EVALUACIN DE DIFERENTES MTODOS DE

EXTRACCIN DE ADN DE MICOPLASMAS PARA SU

EMPLEO EN EL DIAGNSTICO POR PCR

EVALUATION OF DIFFERENT DNA EXTRACTION METHODS

FROM MYCOPLASMA TO BE EMPLOYEES IN THE DIAGNOSTIC
BY PCR

Yenney Hernndez, Evelyn Lobo, Siomara Martnez y Loidy Zamora

Direccin de Microbiologa, Grupo Biologa Molecular, Laboratorio de Diagnstico de
Micoplasmas (MYCOLAB), Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA),
Apartado 10, San Jos de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo
electrnico: yeni@censa.edu.cu

RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue evaluar diferentes mtodos de extraccin de
ADN de micoplasmas, para su empleo en el diagnstico por PCR. La caracterizacin
de la cepa de Mycoplasma arginini utilizada como control positivo, se realiz con el
empleo de los estudios morfolgicos y las pruebas bioqumicas y enzimticas. A
continuacin se procedi a la obtencin de un cultivo homogneo de la cepa
de Mycoplasma arginini, que permitiera evaluar tres mtodos de extraccin de ADN
de micoplasmas para su utilizacin en el ensayo de PCR. Se probaron los mtodos
de extraccin fenol - cloroformo, centrifugacin y centrifugacin con choque trmico
en muestras clnicas de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos, que
haban sido testadas por el mtodo de cultivo y la Hibridacin de cidos Nucleicos
(HAN). Como resultado se obtuvo la cepa de Mycoplasma arginini caracterizada y
evaluada. Tanto el mtodo de fenol-cloroformo, como la centrifugacin y
centrifugacin con choque trmico, ms sencillos, brindaron similares resultados
cuando se realiz la PCR utilizando la cepa tipo de Mycoplasma arginini. Se
demostr que los mtodos de choque trmico y centrifugacin son eficientes para la
obtencin de ADN de micoplasmas a partir de muestras clnicas con el empleo de la
PCR, comparndose estos resultados con los obtenidos por cultivo y la HAN.
Palabras clave: micoplasmas; diagnstico; cultivos celulares; PCR

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate different DNA extraction methods of
mycoplasma with the use of PCR. The characterization of Mycoplasma
arginini strain use as positive control in this test was carried out, by means of
morphological studies and biochemical and enzymatic tests, in order to obtain a
homogenous culture, which allowed evaluating three mycoplasma DNA extraction
methods for their use in the PCR test. Methods based on centrifuge and thermal
shock with centrifuge were proven for the DNA extraction in cell culture clinical
samples, sera and biopharmaceutical products, which had been tested by culture
method and Nucleic Acid Hybridization (NAH). Mycoplasma arginini, strain was
characterized and evaluated. Either phenol-chloroform extraction as well as two
more simple methods describe above, brought the same results when the PCR
assay was carried out using M. arginini strain. It has been demonstrated that the
methods based on centrifuge and thermal shock with centrifuge are efficient to
obtain Mycoplasma DNA from clinical samples with the use of PCR, comparing these
results with those obtained by culture method and NAH.
Key words: mycoplasmas; diagnostic; cell cultures; PCR

