Practicas de Microbiologia General

Prcticas Ecologa Microbiana 2008
EXPERIENCIA 1:
Estudio Fisicoqumico y Microbiolgico de un
microcosmos acutico.
K:\Mis Documentos Reston\Mi

Docencia\Ecologia_Microbiana\DocumentosEcolMic\2008\EcolMicroGuiaPracticas2008\EcolMicroGuiaPracticas_
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Experiencia 1A: Determinacin de las caractersticas fsico-qumicas del medio acutico

El laboratorio est distribuido en puestos independientes, con los reactivos necesarios y
las instrucciones detalladas, para la determinacin de Nitratos, Nitritos, Amonio, Sulfuros,
Fosfatos, Dureza Total, Alcalinidad de Carbonato, pH, T , Oxgeno disuelto y Hierro.
1) Cada pareja filtrar 50 mL del agua problema (contenida en el acuario) sobre un tubo
limpio (de 50 mL con faldn y tapn azul) con ayuda de Jeringa de 60 mL y Filtro GF/C
Whatman alojado en portafiltros del mismo fabricante y luego por filtro de 0,22 m (Serum
Acrodisc Pall Gelman Laboratory prod. n 4525, o similar). Marcar convenientemente el tubo
con nombre, contenido y fecha.
2) A continuacin preparar 5 tubos (Tapn verde) conteniendo cada un o 5 mL del agua

filtrada; uno ms conteniendo 5 mL del control positivo y otro ms con 5 mL de agua destilada o
control negativo. Posteriormente ir rotando por los diferentes puestos hasta que complete todas
las determinaciones. Para hacer las lecturas frente a las cartulinas indicadoras emplear los tubos
de vidrio roscado suministrados con el kit.
3) Todos los resultados se recogern en el encerado en una tabla y se utilizarn para los
clculos finales promedindolos y calculando la desviacin estandar.
4) Cada pareja elaborar un informe en el que se recojan los resultados de todas las
determinaciones realizadas y su interpretacin. Para ello se les suministrar una tabla con valores
gua de diferentes tipos de aguas. El significado de los resultados se discutir en una sesin
posterior
(Explicar el procedimiento para las determinaciones,
tanto del problema como del control, y para realizar
los clculos y la no necesidad de condiciones
estriles. Advertir acerca de las precauciones de
seguridad con las muestras y los reactivos y el uso de
guantes)

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Material necesario para la Prctica:

(General)
Etiquetas para los puestos especificando cada determinacin.
Maletn de anlisis Visocolor ECO Analysenkoffer Art, n 931 001 [Macherey-Nagel
(http://www.macherey-nagel.com), distribuido en Espaa por Panreac Qumica S.A.
(http://www.Panreac.es)]
Contiene:
Visocolor Eco test Amonio: 0,2 3 mg/L NH4+ ;Art. N 931 008 (Refill 931 208)
Visocolor Eco test Nitrito: 0,02 0,5 mg/L NO2- ;Art. N 931 044
Visocolor Eco test Nitrato: 4 120 mg/L NO3- ;Art. N 931 041
Visocolor Eco test Fosfato: 0,2 5 mg/L P-PO4- ;Art. N 931 084
Visocolor Eco test Alcalinidad de Carbonato: 1 gota = 1 d ;Art. N 931 014
Visocolor Eco test Dureza Total: 1 gota = 1 d ;Art. N 931 029
Visocolor Eco test pH: 4.0 9.0 ;Art. N 931 066
Visocolor ECO Sauerstoff Test Oxgeno disuelto Art, n 931 088

Botella Visocolor para determinacin de Oxgeno disuelto Art, n 915 498
Visocolor HE test Hierro: 0,01 0,20 mg/L Fe ; Art. N 920 040
Guantes varios tamaos
1 Termmetro
(Por cada pareja)

2 folletos de Instrucciones Visocolor
2 Hojas con valores gua de diferentes tipos de agua (ver apndices)
1 Tubo de 50 mL (tapn azul con faldn) para muestra filtrada.
7 Tubos de 1 mL (Tapn verde)
1 jeringa de 60 mL + 1 portafiltros+ 1 filtro GF/C Whatman y 1 filtro de 0,22 m
(Serum Acrodisc ,Pall Gelman Laboratory o similar). para filtrado de las muestras.
1 jeringa de 5 mL para las diferentes determinaciones
1 tubos 50 ml Control+ (1mg/L N-NH4+, 0,1 mg/L N-NO2-, 10 mg/L N-NO3-, 1mg/L PPO4-)
Papel absorbente
1 pinzas metalicas
Duracin:
2 horas aproximadamente.

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Experiencia 1B-1: Recuento en placa y observacin de Hetertrofos quimiorganotrofos del

agua
(((PREVENIR ACERCA DE ESTERILIDAD Y PRECAUCIONES CON LOS MECHEROS!!!
11) Realizar diluciones en agua estril (tubos Eppendorf) del agua problema: Original, 1/10,
1/100 y 1/1000. Cada pareja hace las cuatro diluciones. (Recordar marcaje de tubos, esterilidad
y diluciones)
21) Siembra por extensin, con asa de Digralsky, en 4 placas diferentes (marcadas con la
dilucin, nombre y fecha) de Agar nutritivo (medio para hetertrofos, composicin en
Apndices) de 100 l de cada una de las diluciones respectivas. (Recordar esterilizacin con
alcohol y extensin segn esquema en pgina siguiente)
3) Incubacin durante 5-7 das a 221C (en nuestro caso T0 ambiente) en la poyata superior del
laboratorio.
4) En una sesin posterior se realizar el recuento y la observacin del aspecto y la morfologa

de las colonias a simple vista y con lupa binocular.

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(Por cada Pareja)
1 tubo con agua estril en una gradilla
1 Micro Pipeta Automtica P1000
1 caja puntas azules estriles
1 bote de vidrio con Eppendorfs estriles y una gradilla
1 asa Digralsky + 1 Bote alcohol
1 mechero de alcohol
4 placas Agar Nutritivo (secas en campana)
Muestra problema
Duracin:
1 hora aproximadamente.

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Experiencia 1B-2: Diferenciacin de colonias de microorganismos mediante microscopa

con luz oblicua. Recuento de Hetertrofos Quimioorganotrofos del agua. (ufc/ml)
1) Tras una minuciosa observacin de las colonias crecidas en AN, se realizar el recuento y se
seleccionarn 4 colonias por pareja para proceder a su aislamiento y caracterizacin.
Las colonias de diferentes especies de bacterias y otros m.o. pueden diferenciarse ms fcilmente
si empleamos un Estereomicroscopio con bajo poder de magnificacin (Lupa o microscopio de diseccin)
y una iluminacin oblicua. Mediante una fuente de luz externa, o la incluida en el estereomicroscopio,
podemos utilizar Iluminacin oblicua reflejada o Iluminacin oblicua transmitida en conjuncin con
una magnificacin de 6 a 60x.
La luz oblcua reflejada destaca caractersticas de las superficies y los bordes de las colonias que
escaparan a la observacin
visual directa o con luz recta.
Esta mtodo es especialmente
recomendable para examinar las
colonias que crecen en la
Luz
superficie de un medio opaco
(e.j. Agar-sangre) y tambin
para diferenciar colonias de
especies y cepas relacionadas
(ej. estreptococos) que de otra
forma pareceran iguales.
La luz oblicua transmitida se aconseja para examinar colonias que crecen sobre agar transparente
o semi-transparente (tcnica de Henry).
En ambas tcnicas, las placas de cultivo (a ser posible sin tapas) se observan primero a 6x y luego
pueden incrementarse los aumentos dependiendo del tamao de la colonia en cuestin. La iluminacin
debe ajustarse de tal manera que permita una diferenciacin ptima del colorido (ms fcilmente visible
hacia el centro del campo). La diferenciacin de las colonias se basa en el tamao, tipo de borde,
topografa, grado de opacidad y color intrnseco. Adicionalmente, la luz oblicua transmitida es reflejada
y refractada por las colonias de tal manera que destaca diferencias en color, refraccin y estructuras
internas que no son aparentes con la luz vertical normal. De hecho, lo que se produce es un efecto similar
al del campo oscuro. Las colonias de cocos o cocobacilos poseen por lo general una estructura interna
homognea y finamente granular mientras que las de bacilos de longitud variable suelen presentar
patrones de estras suaves a muy marcadas. Los bacilos ms largos y formadores de cadenas exhiben
estructuras prismticas sorprendentes que estn aparentemente relacionadas con la capacidad de refraccin
de las filas paralelas de bacilos dentro de la colonia.
La tcnica de Henry de luz oblicua transmitida es de extraordinaria utilidad para detectar colonias
con cuya forma estamos familiarizados entre incluso cientos de colonias diferentes. Dado que en una
mezcla compleja pueden distinguirse colonias de diferentes gneros y especies, resulta fcil tomar una
porcin de una de ellas y transferirla a cultivo puro para pruebas de confirmacin. Este mtodo tambin es
muy til para el reconocimiento y seleccin de colonias mutantes de un determinado organismo.
Aunque no guarda relacin, esta tcnica tambin se usa para el examen de resultados de tests de
aglutinacin, hemaglutinacin, etc.
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Fig. Superior: Ejemplo de aspecto de colonias

