Aislamiento

de hemoglobina en la sangre y analisis de sus derivados

Universidad del Valle de Guatemala. Joshua Ordoez. 11330
Resumen
El objetivo principal de la practica observar los diversos derivados de la hemoglobina,
los reactivos que se utilizaron para la elaboracion de este analisis fue el reactivo de
Stoke, ferricianuro de potasio, y acido ascrobico. Por medio de estos analisis se pudo
determinar los derivados de la hemoglobina, como metahomoglobina, oxihemoglobina
y deoxihemoglobina. En la oxihemoglobina se obtuvo una absorbancia maxima en 540 y
570nm, en la metahemoglobina de igual manera se obtuvo una absorbancia maxima en
540 y 570nm, en la deoxihemoglbina hubo una absorbancia maxima en 500nm.
Objetivos

Efectuar el aislamiento de la
hemoglobina a partir de sangre
humana.
Realizar experimentalmente la
transformacion
de
la
hemoglobina
a
diferentes
derivados de la misma.

Introduccion
La hemoglobina (HB) es una protena
globular,
que esta presente
en altas concentraciones en lo glbulos
rojos y se encarga del transporte de O2
del aparato respiratorio hacia los tejidos
perifricos; y del transporte de CO2 y
protones (H+) de los tejidos perifricos
hasta los pulmones para ser excretados.
Los valores normales en sangre son de
13 18 g/ dl en el hombre y 12 16 g/
dl en la mujer.. La hemoglobina es una
protena con estructura cuaternaria, es
decir, esta constituida por cuatro
cadenas polipeptdicas (fig. 1): dos y
dos (hemoglobina adulta- HbA); dos
y dos (forma minoritaria de
hemoglobina adulta- HbA2- normal
2%); dos y dos (hemoglobina fetal-
HbF). En el feto humano, en un
principio, no se sintetizan cadenas alfa
ni beta, sino zeta ( ) y epsilon () (Hb
Gower I). Al final del primer trimestre la

subunidades han reemplazado a las

subunidades (Hb Gower II) y las
subunidades a los pptidos . Por esto,
la HbF tiene la composicin 22. Las
subunidades comienzan su sntesis en
el tercer trimestre y no reemplazan a
en su totalidad hasta algunas semanas
despus del nacimiento. Las cadenas
polipeptdicas alfa contienen 141
aminocidos, las no alfa 146 (, , ) y
difieren en la secuencia de aminocidos.
Se conoce desde hace dcadas la
estructura primaria de las cuatro
cadenas de Hb normales. La estructura
secundaria es muy similar: cada una

exhibe 8
segmentos

helicoidales designados con las
letras A a la H. Entre ellos se encuentran
7 segmentos no helicoidales. Cada
cadena esta en contacto con las
cadenas , sin embargo, existen pocas
interacciones entre las dos cadenas o
entre las dos cadenas entre si. (Miale,
1985)

Metodologia
Lo primero que se hizo fue la
centrifugacion de 50ml de hemoglobina,
ya centrifugado se decantaron y se
lavaron los eritrocitos con cloruro de
sodio. Se agrego 1.2 ml de agua y 0.4 de
touleno, se mezclo y se descarto la capa

de touleno, obteniendo asi el concetrado

de oxihemoglobina. Ya teniendo la
oxihemoglobina se prepraro una
solucion con 0.5ml de solucion con 20ml
de agua destilada. Para la preparacion
de la deoxihemoglobina se preparo a la
cual se leagrego 4ml de solucion diluida
con el reacgivo de stoke amoniacal a la
solucion. Para la preparacion de
metahemoglobina se le adiciono
ferricianuro de potasio al 10% a 4ml de
la solucion. se analizo cada una de las
soluciones preparadas en un espectro a
una absorbancia de 0.5M a 500nm.

Grafica No. 2 Espectro de absorbacina

de la deoxihemoglobina

Esta grafica muestra la absorbancia de

la deoxihemoglobina, en la que se puede
observar que hubo una absrobancia
maxima en 540 y 570nm.

Resultados
Tabla No. 1 Longitud de onda y
absorbancia de Oxihemoglobina

Grafica No. 1 Espectro de absorbacina
de oxihemoglobina.

Grafica No. 3 Espectro de absorbacina
de metahemoglobina.

Esta grafica muestra la absorbancia de
la oxihemoglobina, en la que se puede
observar que hubo una absrobancia
maxima en 540 y 570nm.

