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Valoracion de La Hemoglobina - Rosarioalorscorrederas
Valoracion de La Hemoglobina - Rosarioalorscorrederas
DETERMINACION DE LA HEMOGLOBINA EN EL
LABORATORIO
AUTORIA
ROSARIO ALORS CORREDERAS
TEMTICA
HEMATOLOGA
ETAPA
FORMACION PROFESIONAL
Resumen
Esta prctica que est encuadrada dentro del ciclo formativo de grado superior: Laboratorio de
Diagnostico Clnico, se hace necesaria para que el alumno alcance las capacidades terminales de
dicho ciclo y en definitiva obtenga el titulo. Antes de entrar en la determinacin propiamente dicha,
veremos algunos conceptos para que el alumno se familiarice con ellos.
Palabras clave
Hemoglobina, eritrocitos, espectofotmetro,
HEMOGLOBINA:
La hemoglobina es una protena conjugada que sirve para el transporte de O2 y CO2. Cuando est
totalmente saturada, cada gramo contiene alrededor de 1'4ml de O2.
La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr de hemoglobina capaces de transportar
800ml de O2.
Una molcula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipeptdicas (unin de aminocidos)
(globina) y 4 grupos prosticos HEM que contienen cada uno un tomo de Fe en estado ferroso. Las
cadenas peptdicas que son iguales 2 a 2 adoptan una posicin helicoidal; lo que da a la molcula de
hemoglobina una estructura esteroide. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una
de las cadenas de polipptidos. Localizado cerca de la superficie de la molcula, el HEM se combina de
forma reversible con una molcula de O2 de CO2. Este grupo HEM es el responsable del color rojo de la
hemoglobina.
La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptdicas que se denominan con las letras , , y .
Existe una cadena ms, la que est presente durante los primeros 3 meses de vida.
Se diferencian unas de otras en el nmero o posicin (de los aminocidos de los que estn
compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hemoglobinas. En el ser humano se pueden encontrar
las siguientes hemoglobinas normales:
HEMOGLOBINA A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas . En un adulto normal corresponde a ms del
95% del total.
HEMOGLOBINA A2: consta de 2 cadenas y 2 cadenas . En un adulto sano est en proporcin menor
al 3%.
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ISSN 1988-6047
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Las 2 hemoglobinas son la Hb y HbO2 se convierten fcilmente en una serie de compuestos por la
accin de cidos lcalis, sustancias reductoras u oxidantes, el calor u otros agentes.
Hi (Hemiglobina metahemoglobina): es un derivado de la hemoglobina en la que el hierro en est en
estado ferroso se convierte en estado frrico y es incapaz de combinarse de manera reversible con el
O2. Sin embargo hasta el 1'5% de la hemoglobina de una persona normal es Hi. Sin embargo los
aumentos de Hi causarn cianosis y anemia funcional s son bastante elevados y simplemente cianosis
en concentraciones bajas. En general siempre se forman pequeas cantidades de Hi pero son
producidas dentro del eritrocito. El ms importante es el sistema metahemoglobin-reductasa
dependiendo de NADH (es lo mismo que NADH-citocromob5reductasa). Otros sistemas que funcionan,
sobre todo con sistemas de reserva son el cido ascrbico; glutacin reduccin, NADHmetahemoglobn-reductasa. Esta ltima requiere un cofactor natural o un colorante autoxidante como el
azul de metileno para ser activa.
La metahemoglobilemia es un aumento de la hemoglobina en los eritrocitos es el resultado de un
aumento en la produccin de Hi o bien de una disminucin de la actividad de la NADH citocromo-b5
reductasa y puede ser hereditaria o adquirida.
1- Forma Hereditaria: se divide en 2 categoras principales:
a) En la primera la metahemoglobilemia se debe a una disminucin de la capacidad del eritrocito para
reducir la Hi que se forma constantemente a partir de la hemoglobina. La mayora de las veces se debe
a un dficit de la enzima NADH citocromo-b5 reductasa y se hereda con carcter autosmico recesivo.
El homocigoto tiene unos niveles de Hi del 10 al 50% y su aspecto es ciantico (de color azulado). Slo
de forma ocasional presenta policitemia como mecanismo de compensacin. La concentracin de
hemoglobina del 10-25% puede no mostrar. Los niveles de 35-50% producen sntomas leves como
disnea de esfuerzo (ahogo) y cefaleas y las que exceden de 70% son probablemente letales. El
tratamiento con cido ascrbico azul de metileno en esta forma de metahemoglobulemia hereditaria
reducir el nivel de Hi aparentes por activacin del sistema NADPH metahemoglobin-reductasa.