con diferente iluminacin, observadas con un
Esteromicroscopio (lupa binocular) Zeiss
modelo Stemi SV11. Fotografa mediante
cmara digital Canon PowerShot G3
Fig. Inferior: Terminologa ms usual

empleada en la descripcin de la morfologa
de las colonias
Luz Reflejada Oblicua
Luz Transmitida Oblicua

(campo oscuro)
Luz Transmitida Recta

(campo claro)
Duracin: 1 Hora aproximadamente

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Experiencia 1B-3: Aislamiento y caracterizacin de Hetertrofos Quimioorganotrofos del

agua.
1) Se asignar una denominacin especfica a cada una de las 4 colonias seleccionadas por la
pareja respectiva que contendr: Medio de Cultivo/Ao_Pareja/letra de aislado_n estra (por
ejemplo AN08_A1C_1). Adems en la placa correspondiente se consignar la fecha de siembra.
Esta nomenclatura permitir en todo momento la identificacin inequvoca de las muestras as
como su comparacin con la base de datos de imgenes que se ira construyendo en la Pgina
WEB de la asignatura.
2) Se proceder al aislamiento por estra (o agotamiento), en medio Agar Nutritivo (AN), de
cada una de las 4 colonias seleccionadas por la pareja e incubacin a la temperatura adecuada 5 a
7 das.
Dos aislamientos simultneos en una misma placa
3) El aislamiento se repetir tantas veces (nunca menos de dos) como sea necesario, hasta
obtener un nico tipo de colonias idnticas a aquella que se seleccion en la placa original.
4) Se fotografiar tanto la placa con el aislamiento definitivo como las colonias aisladas con las
iluminaciones que pongan de manifiesto sus caractersticas ms distintivas.
5) Se proceder a conservar un stock del aislado en 20% glicerol a -70 C para su conservacin.

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6) La caracterizacin del aislado se llevar a cabo mediante:
Descripcin detallada de caractersticas de crecimiento colonial en medio slido.
Observacin de la capacidad de movimiento en una gota de agua o 5% glicerol.
Tipo de Tincin de Gram (ver apndices) y morfologa celular.(ej. Bacilos G+)
Existencia y caractersticas de formas de resistencia (esporas).
Presencia o ausencia de Catalasa y Oxidasa (ver apndices).

7) Posteriormente y si fuera necesario se procedera a la identificacin molecular.
(Por pareja)
4 placas de Agar Nutritivo bien secas.
2 asas de siembra
Mechero de alcohol
Papel absorbente
Rotulador de Vidrio
Agua Oxigenada 30%
Tetrametil-1,4-fenilendiamina diclorhidrato (10 mg/mL)
Glicerol 5% y 20% estril
Viales de congelacin con gradilla
Duracin: (La experiencia se prolonga a lo largo de varias sesiones)

1/4 hora aproximadamente cada estra
1/4 hora aproximadamente la preparacin de Stocks en glicerol 20% para conservacin.
1/4 hora aproximadamente la observacin de la movilidad
1/4 hora aproximadamente las pruebas de Catalasa y Oxidasa
1/2 hora aproximadamente la Tincin de Gram, incluida observacin microscpica)
1/2 hora aproximadamente la descripcin del crecimiento colonial (si no se hizo en su da)

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Experiencia 1B-4: Extraccin a pequea escala de DNA de los HQOs aislados del agua
para PCR e identificacin molecular.
El protocolo que se explica a continuacin es una lisis alcalna sencilla y rpida y
funciona muy bien con bacterias Gram negativas, que son las que mas frecuentemente aparecen
en medios naturales. En el caso de no obtener buenos resultados, o para otros microorganismos
ms resistentes (Gram +, Hongos, Levaduras y Algas) se puede aplicar el protocolo alternativo
que se proporciona en el apndice correspondiente.
Se realizar la extraccin individualmente sobre cada uno de los aislamientos realizados en
etapas anteriores de la experiencia 1B, manteniendo rigurosamente la nomenclatura establecida
para marcar los diferentes tubos en los que se lleva a cabo la extraccin.
1) Coger el cultivo de placa* (aprox. 1-2 granos de arroz) y resuspender en 500 L de agua MQ
estril en un tubo Eppendorf. Centrifugar a 10.000xg /4 min. Retirar el sobrenadante y congelar
las clulas sedimentadas durante 1-2 horas (-70C, importante para Gram+)
2) Aadir 200L de Sarcosyl (0,1% en agua MQ, estril) a las clulas congeladas. Resuspender
por pipeteo suave y centrifugar a 10.000xg /4 min.
3) Retirar el sobrenadante y aadir a las clulas sedimentadas 100 L de NaOH (0,05M, estril)
4) Resuspender las clulas por pipeteo suave y calentar en un termobloc (previamente
calentado) a 100C. (4 min. Para Gram- y 10 min. Para Gram+)
5) Despus de la incubacin, poner en bao de hielo (2-5 min.)
6) Aadir 600 L de agua MQ estril a la mezcla clulas-NaOH y resupender por pipeteo
suave**
7) Centrifugar a 4C, 5.000xg /4 min.
8) Recoger 400 L del sobrenadante (que contiene el DNA) y guardar en alcuotas de 100 L
a 20C -70C.
(*) Puede partirse de unos 2 ml de cultivo en medio lquido en fase exponencial tarda
(**) Aunque la solucin queda alcalina, el bajo volumen empleado para las reacciones de PCR
no interferir posteriormente con stas
Bibliografa:
Rivas, R., Velzquez, E., Valverde, A., Mateos, P.F., Martnez-Molina. E. (2001). "A two primers
random amplified polymorphic DNA procedure to obtain polymerase chain reaction fingerprints of
bacterial species". Electrophoresis 22, 10861089.
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(Por pareja)
Placas con los aislamientos previos.
2 asas de siembra
Mechero de alcohol
Tubo 10 mL con agua MQ estril
Tubos Eppendorf estriles
Micropipetas automticas P1000 y P200
Puntas estriles para micropipetas
1 Eppendorf con 0,1% Sarkosyl estril
1Eppendorf con 0.05M NaOH estril
Gradilla Eppendorf
Microcentrfuga
Termobloc
Papel absorbente
Duracin:
Explicacin y congelacin de las clulas del punto 1) aproximadamente 1 h.
Extraccin y almacenamiento 1 h.

