Comparacin de la pectinasa obtenida de Aspergillus niger, y de pectina

ctrica extrada de la cscara de naranja y pectina ctrica comercial

empleadas como fuente de carbono en un medio de cultivo
Integrantes:

Flix Snchez Eduardo Pablo

Mndez Elizalde Paola
Pineda Lozada Vianey
INTRODUCCIN

Las enzimas pcticas de hongos filamentosos son un conjunto de enzimas que hidrolizan
la pectina que son productos qumicos que se obtienen de materias primas vegetales,
principalmente frutas; se usan en varias industrias, especialmente la de alimentos, para
darle propiedades de gel a los productos y como estabilizantes. Las pectinasas figuran
entre las enzimas de aplicacin industrial ms antiguas y pueden ser clasificadas en dos
grandes grupos: cidas y alcalinas. Las primeras son utilizadas en la industria de zumos
de fruta y en la fabricacin de vinos: son mayoritariamente poligalacturonasas de origen
fngico, especialmente de Aspergyllus niger. (Devia, 2002). Aspergillus es un hongo
filamentoso hialino, saprofito, perteneciente al filo Ascomycota. Se encuentra formado por
hifas hialinas septadas y puede tener reproduccin sexual (con formacin de ascosporas
en el interior de ascas) y asexual (con formacin de conidios); su color de colonia es
negro; y ste es uno de los principales hongos productores de micotoxinas las cuales son
metabolitos secundarios producidos y secretados por el hongo durante el proceso de
degradacin de la materia orgnica, como mecanismo de defensa frente a otros
microorganismos. (Instituto nacional de seguridad, 2013). La finalidad del presente trabajo
es comparar la pectinasa de Aspergillus niger y la fuente de carbono empleando pectina
ctrica extrada de la cscara de naranja y pectina ctrica comercial en un medio de cultivo.
MATERIALES Y MTODOS

Microorganismo de estudio

En este trabajo se emplea Aspergillus niger

Inculo

La suspensin de esporas que sirvi como inculo se obtuvo a partir de cultivos

desarrollados en cajas petri, utilizando solucin salina (NaCl al 0.9%) y Tween. Cada
experimento se inocul con el volumen adecuado de esta suspensin para tener 1x10 6
esporas/mL.

Medio de cultivo

Aspergillus niger se hizo crecer en medio basal, que contena, en g/L: K2HPO4; KH2PO4;
y (NH4)2SO4. El pH inicial del medio se ajust con la ayuda de soluciones de NaOH o
H2SO4 2M, hasta lograr el valor deseado. El medio se esteriliz a 121C y 1.5 psia
durante 20min. A esta solucin basal se le adicion la fuente de carbono (pectina natural y
comercial) en la concentracin final adecuada para cada cultivo.
Tcnicas de anlisis (yo le haba puesto tcnicas analticas, porque asi lo vi en un
articulopero igual la que sea esta bien)

Cuantificacin de esporas.

El conteo se realiz mediante la cmara de Neubauer.

Concentracin de protenas durante el crecimiento

La cuantificacin de protenas se realiz para evaluar la produccin de enzimas

pectinolticas y se llev a cabo utilizando el mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951), con las
siguientes modificaciones: se realiz una solucin patrn (BSA) (10mg/10mL), se
agregaron 2mL del reactivo C y 0.5mL del reactivo de folin diluido y se ley a una
absorbancia de 540nm. Se aplic el mtodo de Lowry para determinar protenas en el
sobrenadante de las muestras problema y se leyeron a la misma longitud de onda.