Heterocigoto (menos grave) presentan niveles intermedios de actividad NADH citocromob5reductasa y
niveles sanguneos normales. Sin embargo pueden llegar a ser cianticos tras la exposicin a productos
por frmacos oxidantes en cantidades que no afectaran a individuos normales.
b) La segunda categora: en ella los sistemas de reductores dentro de la hemoglobina dentro del
eritrocito son normales pero las estructuras de la molcula hemoglobnica es anormal, pueden formar
una molcula de hemoglobina que tiene una tendencia aumentada a la oxidacin y una capacidad
reducida de que la hemiglobina o metahemoglobina se reduce a hemoglobina. Se han identificado
sulfohemoglobina aberrantes cuya consecuencia es la cianosis asintomtica debida a
metahemoglobulemia; se denomina formas diversas de la hemoglobulemia. Se heredan como genes
autosmicos dominantes y la teraputica con azul de metileno no es efectiva.
2- Metaglobulinas adquiridas: las presentan las mayoras de las metaglobulemias, son debidas
principalmente a la exposicin a frmacos o productos qumicos que producen un aumento de la
formacin de la metaglobulina. Entre ellos destacar los nitritos, nitratos, cloratos y quironas. Otras
sustancias como las anemias cromticas y los compuestos nitrogenados actan probablemente de
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hornos defectuosos y el humo de tabaco. La exposicin al CO es por tanto uno de los riesgos de la
civilizacin moderna. En las calles ms frecuentadas de las grandes ciudades se ha encontrado que el
aire tiene una concentracin de gas suficiente como para causar sntomas leves en personas que
permanezcan durante largos periodos de tiempo en ellas. Por ejemplo: agentes de trfico. La
exposicin crnica al CO a travs del humo del tabaco puede provocar una elevacin crnica del nivel
del carboxihemoglobina para los fumadores, de modo que tienden a presentar hematocrito ms altos
que los no fumadores y pueden presentar policitemia.
Los individuos sanos que han sido expuestos a diversas concentraciones del gas durante una hora no
presentan sntomas definidos (cefalea, vrtigo, debilidad muscular y nuseas) a menos que la
concentracin del gas en la sangre llegue al 20% o al 30%. Mientras que la intoxicacin crnica, sobre
todo en nios, pueden aparecer sntomas graves con concentracin ms bajas.
La ferroxihemoglobina: se puede cuantificar por espectrofotometra diferencial o por cromatografa de
fases.
PRUEBAS PARA DERIVADOS DE HEMOGLOBINA.
Algunos datos se obtienen examinando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto normal del
suero o del plasma revela que el pigmento est en los glbulos rojos. Si se agita una sangre total
normal en el aire durante 15 minutos adquiere un color rojo claro por convertir la hemoglobina en
oxihemoglobina.
La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la
intoxicacin por CO. El color es de chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malva en al
sulfohemoglobulemia.
INDENTIFICACIN ESPECTROFOTOMTRICA
Las distintas hemoglobinas tienen espectros de absorcin caractersticas que se determina en un
espectofotmetro. La identificacin de las diferentes formas de la hemoglobina con la determinacin de
sus espectros de absorcin puede hacerse de una manera muy sencilla: se coloca en un tubo de
ensayo aproximadamente la mitad de una gota de sangre y se diluye 20ml de agua bidestilada. Se
examina la muestra en un espectrmetro empleando agua como blanco y se lee la absorcin a
intervalos de 5 nm.
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE HEMOGLOBINA.
Se considerarn los mtodos de cianometahemoglobina (hemiglobincianuro; HiCN), el que mide el
contenido de hierro. El mtodo del HiCN, recomendado por el International Comit for Standardizationin
Hematology (ICSH, 1978), presenta la ventaja de ser cmodo y de ser una solucin estndar estable,
fcilmente disponible.
Mtodo del hemiglobincianuro (HiCN)
Principio: se diluye la sangre en una solucin de ferrocianuro potsico y cianuro potsico. El
ferrocianuro potsico oxida las hemoglobinas a hemiglobinas (Hi; metahemoglobinas), y el cianuro
potsico proporciona los iones cianuro (CN-) para formar hemiglobincianuro (HiCN,
cianmetahemoglobina), que tiene una absorcin mxima amplia a una longitud de onda de 540
nanmetros.
