S7T/7TEL Métodos de laboratorio clinico para deteccién de inmunidad celular ¢ 311 ———— ANALISIS DE MONOCITOS Y MACROFAGOS —— La identificacién morfolégica de monocitos norma- les de sangre periférica en frotes tefiidos es muy sencilla. Los monocitos son mas grandes que los granulocitos y la mayor parte de los linfocitos. Tienen niicleo redondo o en forma de rifién, con granulos finos ligeramente teftidos. Sin embargo, en Suspensién o incluso en especimenes tisulares 0 de sangre, se pueden requerir marcadores adicionales para diferenciar monocitos de linfocitos y de células mieloides primitivas (capitulos 1 y 2). Una tincién confiable para los monocitos es la llamada estearasa no especifica, oestearasaalfa-naf- tol, presente en los monocitos, pero ausente en la mayor parte de las células mieloides 0 linfociticas. Estan disponibles anticuerpos monoclonales dirigi dos contra antigenos especificos de diferenciacién como el CD14. En el capitulo 2 se describen en detalle las caracteristicas funcionales de los monocitos. Una prueba conveniente para la identificacién funcional de los monocitos en el laboratorio clinico es la fagocitosis de particulas omicroorganismos muertos por calor y recubiertos por anticuerpo. Ne FUNCION DE LOS NEUTROFILOS ————— Los neutréfilos polimorfonucleares (PMN, del in- glés polymorphonuclear neutrophils)son leucocitos derivados de médula ésea con una vida media finita, que tienen una funcién central en la defensa del individuo contra la infeccién, Para varios tipos de infecciones, el neutrfilo desempefia una funcién principal como célula efectora o asesina, Sin em- bargo, en el flujo sanguine y en los espacios extravasculares, los neutréfilos ejercen sus efectos antimicrobianos através deunainteracciéncompleja con anticuerpo, complemento y factores quimiotac- ticos, De esta manera, al evaluar la funcién de los neutréfilos, no se puede ver a la célula como una entidad independiente; se debe tomar en cuenta su dependencia esencial en otros procesos inmunitarios celulares y humorales. Los defectos en la funcién de los neutréfilos se pueden clasificar como cuantitativos 0 cualitativos. En los trastornos cuantitativos, el numero total de neutrofilos de funcién normal esta disminuido por debajo del valor critico, lo cual permite que se presente la infeccion. La neutropenia idiopatica y la originada por farmacos (capitulo 35). con cuenta absoluta de granulocitos circulates menor de 1000/uL, son ejemplos de este tipo de defecto. En estas situaciones los granulocitos tienen funcién normal, pero estan presentes en niimeros insuficien- tes para mantener una defensa adecuada contra la infeccién. En los trastornos neutrofilicos cualitati- vos, el ntimero total de PMN circulantes es normal ‘©, en ocasiones, aumentado, pero las células no pueden ejercersus funciones microbicidasnormales. Laenfermedad granulomatosa crdnica es un ejemplo de este tipo de trastorno (capitulo 24). En pacientes con enfermedad granulomatosa crénica, las cifras nor- males 0 incrementadas de neutréfilos circulantes impiden destruir ciertos tipos de microorganismos intracelulares. La fagocitosis por PMN se puede dividir en cinco etapas temporales secuenciales: 1) movilidad, 2) reconocimiento y adhesién, 3) ingestion, 4) des- granulacién y 5) muerte intracelular (figura 15-1 1). La actividad microbicida del neutrofilo es la suma de la actividad de estas cinco fases. Los sindromes clinicos originados por defectos en mu- chas de las diversas etapas de Ia fagocitosis, se © 9 <——1- Movilidad; ee uimiotaxia |< 2. Reconocimiento, adherencia, copsonizacién 3. Ingestion, pinocitos's 4 Formacién del fagosoma 5, Desgranulacion de peroxidasa @ hidrolasa 6. Muerte bacteriana Figura 15-11. Etapas en el progreso de la fagocitosis. Re- presentacién esquematica de fagocitosis por un granulocto 4: Las bacterias atraen células fagociticas por estimulo qui- riotactico. 