INTRODUCCIN
La necesidad de controlar estrictamente las contaminaciones por micoplasmas en
cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos de aplicacin biomdica,
est basada en los efectos indeseables que producen estos microorganismos en los
cultivos celulares infectados, as como en el individuo que recibe estos productos
contaminados (1). Debido a esto las agencias reguladoras han establecido normas
muy estrictas relacionadas con la deteccin de contaminaciones y entre ellas,
especficamente, la deteccin de micoplasmas (2; 3).
Numerosos mtodos se han utilizado para lograr el aislamiento, deteccin e
identificacin de los micoplasmas: los cultivos microbiolgicos, las pruebas
bioqumicas y enzimticas, tincin fluorescente del ADN y las tcnicas moleculares
dentro de las que se encuentran la Hibridacin de cidos nucleicos (HAN) y la
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (4).
Los micoplasmas como caracterstica distintiva carecen de pared celular, lo cual ha
permitido desarrollar diferentes mtodos de extraccin de ADN mucho ms
sencillos, basados en choques trmicos o ruptura mecnica, para ser empleados en
los ensayos de PCR, adems de tener en cuenta las grandes ventajas que presenta
esta tcnica como son su gran sensibilidad, especificidad y rapidez en el diagnstico
(5). Por tales antecedentes, recientemente los organismos reguladores
internacionales como la Farmacopea Europea, 2007 (3) y el Manual de OIE, 2004
(6) han aprobado esta tcnica, como otros de los mtodos para el diagnstico de
micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos de
aplicacin biomdica, que junto al cultivo microbiolgico y la Tincin de ADN,
permita la liberacin de estos productos con la calidad requerida.
Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado es que nos propusimos como
objetivo evaluar diferentes mtodos de extraccin de ADN para la deteccin de
micoplasmas, mediante el empleo de un ensayo de PCR.

MATERIALES Y MTODOS
CEPAS DE MICOPLASMA UTILIZADAS
Cepa de Mycoplasma arginin NCTC 10129 (Nacional Colecction of Type Culture, de
la Agencia de Proteccin a la Salud, Inglaterra), empleada como control positivo
para la tcnica de PCR, segn lo recomienda la Farmacopea Europea, 2007 (3).
Cepa de Mycoplasma gallinarum, cepa de coleccin del PDRC (Poultry Diagnostic
Reseach Center, Atlanta University, USA, utilizada como control positivo en la
prueba de la produccin de Film y Spot.
Siembra de la cepa: El cultivo de la cepa se realiz segn lo descrito por Poveda
(7). Se incub durante 15 das en condiciones de microaereofilia y
anaerobiosis para favorecer el crecimiento de los micoplasmas, realizndose
lecturas al microscopio cada 48 horas.
Estudio morfolgico: Se sigui como criterio de caracterizacin la formacin de
colonias pequeas, entre 50 a 500 mm de dimetro (7).
Una vez observado el crecimiento de la cepa en forma de huevo frito, se subcultiv
en medio Hayflick lquido para su posterior identificacin, incubndose a 370C en
condiciones de aerobiosis durante 15 das, realizando lecturas diarias para
determinar cambios de pH en el medio que indicara crecimiento de micoplasmas.
Pruebas bioqumicas y enzimticas: Los procedimientos bioqumicos (prueba de
la Digitonina, fermentacin de la glucosa, hidrlisis de la arginina y produccin de
Film y Spot) para la identificacin de micoplasmas se realizaron segn el protocolo
descrito por Poveda, 1998 (7) y de acuerdo a los criterios de clasificacin del
Manual del Bergey (8).
OBTENCIN DEL CULTIVO DE LA CEPA A UTILIZAR COMO CONTROL
POSITIVO
Se parti de la cepa crecida en placa y se sembr en 5 mL de medio Hayflick lquido
y se incub a 370C por 48 horas hasta que alcanzara DO540nm entre 0.2-0.4 y un pH
entre 7.4-7.5. Posteriormente se procedi de igual manera y bajo las mismas
condiciones de crecimiento hasta obtener un cultivo crecido en un volumen final de
100 mL (9).
EVALUACIN DE TRES MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN DE LA CEPA
DE Mycoplasma arginini, UTILIZADA COMO CONTROL POSITIVO,
MEDIANTE EL EMPLEO DE UN ENSAYO DE PCR.
Mtodo I: Extraccin con Fenol-Cloroformo (10).
Mtodo II: Se tomaron 25 mL del cultivo de micoplasma y se centrifugaron a 12
000 rpm durante 10 minutos, el sedimento se resuspendi en 25 mL de PBS y se
centrifug nuevamente a 12 000 rpm durante 10 minutos. Se elimin el
sobrenadante y se resuspendi en 2.5 mL de agua destilada estril, se hirvi
durante 10 minutos y rpidamente se coloc en hielo. El extracto se conserv a 200C hasta su posterior utilizacin (11).

