UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

Facultad de ciencias medicas

Escuela de medicina
Catedra de semiologa practica.

Tema: SISTEMA CRISPR/CAS9

Docente: Dr. Eduardo Soria.

Grupo N: 11

Fecha: 22 de junio 2016

Por: German Antonio Paredes Aguirre

Nombre: German Paredes Aguirre

Grupo 11

5TO Semestre

SISTEMA CRISPR/CAS9 DE EDICIN DEL GENOMA PARA

EL DESARROLLO DE TRATAMIENTOS EN ENFERMEDADES
HEREDITARIAS

La tecnologa CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada

para editar o corregir el genoma de cualquier clula. Eso incluye,
claro est, a las clulas humanas. Sera algo as como unas tijeras
moleculares que son capaces de cortar cualquier molcula de ADN
hacindolo adems de una manera muy precisa y totalmente
controlada. Esa capacidad de cortar el ADN es lo que permite
modificar su secuencia, eliminando o insertando nuevo ADN.

Las siglas CRISPR/Cas9 provienen de Clustered Regularly Interspaced

Short Palindromic Repeats, en espaol Repeticiones Palindrmicas
Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas. La segunda es el
nombre de una serie de protenas, principalmente unas nucleasas,
que las llamaron as por CRISPR associated system (es decir: sistema
asociado a CRISPR)

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Grupo 11

5TO Semestre

El sistema CRISPR/Cas9 de edicin del genoma, reconocido como el

avance tecnolgico del 2015, presenta una gran versatilidad y puede
potencialmente ser adaptado segn el objetivo de la investigacin o,
en el futuro, de su aplicacin teraputica.
Un reciente estudio, publicado en el American Journal of Human
Genetics ha investigado el potencial de las aplicaciones teraputicas
de la tecnologa CRISPR-Cas9 en diversas enfermedades hereditarias.
Los investigadores, dirigidos por Ronald D. Cohn, director del Centro
de Medicina Gentica en el Hospital for Sick Children, en Canad,
desarrollaron un protocolo para utilizar estrategias de edicin del
genoma en clulas de pacientes con diferentes condiciones.
El sistema CRISPR-Cas9 consta de dos componentes bsicos: una
enzima, Cas9, especializada en cortar el ADN y un ARN gua que le
indica a la enzima dnde actuar. Una vez que el fragmento de ADN de
inters es identificado y el ADN cortado, la rotura en el ADN es
reparada por la clula. Esta reparacin resulta en la aparicin de
mutaciones de insercin o delecin, que si estn localizadas dentro de
un gen pueden dar lugar a la prdida de produccin de la protena
que codifica. As, la primera aplicacin es la de inhabilitar genes. Sin
embargo, si se proporciona a la clula una molcula de ADN que sirva
como molde durante la reparacin, a la que se ha aadido un cambio,
la clula lo copiar y el cambio quedar incorporado en el ADN. Esta
segunda aplicacin, la introduccin de cambios especficos en
posiciones concretas supone uno de los aspectos ms prometedores
de la tcnica, ya que permitira corregir errores en los genes
responsables de causar enfermedades. Adems, el sistema tambin
puede ser utilizado para regular la expresin gnica, o incluso para
introducir

modificaciones

epigenticas,

inactivando

la

actividad

nucleasa de Cas9 e incorporndole un mdulos que interaccionen con

elementos reguladores de la expresin gnica o capaces de llevar a
cabo cambios en metilacin o modificaciones de las histonas.
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En el trabajo, en primer lugar, el equipo adapt el sistema

CRISPR/Cas9 para aumentar la cantidad de utrofina, un modificador
de la distrofia muscular de Duchenne. Para ello fusionaron una enzima
Cas9 inactivada a un elemento activador de la transcripcin y
utilizaron un ARN gua dirigido hacia el promotor del gen que codifica
la utrofina.
A continuacin utilizaron el sistema para eliminar de forma selectiva
el alelo dominante negativo del gen FGFR3 responsable de la
acondroplasia en fibroblastos de un individuo afectado por la
condicin. En este caso, introdujeron en las clulas la enzima Cas9
funcional y un ARN gua complementario al alelo patognico de
manera que la nucleasa identificara este alelo y cortara el ADN.
La siguiente aplicacin a evaluar fue la posible eliminacin de
fragmentos cromosmicos duplicados en el genoma, estrategia no
abordada previamente en ningn laboratorio. En este caso, utilizando
un ARN gua nico consiguieron eliminar la copia duplicada del
gen MECP2 -responsable del sndrome de duplicacin de MECP2 en
un paciente con una duplicacin en el cromosoma X. Adems, tras el
xito conseguido utilizaron la misma aproximacin para eliminar
duplicaciones en el gen DMD y restaurar su funcin.