2: La presencia de opsoninas (inmunoglobulina y complemento) facia el reconocimiento y la union ala super- ficie. 3: Invaginacién de la membrana celular con la bacteria ‘opsonizada incluida, 4: Se forma el organelo intracelular, el fagosoma. §: Los grénulos se funden con los fagosomas y liberan enzimashaciaelfagolisosoma 6:Sepresentanmuerte y digestion bacteriana, (Modificada con autorizacion de Baehner: Chronicgranulomatous disease In: The Phagocytic Gall in Host Resistance. Bellanti JA, Dayton DH [editors} Raven Press, 1975, p. 175.)312 ¢ Inmunologia basica y clinica explicanenel capitulo 24. Las pruebas de laboratorio utilizadas en la practica clinica para evaluar la fun- }on fagocitica en seres humanos con varias enfer- medades. se analizan en términos de los cinco pasos principales de este proceso. Se debe acentuar que Ro existe andlisis estandar para muchas funciones del neutréfilo: por tanto, la variedad de la eleccion de las pruebas depende del laboratorio. Las siguien- tes secciones incluyen ejemplos de pruebas clinicas atiles para la funcidn del neutréfilo PRUEBAS DE MOVILIDAD Los neutrofilos estan en movilidad constante. Este movimiento puede ser al azar o dirigido. La mo- vilizacion al azar o pasiva es el resultado del movimiento browniano. En el movimiento uimiotactico las células son atraidas de manera activa por algun estimulo quimiotictico. Las qui- miotaxinas se producen por activacion del comple- mento(C3a,C5a, C567; capitulo | 1), por fibrindlisis (fibrinopéptido B) y por los microorganismos (en- dotoxinas) y otros leucocitos (factor quimiotactico de linfocitos). Los productos de la lipooxigenacién del acido araquidénico, en particular el leucotrieno B. (LTB.), también son quimioticticos. Se han di- seftado andlisis relativamente simples para evaluar elmovimiento de los leucocitos in vitro. Una técnica in vivo, la ventana cuténea de Rebuck, precedié al desarrollo de los analisis in vitro y fue uno de los primeros métodos desarrollados para evaluar la fun cién de los leucocitos. Prueba para movilidad al azar La movilidad al azar se prueba por e! método de tubo capilar. Se colocan neutréfilos purificados a concentracion de 5 x 10°/mL en una solucién de albumina humana a 0.1%, en un capilar siliconizado para microhematocrito. El capilar se encierra en una camara construida ex profeso en el portaobjetos y se incluye en silicén adhesivo. Después de llenarse con aceite de inmersion, toda la camara se coloca en la platina del microscopio. La movilidad seevalia al observar el borde de la columna de leucocitos en ¢l microscopio, a intervalos de una hora. Las medi- Ciones se expresan en milimetros de desplazamiento, desde la frontera de inicio de la capa de leucocitos empaquetados, Prueba para quimiotaxia La locomocién direccional de los neutréfilos hacia diversos estimulos quimiotacticos se cuantifica me- diante el uso de la cdmara de Boyden. Las células (Capituto, Por analizar se colocan en la cémara superior y Separan de la cémara inferior que contiene la tancia quimiotictica mediante una membrang filtro de poro pequefo, Los neutrOfilos pueden ate vesar el filtro, pero se atrapan en el transito hacig membrana. Después de un period adecuado da incubacién, se elimina el filtro y la parte inferior gg examina al microscopio para observar la presenci de los neutrofilos. Aunque este método es en teoria simple, hay muchas dificultades teoricas. Estas son: falta de disponibilidad de filtros de tamafo estandarizadg del poro, predisposicion del observador a cuantificar los neutrofilosquemigranenelmicroscopio, pérdida de células que fallan en atravesar o atraviesan total. mente el filtro, y falla de muchos investigadores para estandarizar el nimero de células y los com. plementos de suero, Hace poco se desarrollé un método adicional Para medir la quimiotaxia y movilidad al azar. Esta técnica implica la migracién radial de leucocitos de Pequeiios pozos cortados en un medio de agarosa en una caja de Petri. En muchos aspectos, el