GENTICA BACTERIANA 2014

Trabajo prctico N 4: Respuesta SOS y Regulacin Gnica

Cepas bacterianas utilizadas:
PQ37 (F-, thr, leu, his-4, pyrD, thi, galE, galK, lac U169, srl300::Tn10 (tcR), rpoB,
rpsL, uvrA, rfa, trp::Muc+, sfiA::Mud (Ap, lac) cts. Expresa constitutivamente la enzima
fosfatasa alcalina.
DH5 (lac)
CG2245 (lac+)
Introduccin
La continuidad de las especies de una generacin a otra se debe a la estabilidad
del ADN. Si el ADN no fuese tan estable y no se reprodujera en forma tan fiel no podran
existir las especies. Por lo tanto, el mantenimiento de la secuencia de bases del ADN de
una generacin a otra es una de las metas principales de todo sistema biolgico. Sin
embargo, pueden surgir alteraciones en la secuencia de distintas maneras. Dado que el
ADN es una molcula, est permanentemente siendo daado por reacciones qumicas.
Muchos factores ambientales pueden daar el ADN. El calor puede acelerar las
reacciones qumicas espontneas, llevando, por ejemplo, a deaminacin de las bases. Los
qumicos pueden reaccionar con el ADN, adicionando grupos a las bases o a los
azcares, rompiendo enlaces del ADN, o fusionando partes de la molcula entre s. Las
radiaciones de ciertas longitudes de onda pueden tambin daar qumicamente al ADN,
el cual puede absorber energa de los fotones. Una vez que la molcula est energizada,
los enlaces pueden romperse o pueden fusionarse distintas partes. El dao qumico puede
ser muy perjudicial para las clulas ya que puede llegar a impedir la replicacin del ADN
y las clulas por lo tanto no pueden dividirse. Incluso si el dao no bloquea la
replicacin, si se copia la secuencia daada, pueden llegar a introducirse mutaciones,
muchas de las cuales pueden ser dainas o incluso letales. Es obvio, por lo tanto, que las
clulas necesitan mecanismos para reparar los daos que sufre el ADN.

Radiacin ultravioleta (UV)

La radiacin UV puede matar a las bacterias y a los fagos. Los cidos nucleicos y
las protenas absorben luz casi en el mismo rango de longitudes de onda: 260mn y 280
nm respectivamente, pero se ha demostrado, sin embargo, que la molcula afectada que
lleva a la inactivacin de estos microorganismos es el ADN.
El anlisis qumico de las bacterias y fagos, as como tambin de ADN purificado,
irradiados mostr que el fotoproducto principal de la irradiacin con UV es un dmero
intracadena formado por dos residuos adyacentes de pirimidinas, siendo aparentemente
el ms importante el dmero de timina. Este dmero provoca 1) distorsin de la hlice y
2) como consecuencia de esta distorsin, la debilitacin de los enlaces de hidrgeno con
las adeninas de la hebra opuesta. Esta distorsin estructural bloquea la horquilla de
replicacin ya que la PolIII interpreta que hay un mal apareamiento de bases cada vez
que coloca una A en dicha posicin. La detencin es slo temporal debido a que existen
diversas formas en que la sntesis del ADN puede ser reiniciada: 1) el dmero puede ser
directamente reparado por fotoreactivacin; 2) el dmero puede ser escindido y las bases
correctas pueden ser reemplazadas por la ADN polimerasa I; 3) la sntesis del ADN
puede reiniciarse del otro lado del dmero, y luego el dmero puede ser reparado por
recombinacin; y 4) la induccin del sistema de reparacin SOS puede permitir la sntesis
a travs del dmero (reparacin con tendencia al error).
La respuesta SOS
La luz UV es un potente mutgeno. Sin embargo, esta mutagnesis requiere de
altas dosis de radiacin UV. Este hecho sugiere que cuando el dao por UV (dmeros de
T) excede la capacidad de los sistemas fieles de reparacin para corregir los daos en el
ADN, otro proceso permite la sobreviva de las clulas pero con el costo de sufrir
mutaciones. Este proceso se denomina reparacin SOS porque es el ltimo recurso para
permitir que la replicacin del ADN contine y por lo tanto las clulas sobrevivan. As, la
reparacin SOS es un sistema puente que permite el crecimiento de la cadena de ADN a
lo largo de segmentos daados con el sacrificio de la fidelidad de la replicacin. Es un
proceso con tendencia al error, es decir, aunque se forman cadenas intactas de ADN las
hebras frecuentemente contienen bases incorrectas. El sistema de reparacin SOS an no
se comprende totalmente pero uno de los resultados parece ser la relajacin de los
sistemas de edicin para permitir que la polimerizacin proceda a travs de un dmero
(sntesis transdimrica) a pesar de la distorsin de la hlice. El sistema de reparacin
SOS es la causa principal de mutagnesis por UV y muchos mutgenos qumicos.