Esta grafica muestra la absorbancia de
la metahemoglobina, en la que se puede
observar que hubo una absrobancia
maxima en 540 y 570nm.

Discusion
Teniendo como objetivo el analisis de
los derivados de la hemoglobina en sus
diferentes estados, lo primero que se
hizo fue llevar la hemoglobina a

oxihemoglobina, la oxihemoglobina es
cuando la hemoglobina se encuentra
unida al oxigeno, lo que ocurre es que se
hace cambio del grupo R en la molecula,
lo cual esta empieza un proceso de
oxidacion, lo cual provoca un cambio de
color, al momento que ocurre este
cambio de la estructura molecular, de
igual manera cambia la absorbancia de
la molecula, de acuerdo a la grafica No. 1
se puede obserar que su absrobancia
maxima se encuentra en 540 y 570nm.
Esta molecula de igual manera se llevo a
su estado de metahemoglobina, en la
que la molecula de hemoglobina se
encuentra con un grupo hemo con
hierro es estado ferrico. En este estado
la hemoglobina tiene un gran afinidad
hacia el oxigeno. Este se realizo por
medio del reactivo de Stoke, el cual
permite insertar el grupo Hemo en la
molecula, cuando ocurre este proceso la
molecula empieza un proceso de
oxidacion, lo cual provoca un cambio de
color caf de la molecula.
La hemoglobina se transformo en
nitrosihemoglobina, lo que ocurre al
momento de agregr NOHb es que ocurre
una sustitucion, se elimina eloxigeno y
se sustituye por un grupo amino, lo cual
provoca un leve cambio de color
marron, ya que en presencia de oxigeno
del grupo hemo es rapidamente

oxidado,
dando
lugar
a
la
metahemoglobina, nitrato y nitrito
residuales. El grupo Hb se encuetra
ligado al CO2 el Co2 y No producido,
cuando la molecula se encuentra en su
estado oidativo ferrico o ferroso.
De igual manera se llevo a la
hemoglobina con ausencia de oxigeno,
esta transicion provoca que la molecula
de hemoglobina estando en su estado R,
cuando se desoxigena esta pasa a su
forma T. Permitiendo que la molecula
tenga una mayor afinidad hacia el CO2.
La absorbancia maxima fue a 500nm,
esto se debe a que el proceso de la
reaccion de es mucho mas retardado, ya
que se pudo observar que conforme
pasaba el tiempo la molecula cada vez
se iba poniendo mas obscura.
Los principales factores que pudieron
intervenir en nuestros resultados, pudo
ser una mala aforacion de la cristaleria
al momento que se realizaron las
soluciones, como tambien diversos
contaminantes que se encontraban en la
cristaleria. para esta practica se debe de
manejar con mucha precacucion el
reactivo de Stoke, ya que su alta
sensibilidad puede afectar las lecturas
de absorbancia de las soluciones.

Conclusiones
Por medio de esta practica fue posible realizar el analisis correspondiente de la
hemoglobina, en la que se pudo observar los distintos comportamiento que esta puede
tomar, en base a los resusltados se pudo obtner oxihemoglobina y metahemoglobina, ya
que se absorbancia se encuentra cercana a la teorica. Mientras que no se pudo obtener
deoxihemoglobina, ya que se encuentra muy lejano al real, esto pudo ser ya por el
entorno que se encontraba la solucion, ya que este tienen una mayor afinidad hacia el
CO2.

Literatura citada
1. Miale, J. 1985. Hematologa: medicina de laboratorio. Ed. Revert Barcelona.
1168pp.

2. Koolman, J. 2005. Bioqumica. Ed. Mdica Panamericana. Madrid, Espaa. 488pp

Anexos
Tabla No. 2 tabla de resultados longitud de onda y absorbancia

Oxi hb
Meta hb
Deoxi hb
450
0.793
1.067
0.723
460
0.677
0.766
0.608
470
0.582
0.601
0.542
480
0.511
0.517
0.506
490
0.467
0.481
0.492
500
0.443
0.459
0.494
510
0.435
0.442
0.499
520
0.401
0.483
0.485
530
0.663
0.685
0.462
540
0.780
0.882
0.443
550
0.664
0.761
0.396
560
0.592
0.541
0.349
570
0.710
0.684
0.287
580
0.697
0.824
0.243
590
0.347
0.270
0.225
600
0.167
0.123
0.206
610
0.139
0.079
0.198
620
0.130
0.069
0.197
630
0.127
0.071
0.209