método es similar a la difusién radial simple (capitulo 14). En general, se cortan tres pozos en la agarosa. La po- blacién celular en cuestion se coloca en el pozo central. Se pone un quimiotactico en uno de los otros Pozos y en el pozo restante se coloca una sustancia no quimiotactica, Después de varias horas de migra- cién, se mide la distancia desde el centro del pozo que contiene células a los bordes de las células migrantes. De esta manera, se pueden cuantificar tanto lamovilidad dirigidacomoal azar. Este método ha obtenido una amplia aplicacién y en muchos laboratorios ha desplazado a la prueba un poco mas compleja de la camara de Boyden PRUEBAS PARA RECONOCIMIENTO Y ADHERENCIA Cuando el neutrofilo en un individuo inmune se aproxima al blanco por movilidad al azar o dirigida Feconoce microorganismos debido a la presencia de anticuerpo y complemento fijado a la superficie de ellos. En estas circunstancias se presenta un incremento de la fagocitosis (opsonizacién). La ad- herencia y agregacién de los neutr6filos se promue- ven por varias glucoproteinas de membrana. La familia de glucoproteinas de membrana que funcionan como moléculas de adherencias es LFA-1 (antigeno relacionado con la funcién de linfocitos tipo |), Mac-1 (macrofago 1) y p 150,95. Todas estas moléculastienenen comin lasubunidad beta(CD18) yuna subunidad unica alfa. El Mac-! funciona como receptor para C3bi. Se han descrito deficiencias dei Métodos de laboratorio clinico para deteccién de inmunidad celular © 313 Ja subunidad beta (capitulo 23). Estan disponibles jos anticuerpos monoclonales contra CD18 (subu- zidad beta), asi como aquellos especificos contra las subunidades alfa: CD] la=LFA-1,CD11b=Mac-1, y CDI le=p 150,95. Estas moléculasestan presentes: “én granulocitos, monocitos y algunos linfocitos, y se pueden medir con facilidad por medio de citome- -tria de flujo e inmunofluorescencia. Pocas veces son utiles en los analisis clinicos las pruebas para detectar la presencia de comple> _ mento y receptores para Fe del anticuerpo en los " peutréfilos, La necesidad de anticuerpos 0 comple- trento (opsoninas) que recubran a los microorganis~ mos para ta fagocitosis, se puede determinar mediante el uso de sueros libres de cualquiera de tstos factores, seguido por un andlisis de la ingestion y muerte intracelular subsecuente, Mas an, se pue- Xen detectar facilmente los receptores para IgG y complemento en los neutréfilos y en los fagocitos trononucleares, mediante la formacion de rosetas Gon eritrocitos recubiertos de IgG 0 complemento, © bien por inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales. fa 4 mw PRUEBAS PARA INGESTION La ingestién de microorganismos por neutr6filos es tun proceso que requiere produccion de energia por parte de la célula fagocitica. La internacién de mi- eroorganismos recubiertos de anticuerpo y comple~ mento se presenta con rapidez después del contacto ‘con neutrofilos. Ya que los procesos intracelulares Subsecuentes (por ejemplo, desgranulacién y asesi- ato) dependen del éxito de la ingestion, las pruebas para ingestion proporcionan un método ripido y rolativamente simple para evaluar el proceso fago- titico en general. Por desgracia, el término fagoci- tosis a menudo se ha utilizado s6lo para referirse a la fase de ingestion del proceso. Asi, un término como indice fagocitico, que se refiere al nimero promedio de particulas ingeridas, en realidad se debe Considerar la medida de la ingestion mas que de la fagocitosis. ‘Todas las pruebas para medir la propiedad de los neutréfilos de ingerir particulas nativas u opso- nizadas, emplean dos criterios generales. Se hace un calculodirectodelacaptaciondeparticulasmediante el andlisis de las células, 0 bien de la eliminacién de particulas del liquido 0 del medio como eélculo indirecto de la captacién celular. Los métodos para cuantificar la ingestion de particulas mediante andlisis celulares son: 1) cuenta Girecta al microscopio de