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Experiencia 1C-1: Desarrollo de Biofilms sobre portas de vidrio en medio acuatico

1) Cada pareja debe montar (usando guantes) un soporte constituido por dos encuadernadores de
plstico con 6 portas bien limpios asegurados por gomas elsticas que se introducirn en el
acuario para seguir el desarrollo de la formacin de Biofilms sobre ellos con el paso del tiempo.
Pueden ayudarse de unas pinzas para evitar cortes con el vidrio. (Recordar marcar con Tipex los
encuadernadores con nombre y fecha)
Se podran montar alternativas como las mostradas en las figuras de la derecha. En el caso de los
portas multipocillo puede despus analizarse cada pocillo con una tcnica diferente.
2) En sesiones posteriores y una vez desarrollado el Biofilm se proceder a su observacin y
anlisis por diferentes tcnicas.

(Por pareja)
2 encuadernadores de plstico
2 gomas elsticas
6 portas normales
1 pinzas metalicas
Papel absorbente
Etanol comn para el laboratorio
Tipex7 para marcaje de los encuadernadores
Guantes
Duracin:
1/2 hora aproximadamente.

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Experiencia 1C-2: Observacin y caracterizacin de los Biofilms desarrollados sobre portas

de vidrio en medio acutico
A) Tincin de Gram: (ms apropiada para procariotas y eucariotas de pequeo tamao)
- Sacar un porta del acuario con ayuda de unas pinzas, eliminar el exceso de agua y limpiar una de
las partes con papel absorbente.
- Secar al aire con movimientos rpidos
- Fijar a la llama del mechero de alcohol (sin que nos queme el porta)
- Colocar el porta en soporte de vidrio sobre el cristalizador y proceder a la tincin de Gram (ver
Apndices). Puede hacerse individualmente o buen colectivamente en cubetas.
- Anotar y dibujar todas las observaciones realizadas.
Tinciones G+ y G-
B) Montaje hmedo: (mas apropiado para formas de mayor tamao y observacin vital)
- Colocar cuidadosamente dos gotas separadas de 5% Glicerol (para evitar la desecacin rpida)
sobre la cara hmeda.
- Aadir a una de las gotas otra gotita de Lugol (I/IK) para aumentar el contraste.
- Colocar sobre cada gota un cubre con cuidado de no atrapar burbujas de aire. (Puede sellarse)
- Observar al microscopio, con objetivos 10x (enfoque), 40x y 100x (aceite de inmersin).
- Anotar y dibujar todas las observaciones realizadas.
Tinciones con Lugol

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C) Tincin con DAPI: (ms apropiado para recuento total de microorganismos)

- Secar al aire con movimientos rpidos
- Fijar a la llama del mechero de alcohol (sin que nos queme el porta)
- Proceder a la tincin con DAPI (ver Apndices)
- Observar con luz U.V. en Microscopio de Epifluorescencia
Tincin con DAPI
Material necesario para la Prctica: (por pareja)
Cristalizador o, en su caso, cubetas para tinciones

Colorantes de la Tincin de Gram
Lugol (I2 +IK)
DAPI
5% Glicerol
Cubreobjetos
Mechero de alcohol
Papel absorbente
Microscopios ptico y de Epifluorescencia
Aceite de inmersin
Laca de uas incolora
Duracin aproximada:
1 hora para Gram y Montaje hmedo, incluidas observaciones
1/2 hora para DAPI, incluida observacin

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Experiencia 1D-1: Recuento en placa y observacin de Auttrofos fotolitotrofos del agua

11) Realizar diluciones en agua estril (tubos Eppendorf) del agua problema: Original, 1/10, y
1/100. Cada pareja hace las tres diluciones. (Recordar marcaje de tubos, esterilidad y diluciones)
2) Cada pareja prepara 2 series de 3 placas de Agar Blue Green 11 (BG11, composicin en
apndices). A una de las series se le aaden 100 l de una solucin de Antibacterianos que se
extiende con asa de Digralsky.
31) Siembra por extensin, con asa de Digralsky, en las 2 series de 3 placas diferentes (marcadas
con dilucin, nombre fecha y tipo de luz) de 100 l de cada una de las diluciones respectivas.
(Recordar esterilizacin con alcohol y extensin segn esquema en pgina siguiente)
3)Incubacin durante 1 a 2 semanas a 221C (en nuestro caso T0 ambiente) en la ventana (luz
solar) o en la poyata superior del laboratorio (luz de tungsteno).
4) En una sesin posterior se realizar el recuento y la observacin del aspecto y la morfologa
de las colonias a simple vista y con lupa binocular.
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(Por cada Pareja)
1 Micro Pipeta Automtica P1000
1 caja puntas azules estriles
4 placas BG11 (secas en campana o estufa)
Solucin de Antibiticos (Streptomicina y Penicilina)
Muestra problema
Duracin:
1 hora aproximadamente.

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Experiencia 1D-2: Aislamiento y caracterizacin de Auttrofos Fotolitotrofos del agua.

ejemplo BG1108_A1C_1). Adems en la placa correspondiente se consignar la fecha de
siembra.
2) Se proceder al aislamiento por estra (o agotamiento), en medio BG11, de cada una de las 4
colonias seleccionadas por la pareja e incubacin con la iluminacin y la temperatura adecuada 1
a 2 semanas .
6) La determinacin del aislado se llevar a cabo mediante Microscopia ptica con las guas
adecuadas. :

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(Por pareja)
4 placas de BG11 bien secas.
2 asas de siembra
Mechero de alcohol
Papel absorbente
Rotulador de Vidrio
Glicerol 5%
Duracin: (La experiencia se prolonga a lo largo de varias sesiones)

1/4 hora aproximadamente cada estra
1/4 hora aproximadamente la preparacin de Stocks en glicerol 20% para conservacin.
1/2 hora aproximadamente la determinacin de cada aislado (incluida observacin microscpica)

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Experiencia 2:
Estudio de los procesos de descomposicin de la materia
orgnica en los ciclos BGQs.

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Experiencia 2A-1 Deteccin de microorganismos productores de enzimas hidrolticas

extracelulares: Inoculacin e incubacin de placas con sustratos especficos
Debido probablemente a la adaptacin a sus hbitats naturales, muchos y variados
microorganismos han desarrollado la capacidad de producir y secretar enzimas hidrolticas al
exterior celular. Esto les permite degradar la materia orgnica que les rodea y obtener
nutrientes asimilables para su crecimiento. Entre las enzimas producidas estn agarasas,
celulasas, xilanasas, amilasas, proteasas, peptidasas, -galactosidasas, nucleasas, fosfatasas,
lipasas, pectinasas, queratinasas, quitinasas, etc.
A continuacin se explica el protocolo por el cual pueden detectarse microorganismos
productores de diferentes actividades hidrolticas mediante un simple ensayo de crecimiento en
placa con diferentes sustratos y posterior tincin para observar los halos de lisis producidos en
los diferentes sustratos. Se han escogido algunas actividades hidrolticas ms frecuentes:
celulsica o celuloltica, capaz de hidrolizar celulosa o derivados (polmeros lineales de Dglucosa unidos por enlace (1,4)); amilsica o amiloltica: capaz de hidrolizar almidn
(polmero de glucosa con enlaces (1,4) y (1,6)); y proteasica o proteoltica: capaz de
hidrolizar los enlaces peptdicos de las protenas.
Se realizar el experimento con un muestra de suelo de jardn diluida a una
concentracin apropiada para la obtencin de microorganismos aislados. Tambin se ensayarn
las posibles actividades hidrolticas de los diferentes aislamientos de HQOs obtenidos en la
experiencia 1B-3.
Entre los microorganismos productores, uno de los ms representativos es el gnero
Streptomyces, tres de cuyas especies utilizaremos como control positivo. Estas especies son S.
halstedii JM8 (JM8), Streptomyces sp.PROTEASA9 (P9) y Streptomyces sp. SF (SF).
1) Cada grupo tiene 2 placas de medio agar nutritivo (AN) con cada sustrato a utilizar:
carboximetilcelulosa (CMC)- actividad clulasica; almidn (ALM)-actividad amilsica;
leche -actividad proteoltica. Marcarlas adecuadamente.
2) Sembrar por extensin una de las placas de cada medio de cultivo con 0,2 ml de una
dilucin 10-3 de una muestra de suelo de jardn preparada previamente.
(10 g de tierra de jardn se agitaron con 100 ml de agua estril durante al menos 1 hora y del
sobrenadante se realizaron diluciones seriadas 1/10 (10-1, 10-2, 10-3) en agua estril. A
continuacin se sembraron 0,2 ml de cada dilucin en AN para determinar la dilucin en la
que se obtienen colonias aisladas tras incubacin a T ambiente )
3) Inocular la otra placa de cada sustrato, con la ayuda de palillos estriles, con las tres cepas
control de Streptomyces (JM8, P9 y SF) y los correspondientes aislamientos de HQOs que se
realizaron con anterioridad.
4) Incubar las placas a temperatura ambiente durante 3-4 das.