La respuesta SOS involucra el encendido y apagado coordinados de un gran

nmero de genes (aproximadamente 20) luego de que ocurre un extensivo dao sobre el
ADN.
El sistema regulatorio SOS tiene dos componentes, los productos de los genes
lexA y recA. Los mismos tienen tres caractersticas esenciales:
1.

El gen lexA codifica para un represor de todos los operones del sistema
SOS. El represor LexA se une a una secuencia operadora comn
adyacente a cada gen u opern. La protena LexA est autorregulada,
es decir, LexA se une a una secuencia operadora adyacente al gen lexA
lo que le permite controlar su propia expresin.

2.

La protena RecA enciende la respuesta SOS al facilitar la

autoprotelisis del represor LexA.

3.

El dao sobre el ADN provoca un aumento de ADN simple hebra en la

clula el cual al unirse a RecA causa un cambio conformacional en la
protena la cual adquiere la capacidad de promover la autoprotelisis de
LexA.

En ausencia de dao en el ADN, las protenas del sistema de reparacin SOS no se

necesitan. Luego de ocurrido el dao sobre el ADN, las protenas deben expresarse pero
una vez que se completa la reparacin, las protenas deben ser silenciadas. En las clulas
que no han sido daadas, la protena RecA carece de la habilidad de facilitar la
autoprotelisis del represor LexA. Sin embargo, en las clulas daadas por UV, RecA se
une a ADN simple hebra lo que provoca un cambio conformacional en la protena que
estimula su actividad de facilitador proteoltico. As, RecA activada promueve la
autoprotelisis del represor LexA, lo que permite el aumento de la transcripcin de todos
los operones del reguln SOS en aproximadamente unas 50 veces. Esto resulta en un
alto nivel de expresin de todas las protenas del SOS necesarias para reparar el ADN.
Dado que lexA est autorregulado, la protena LexA tambin se produce en altos niveles.
La gran cantidad de protena RecA activada contina facilitando su ruptura proteoltica y
por lo tanto induciendo la produccin de altos niveles las protenas del reguln SOS.
Una vez que el ADN es reparado, RecA pierde la capacidad de inducir protelisis y por
lo tanto LexA no se autoproteoliza ms. As, LexA se acumula rpidamente en la clula,
se une a las cajas operadoras SOS y apaga la expresin de los operones pertenecientes al
sistema. Finalmente la clula vuelve al estado previo a sufrir daos en el ADN.

Objetivo

El objetivo de este prctico es observar la induccin del sistema SOS en

Escherichia coli. Para ello se emplea la cepa PQ37 que posee el gen lacZ, que codifica
para la -galactosidasa, bajo el control del promotor del gen sfiA (PsifA). SifA est
involucrada en la inhibicin de la divisin celular durante la respuesta SOS y por lo tanto
es parte de este reguln. Por otra parte, esta cepa posee una delecin en el opern
lactosa de manera que la actividad -galactosidasa es estrictamente dependiente de la
expresin a partir de PsfiA. La mutacin uvrA hace que la clula sea deficiente en el
sistema de reparacin por escisin y por lo tanto la respuesta SOS se observa mejor ante
ciertos agentes que daan el ADN. La mutacin rfa la hace deficiente en
lipopolisacridos, lo cual facilita la difusin de los agentes qumicos al interior de la
clula. Adems esta cepa expresa la protena fosfatasa alcalina en forma constitutiva.
s if A g e n e

C E L U L A N O IN D U C ID A
la c
u v rA

r fa

la c Z

I n d u c c io n
d e p ro fa g o s

R e p a r a c io n
Im p e r fe c ta

F ila m e n t a c io n c e lu la r

P r o te a s a
R ecA

P r o te in a R e c A
Seal
SO S

C liv a je d e l
re p re s o r

C E L U L A IN D U C ID A

L e s io n e n D N A

T r a n s c r ip c io n

T r a d u c c io n

T o x in a g e n e tic a
- g a la c to s id a s a

El trabajo prctico consta de dos etapas:

En una primera instancia se realiza una observacin cualitativa de la expresin de galactosidasa de distintas cepas - DH5 (lac), CG2245 (lac+) y PQ37 ante la
presencia o ausencia de lactosa y/o glucosa y ante el estmulo de luz UV. Los
resultados se evidencian por la aparicin de colonias azules en placas que contienen
X-Gal.

 Posteriormente, con la cepa PQ37, se realizan curvas dosis-respuesta ante distintas

dosis de un agente fsico (radiacin UV), inductor del sistema SOS. En este caso se
mide la actividad -galactosidasa y fosfatasa alcalina por un ensayo colorimtrico.
Materiales y equipo.
Medio LB lquido y LB-agar.
Na3PO4 50 mM pH=7
Ampicilina

100 mg/ml.