Mtodo III: Se hirvieron 25 mL del cultivo de micoplasma durante 10 minutos y

posteriormente se centrifugaron a 10 000 rpm por 10 minutos. Se tom el pellet y
se resuspendi en 2.5 mL de agua destilada estril y se conserv a -200C hasta su
posterior utilizacin (12, 13).
Electroforesis del ADN extrado: Se realiz una electroforesis en gel de agarosa
al 0.8% teido con bromuro de etidio (0.5 g/mL), corrida a 90 volts por 35
minutos, para analizar la presencia y calidad del ADN obtenido por los tres
mtodos.
Cebadores utilizados: Se utiliz un pareja de cebadores reportado por Fernndez
y Chvez, 1999 (11) que amplifica una regin de 1200pb, correspondiente a la
regin conservada del ARNr 16S de Mollicutes (14). Los cebadores fueron
sintetizados en el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB).
Cebador MGSO:
5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG A 3
Cebador GPO-1:
5 GGT AGG GAT ACC TTG TTA CGA CT 3
Preparacin de la mezcla
La amplificacin se realiz en un volumen final de 50 uL donde se utiliz 2.5 uL
para la muestra de ADN extrado con fenol cloroformo y 5 uL para las muestras
provenientes de los otros dos mtodos de extraccin descritos. La mezcla de
reaccin contena 5 uL de solucin tampn 1X (10 mM de KCL, 200 mM de Tris HCI
pH 8.8; 2.5 mM de MgCl2; 0.1% de Triton X-100 Promega); 10 mM de los dNTP
(Promega); 20 pmoles de cada cebador y 1 L de la enzima AmpliCEN (CENSA).
Condiciones de la reaccin
Las reacciones se realizaron en un equipo Termociclador de ADN REACTOR
ThermoHyBaidTM, utilizando el siguiente programa de amplificacin: 1 ciclo de 94 0C
por 4 minutos; 39 ciclos de 940C /1 minuto; 550C/1 minuto; 720C/ 2 minutos y 1
ciclo de 720C por 8 minutos. La electroforesis se realiz en gel de agarosa al 1.2%
teido con bromuro de etidio (0.5 ug/mL), corrida a 90 volts por 35 minutos. El
resultado se visualiz en un trasluminador de luz ultravioleta (MacroVue). Se utiliz
un patrn de peso molecular con una talla de 150 a 2000pb (Promega).
EVALUACIN DE LOS MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN II Y III EN
MUESTRAS CLNICAS, MEDIANTE LA REALIZACIN DEL PCR
Tipo de muestras
Se analiz un total de 56 muestras, que corresponden con las muestras de cultivos
y lneas celulares, suero fetal bovino, tripsina, lquido asctico, productos
biofarmacuticos de aplicacin biomdica procedentes del CIGB y CIM. Las mismas
haban sido analizadas con anterioridad por el mtodo de cultivo y la HAN.
En la extraccin del ADN de micoplasmas provenientes de las muestras clnicas, se
emple el mtodo II y III descritos anteriormente y la preparacin de la mezcla y

realizacin del PCR, se realizaron bajo las mismas condiciones y requerimientos que
el experimento anterior.

RESULTADOS Y DISCUSIN
A pesar del incremento en el empleo de las tcnicas moleculares para la
caracterizacin de cepas de micoplasmas, el estudio morfolgico y el
comportamiento frente a las diferentes pruebas bioqumicas y enzimticas
continan siendo recomendadas por la literatura especializada para este fin (1).
Los resultados obtenidos como parte de la caracterizacin de la cepa en cuanto al
anlisis morfolgico se puede observar en la Figura 1, donde se muestra la
apariencia microscpica de las colonias de este cultivo a las 48 horas de incubacin.
En la misma se puede apreciar la conocida forma de huevo frito reportada para el
gneroMycoplasma como caracterstica distintiva de los Mollicutes, consistente en
una zona central granular opaca embebida en el agar y una zona traslcida
perifrica (7).

El comportamiento de estos microorganismos frente a la fermentacin de la

glucosa, la hidrlisis de la arginina, la produccin de Film y Spot, prueba de la
digitonina, entre otras, constituyen una herramienta importante en la
caracterizacin de estos agentes (8). En la Tabla 1 se muestran los resultados
obtenidos en la caracterizacin de la cepa de Mycoplasma arginini utilizada como
control positivo, frente a las diferentes pruebas bioqumicas y enzimticas.