Docencia\Ecologia_Microbiana\DocumentosEcolMic\2008\EcolMicroGuiaPracticas2008\EcolMicroGuiaPracticas
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21
Material necesario para la prctica:

(Por pareja)
2x3 placas AN con cada sustrato (CMC, ALM, y leche)*
Micropipetas P200
Puntas amarillas estriles
Asas de Digralsky y alcohol de quemar
Palillos estriles
1 tubo con 1,5 ml de la dilucin del suelo apropiada (10-3)
Placa con los microorganismos control (Streptomyces P9, JM8 y SF)
Placas con los aislamientos de HQOs de la experiencia 1B-3
(*) Para la preparacin de las placas de AN con los sustratos se utilizan soluciones stock
previamente esterilizadas de cada uno de ellos a unas concentraciones de 5% (CMC y ALM) o
del 10 % (leche). Tras autoclavar el medio AN, se deja enfriar a 55 C y se aaden los
sustratos para que queden a una concentracin final de 0,5 %.
Duracin:
1 hora aproximadamente

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22
Experiencia 2A-2. Deteccin de microorganismos productores de enzimas hidrolticas

extracelulares: Revelado de las actividades hidrolticas mediante mtodos especficos.
Cada una de las actividades hidrolticas que estamos estudiando se detecta de una
manera diferente:
1) Actividad clulasica
Tincin con Rojo Congo de las placas con CMC
- aadir 10 ml de Rojo Congo 0,1 % a cada placa
- dejar unos 20-30 minutos
- desteir con 10 ml de ClNa 1M durante otros
20 minutos
Tras la tincin las colonias productoras se detectan por
presentar un halo amarillento a su alrededor
correspondiente a la hidrlisis de la celulosa. El resto de la
placa se observa de un color rojo intenso.
2) Actividad amilsica
Tincin de la placa que contiene almidn con lugol (I2/IK)
- aadir unas gotas de lugol a la placa hasta
cubrirla y dejar que penetre en el agar.
El almidn de la placa se tie de color violeta, apareciendo
halos claros alrededor de las colonias productoras,
correspondientes a la degradacin del almidn. (Con el paso
del tiempo la oxidacin hace que se produzca una
decoloracin progresiva)
3) Actividad proteoltica
Observacin directa en las placas con leche de la
aparicin de un halo transparente alrededor de las
colonias productoras de proteasas, correspondiente a la
degradacin de protenas de la leche.
(La definicin del halo puede mejorarse mediante la
adicin de cido tricloactico (TCA) al 10%)

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Material necesario para la prctica:

(Por pareja)
Rojo Congo 0,1 % (25 ml)
ClNa 1 M (25 ml)
Lugol
Duracin:
1 hora aproximadamente

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Experiencia 3:
Estudio Fisicoqumico y Microbiolgico del ecosistema de
un sedimento lacustre mediante el desarrollo de columnas
de Winogradsky.

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Introduccin : La Columna de Winogradsky

La columna de Winogradsky, ideada por el microbilogo ruso Sergei Winogradsky, es un
ecosistema modelo que se usa en el estudio de los microrganismos acuticos y sedimentarios
(Eveleigh and Davies 1996). En este sistema se promueve el crecimiento de poblaciones
fotosintticas bacterianas que usan SH2 como donador de electrones en su metabolismo auttrofo
fotolitotrofo (fotoauttrofo). La columna consiste en una capa de fango o sedimento colocada en
un cilindro alargado de vidrio o plstico. La altura de la columna permite el desarrollo de una
zona aerobia en la superficie y zonas sucesivas microaerfila y anaerobias ( anxicas) bajo la
superficie. La columna se expone a la luz para que se desarrollen varias poblaciones fotosintticas
a diferentes profundidades. El fango o sedimento contiene per se, o es suplementado con sustratos
de carbono orgnico de utilizacin lenta, sulfatos y sulfuros. Estas condiciones permiten el
crecimiento de numerosas poblaciones tanto heterotrofas como fotoautotrofas, incluyendo las
bacterias fotosintticas anaerobias del azufre. Aunque pueden aplicarse numerosas variaciones, un
montaje adecuado consiste en colocar fango, un sustrato carbonado como papel de filtro en
trocitos y un poco de CaSO4 y CaCO3 en el fondo de la columna y cubrirlo con capas de arena de
color claro y agua (a ser posible del mismo origen que el fango). Estas condiciones favorecen el
establecimiento de gradientes de potencial redox y la fcil observacin de los microorganismos
pigmentados por su contraste con la arena.
La zona superior de la columna suele volverse de color verde debido a que las poblaciones
de algas y cianobacterias (capaces de realizar fotosntesis oxignica) crecen en esta zona aerobia.
El oxgeno producido por estos m.o. ayuda a mantener las condiciones de aerobiosis y permite el
desarrollo de poblaciones de hongos y bacterias hetertrofas aerobios. La capa de agua situada en
contacto con el sedimento contiene una concentracin de oxgeno ms reducida y adems recibe
algo de SH2 que difunde desde las zonas profundas del sedimento. Esta zona es ideal para el
crecimiento de los oxidadores de sulfuro microaerfilos Beggiatoa y Thiotrix, organismos del
gradiente con crecimiento filamentoso blanco-grisceo. Tambin se encuentran en esta zona
tiobacilos no cido-tolerantes como Thiobacillus thioparus. La parte superior de la columna de
arena es de color marrn-rojizo debido al crecimiento de principalmente fotohetertrofos
anaerobios (Rhodospirillaceae). Bajo ellos, una zona rojo-prpura es indicativa del crecimiento
de las bacterias prpuras del azufre (Chromatiaceae y Ectothiorhodospiraceae). An ms abajo,
una zona verdosa indica el crecimiento de bacterias verdes del azufre (Chlorobiaceae). La zona
de color negro intenso que se extiende hacia arriba desde el fondo del sedimento es resultado de la
actividad de los reductores de sulfato (Desulfovibrio, Desulfotomaculum, etc). El color negro se
debe a la formacin de sulfuros metlicos, principalmente sulfuro ferroso (FeS).
Los sulfuros que se producen por el metabolismo de los reductores de sulfato son
aprovechados por las bacterias fotosintticas anaerobias, verdes y prpuras, del azufre. Las
bacterias verdes del azufre son anaerobias estrictas capaces de desarrollar metabolismo tanto
fotoauttrofo como fotohetertrofo usando sulfuros o azufre como donador de electrones. La
oxidacin de los sulfuros conduce al depsito de azufre elemental en el exterior celular. La
familia Chlorobiaceae con el gnero Chlorobium son representantes tpicos. Las bacterias
prpuras del azufre forman una banda por encima de las verdes. Aunque tambin son anaerbicas
son en cierta medida menos sensibles al oxgeno y ms sensibles al SH2 que las Chlorobiaceae.
Entre las bacterias prpuras del azufre se incluye la familia Chromatiaceae con su gnero
008.doc
27
representativo Chromatium. Cuando los sulfuros son oxidados por Chromatium, se producen
acmulos de azufre elemental en el interior celular. La familia Ectothiorhodospiraceae deposita
azufre fuera de las clulas. La familia Rhodispirillaceae utiliza compuestos orgnicos reducidos
en lugar de sulfuros como donadores de electrones, son por lo tanto fotohetertrofos.
La columna de Winogradsky es un ecosistema modelo que mimetiza la situacin existente en una

