico, sobre un portaobjeto. Un mtodo con
aplicacin en el estudio neuropatolgico de los nervios perifricos es el desgarramiento
de los nervios para aislar y poder observar fibras nerviosas individuales. Todos estos
mtodos, junto con el aplastamiento entre dos portaobjetos del material a observar, se
utilizaron antes de la invencin del microtomo y aunque algunos de ellos son todava
muy tiles, la mayor parte de las observaciones histolgicas se realizan sobre cortes
finos, de un espesor aproximado de 5 m (habitualmente entre 1 y 10 m).
Para realizar cortes finos de una muestra biolgica, sta ha de tener suficiente
consistencia. Para aumentar la consistencia, para detener los procesos de putrefaccin y
autolisis y para facilitar la tincin, se realiza la fijacin de la muestra, generalmente en
formaldehdo tamponado. Posteriormente, la pieza puede congelarse y cortarse en un
microtomo apropiado, o bien puede incluirse en parafina o plstico y cortarse con el
correspondiente microtomo. El proceso bsico de la inclusin consiste en una

deshidratacin, con alcohol o acetona, ya que la parafina o las resinas plsticas no son
hidrosolubles, una impregnacin en una mezcla de solvente y parafina (o resina) y,
finalmente, una infiltracin en parafina con posterior solidificacin con el fin de hacer
un bloque de parafina con la muestra incluida en l dispuesta para ser seccionada. La
seccin de las piezas en cortes finos se realiza en el microtomo. A continuacin, las
secciones colocadas sobre un portaobjetos pueden ser teidas y cubiertas con una resina
de ndice de refraccin igual al del vidrio y con un cubreobjetos, para ser observadas.

Fig.: 2-3: Esquema de los mtodos usuales para la observacin de muestras con el microscopio
de luz.

METODOS DE TINCIN PARA MICROSCOPA DE LUZ

Son muy variados y, desde un punto de vista descriptivo, los podemos clasificar
en:
- Topolgicos: Tambin denominados panpticos o generales. Tien todas las clulas o
tejidos de manera constante y general. La tincin ms utilizada de este tipo es la
hematoxilina-eosina.
- Especiales: Tien solamente algunos orgnulos celulares, clulas especficas o sus
productos. Como ejemplos: el mtodo del formol-urano, tie selectivamente el Aparato
de Golgi de las clulas animales y el tricrmico de Masson tie especialmente las fibras
de colgeno.
- Citoqumicos o histoqumicos: Colorean determinadas sustancias gracias a
reacciones qumicas especficas, cuyo producto final es observable al microscopio. Por
ejemplo, la reaccin del azul de Perls para detectar depsitos de hierro en clulas u
rganos o la reaccin de Gomori para detectar actividad fosfatasa.

Fig. 2-4. Esquema de una reaccin citoqumica para detectar actividad fosfatasa.

-Inmunocitoqumicos o inmunohistoqumicos: Consisten en evidenciar una sustancia

gracias a la reaccin altamente especfica de los anticuerpos con sus correspondientes
antgenos. Para ello se utilizan anticuerpos contra la sustancia a determinar, sea por
ejemplo: el enzima tirosn-hidroxilasa. Estos anticuerpos, en el caso ms sencillo, se
unen a una molcula fluorescente, por ejemplo: la fluorescena, y se ponen en contacto
con las clulas o secciones de rganos donde queremos estudiar la localizacin de este
enzima. Los anticuerpos antitirosn-hidroxilasa, ligados a la fluorescena, se unirn a la
tirosn-hidroxilasa de algunas neuronas y, al iluminarlas con luz ultravioleta, emitirn
una fluorescencia verde que permite identificarlas.
- Autorradiografa: Este mtodo se basa en la capacidad que tienen las radiaciones

ionizantes ( y ), para impresionar las emulsiones fotogrficas. La fuente de

radiacin se incorpora a las clulas u rganos, por ejemplo, mediante el suministro de
aminocidos radiactivos. Estos elementos radiactivos son captados por las clulas y
luego puede realizarse una preparacin histolgica para su estudio.

Fig. 2-5. Esquema de una reaccin de inmunohistoqumica con anticuerpos fluorescentes.

Brevemente, las clulas o los rganos con el marcador radioactivo incorporado

han de ser fijados, incluidos, seccionados y colocados sobre un portaobjetos. A
continuacin se recubren, en la oscuridad, con una emulsin fotogrfica y se dejan
varias semanas para que las radiaciones acten sobre la emulsin. Despus se revela
como una fotografa y se tien las clulas. Los lugares donde hay aminocidos
radiactivos dejarn puntos oscuros sobre la emulsin fotogrfica, que se correspondern
con una determinada zona de las clulas u rgano que se estudia. La iluminacin en
campo oscuro facilita la observacin de estas preparaciones

Fig. 2-6 Esquema simplificado de una preparacin de autorradiografa.

- Hibridacin "in situ". Esta metodologa se fundamenta en la capacidad que tienen

las secuencias de los cidos nucleicos para unirse con sus secuencias complementarias.
Gracias a esta propiedad, si se prepara una secuencia de bases (sonda) y se marca, puede
utilizarse para reconocer la secuencia complementaria en las clulas que la posean.

Fig. 2-7. Representacin esquemtica de una preparacin de "Hibridacin in situ", utilizando como
marcador fluorescena y anticuerpos anti-fluorescena marcados con fosfatasa.

Por lo tanto, si se conoce la secuencia de un determinado gen, o de un ARN

mensajero que codifica una determinada protena, puede prepararse una sonda
complementaria de una regin ms o menos larga de la secuencia de bases que se quiera
localizar. Esta sonda, una vez marcada, se pone en contacto con las clulas a estudiar
para que se hibride con su secuencia complementaria y se pueda observar con el
microscopio gracias a su marcaje. Las sondas pueden ser de ADN o de ARN, ya que
ambas pueden hibridarse con cadenas complementarias tanto de ADN como de ARN.
Sin embargo, es importante considerar la estabilidad de los complejos de hibridacin
que, de mayor a menor, es ARN-ARN, ARN-ADN y ADN-ADN por lo que son ms
usuales las sondas de ARN.
Para facilitar la hibridacin de la sonda con el cido nucleico de la preparacin
puede hacerse un tratamiento previo con proteasas o con soluciones cidas con el fin de
aumentar la permeabilidad y facilitar la accesibilidad de la sonda a los cidos nucleicos.
El marcaje ms utilizado es el radioactivo, por ejemplo, con S35 o H3. El tratamiento
posterior en este caso es bsicamente el mismo de la autorradiografa, que permite
estudios cuantitativos. Tambin puede marcarse la sonda con digoxigenina, conjugada
con peroxidasa o fosfatasa alcalina, que luego se pone de manifiesto como en los
mtodos inmunohistoqumicos.