El comportamiento de la cepa frente a las diferentes pruebas, coincide con lo

reportado como caracterstico para esta especie, segn Manual de Microbiologa
Clnica (15) y Manual del Bergey (8).
El resultado frente a la prueba de la digitonina confirma su identidad como
microorganismo perteneciente al gnero Mycoplasma. En la Figura 2 se puede
observar el halo de inhibicin producido por la ausencia de crecimiento en dicha
regin.

A partir de estos resultados se obtuvo un cultivo con el pH y DO requeridos segn

lo referido en el Manual de Obtencin del Antgeno (9), donde se seala que con
valores de pH entre 7.4 y 7.5 y una absorbancia entre 0.2 y 0.4 son los ptimos
valores en cultivo para ser utilizado como control positivo en el diagnstico de
micoplasmas. En nuestro caso, el cultivo tena un pH de 7.4 y una absorbancia de
0.23. Por otra parte, una vez lograda su obtencin, dicho cultivo mantuvo sus
propiedades morfolgicas y bioqumicas estables, lo cual posibilit contar con un
cultivo homogneo, que permitiera la extraccin del ADN de esta especie por los
diferentes mtodos, partiendo de las mismas condiciones.
El anlisis bacteriolgico del cultivo de la cepa result negativo, lo cual demostr
que el mismo no presentaba contaminacin bacteriana.
En la Figura 3 se evidencian los resultados obtenidos en la electroforesis analtica
realizada al ADN de la cepaMycoplasma arginini obtenido a partir de los tres
mtodos de extraccin.

En la Figura 3 solo se observa el ADN extrado por el mtodo de fenol/cloroformo,

debido a que el material gentico se encuentra purificado y separado del resto del
material celular, libre de inhibidores y de las histonas que son degradadas por la
proteinasa K, lo cual concuerda con lo reportado por Bashiruddin, 1998 (10) y
Harasawa, 2004 (16). Por otra parte, se observa la banda de ADN obtenida por
este procedimiento, por encima del marcador de peso molecular, lo cual se debe a
que la talla del genoma de micoplasmas es de aproximadamente 2 Kb (17).
A diferencia del mtodo de fenol/cloroformo, con los otros dos mtodos no se
observ ninguna banda que indicara presencia de ADN. Esto se debe a que los
mismos se basan en la ruptura mecnica o por choque trmico, obtenindose ADN
geonmico unido al material celular y a protenas desnaturalizadas y por tanto no
se encuentra totalmente expuesto para ser detectado en este tipo de electroforesis
analtica, realizada con el objetivo de observar la calidad y pureza del ADN extrado,
coincidiendo estos resultados con lo reportado por Bashiruddin, 1998 (10) y Reina,
2003 (1).
Sin embargo, cuando se realiz la PCR utilizando el ADN de Mycoplasma
arginini extrado por los tres mtodos, se pudo observar la presencia de un
producto amplificado de aproximadamente 1200 pb, el cual coincide con el control
positivo de la reaccin (Figura 4).

Como se muestra en la Figura 4 (a), los tres mtodos empleados en la extraccin

del ADN de la cepa utilizada, permitieron la amplificacin del material gentico de
micoplasmas, coincidiendo con lo reportado por Nissen et al. (18); Uphoff y Drexler
(19) y Chaudhry et al. (20) quienes describen que no es necesario tener un ADN
puro, es decir expuesto o libre de material celular para que pueda ser detectado por
esta tcnica, lo que se debe al empleo de cebadores que reconocen una regin
especfica del ADN de estos microorganismos. Unido a esto tambin se encuentra la
capacidad del PCR de amplificar ADN presente en la muestra en muy pequeas
concentraciones, incluso hasta degradado, siempre que no se afecte la regin de
inters, lo cual avala la gran sensibilidad y especificidad de este sistema (12).
A pesar de la calidad del ADN obtenido por el mtodo fenol/cloroformo, este
procedimiento implica una mayor manipulacin de la muestra, un mayor tiempo de
realizacin, as como el empleo de reactivos que encarecen el diagnstico, los
cuales en muchas ocasiones suelen daar la salud del personal. Por tales motivos,
se dificulta su empleo para el tratamiento de muestras clnicas en el diagnstico de
rutina de micoplasmas (21).
A partir de los resultados obtenidos en la extraccin de ADN de la cepa
de Mycoplasma arginini, con el sistema de PCR, se decidi emplear el mtodo II y
III para la extraccin de ADN de micoplasmas, a partir de muestras clnicas de
cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos de aplicacin biomdica. En
las Figuras 5 y 6 se observan los resultados con los mtodos II y III
respectivamente.