columna de agua anaerbica que recibe luz. Una zonacin similar puede producirse en sedimentos
naturales a escala milimtrica, ya que la luz es incapaz de penetrar en el sedimento. La C.W. es un
ecosistema artificial que permite la iluminacin a travs de la pared transparente. En teora es
posible preparar C.W. mayoritariamente acuticas, conteniendo una cantidad de sedimento
mnima en su parte inferior, lo que sera ms cercano a las situaciones naturales. Sin embargo,
debido a las corrientes de conveccin trmicas, se producen mezclas de las capas de agua que
dificultan el establecimiento de gradientes redox estables, esenciales para lograr C.W.
funcionales.
Una forma de examinar la biota de una C.W. completamente desarrollada consiste en
desmontarla capa por capa y examinar por microscopa o aislar y cultivar las algas, protozoos,
cianobacterias, Beggiatoa y dems m.o. asociados a cada capa. Otra alternativa consiste en
congelar el sedimento y cortarlo en rodajas con una sierra separando las zonas coloreadas. Pueden
analizarse las bacterias presentes, o extraerse los diferentes pigmentos fotosintticos y separarlo e
identificarlos por cromatografa.
Bibliografa:
Eveleigh, D. and Davis, D. (1996) Whimsical wrinkles with Winogradskys wonder. SGM Quarterly (UK) 23:106107
Atlas, R.M. y Bartha, R. (2002) Ecologa Microbiana y Microbiologa Ambiental (4 Ed.) Pearson Education S.A.
Madrid.
008.doc
28
Experiencia 3A: Montaje de la columna de Winogradsky

Se describe a continuacin el montaje de una columna estandar completa sobre la que pueden
introducirse las variaciones que se consideren oportunas en funcin del nmero de alumnos y la
disponibilidad de espacio y tiempo.
1) Lavar perfectamente una botella de 1,5-2 L de plstico transparente y eliminar las etiquetas. A
continuacin cortar cuidadsamente con unas tijeras el cuello de la botella para usarlo despus
como embudo.
2) Marcar en la parte superior de la columna el nombre de la pareja y las condiciones de la
columna. Esta inscripcin servir como referencia para su orientacin a la luz.
3) Pegar, con un poco de cinta adhesiva, en el interior de la botella un electrodo que llegue hasta
al fondo y sobresalga al menos 10 cm del borde superior. Pegar el extremo sobresaliente.
4) Pesar:
5-10 gramos de fuente de Carbono de utilizacin lenta (papel de filtro cortado en trocitos,
serrn, papel de peridico, restos vegetales secos, etc)
5 gramos de Sulfato Clcico
5 gramos de Carbonato clcico
4) En un vaso de precipitados de plstico aadir unos 750 mL de fango, quitando los restos
vegetales o piedras que puedan existir (USAR GUANTES). Aadir poco a poco agua (del mismo
origen que el fango), si es necesario, a la vez que se remueve con un trozo de madera hasta lograr
una crema espesa. (Cuidado no aadir demasiada agua!)
5) Aadir la fuente de carbono, el sulfato y el carbonato, removiendo bien para su perfecta
distribucin. Asegurarse de que queda una crema fluida que pueda discurrir a travs del embudo.
6) Colocar el embudo en la parte superior de la botella y asegurarlo con cinta adhesiva o con la
ayuda de un compaero. Aadir con cuidado una pequea parte de la mezcla a la base de la
botella.
7) Sujetando la parte superior de la botella golpear unas cuantas veces el fondo sobre la mesa
para que se distribuya uniformemente y se elimine el oxigeno atrapado.
8) Repetir los pasos 6 y 7 varias veces hasta que hayas aadido todo el fango (aprox. 50% del
volumen).
9) Aadir ahora a travs del embudo arena de color claro, previamente empapada con agua del
mismo origen que el fango, hasta completar el 75% del volumen.
10) Rellenar cuidadosamente con agua hasta casi el borde y tapar la columna con film
transparente asegurndolo con una banda elstica.
11) Colocar la columna en una ventana en la que no de el sol directo (orientada al norte o
cubierta con papel de filtro o a unos 60 cm de una bombilla de unos 40 0 60 W). El nombre de la
pareja deber estar orientado hacia el interior del laboratorio de forma que sea visible.
12) Observar semanalmente dibujando con detalle o fotografiando los cambios que se vayan
produciendo.

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Material necesario para la Prctica: (por pareja)
Vaso de precipitados de 2 a 5 litros

Removedores de madera
2 Botellas de plstico transparente
2 electrodos
Cinta adhesiva, Film transparente y Bandas elsticas
Papel de filtro, Sulfato clcico y Carbonato clcico
Balanza de precisin, papel de aluminio.y esptulas de pesada
Guantes de latex
Tijeras
Fango de charca de agua dulce, marisma o marino. (Zona con materia vegetal abundante)
Agua del mismo origen
Arena de color claro
Celofn de colores
Bolsas de basura grandes para proteccin de zona de trabajo
Duracin aproximada:
1 hora discusin previa de condiciones
1 hora el montaje propiamente dicho

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Experiencia 3B-1: Enriquecimiento en placa y medio lquido de Hetertrofos

FotoOrganotrofos (HFOs) de la Columna de Winogradsky, [Bacterias rojas (- y proteobacterias) y verdes (Chloroflexus) no del azufre].
Constituyen estos m.o. un grupo fisiolgico muy importante desde el punto de vista
ecolgico. Algunas bacterias rojas y verdes no del azufre son fotosintticas anoxignicas y
utilizan materia orgnica como donador de electrones y fuente de carbono. Estos m.o.
Hetertrofos fotoorganotrofos (fotoorganohetertrofos) habitan comunmente lagos y arroyos
contaminados. Algunas de estas bacterias pueden crecer tambin como Auttrofos fotolitotrofos
teniendo como donador de electrones al hidrgeno molecular o compuestos reducidos del azufre.
Cuando utilizan la luz como fuente de energa lo hacen en anaerobiosis pero muchos pueden
crecer en presencia de oxgeno y oscuridad, siendo entonces hetertrofos quimioorganotrofos y
perdiendo la pigmentacin casi por completo.
1) Tomar muestras, con pipeta Pasteur estril, de las zonas con