La capacidad de absorcin de la solucin se mide en un fotmetro o espectrofotmetro a 540 nm y se
compara con la de una solucin de HiCN estndar.
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Reactivo: el disolvente de Drabkin modificado con detergente: ferrocianuro potsico 0'2gr, cianuro
potsico 0'05gr, fosfato potsico dihidrogenado (anhidro) 0'14gr, detergente no inico (por ejemplo
serox) 1 ml y por ltimo agua destilada 1.000ml.
La solucin debe ser de color amarillo claro y plido, tener un pH de 7 a 7'4 y dar una lectura de 0
cuando se miden en fotmetros a 540nm frente a un patrn de agua. La sustitucin del KH2PO4, en
este reactivo por bicarbonato sdico (NaHCO3) acorta el tiempo necesario en el reactivo original de
Drabkin para la conservacin total de hemoglobina a CNHi de 10 a 13 minutos. El detergente aumenta
la lisis de los eritrocitos y disminuye la turbidez de la precipitacin proteica.
Se debe tener cuidado con el KCN en la preparacin de la solucin de Drabkin, ya que las sales o
soluciones de cianuro son venosas. El disolvente contiene slo 50mg/l de KCN, menos que la dosis
letal para una persona de 70Kgr. Sin embargo, ya que se libera HCN por acidificacin, se debe evitar la
exposicin del disolvente a cidos. Es aconsejable deshacerse de los reactivos y muestras a travs del
agua corriente del fregadero. El disolvente se conserva bien en frasco oscuro a la temperatura del
laboratorio, pero se debe renovar cada mes.
Mtodo:
Se aaden 20 microlitos de sangre a 5 ml de disolvente (1:251), bien mezclados y se mantienen a
temperatura ambiente durante al menos 3 minutos. Se determina la capacidad de absorcin, frente al
blanco reactivo, en el colormetro fotoelctrico a 540nm o con un filtro apropiado. Se abre entonces un
vial de HiCN estndar y se mide la capacidad de absorcin, a temperatura ambiente, en el mismo
aparato de una manera similar. La muestra se debe analizar a las pocas horas la dilucin. El estndar
se mantendr en oscuridad cuando no se utilice y se desechar al trmino del da.
Hb (g/dl)= (muestra de prueba A540/estndar A540) X ([estndar(mg/dl)] X 251/1.000(mg/gr)
Suele ser conveniente calibrar el fotmetro al utilizarse para hemoglobinometra preparando una curva
estndar o una tabla que relaciona la capacidad de absorcin a la concentracin de Hb en g/dl.
La capacidad de absorcin del estndar HiCN fresco se mide frente a un blanco reactivo.
Se hacen las lecturas de la capacidad de absorcin del estndar HiCN fresco y de sus diluciones en el
reactivo (1 en 2, 1 en 3, 1 en 4) frente al blanco reactivo. Los valores de Hb en g/dl se calculan para
cada solucin, como se vio anteriormente. Cuando las lecturas de capacidad de absorcin se llevan a
un papel grfico lineal como ordenadas frente a la concentracin de Hb en las abscisas, los puntos
deben describir una lnea recta que pasa por el origen. A partir de esta curva estndar se puede
preparar una tabla que da las concentraciones de Hb para las lecturas de capacidad de absorcin.
* ms sencillo: material y reactivos: tubos de ensayo, pipetas de 5ml y 0'02ml, matraz aforado de 1 litro,
espectrofotmetro; reactivo de Drabkin, puede encontrarse de forma concentrada o ya diluida. En el 1
caso son viales de 20ml que hay que diluir para obtener 1litro. Se guarda a temperatura ambiente y
protegida de la luz; patrn de Hb: viene indicada su concentracin, pero suele ser de 15g/100ml de
sangre. Los patrones tienen caducidad, se guardan en nevera, pero no se congelan.
3 tubos de ensayo: blanco (5ml reactivo de Drabkin) patrn (5ml reactivo + 0'02ml de sangre patrn)
problema (5ml reactivo + 0'02ml sangre) se deja reposar 3 minutos. Y se miden las densidades pticas
a 540nm, de modo que:
Hb(g/ml) = (absorbancia problema/ absorbancia patrn) X 15 *
La ventaja del mtodo del HiCN es que se miden la mayora de las formas de hemoglobinas (Hb, HbO2,
Hi y HbCO, pero no SHb). La muestra de la prueba se puede comparar directamente con el estndar
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HiCN, y las lecturas se pueden hacer segn la conveniencia del tcnico, gracias a la estabilidad del as
muestras diluidas.