luz; 2) estimacion de Ja radiactividad enlazada a las células después de la ingestion de una particula radiaetiva; 3) medicién de un lipido que se tine facilmente como el aceite ojo O después de su extraccion de las eélulas, y 44) analisis mediante citometria de flujo de la capta- cin de particulas mareadas con medios fluorescentes. Una desventaja de muchos de estos andlisis es que las particulas adherentes a la membrana del Reutréfilo se incluyen como particulas ingeridas Otros elementos que influyen en los resultados para Hevar a cabo los andlisis de ingestion son: la pre- sencia de factores humorales (opsoninas) que incre- mentan la ingesta, la presencia de sueros que ‘Contienen reactantes de fase aguda que disminuyen ja captacion, la necesidad de agitacion constante © desprendimiento de las células y particulas para mmaximizar el contacto y la toma subsecuente, el tipo O tamafo de la particula por probar y, finalmente Taproporcién entre las particulas y las celulas fa citicas, En laactualidadnoesté disponible unanalisis adecuadamente estandarizado para estimar la inges- tidn de particulas. PRUEBAS PARA DESGRANULACION Después de la ingestién de particulas o microorga- nismos, el elemento ingerido se enlaza por la super- ficie invaginada de la membrana celular a un organelo llamado fagosoma, Poco después. se fun den los lisosomas con el fagosoma para formar una estructura llamada fagolisosoma. Ladesgranulacion esel procesode fusién de los lisosomas y fagosomas. Con la descarga subsecuente del contenido intrali- ‘sosémico hacia el fagolisosoma. La desgranulacion es un proceso activo y re quiere gasto de energia porla célula. Deesta manera, Oi deterioro de las vias metabolicas normales del neutrofilo —en especial, consumo de oxigeno y metabolismo de glucosa a través de la via derivada del monofosfato de hexosa— interfiere con la des- granulacidn y asesinato intracelular subsecuente Se ha desarrollado una prueba para la desgra- nulacion, denominada fagocitosis frustrada y se ha aplicado en el estudio de algunos sindromes de disfuncién de neutrofilos. El sistema de fagocitosis frustrada (figura 15-12) permite el examen de la desgranulacion de modo independiente de la inges~ tién, Se fijan gamma-globulina agregada por calor fo complejos inmunitarios a la superficie plastica de tuna caja de Petri, de manera quenose puedan ingerir. Se colocan los neutrofilos en suspensién en Ia caja de Petri, con o sin aglomerados de globulina-gamma ‘adheridos, Las membranas celulares de los neutro- filos se estimulan por el contacto entre la gamma- globulinay los receptores celulares apropiados. Este proceso origina fusién de grénulos intraleucocitarios (lisosomas) con la membrana celular. Como resul-314 © Inmunologia bdsica y clinica Enzimas lisosomicas an SAC {| t Caja de Petri IgG agregada Figura 15=12. Analisis de la desgranulacién de los granulo- cites por el metodo de “fagocitosis frustrada”. Elneutrofilo se tne a la IgG agregada fia en el fondo de la caja de Pein Las enzimas lisosomicas se descargan enelsobrenadante cuando fa célula intenta fagocitar a IgG. pero se “frustra® (Conesia de S. Barrett) tado de esto, el contenido intralisosémico se des- carga hacia el medio, Eljindice de liberacién de enzimas lisosomales, en particular beta glucoroni- dasa y fosfatasa acida. se toma como un estimado del indice de desgranulacion. Se puede calcular la muerte celular no especifica o citdlisis al medir la descarga de deshidrogenasa lactica (enzima no granular) en el medio. Este tipo de analisis se ha utilizado para demostrar el retardo.en laivelocidad de desgranulacién de neutrésilos de pacientes con enfermedad granulomatosa crénica PRUEBAS DE MUERTE INTRACELULAR La funcidn primaria del neutréfilo en la resistencia del individuo, es la muerte intracelular de los mi- croorganismos. Esta etapa final de la fagocitosis' depende de completar exitosamente las etapas pre- cedentes: movilidad, reconocimiento, ingestion