Los resultados del trabajo constituyen una prueba de principio para

las mltiples aplicaciones teraputicas del el sistema CRISPR-Cas9.
Inicialmente probadas en clulas de paciente, el siguiente paso ser
utilizar modelos animales en los que reproducir mutaciones concretas
de los pacientes para poder abordar terapias personalizadas.
Hasta la fecha, CRISPR es la tecnologa ms importante que he
encontrado en mi carrera cientfica, manifiesta Ronald Cohn.
Trabajando con pacientes y familias con desrdenes genticos a

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menudo estoy en una posicin en la que puedo proporcionar

diagnstico y quizs cuidado de apoyo, pero no tratamiento. CRISPR
podra cambiar eso. Podra revolucionar la forma en la que cuidamos
de los pacientes con condiciones genticas intratables en la
actualidad.
Es el caso de Gavriel Rosenfeld, paciente de distrofia muscular de
Duchenne cuyas clulas fueron utilizadas en el estudio. De 14 aos de
edad, Gavriel fue diagnosticado con tan solo 4 aos. El equipo de
investigadores consigui eliminar la duplicacin del gen DMD y
restaurar la funcin del gen en clulas extradas y cultivadas de
Gavriel. Ahora planean reproducir su duplicacin en un modelo de
ratn para desarrollar una terapia personalizada. Como cientfico y
clnico, ser capaz de ayudar a un nio con ms que cuidados bsicos
y

pensar

realmente

en

corregir

la

mutacin

gentica

es

verdaderamente un cambio de paradigma, concluye Cohn.

LA TCNICA CRISPR DE EDICIN DEL GENOMA LLEGA A LOS

LINFOCITOS T

Investigadores de la Universidad de California San Francisco han

desarrollado una estrategia para modificar el genoma de los linfocitos
T mediante la conocida tcnica CRISPR-Cas9. El nuevo mtodo
presenta un potencial muy grande para el desarrollo de aplicaciones
teraputicas y en el futuro podra utilizarse para el tratamiento del
SIDA, diabetes o cncer.
Un equipo de bilogos moleculares liderado por Kamel Khalili de la
Universidad del Temple (Filadelfia, EE.UU.) ha conseguido extraer un
segmento del ADN infectado por el VIH-1, el tipo ms contagioso del
virus causante del sida, de los genomas de ratas y ratones

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transgnicos mediante la tecnologa CRISPR/Cas9. Se trata de la

primera vez que un experimento de este tipo se lleva a cabo con xito
en seres vivos. Los cientficos sostienen que han dado un paso crucial
para el desarrollo de una estrategia que podra curar el VIH.
Para

el estudio,

publicado

en

la

revista

'Gene

Therapy',

los

investigadores utilizaron el sistema de transferencia del vector de

virus adeno-asociado recombinante (raaV, por sus siglas en ingls)
para transportar la tecnologa para la edicin de genes CRISPR/Cas9 a
las clulas de los animales. La tecnologa consigui eliminar el
segmento del ADN del VIH-1 del genoma viral de cada tejido de ratas
y ratones, incluso el cerebro, el corazn, el rin, el hgado,
pulmones, el bazo y clulas de la sangre. Los anlisis del ARN viral
mostraron que el nivel del ARN del VIH-1 se vio reducido en linfocitos
circulantes y en ganglios linfticos.
"Hemos demostrado que nuestra tecnologa para la edicin de genes
puede ser introducida en muchos rganos de dos modelos animales
pequeos y puede extraer grandes fragmentos del ADN viral del
genoma de la clula husped", explic Kamel Khalili, aadiendo que
son indicios importantes de que la estrategia puede superar la
reactivacin del virus de clulas latentemente infectadas y podra ser
un enfoque curativo para los pacientes con VIH.
El actual tratamiento del VIH se centra en el uso de medicamentos
antirretrovirales que suprimen la replicacin del virus pero no son
capaces de eliminarlo de las clulas infectadas. Adems, si la terapia
se interrumpe, el VIH puede comenzar a replicarse de forma activa y
los pacientes corren el riesgo de desarrollar el sida.