Actividad de exopectinasas mediante determinacin de azcares reductores

totales por el mtodo de cido dinitrosaliclico (DNS). (aqu como ya lo haba mencioado
faltara poner q tcnica fue, como en la de arriba se dice q fue la de Lowry a qui falta decir
cual es esta). Le puse q se hizo con modificaciones porq segn yo ya era una tcnica
establecida pero se modificaron cantidades, eso recuerdo.
La determinacin de azucares reductores se realiz con las siguientes modificaciones: Se
determinaron las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de 0 a 2.5mg/mL.
Se emple una solucin patrn de glucosa con una concentracin de 10mg/mL, la cual se
disolvi 100mg de glucosa en 10mL de agua. De sta solucin patrn se prepararon
diferentes concentraciones a las cuales despus se les adicion 0.25mL de reactivo de
DNS con agitacin constante. Posteriormente se llev a bao mara durante 5 minutos, se
dej enfriar en hielo durante 10min y se aadi agua destilada hasta completar el volumen
de 3mL. Se determin la absorbancia de cada tubo a 540nm en el espectro UV. De las
muestras tomadas de los medios de fermentacin y centrifugacin se tom 1mL de la
solucin acuosa de la muestra, ms 1mL de buffer, 1mL de H2O destilada y 1mL del
sustrato previamente preparado. El volumen final se dividi en 2 para llevar a cabo una
reaccin en calor (bao mara) y otra en hielo, se adicion 1mL del reactivo de DNS y se
dejaron reaccionar durante 15 min. Posteriormente a las reacciones en hielo se les aadi
H2O destilada hasta completar el volumen respectivo y se sacaron del hielo mientras que
las reacciones en calor se dejaron enfriar en hielo y se diluyeron con 10mL de H 2O
destilada. Se leyeron las absorbancias junto con el blanco a la misma longitud de onda y
se extrapolaron los datos con la curva estndar para conocer la concentracin.

RESULTADOS
1. Composicin del medio de cultivo

Tabla 1. Composicin de cada medio de cultivo para un volumen de 500mL

Composicin de cada medio de cultivo.
Pectina Natural
K2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
Pectina

Pectina Comercial
K2HPO4
1g
KH2PO4
1g
(NH4)2SO4
2.5g
Pectina
5g

1g
1g
2.5g
5g

Composicin de cada medio de cultivo con cantidades para 500 mL de medio.

2. Cuantificacin de esporas
La cuantificacin de las esporas se realiz por medio de un conteo en cmara de
Neubauer, obteniendo un resultado de 1.82x108 esporas. El inculo de acuerdo a la
bibliografa es de 1x106 esporas/mL por ello se hizo un clculo para determinar el volumen
(2.75mL) a tomar de la solucin de esporas para realizar el inculo manteniendo sta
relacin para los 500mL de medio de cultivo preparado.
3. Tcnicas de anlisis

Tabla 2. Toma de muestras en diferentes horas durante la fermentacin y tcnicas

aplicadas
Tiempo

Horas

T-1
T-2
T-3

15 hrs
17 hrs
19 hrs con
30 min
21 hrs con
15 min
39 hrs
41 hrs

T-4
T-5
T-6

Mtodo de Lowry
Pectina
Pectina natural
comercial
Abs.
Conc. Abs.
Conc.
0.026
0.063
0.077

28.363
62.000
74.727

0.034
0.042
0.043

35.636
42.909
43.818

Mtodo de DNS
Pectina
Pectina natural
comercial
Abs.
Conc.
Abs.
Conc.
real
real
0.020
0.109
0.038
0.124
0.032
0.119
0.039
0.124
0.095
0.168
0.022
0.111

0.157

147.454

0.092

88.363

0.373

0.387

0.042

0.127

0.057
0.047

56.545
47.454

0.046
0.036

46.545
37.454

0.060
0.003

0.141
0.096

0.062
0.067

0.142
0.146

En la valoracin de protenas por mtodo de Lowry, se realiz una curva patrn de

albmina en donde se determinaron diferentes concentraciones desde 0 a 250mg/mL, las
absorbancias obtenidas fueron crecientes y calculando una regresin lineal se obtuvo una