Tetraciclina 15 mg/ml.
Lactosa

10%

Glucosa

20%

X-Gal 20mg/ml
Buffer Z (6 ml de Na2HPO4 1M; 4 ml de NaH2PO4 1M; 1 ml KCl 1M; 200 l
MgSO4.7H2O 0.5M; -mercaptoetanol 350 l; H2O c.s.p 100ml).
Buffer T (Tris 1M pH 8)
0,1% SDS
Cloroformo
o-nitrofenil galactosido (ONPG) 4.5 mg/ml (preparado en agua)
p-nitrofenil fosfato (PNPP) 4.5 mg/ml (preparado en agua)
1 M. Na2CO3
1,5 N NaOH
Bao termostatizado a 37C.
Lmpara UV.
Tubos eppendorf, hemlisis y ensayo estriles.
Placas de petri, pipetas y frascos de cultivo estriles

Procedimiento.
Da 1.
A) Observacin cualitativa. Regulacin del opern lac y el reguln SOS:
Se proveern las siguientes placas por grupo:

2 placas de LB agar suplementado con X-Gal 40g/ml y lactosa 0,5%.

2 placas de LB agar suplementado con X-Gal 40g/ml, lactosa 0,5% y glucosa 1 %

Dividir las placas en 3 secciones iguales y sembrar las cepas DH5, PQ37 y

CG2245. Incubar en estufa a 37 C durante 7-10 h. Luego irradiar con UV (entre 5 y 30

seg). Dejar una de cada una como control sin irradiar. Incubar ON a 37C en estufa.

B) Induccin del reguln SOS:

Se proveer un cultivo crecido toda la noche (ON) de la cepa PQ37 en 10 ml de LB
lquido conteniendo 15 g/ml de tetraciclina y 100 g/ml de Ampicilina.
Subcultivar la cepa PQ37 realizando una dilucin 1:10 en 10 ml de LB

conteniendo 100 g/ml de Ampicilina y 15 g/ml de Tetraciclina.

Incubar en un bao con agitacin a 37 C durante aprox. 1 h (DO ~0,4).

Induccin del SOS por radiacin UV.

Colocar 4 ml de cultivo de la cepa PQ37 en fase exponencial en 4 tubos eppendorf
(1 ml por tubo).
Centrifugar por 2 min. a 10.000 rpm.
Descartar el sobrenadante y agregar a cada tubo 1 ml de Na 3PO4 50 mM pH=7 (este
medio no absorbe la radiacin UV). Resuspender las clulas. Mezclar bien usando
Vortex.
Colocar el contenido de todos los tubos en una placa de petri de plstico (JUNTAR
LOS CULTIVOS DE DOS GRUPOS EN UNA MISMA PLACA). Tomar una
alcuotas de 0,4 ml (una por grupo) y colocarla en un tubo eppendorf (t= 0 para cada
una de las actividades a medir). Rotular bien.
Irradiar las bacterias segn lo indica la tabla:
Intervalo de

Tiempo total de

Irradiacin (seg)
1
+1
+1
+2
+3

irradiacin (seg)
1
2
3
5
8

 Luego de cada paso de irradiacin tomar una alcuota de 0,4 ml (una por grupo) y
colocarla en dos tubos eppendorf (t= x para cada una de las actividades a medir).
Rotular bien.
Agregar a cada uno de los tubos 0,8 ml de LB lquido e incubar a 37C en estufa
durante aproximadamente 45 min.
Centrifugar los tubos y descartar el sobrenadante. Guardar a -20C hasta el da

siguiente.
Da 2:
Se miden las actividades -galactosidasa y fosfatasa alcalina de los cultivos provenientes
de cada una de las placas de Petri. Cada grupo mide una actividad.
A) Ensayo para -galactosidasa

Resuspender las bacterias en 1 ml de Buffer Z.

En tubos eppendorf mezclar:

1. Buffer Z:

0,6 ml

2. Bacterias:

0,15 ml

3. 0,1% SDS

25 l

4. Cloroformo

40 l

Hacer en paralelo un blanco reemplazando los 0,15 ml de bacterias por 0,15 ml de Buffer
Z.
Mezclar usando vortex.
Agregar 150 l de ONPG 4 mg/ml.
Incubar los tubos 10 min a 37C.
Cortar la reaccin con 0,5 ml de Na2CO3 1 M.
Leer Abs a 420 nm.

B) Ensayo Fosfatasa Alcalina

Resuspender las bacterias en 1 ml de Buffer T.