Desde el descubrimiento del sistema CRISPR como herramienta para

editar genomas, se han dirigido intensos esfuerzos hacia su utilizacin
con fines teraputicos en humanos, bien para regular la expresin de

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genes especficos, bien para corregir errores responsables de causar

enfermedades.
Adems de constituir un elemento clave en la respuesta inmune
celular e intervenir en numerosas enfermedades como el cncer, la
diabetes o el SIDA, los linfocitos T son clulas de fcil acceso que
pueden ser extradas de los pacientes, modificadas y vueltas a
introducir en ellos para ejercer su accin teraputica. Otra ventaja, es
que cualquier modificacin en el genoma de los linfocitos T de un
individuo no ser transmitida a la descendencia, lo que minimiza los
posibles futuros efectos sobre la poblacin, una de las principales
preocupaciones surgidas durante la creciente controversia sobre la
edicin de los genomas en embriones humanos.
Sin embargo, hasta el momento, los linfocitos T se resistan a ser
modificados mediante el sistema CRISPR: la eficiencia de la edicin
era limitada y no se haba conseguido sustituir o insertar nucletidos
del ADN de forma especfica. El sistema CRISPR est formado por
varios componentes: una enzima nucleasa, Cas9, que corta el ADN,
un ARN gua que marca la posicin exacta donde debe cortar y un
fragmento de ADN que acta como molde para que al reparar la
rotura se introduzcan los cambios deseados en el ADN. Usualmente,
el mtodo para introducir Cas9 en la clula a modificar es a travs de
la infeccin mediante virus atenuados que incluyen su secuencia de
ADN o mediante vectores de ADN, de manera que es la propia clula
la que tiene que producirla. En el nuevo trabajo, los investigadores
introdujeron el complejo ribonucleoproteico, Cas9-ARN, por otro
mtodo,

la

electroporacin,

que

consiste

en

aumentar

la

permeabilidad de la clula por medio de la aplicacin de un campo

elctrico. As, la clula a modificar no necesita producir los elementos
del sistema, sino que le son administrados directamente.

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Edicin del genoma. Imagen: KC Roeye

De este modo el equipo de investigadores consigui generar linfocitos
T con niveles reducidos de CXCR4, receptor de quimiocinas que acta
como correceptor para la entrada del virus VIH, y linfocitos T en los
que el gen CXCR4haba sido modificado de forma especfica. Con el
objetivo de confirmar que el mtodo permita modificar diversas
regiones del genoma, los investigadores lo utilizaron tambin para
editar el gen PDCD1. Este gen codifica para PD-1, un receptor que se
encuentra en la superficie de los linfocitos T activados de forma
crnica y que puede inhibir la actuacin del sistema inmune contra
las clulas tumorales.
Los investigadores indican que si bien la eficacia no es tan alta como
en otros tipos celulares, ste mtodo de edicin del genoma es ms
seguro para su utilizacin en aplicaciones teraputicas que otros
mtodos de integracin del sistema CRISPR en las clulas, debido a
que los componentes introducidos son degradados por la maquinaria
celular y su presencia es temporal.

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Antes de plantear la utilizacin de esta aproximacin en pacientes

deber confirmarse que no se producen otros cambios no deseados
en el genoma, adems de optimizar los mtodos de reintroduccin de
las clulas en los pacientes. No obstante los investigadores son
positivos al respecto. Realmente el camino hacia la introduccin de
linfocitos T en los pacientes est muy trillado, indica Alexander
Marson, director del trabajo. Hay compaas que ya lo estn
haciendo, as como resolviendo los aspectos de seguridad, por lo que
existe una infraestructura clnica en crecimiento que podramos
utilizar conforme resolvemos los detalles de la edicin del genoma.
El investigador confa en que los linfocitos T editados mediante
CRISPR se utilizarn en pacientes e indica que sera un error no
pensar en los pasos que hacen falta para llegar a ese momento de
forma segura y efectiva.
Por ltimo, los resultados obtenidos apuntan a la posibilidad no slo
de obtener linfocitos T con utilidad clnica sino tambin a poder
obtener lneas de linfocitos T modificadas con las que estudiar la
regulacin de su funcin de forma precisa.

Bibliografa:
http://revistageneticamedica.com/2016/01/04/sistema-crisprcas9-deedicion-del-genoma-enfermedade-hereditarias/
http://revistageneticamedica.com/2015/08/06/edicion-crispr-linfocitost/
http://dciencia.es/que-es-la-tecnologia-crispr-cas9/
http://i.ytimg.com/vi/SuAxDVBt7kQ/hqdefault.jpg

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