El aumento en la capacidad de absorcin no debido a hemoglobina puede estar originado por la
turbidez causada por protenas plasmticas anormales, hiperlipemias, grandes leucocitos (recuentos
superiores a 30x109/l) o gotitas de grasa, factores todos ellos que pueden dar lugar a un incremento en
la dispersin de luz y de la capacidad de absorcin aparente.
Mtodo de la oxihemoglobina (HbO2): ya no se utiliza ampliamente, pero todava constituye un mtodo
satisfactorio la determinacin de la hemoglobina como oxihemoglobina. La principal desventaja reside
en que no se dispone de un estndar estable para la HbO2. Debido a la sencillez del mtodo, muchas
veces se utiliza para comparar niveles de hemoglobina en los casos en los que no se precisa la
cantidad absoluta, como, por ejemplo, en las determinaciones de fragilidad osmtica o de HbA2. El
mtodo de HbO2 no mide la carboxihemoglobina (HbCO), la metahemoglobina (Hi) o la
sulfohemoglobina (SHb), todas las cuales son inactivas para el transporte de oxgeno.
Se hace una dilucin 1:251 de sangre en NH4OH 0'007N. El agua empleada para preparar la solucin
amnica debe destilarse en columna, porque cantidades mnimas de cobre en el agua destilada o en
otros diluyentes utilizados en las determinaciones de HbO2 pueden transformarla en metahemoglobina
y reducir los valores. Agtese bien para asegurar la mezcla y la oxigenacin de la hemoglobina. La
solucin se lee en un fotmetro en que se emplea un filtro verde (540nm) y una solucin 0'007N de
hidrxido amnico como blanco. La prueba puede leerse transcurridos algunos segundos o, si est en
una cubeta tapada, en cualquier momento antes de pasar 3 das. La curva estndar puede trazarse por
uno de los procedimientos que se expondrn ms adelante.
Mtodos qumicos (contenido en hierro): la hemoglobina puede medirse por determinacin de su
contenido en hierro. En la sangre, el hierro no hemoglobnico es insignificante en comparacin con el
hemoglobnico. El hierro debe separarse primero de la hemoglobina, generalmente por medio de un
cido o por incineracin, y entonces es titulado con TiCl3 o forma un complejo con un reactivo que
desarrolle un color susceptible de medirse fotomtricamente.
Basado en la estructura molecular, el contenido de hierro de la hemoglobina es de 0'347%. La
concentracin de hemoglobina en sangre (g/dl) por 3'47. la determinacin de la concentracin de la
hemoglobina por medicin del contenido en hierro es demasiado complicada para el trabajo habitual,
pero se puede utilizar para verificar otros mtodos, y a partir de ella se pueden disear curvas de
calibracin para los mtodos de HbO2 y HiCN. Se usa para estandarizacin en hemoglobinometra si se
desea o si no estn disponibles estndares de cianometahemoglobina certificados. El mtodo del
hierro, por supuesto, mide la hemoglobina total; el mtodo de HbO2 mide solo Hb y HbO2 y el mtodo
de HiCN determina la Hb, HbO2, Hi y HbCO.
Errores en hemoglobinometra: los errores pueden depender de la muestra, el mtodo, el equipo o el
operador. Algunos han sido comentados al describir los distintos mtodos.
Errores inherentes a la muestra: una puncin venosa inadecuada puede producir hemoconcentracin,
que aumentar la concentracin de hemoglobina y el recuento de clulas hemticas. Una tcnica
inadecuada en la obtencin de muestras por puncin del dedo o capilares puede producir errores en
ambos sentidos.
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BIBLIOGRAFA:
Carrasco Carrasco, M. y otros. (2004). Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Hematolgicos y
Citolgicos. Madrid: Paraninfo.
Carrasco Carrasco, M. y otros. (2007). Hematologa I. Citologa, Fisiologa y Patologa de Hemates y
Leucocitos. Madrid: Paraninfo.
ISSN 1988-6047
Autora
Rosario Alors Correderas
rosarioalors@gmail.com