Los micoplasmas al carecer de pared celular, son susceptibles a la lisis por

temperaturas elevadas, permitiendo por tanto, la accesibilidad del material
gentico, lo cual justifica la aplicabilidad de los mtodos II y III basados en choques
trmicos, para su empleo en los ensayos de PCR en el diagnstico de los
micoplasmas, lo cual coincide con lo reportado por Fernndez y Chvez (11) y
Sung et al. (4). Adems, se debe tener en consideracin las grandes ventajas de
los mismos, que a diferencia de la extraccin con fenol/cloroformo, no se necesita
gran manipulacin, siendo muy sencillos y rpidos y no se requiere del uso de
reactivos que hagan ms engorroso el trabajo.

Por otra parte en la Tabla 2 se evidencian los resultados obtenidos en el ensayo de

PCR frente a las diferentes muestras clnicas procesadas por los mtodos de
extraccin de ADN II y III, en comparacin con los resultados registrados por el
mtodo de cultivo y la HAN.

Segn se observa en la Tabla 2 la PCR detect mayor cantidad de muestras

positivas que el cultivo y la HAN. En comparacin con el cultivo, diferentes autores
refieren la ventaja que reporta la PCR de detectar organismos no viables en
contraposicin al cultivo que solo detecta microorganismos vivos (18; 23). Adems
se debe tener en cuenta que es un mtodo muy rpido, que a diferencia del cultivo,
a las 24 horas se puede brindar un resultado con la calidad y confianza requeridas.
Una de las razones por la que el cultivo demora tanto es que como parte de la
rutina del laboratorio se aaden antibiticos a los cultivos para evitar posibles
contaminaciones bacterianas, las cuales tienden a enmascarar la presencia de
micoplasmas, impidiendo su crecimiento.
La HAN al igual que la PCR, es capaz de detectar microorganismos no viables, pero
solo detecta hasta 104UFC/mL, a diferencia de la PCR que segn Razin, 1994 (22) y
Tang et.al , 2000(24) es capaz de amplificar por sistemas simples hasta
102 UFC/mL. En ocasiones, esta sensibilidad puede ser mucho mayor cuando se
emplean sistemas como la PCR anidada y/o RT-PCR, llegando a detectar 1 UFC/mL.
Adems, la HAN implica un mayor tiempo de realizacin, as como el empleo de
istopos radioactivos que ponen en riesgo la salud del personal.
Como resultado de este trabajo se pudo comprobar que los mtodos de extraccin
II y III empleados fueron capaces de detectar el ADN de micoplasmas en las
muestras clnicas analizadas. Por las ventajas que presenta el mtodo III, ms
sencillo que el mtodo II, proponemos sea empleado en el diagnstico de
micoplasmas por PCR, con el objetivo de brindar un servicio mucho ms rpido,
menos costoso, confiable y sencillo. Adems con este trabajo se pudo corroborar
que la PCR constituye una tcnica de gran utilidad en el diagnstico de rutina de
micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biofarmacuticos.

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(Recibido 2-1-2007; Aceptado 14-12-2008)

ADN de referencias, donadas gentilmente por el Dr. K.E Johansson, Jefe del
Instituto Nacional de Veterinaria, Departamento de Bacteriologa, Suecia.

2015 1979, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

Carretera de Jamaica y Autopista Nacional, Apartado 10, San Jos de las Lajas, La
Habana, Cuba
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