y desgranulacién. E| armamento antimicrobiano del neutrofilo esté compuesto por varios sistemas intra Jeucocitarios (cuadro 15-10). Obviamente, unde fecto en elasesinato intracelular podria ser resultado de algunao una combinacion de estas funciones. Sin embargo, én la practica clinica, dos analisis han recibido un uso mas extenso: la prueba de reduccion del azul de tetrazolio nitradoy la prueba deasesinato intraleucocitario. Se espera que en el futuro se dis ponga de analisis especificos metabolicos y antimi- crobianos para otros procesos intraleucocitarios. Prueba de reduccion del azul de tetrazolio nitrado El azul de tetrazolio nitrado (NBT, del inglés niiro- blue tetrazolium) es un compuesto claro, amarillo y soluble en agua, que al reducirse forma el formazan, (Capitulo Cuadro 15-10. Sistemas antimicrobiat de los neutrofilos* pH acido del fagolisosoma Lisozima Lactoferrina Defensina Catepsina G Sistema de mieloperoxidasa-halogenacion Peréxide de hidrogeno Radical superoxide Radical hidroxilo ‘Oxigeno molecular Para una desoripcion mas amplia de estos sistemas, vease: Ri, et al. Neutrophils in host defense. Ann intern Med 1286; 127, y Boxer LA, Morganroth ML, Neutrophil function di Disease-a-Month 1987:33:681 tincién de color azul oscuro.Los neutréfilos pueden reducir el colorante después de la ingestién de latex w otras particulas. subsecuente a la descarga metabolica abrupta generada por la via derivada de! monofosfato de hexosa. El colorante reducido se puede medir con facilidadspor_medio de fotometria despti cxtracciéndelosneutrofilosconelsolventeorganico piridina. De esta manera, Ya reduccion del NBTaun ‘color azul, forma la base para la prueba cuantitativa de! azul de tetrazolio nitrado. Se desconoce el meca- nismo preciso de la reduccion del NBT, pero el fenomeno esta estrechamente unido a los procesos de la explosidn respiratoria que sigue a la ingestién, v que incluyen el aumento de la actividad de la via derivada del monofosfato de hexosa, incrementodel Tonsumo de oxigeno y aumento de Ta formacion de perdxido de hidrogeno y radical superéxido. Ya que la generacion de la actividad reductora en neutrOfilos intactos es paralela a las actividades que siguen ala ingestion, la reduccion del NBT es un medio util para analizar la integridad metabolica general de los neu- “trofilos fagocitantes. Ta falla en Ta reduccion del colorante NBT es una anormalidad consistente con, y de importancia diagnéstica para, la enfermedad granulomatosa crénica. Los neutréfilos de estos pacientes no pueden dar muerte a ciertos microor- ganismos intracelulares ni generar H:020 el radical superdxido. Prueba cuantitativa del NBT Se incuban los neutréfilos aislados en una solucion salina balanceada, con particulas de latex y azul de tetrazolio nitrado. Después de 15 minutos de incu- bacion a 37 °C, se extrae el colorante reducido (formazan azul) con piridina y se mide en el espec trofotometro @ 515 nm. El cambio en absorbencia entre cultivos de células que fagocitan activamente particulas de latex, y aquellos que no lo hacen, se toma como indice de la funcién de los neutrofilos La prueba es impresionantemente anormal en la Do nindA‘enfermedad granulomatosa crénica (capitulo 24).Se ‘han desarrollado diferentes modificaciones de la ieba cuantitativa del NBT como pruebas de de- teccidn paraenfermedad granulomatosacronica. Las Lobresalientes entre éstas son las Ilamadas pruebas del portaobjetos, en las cuales se colocanneutréfilos, itex y NBT en una gota'en un portaobjetos y se liza la reduccién a formazan azul, en el micros- jo. Se puede llevar a cabo en una sola gota de ‘sangre, pero se deben confirmar los datos anormales nel método cuantitativo mas preciso descrito cencia Los neutréfilos emiten pequefias cantidades de ra- diacién electromagnética después de la ingestion de tmicroorganismos. Esta energia se puede detectar como luz mediante tubos sensibles fotomultiplica~ dores, como aquellos