coloracin marrn o rojiza de columnas de Winogradsky
incubadas al menos 30 das. Reunir en un tubo estril de 10 ml
(tapn verde). Agitar bien y tomar 1-2 mL para inocular una
botellita de vidrio de 50 mL con medio MER. Asegurar que slo
queda una mnima burbuja de aire para permitir expansin y cerrar
hermticamente.
2) Dejar sedimentar las partculas en el tubo y, a partir del
sobrenadante, realizar diluciones en agua estril (tubos Eppendorf)
Original, 1/10, 1/100 y 1/1000. Cada pareja hace las cuatro diluciones. (Recordar marcaje de
tubos, esterilidad y diluciones. En cualquier momento se puede proceder a la observacin
microscpica rpida del sobrenadante original)
3) Cada pareja prepara una serie de 4 placas de Medio de Enriquecimiento de
Rhodospirillaceae (MER), (composicin en apndices). Sembrando por extensin, con asa de
Digralsky, (marcadas con dilucin, nombre fecha y tipo de luz) 100 l de cada una de las
diluciones respectivas.
4) Introducir las placas inoculadas en una jarra de anaerobios (poner una sin sembrar en la parte
inferior) y crear la atmsfera sin oxgeno y con CO2 por medio de un sobre BBL GasPak Plus
(Becton Dickinson). Para ello se introduce un indicador de anaerobiosis en el receptculo
destinado al efecto. A continuacin se coloca el sobre con catalizador en la ranura de la rejilla
(con la cara impresa hacia dentro) se corta una esquina y se aaden suavemente 10 ml de agua
para comenzar la reaccin de generacin de Hidrgeno y CO2. Se cierra hermticamente con el
tornillo excntrico sin forzar. Cuando el indicador vira a blanco quiere decir que el H2 , en
presencia del catalizador de Paladio, se ha combinado con el O2 para formar H20 y se ha generado
el CO2, y por tanto se han conseguido las condiciones requeridas.
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5)Incubacin tanto de las botellas como de las Jarras de Anaerobios, durante al menos una
semana a T0 ambiente en la poyata superior del laboratorio (luz de tungsteno de 40-60 W a unos
30-50 cm).
6) En una sesin posterior se realizar el recuento y la observacin del aspecto de las botellas y
placas y de la morfologa de las colonias a simple vista y con lupa binocular.
(Por cada Pareja)
Micro Pipetas Automticas P1000 y P200
1 caja puntas azules y otra de puntas amarillas estriles
Un paquete con pipetas Pasteur estriles y un chupete
4 placas de medio MER (secas en campana o estufa)
1 Botellita de 50 mL con medio MER
1 tubo esteril de 10 mL para Muestra problema
Jarra de Anaerobios con sobre BBL GasPak Plus e indicador de anaerobiosis
Duracin:
1 hora y media aproximadamente.

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Experiencia 3B-2: Aislamiento de Hetertrofos FotoOrganotrofos (HFOs) de la Columna

de Winogradsky (Bacterias rojas no del azufre, Rhodospirillaceae).
ejemplo MER08_A1C_1). Adems en la placa correspondiente se consignar la fecha de siembra.
2) Se proceder al aislamiento por estra (o agotamiento), en medio MER, de cada una de las 3
colonias seleccionadas por la pareja e incubacin con la iluminacin y la temperatura adecuada 57 das . Otra placa se sembrar por agotamiento con 10 L del cultivo crecido en MER lquido.
La incubacin se llevar a cabo en jarra de Anaerobios como se describi previamente y con
iluminacin de tungsteno.

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(Por cada Pareja)
Micro Pipeta Automtica P200
1 caja puntas amarillas estriles
Un paquete con pipetas Pasteur estriles y un chupete
4 placas de medio MER (secas en campana o estufa)
Jarra de Anaerobios con sobre BBL GasPak Plus e indicador de anaerobiosis
2 asas de siembra
Glicerol 5%

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Experiencia 3B-3: Caracterizacin e Identificacin tentativa

de Hetertrofos
FotoOrganotrofos (HFOs) de la Columna de Winogradsky (Bacterias rojas no del azufre,
Rhodospirillaceae).
1) A partir de cada aislamiento hacer una suspensin en agua destilada hasta que sta adquiera
coloracin visible. Alternativamente podra disponerse de un cultivo lquido del aislamiento
correspondiente en medio MER.
2) Pesar 5 g de Sacarosa en varios tubos de tapn verde y aadir a cada uno 3,5 mL
respectivamente de las suspensiones anteriores. Mezclar por inversin repetida hasta total
disolucin de la sacarosa. Preparar de idntica forma un blanco con agua destilada y sacarosa.
3) La determinacin del aislado se llevar a cabo mediante Microscopa ptica (puede hacerse un
Gram), estudio del espectro de absorcin entre 350-1000 nm y capacidad de crecimiento en
aerobiosis y oscuridad. Para ello basta con incubar los aislados en paralelo en luz y anaerobiosis y
oscuridad y aerobiosis y comparar luego los crecimientos.
Se utilizar como gua el Captulo 18 del texto The Prokaryotes: A handbook on Habitats,
Isolation and Identification of Bacteria. Vol I; Ed by Starr, Stolp, Trper, Balows and Schlegel.
Springer-Verlag Heidelberg, (1981)

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Apndices

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Medios de Cultivo
Agar Nutritivo
Caldo Nutritivo
(Nutrient agar)
(Nutrient broth)
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
NaCl
Agar
1,0 g/L
2,0 g/L
5,0 g/L
5,0 g/L
15,0 g/L
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
NaCl
Agar
1,0 g/L
2,0 g/L
5,0 g/L
5,0 g/L
-
Ajustar a pH 7,4 y esterilizar 15 min a 121C en autoclave. Para extender las

placas de AN dejar enfriar en bao hasta 47C.
Usamos habitualmente un preparado comercial de la casa Scharla con todos los componentes
premezclados que se prepara de acuerdo a las instrucciones del envase (28 g/L en el caso del Agar
nutritivo y 13 g/L para el Caldo nutritivo)
Medio BG 11 para Enriquecimiento de Cianobacterias

Solucin de Elementos Traza A-5
Aadir los componentes en orden a 900 mL de agua Milli-Q (destilada/desionizada) y
mezclar concienzudamente. Llevar el volumen a 1 L (no utilizar esptulas metlicas!)
H3BO3 (Ac. Brico)
2.86 g
MnCl2.4H20 (Cloruro manganoso tetrahidrato)
1.81 g
Na2MoO4.2H2O (Molibdato sdico dihidrato)
0.39 g
ZnSO4 .7H2O (Sulfato de Zinc heptahidrato)
0.222 g
CuSO4.5H2O (Sulfato de cobre pentahidrato)
0.079 g
Co(NO3)2.6H20 (Nitrato de cobalto hexahidrato))
0.049 g
Preparacin del medio BG 11 Final ( por Litro)

Disolver los componentes en orden en 900 ml de agua Milli-Rho (destilada/desionizada)
calentando suavemente hasta ebullicin y llevar a 1L. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 psi y
1211C. (Puede distribuirse antes en tubos o frascos)
NaNO3 (Nitrato sdico)
1.5 g
MgSO4.7H2O (Sulfato magnsico heptahidrato)
0.075 g
K2HPO4 (Fosfato hidrgeno dipotsico)
0.04 g
CaCl2.2H2O (Cloruro clcico dihidrato)
0.036 g
Na2CO3 (Carbonato sdico)
0.02 g
cido ctrico
6.0 mg
Citrato Frrico Amnico
6.0 mg
EDTA sal disdica (Titriplex)
1.0 mg
Solucin de elementos traza A-5
1.0 mL
pH 7.1 0.2 a 251C Para preparacin de medio slido aadir 10 g/L de Agar
Para Cianobacterias marinas aadir 10 g/L NaCl y 50 l/L de solucin de Vitamina B12 (0,02 mg/mL) en
condiciones esteriles despus de autoclavar.