En tubos eppendorf mezclar:

Buffer T:

0,50 ml

Bacterias:

0,25 ml

0,1% SDS

25 l

Cloroformo

40 l

Hacer en paralelo un blanco reemplazando los 0,25 ml de bacterias por 0,25 ml de

Buffer T.
Mezclar usando vortex.
Agregar 150 l de PNPP (4 mg/ml).
Incubar los tubos 10 min a 37C.
Cortar la reaccin con 0,5 ml de 1,5 M NaOH.
Leer Abs a 420 nm.
Da 3:
C) Anlisis general de los resultados.

Preguntas y Problemas
1)

Los dmeros de timina se forman entre timinas adyacentes de la misma hebra o

entre timinas opuestas en hebras complementarias? Qu sistema de reparacin corta
los dmeros de timina? Qu enzimas se necesitan para la reparacin por escisin en
E. coli?

2)

Describa brevemente cmo funciona el sistema de reparacin SOS detallando

cules son las principales protenas involucradas en la misma y el rol que cumple
cada una. Cules son las dos caractersticas del sistema de reparacin SOS que lo
distinguen de los otros sistemas de reparacin? Por qu se introducen mutaciones
durante el accionar de este sistema?

3)

El operon srl es requerido por Salmonella para crecer con sorbitol como nica
fuente de carbono. En ausencia de sorbitol una cepa mutante srl::MudJ(lac, KanR)
expresa muy bajos niveles de -galactosidasa. Sin embargo, en presencia de sorbitol,
la cepa srl::MudJ(lac, KanR) expresa altos niveles de -galactosidasa.
a) Como podra usar Ud esta cepa para aislar mutantes que afecten la regulacin
del operon srl? Explique brevemente.
b) Al aislar mutantes de esta cepa encuentra que muchas de ellas muestran una alta
expresin constitutiva de la -galactosidasa. Que podra concluir a cerca del
mecanismo de regulacin del operon srl de la cepa parental? Esquematice el
mecanismo propuesto y justifique.
c) Como podra determinar experimentalmente si una mutacin en el gen regulador
est ligada al opern srl o est en otra regin del cromosoma utilizando alguno/s de
los siguientes elementos? Plsmido con copia wt del opern srl, fago P22, IPTG, XGal, LB, LB-agar, sorbitol, kanamicina. Explique y justifique.

4)

La habilidad de formar placas de un fago X irradiado con UV es casi la misma

sobre bacterias Uvr+ y Uvr-, con una curva de sobrevida apenas ms empinada sobre
la bacteria Uvr- respecto de la Uvr+.
a) Como podra explicar este fenmeno?
b) Un mutante de este fago X es irradiado con UV y plaqueado sobre las mismas
bacterias Uvr+ y Uvr-. En este caso las curvas de sobrevida tienen mayor
pendiente que para el fago wt, siendo la mayor pendiente sobre la bacteria Uvrque con la Uvr+. Sugiera que defecto tendra el fago mutante.

5)

En su laboratorio se est estudiando el gen snn de E. coli y existen sospechas de

que puede pertenecer al reguln SOS. Con el fin de comprobar esta hiptesis se

construyeron dos plsmidos. El primero, al cual se lo denomin pREP1, es un

plsmido replicativo que posee una fusin del promotor del gen snn al gen reportero
lacZ (Pssn-lacZ). El segundo, al cual se lo denomin, pINT2, es un plsmido suicida
que cuenta con la porcin 5 del gen ssn seguida del gen lacZ.
A) A usted le han encargado que, utilizando el plsmido pREP1 y la cepa EXP101
(lacZ-) de E. coli, disee un experimento que le permita determinar si efectivamente
ssn pertenece al sistema SOS. Describa brevemente el experimento que realizara
basndose en lo realizado en el trabajo prctico y grafique los resultados esperados
(actividad -galactosidasa vs. dosis UV) si snn perteneciera al SOS. Qu esperara
obtener si la cepa fuese recA-? Y si fuese lexA-?
C) Grafique cmo esperara que den las curvas de sobrevida vs. UV en las siguientes
cepas:
a) EXP101/pREP1
b) EXP101/pINT2
c) EXP101/pREP1 en un background recA-.
6) Disee un experimento para identificar genes involucrados en sistemas de
reparacin del ADN utilizando el mtodo de papilacin de colonias. Describa los
pasos a seguir.
Ud identifica dos genes A y B, cuyas mutaciones aumentan la frecuencia de
mutaciones en E.coli. Luego introduce estas mutaciones en una cepa dam- y
evala el efecto de 2-amino purina, un anlogo de adenina en ensayos de
supervivencia (%).
CEPA
WT
DAM-

A80%
0,15%

B75%
0,12%

A-B72%
0,13%

A+B+
100
0,001 %

Con los datos disponibles, podra indicar en qu sistema/s de reparacin del ADN
estn involucrados los genes A y B?
Explique el mecanismo de reparacin de los genes MutSLH.

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