en los contadores de centelleo en liquido. Durante la explosion respiratoria, se generan H,0:, radicales superoxido y oxigeno mo- lecular. El oxigeno molecular, elemento muy ines- table y reactivo, se combina con bacterias u otros elementos intralisosémicos para formar grupos car- boxilo de inestabilidad electronica. Cuando estos grupos regresan a.un estado basal, se emite energia luminica. El proceso entonces se ha denominado quimioluminiscencia y forma la base de un analisis importante de la funcién de los neutréfilos. De manera parecida al NBT, se requiere que estén intactos todos los pasos previos, para la muerte bacteriana. Los estudios recientes muestran una co- rrelacién precisa entre las emisiones de luz y la actividad micromibicida. Los pasos oxidativos en los patrones bioquimicos presentes en el neutréfilo, generan quimioluminiscencia, que se detecta con facilidaden unespectrometrodecentelleoenliquido, con exclusién del circuito de coincidencia. En la prueba, los neutréfilos se incuban en solucién salina incolora, en presencia de una parti- cula digerible (por ejemplo, latex 0 zimosén), en un frasco de centelleo. Se puede afiadir luminol, com- puesto intermediario fluorescente, para intensificar Jas emisiones de luz, La emisién de fotones se mide ‘como cpm en el contador de centelleo durante los siguientes 10 minutos, a intervalos de dos minutos. Los estudios con esta técnica han revelado una disminucién notable de la quimioluminiscencia en la enfermedad granulomatosa crénica (pacientes y portadores) y en individuos deficientes en mielope- roxidasa, Este método parece ser un poco mas sen- sible que el andlisis cuantitativo de NBT, y quiz se pueda Ilevar a cabo con cantidades muy pequefias de células, Los procedimientos més nuevos emplean el método de sangre total que lo simplifica mucho Métodos de laboratorio clinico para deteccién de inmunidad celular « 315 al obviar los pasos de separacién de granulocitos. Muchos laboratorios lo utilizan para sustituir a la reduccién de NBT como prueba de busqueda para la disfuncién de neutréfilos y para la deteccion de portadores de enfermedad granulomatosa crénica Citometria de flujo Laexplosién oxidativadel neutréfilo que se presenta después de la ingestién, produce perdxido de hidr6, geno que oxida varios componentes intracelulares. Si durante la incubacién de neutrofilos hay diace- tato de 2',7'-diclorofluoresceina, un colorante no polar pequefio, éste se escinde por esterasas y queda atrapado en el interior de la célula. Otro colorante, la dihidrorrodamina (DHR) también puede usarse para este andlisis y se comporta de manera similar (figura 15-13). El peréxido de hidrogeno oxida el compuesto a diclorofluoresceina fluorescente/ que puede detectarse con facilidad mediante citome- tria de flujo en una poblacién intermitente de\neu- tréfilos. Esta técnica permite la deteccion rapida, sensi- ble y relativamente reproducible de pacientes con enfermedad granulomatosa cronica, y en general facilita la discriminacién entre portadores y sujetos normales. Ha reemplazado en gran medida las pruebas cuantitativas de NBT en muchos laborato- rios. FL1-DHR A B FLI-DHR Figura 15-13, Muestra de la citometria de fujo tridimensional de fluorescencia de dihidrorrodamina (CHR) en un paciente con enfermedad granulomatosa crénica y su madre, una portadora. A: Intensidad fuorescente de la DHR (eje horizon- tal) de los neutréfilos de la madre. Ei pico que se presenta a frente muestra el histograma de células no estimuladas. Después de la estimulacién con acetato piridlmercirico (PMA), se muestran dos picos (fondo de la seccién A). La poblacion de la izquierda son neutréfios que no redujeron la DHR y, por tanto, no muestran aumento en a fluorescencia. Epico de la derecha demuestra un incremento en la fuores- ccencia de los PMN que redujeron la DHR. En la seccion B puede verse que los PMN del paciente no reducen la HR , por tanto, no hay diferencia en la