r2=0.9933. Con stos resultados podemos atribuir que a mayor absorbancia es mayor la
cantidad de protenas.
Las absorbancias obtenidas de las muestras del medio de cultivo con pectina natural
resultaron crecientes al igual que la curva patrn. Estas absorbancias se interpolaron en
la grfica de una curva patrn de albmina para determinar la cantidad en miligramos que
se tienen de protenas de cada muestra. Las cantidades que se obtuvieron corresponden
a la absorbancia es decir, que conforme aumenta la absorbancia aumenta la cantidad de
protenas, sin embargo las absorbancias estn por debajo de 0.1 y al estar los valores
muy cercanos al cero los datos obtenidos no se consideran confiables. En el caso de las
muestras del medio con pectina comercial de igual manera se interpolaron las
absorbancias para determinar la cantidad de protenas, las absorbancias de las muestras
fueron aumentando proporcionalmente con forme al tiempo por lo cual se observa una
cierta distancia entre cada punto. En el tiempo 4 (21hrs 5min) se obtuvo una cantidad de
protenas de 147.454mg de acuerdo a la interpolacin realizada, ste dato se puede
comprobar calculando la cantidad de protenas mediante la ecuacin de la recta (y=mx+b)
Comparando las concentraciones de protenas en cada medio de cultivo, podemos decir
que se obtuvo una mayor concentracin en el medio con pectina comercial que en el
medio con pectina natural, por lo que atribuimos a que la pectina natural no presenta la
misma pureza ni el mismo procesamiento que la pectina comercial por lo que existe una
diferencia en los resultados. (yo digo q mejor quite lo de pureza y quedara asi )
Comparando las concentraciones de protenas en cada medio de cultivo, podemos decir
que se obtuvo una mayor concentracin en el medio con pectina comercial que en el
medio con pectina natural, por lo que atribuimos a que la pectina natural no presenta el
mismo procesamiento que la pectina comercial por lo que existe una diferencia en los
resultados.
Las absorbancias reales de las muestras del medio de cultivo con pectina natural se
observan de manera creciente, aunque en el tiempo 3 es de 0.022 la cual es la
absorbancia ms baja esto es porque la absorbancia obtenida en la reaccin en frio es
grande y al realizarse la resta para obtener la absorbancia real queda muy pequea, en el
caso de los tiempos 5 (39hrs) y 6 (41hrs) se observan absorbancias mayores por lo tanto
como es proporcional a la concentracin, sta igual es mayor y no se observa ningn
valor decreciente; ste hecho lo atribuimos a que de las 6 muestras tomadas en este
medio de cultivo todava no llegaba a su punto mximo de crecimiento quiz si se
hubieran tomado ms muestras se hubiera podido observar el punto mximo. Mientras
tanto en el caso de las muestras del medio con pectina comercial, en el tiempo 4 se
observa la mxima absorbancia tanto en la reaccin en caliente como en la reaccin en
fro por lo tanto en ste medio de cultivo si se logr observar claramente el punto mximo
en donde se tiene la mayor concentracin de azcares reductores, es decir, el tiempo 4
(21hrs con 15min) es el punto mximo de crecimiento para el medio con pectina
comercial.
Comparando los resultados tanto del medio con pectina natural como los de la pectina
comercial con los estndares de referencia (enzimas puras), la concentracin ms

cercana a las concentraciones de las enzimas puras, vieja y nueva (0.454 y 0.521,
respectivamente) fue la de pectina comercial en el tiempo 4 siendo la concentracin de
0.387. (esto me parece esta bien)

CONCLUSIN

Se cumpli con todos los objetivos planteados en la presente investigacin, as

como la hiptesis ya que la mejor fuente de carbono fue la pectina ctrica
comercial ya que indujo una mayor actividad enzimtica que la pectina ctrica
extrada de la cscara de naranja.
Podemos concluir que a pesar de que la pectina ctrica extrada de la cascara de
naranja no tena el mismo procesamiento que la pectina comercial, esto porque no
se llevaron a cabo en las misma condiciones de trabajo se pudo realizar y
observar una comparacin entre los dos medios de cultivo, tenindose mayor xito
en el medio de cultivo con pectina ctrica comercial.

Tambin se cumpli con lo establecido en nuestro cronograma de actividades,

realizando la actividad y terminando en el da marcado.

BIBLIOGRAFA
1. Devia J. E. (2002). Proceso para producir Pectinas Ctricas, REVISTA Universidad
EAFIT, 129, 24-26.
2. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Aspergillus. 2013

3. Lowry N.J., Rosebrough A.L., Farr & R.J. Randall. (1951). J. Biol. Chem.
193, 265-275.
4.