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Anlisis microscpico de comunidades microbianas naturales

Los primitivos microscopios pusieron en evidencia un mundo minsculo, desconocido hasta
entonces, por el simple hecho de magnificar cualquier organismo que estuviera presente en el especimen
analizado. Ello permiti la observacin y anlisis de muestras naturales como infusiones, biofilms, aguas
de charcas, etc.. en las que se puso de manifiesto la presencia de complejas comunidades microbianas y
que hoy en da todava nos asombran por su diversidad biolgica. El examen microscpico de estas
comunidades es a la vez fascinante y frustrante. Fascina la variedad de formas, tamaos y estructuras que
pueden observarse y frustra la incapacidad para identificar, por la simple observacin, las especies
presentes (a diferencia de lo que puede hacerse en estudios zoolgicos o botnicos) y para discernir en
muchas ocasiones lo que son formas vivas o materiales inertes. Este ltimo problema es muy frecuente ya
que en numerosas ocasiones la porquera visual en el fondo de la preparacin oculta, o al menos
dificulta, la presencia de microbios. Un ejemplo lo constituye la observacin de bacterias oxidantes del
hierro ya que la aparicin de formas cristalinas del metal, a las que se adhieren las bacterias, crean patrones
visuales en los que los microbios no son distinguibles. Lo mismo sucede con los acmulos de materia
orgnica de sedimentos, tapetes microbianos o biofilms. Estos inconvenientes han podido aliviarse, al
menos en parte, con el desarrollo de diferentes tcnicas microscpicas. Para entender cmo las nuevas
capacidades de los microscopios nos pueden proporcionar informacin importante acerca de los microbios
presentes en una muestra, vamos a considerar las diferentes formas de observacin empleadas hoy en da y
la informacin que nos proporciona cada una de ellas.
La forma mas simple de microscopa (la microscopa ptica de campo claro) consiste en
iluminar directamente la preparacin (montaje hmedo) con luz. El problema con esta iluminacin
directa es que en muchas ocasiones las bacterias no son visibles o no lo son muy claramente, ya que la luz
las atraviesa sin encontrar obstculos. Este problema se disminuye haciendo uso del diafragma de campo,
o tiendo las clulas con diferentes tipos de colorantes. La tincin de Gram es la ms utilizada aunque
desgraciadamente no es tan fiable, cuando se aplica a muestras ambientales, como lo es en la
microbiologa clnica o con cultivos puros. No obstante sirve suficientemente bien para discernir lo
animado (aunque haya muerto) de lo inerte. La adicin de Lugol (I/KI) nos permite incrementar el
contraste de algas y protozoos. Tambin podemos emplear tinciones especficas para el material inerte
(por ejemplo, azul de Prusia para el hierro o bencidina para el manganeso).
Los microscopios modernos poseen capacidades nuevas como mayor poder de resolucin o la
posibilidad de utilizar diversas longitudes de ondas de luz incidente. La microscopa de contraste de
fases se usa para la observacin de montajes hmedos. Este tipo de anlisis nos proporciona informacin
no slo acerca de la forma del microbio, sino tambin de su posible movilidad y de si sta es debida al
deslizamiento o a la presencia de flagelos. Un organismo que nada rpidamente a travs del medio,
probablemente lo hace mediante el uso de flagelos, mientras que si resbala lentamente, es deslizante.
Aseverar la movilidad es a veces difcil para el principiante debido a que el movimiento Browniano (que
se origina al moverse el lquido cuando se comprime la preparacin con el objetivo) puede dar la
impresin de movimiento real. Tambin es importante conocer la fisiologa de los organismos observados.
Por ejemplo si se observan bacterias marinas en un montaje en agua destilada, aquellas se lisarn. Otro
efecto ms sutil es el de la concentracin de oxgeno en lquido que hay bajo el porta. Con el tiempo, el
medio se vuelve anxico y bacterias o protozoos, que en principio son mviles y aerobias, se movern ms
lentamente o no lo harn en absoluto. Una prueba de que esto est sucediendo es la acumulacin de las
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formas mviles en los bordes del cubre o alrededor de posibles burbujas de aire atrapadas en la
preparacin.
La presencia de grnulos de azufre o vacuolas de gas que reflejan la luz, da una apariencia, en
contraste de fases, como de luces de un rbol de Navidad. Algo similar sucede con la presencia de
esporas, que tambin refractan la luz de forma muy caracterstica.
La microscopa de fluorescencia se emplea para poner de manifiesto microorganismos que
contienen molculas que pueden excitarse con luz de una longitud de onda, para posteriormente emitir luz
de una longitud de onda superior. Este tipo de fluorescencia nos muestra a los microorganismos que
contienen compuestos fluorescentes como formas brillantes en un fondo oscuro. Por otra parte, en el caso
de preparaciones con mucha porquera, podemos visualizar mucho ms claramente los microorganismos,
as como distinguirlos de lo inerte, tindolos con colorantes capaces de intercalarse entre las bases del
DNA y volverse fluorescentes exclusivamente en esas condiciones. Primeramente se usaba el Naranja de
acridina, pero actualmente se usa ms el DAPI (4,6-diamino-2-diphenylindol) que proporciona una
fluorescencia azul una vez intercalado. Esta tcnica es especialmente til si se quieren hacer recuentos de
microorganismos totales presentes en una muestra, ya que no dependemos de la capacidad de que crezcan
en cultivo, por lo que los nmeros que se obtienen suelen ser varios rdenes de magnitud superiores a los
obtenidos por recuento en placa. Tambin es muy util para distinguir microorganismos eucariticos (la
tincin est concentrada y ms brillante en el nucleo) de procariticos (la tincin est dispersa por toda la
clula y es ms difusa).
Los microorganismos fotosintticos contienen pigmentos que, por si mismos, son fluorescentes y
pueden excitarse con luz de diferentes longitudes de onda (autofluorescencia), mientras que los no
fotosintticos permanecen oscuros. Esta propiedad nos puede servir para distinguir, en una misma muestra
algas (absorben luz azul-verdosa y la emiten roja) de cianobacterias (absorben luz verde y la emiten rojanaranja) y de bacterias no fotosintticas teidas con DAPI (absorben en UV y emiten luz azul).
Las Archeas metanognicas tambin poseen un conjunto de cofactores enzimticos que permiten
que emitan autofluorescencia azul cuando se iluminan con luz de la longitud de onda adecuada.
Aunque todas estas tcnicas microscpicas son tiles, no nos sirven para identificar ms
exactamente los microbios presentes en una comunidad natural determinada. Una tcnica ms reciente, la
hibridacin fluorescente in situ (FISH) permite aseverar la identidad de los microorganismos que se
visualizan en el microscopio y extraer conclusiones acerca de su distribucin espacial y su relacin con
otros m.o. El empleo de diferentes sondas de DNA, marcadas con colorantes fluorescentes, capaces de
hibridar especficamente con las secuencias correspondientes del rRNA contenido en las diferentes
especies o dominios nos permite llevar a cabo la identificacin deseada.
Bibliografa empleada en la elaboracin del tema:

Saylers, A.A. and Whitt, D.D. (2001) Microbiology: diversity, disease and the environment. Fitzgerald
Science press. Bethesda, Maryland. USA. ISBN 1-891786-01-6

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Tincin de Gram sobre muestras fijadas previamente.

Cubrir con Cristal violeta (colorante primario) y mantener 1 minuto
- Eliminar el exceso de cristal violeta y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso
- Cubrir con Lugol (I/IK, acta como mordiente) y mantener 1 minuto
- Eliminar el exceso de Lugol y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso
- Decolorar con etanol-acetona y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso
- Cubrir con Safranina (colorante de contraste) y mantener 1 minuto
- Eliminar el exceso de Safranina y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso
- Dejar secar al aire sobre papel absorbente.
- Observar al microscopio, sin cubre, con objetivos 10x (enfoque), 40x y 100x (aceite de
inmersin).
Tincin de DNA con DAPI (4,6-diamino-2-diphenylindol)

Secar al aire la preparacin* y fijar a la llama. Aadir 5 a 10 L de DAPI a un cubre,
invertirlo y depositarlo cuidadosamente sobre el porta para no dejar burbujas. Teir 5 min. Sellar
la preparacin con laca de uas. Puede guardarse a 4C durante semanas. Observar en
microscopio de Epifluorescencia.
Preparacin del DAPI (1x, guardar a 20C en alcuotas de 100 L):
1 L de DAPI 1000x (1mg/mL en agua)
10 L de Antifading 100x (100 mg/mL de p-Phenylendiamine en agua)
500 L de Glicerol 100%
489 L H2O
(*) La preparacin puede ser una gota de agua, un poco de biofilm o cualquier muestra natural,
aunque se haya fijado previamente (con formaldehdo o etanol por ejemplo). Tambin puede
ponerse en un poco de agua material tomado de una colonia aislada de un cultivo puro o una gota
de cultivo crecido en medio lquido.