intensidad de la fluores- Cencia entre las células no estimuladas con PMA (pico al frente) y las no estimuladas (fico en el fondo).316 © Inmunologia basicay clinica (Capitulo 15) ~. Paciente con EGC 3 Portador heterocigoto de EGC Mimero de estafilococos viables 3 Horas Figura 15-14. Andlisis de la propiedad bactericida de los granulocitos. Las curvas representan el numero de microor- ganismos intracelulares viables que sobreviven después de ser ingeridos por los granulocitos. Notese la deciinacion pronunciada en la sobrevivencia bacteriana en oélulas nor males, en comparaci6n con elasesinato disminuidooausente enlas células de pacientes y familiares con EGC (enfermedad granulomatosa cronica) Analisis microbicida de neutréfilos Muchas cepas de bacterias y hongos se engloban y asesinan eficazmente por los neutréfilos humanos invitro, Asumiendo que todas las etapas de! proceso fagocitico que preceden al asesinato dentro del fa- golisosoma estan intactas, los andlisis microbicidas constituyen pruebas de importancia extrema para la funcién del neutrofilo. Como ejemplo de esto se describe con algiin detalle la propiedad bactericida de los neutréfilos para la cepa comin de prucba 502A de Staphylococcus aureus Las bacterias se cultivan toda la noche en medio nutritivo para asegurarse de que estén en la fase de crecimiento logaritmico. Entonces, se diluyen para obtener alrededor de cinco bacterias por neutr6filo en la prueba final. Se separan los neutréfilos de la Cuadro 15-11. Trastornos de la funcién » de neutrofilos Deficiencia de la adherencia de leucocitos Enfermedad granulomatosa cronica (unida 2 X 0 autos. mica recesiva) Sindrome de Job Sindrome de Chédiak-Higashi si Deficiencia de mieloperoxidasa Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 105 prematuros Disfuncion transiioria del neutrétlo Infeociones agudas Ataxia-telangiectasia Crioglobulinemia sangre total heparinizada por medio de sedimenta- cidn en dextran y lisis de eritrocitos con NH.CI al 0.84 por ciento. La opsonina se provee diluida 1:1 de suero congelado (~70°C) y suero de sangre recién coagulada. Se incuban bacterias, neutrofilos y op- soninas en tubos de ensayo bien cerrados que se mantienen en balanceo, a 37 °C. Se analiza una alicuota de la mezcla al tiempo cero. Después de 30 minutos de incubacién, se afaden antibidticos para matar las bacterias extracelulares. Se analizan a los, 30, 60 y 120 minutos, alicuotas de neutréfilos con los organismos ingeridos. Los microorganismos in- tracelulares se liberan por lisis de neutréfilos, me- diante agua destilada, y se estima el resultados graficados segin se aprecia en la 15-14, demuestran que los neutrofilos normales originan una reduccion de casi 2 log en S. aureus intracelular, viable después de una hora de incuba- cién. La muerte esta virtualmente ausente en células con enfermedad granulomatosa crénica y es inter- media en los portadores heterocigoticos. Al variar el organismo de prueba o la fuente de la opsonina, se puede utilizar eficazmente este ana- lisis para medir una amplia variedad de actividades microbianas y defectos séricosrelacionados. Resulta ‘obvio que el asesinato falsamente “normal”, es la interpretacién de los resultados si las células no pueden ingerir organismo de manera normal. Por tanto, debe practicarse una valoracién de ingestion microbiana antes de realizar la prueba microbicida de neutréfilos. En el cuadro 15-11 se incluyen algunas enfer- medades con actividad microbicida defectuosa que pueden demostrarse con esta prueba. Para detalles adicionales, véase capitulo 24. llMétodos de laboratorio clinico para deteccin de inmunidad celular ¢ 317 aaa ee REFERENCIAS GENERALES Hudson L, Hay FC: Practical Immunology, 314 ed Blackwell, 1989. Mishell BB, Shiigi SM: Selected Methods in Cellular Immunology. Freeman, 1980. Rose NRet al. (editors): Manual of Clinical Laboratory Immunology, 4th ed. 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