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Tincin de bacterias del Hierro y Manganeso

Azul de Prusia para tincin del Fe ferrico:
Secar al aire la preparacin y aadir unas gotas (10-20 L) de Azul de Prusia (70 mL de 0,1%
HCl + 30 gotas de 2% K4[Fe(CN)6]). Teir durante 10 minutos, preferentemente en cubeta.
Luego puede observarse o lavarse con agua y teir las clulas con Ziehl-Nielsen Carbolfuchsin
(no calentada) preferentemente en cubeta. Alternativamente puede teirse con DAPI y observar
en microscopio de fluorescencia. La tincin proporciona un color azul intenso en los depsitos de
hierro frrico.
En la prctica: 7 mL H2O MQ + 300 L de HCl 1N + 700 L de 2% K4[Fe(CN)6]
Bencidina para tincin de Manganeso:

Humedecer el material a teir con un poco de benceno y aadir luego unas gotas (10-20 L) de
0,5% Bencidina clorhidrato en actico al 50%, dejar unos segundos y retirar la bencidina con
papel de filtro. Observar. La tincin proporciona un color verdoso en los depsitos de manganeso.
( Se puede aadir agua o 5% glicerol antes de observar)
5 mL CH3COOH + 5 mL H2O MQ + 0,05 g Bencidina clorhidrato
Bibliografa:
Hanert, H.H. (1981) AThe genus Siderocapsa (and other Iron- or Manganese- oxidizing
Eubacteria)@ en The Prokaryotes Vol I. Edited by M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Trper, A. Balows y
H.G. Schlegel. Springer-Verlag New York ISBN 3-540-08871-7

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Tinciones y pruebas bioqumicas para la caracterizacin de los aislamientos

microbianos
Tincin de Gram
La tincin de la pared celular se realiza mediante Gram por inmersin, para ello se toma
una muestra de un cultivo joven en una gotita de agua estril y se fija en un portaobjetos mediante
calor. El porta fijado se sumerge durante 1 minuto en cristal violeta, posteriormente se pasa a una
solucin de lugol (mordiente) durante 1 minuto, se lava con etanol-acetona (50%) durante 30
segundos y finalmente se sumerge en safranina durante 1 minuto. Entre cada uno de los pasos los
portas se lavan con agua destilada (por inmersin). Finalmente las muestras se dejan secar a
temperatura ambiente y se observan al microscopio 10x, 40x y 100x (aceite de inmersin).
Tincin de esporas
Para la tincin de esporas (en los casos en que fue necesario) se utiliza como reactivo el
Verde Malaquita. Para ello se toma una muestra de un cultivo maduro en una gotita de agua estril
y se fija mediante calor en un portaobjetos. A continuacin se coloca un papel de filtro sobre la
muestra y se impregna con verde malaquita, sujetndolo con unas pinzas. El portaobjetos se pasa
por encima de una llama hasta que se produce emisin de vapores, se retira y, cuando deja de
emitirlos, se vuelve a pasar por la llama (el proceso se repite durante 5 minutos). Posteriormente
se elimina el papel de filtro, se lava con agua destilada, y se tie con safranina durante 1 minuto.
Se vuelve a lavar para eliminar el exceso de colorante y, como ltimo paso, se deja secar sobre un
papel de filtro. y se observan al microscopio 10x, 40x y 100x (aceite de inmersin).
Prueba de la catalasa
Esta tcnica se basa en la ruptura del perxido de hidrgeno formando agua y oxgeno gas
todo ello catalizado por la enzima catalasa, la formacin de burbujas ser indicativo de la
presencia de la enzima. Para determinar su presencia se utiliza perxido de hidrgeno (H2O2) al 30
%, (ste se conserva en oscuridad a 4 C). Cada uno de los aislamientos se crece en placa durante
48 horas a temperatura ambiente, se toma una muestra y se coloca sobre un porta al cual se le ha
aadido previamente una gota de perxido de hidrogeno. La formacin o no de burbujas de
oxgeno confirma la presencia o ausencia de la enzima.
Prueba de la oxidasa
En este ensayo se utiliza como reactivo el N,N,N,N-tetrametil-1,4-fenilendiamina,
diclorhidrato a una concentracin de 10 mg/ml. El reactivo se prepara con agua milliQ en el
mismo instante de su utilizacin ya que se degrada con el aire y la luz. El fundamento de la tcnica
se basa en la utilizacin de este N,N,N,N-tetrametil-1,4-fenilendiamina, diclorhidrato como un
donador artificial de electrones para reducir el citocromo c (oxidasa positivo). En este caso el
reactivo vira hacia un color azul violaceo oscuro. Si la citocromo oxidasa no est presente el
reactivo se mantiene incoloro en su forma reducida y el microorganismo es identificado como
oxidasa negativo. La aparicin del color ha de producirse antes de un minuto.

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Prcticas Ecologa Microbiana 2008

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Prcticas Ecologa Microbiana 2008

Experiencia 1A: Determinacin de las caractersticas fsico-qumicas del medio acutico

2) A continuacin preparar 5 tubos (Tapn verde) conteniendo cada un o 5 mL del agua

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Material necesario para la Prctica:

Visocolor ECO Sauerstoff Test Oxgeno disuelto Art, n 931 088

(Por cada pareja)

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Prcticas Ecologa Microbiana 2008

Experiencia 1B-1: Recuento en placa y observacin de Hetertrofos quimiorganotrofos del

4) En una sesin posterior se realizar el recuento y la observacin del aspecto y la morfologa

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Material necesario para la Prctica:

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Experiencia 1B-2: Diferenciacin de colonias de microorganismos mediante microscopa

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Fig. Superior: Ejemplo de aspecto de colonias

Fig. Inferior: Terminologa ms usual

Luz Transmitida Oblicua

Luz Transmitida Recta

Duracin: 1 Hora aproximadamente

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Experiencia 1B-3: Aislamiento y caracterizacin de Hetertrofos Quimioorganotrofos del

Dos aislamientos simultneos en una misma placa

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6) La caracterizacin del aislado se llevar a cabo mediante:

Descripcin detallada de caractersticas de crecimiento colonial en medio slido.

Observacin de la capacidad de movimiento en una gota de agua o 5% glicerol.

Tipo de Tincin de Gram (ver apndices) y morfologa celular.(ej. Bacilos G+)

Existencia y caractersticas de formas de resistencia (esporas).

Presencia o ausencia de Catalasa y Oxidasa (ver apndices).

Duracin: (La experiencia se prolonga a lo largo de varias sesiones)

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Material necesario para la Prctica:

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Experiencia 1C-1: Desarrollo de Biofilms sobre portas de vidrio en medio acuatico

Material necesario para la Prctica:

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Experiencia 1C-2: Observacin y caracterizacin de los Biofilms desarrollados sobre portas

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C) Tincin con DAPI: (ms apropiado para recuento total de microorganismos)

Tincin con DAPI

Material necesario para la Prctica: (por pareja)

Cristalizador o, en su caso, cubetas para tinciones

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Experiencia 1D-1: Recuento en placa y observacin de Auttrofos fotolitotrofos del agua

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Material necesario para la Prctica:

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Experiencia 1D-2: Aislamiento y caracterizacin de Auttrofos Fotolitotrofos del agua.

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