PRCTICA N 1

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES EN PLANTAS

1. Objetivos:
- Adiestrar al estudiante en las tcnicas para el diagnstico de enfermedades en plantas producidas por
hongos fitopatgenos.
- Aislar e identificar hongos fitopatgenos de plantas con enfermedades foliares, radiculares y
vasculares.
2. Fundamento terico:
3. Materiales:
- Material vegetal: Hojas con manchas foliares y muestras con lesiones radiculares y vasculares.
- Equipo de diseccin
- Hojas de afeitar de primer uso
- Papel toalla
- Taper pequeo o placas Petri para la cmara hmeda
- Lminas portaobjeto y varillas en V
- Tijera, navaja, agujas entomolgicas con mango
- Pipeta estril de 5ml.
- 02 Placas con agar PDA + antibitico
- Un tubo de 15 x 150 mm. con PDA inclinado
- Leja al 5% y 10%
- Agua destilada estril
- Mecheros
- Estereoscopio
- Microscopio
4. Procedimiento:
Toma de muestra:
Para el caso de plantas enfermas que muestran sntomas de marchitez en la parte area (follaje), las
muestras sern races con pudricin o segmentos de la zona del cuello de la planta con necrosis a nivel
vascular. Con ayuda de una tijera o cuchillo cortar un pedazo de tallo a nivel de la zona de avance y
transportarlo en una bolsa de polietileno. Las races colectarlas juntamente con un poco de tierra para evitar
la desecacin de las muestras.
En plantas con manchas foliares, colectar unas tres hojas con sntomas de la enfermedad en una bolsa de
polietileno.
Rotular considerando lo siguiente: Cultivo, nombre comn y cientfico, lugar, colector y fecha de
coleccin. As mismo tomar nota de las caractersticas de los sntomas.
Nota: Las muestras deben de ser de la zona de avance de la enfermedad y colectadas en plantas con inicio
de la enfermedad.
Lavado y desinfeccin:
a) Lavar las races a chorro de agua para retirar la tierra impregnada. Secar al ambiente.
b) Lavar las hojas y trozos de tallo. Cortar en pequeos segmentos en la zona de avance.
c) Disponer de cuatro recipientes (placas Petri o Beacker) rotulados de 1 al 4. El primero debe contener
leja al 5% para desinfectar tallo u hojas y al 10% para desinfectar races. Los tres restantes deben
contener agua destilada estril.
d) Colocar la muestra lavada y seca en el recipiente con leja por espacio de 2 minutos para hojas y tallos
y 3 minutos para races. Verificar que la muestra se encuentre sumergida.

e) Con una pinza previamente flameada a la llama de mechero y enfriada, retirar el trozo de muestra y
pasar por los recipientes con agua, con leves sacudidas para retirar los remanentes del desinfectante.
f) Colocar la muestra sobre un trozo de papel toalla para el secado.
g) Una vez que la muestra est completamente seca, se debe elegir un trozo de aproximadamente 4 cm.
para la cmara hmeda y la otra cortar en 4 cuadrados de aproximadamente 0.5 cm., en la zona de
avance, con una tijera o bistur previamente desinfectada, para el cultivo.
Cmara hmeda:
a) Instalar una cmara hmeda colocando dentro de una placa Petri o un tper previamente desinfectado
con alcohol de 70, un crculo de papel toalla del dimetro de la base del recipiente, una varilla
dispuesta en V y sobre ella una lmina portaobjetos.
b) Colocar el pedazo de muestra de aproximadamente 4 cm. desinfectado en el paso anterior, sobre la
lmina portaobjetos con ayuda de una pinza.
c) Aadir agua destilada estril sobre el papel toalla en una cantidad suficiente para proporcionarle
humedad a la cmara. Evite mojar la lmina portaobjetos que contiene a la muestra.
d) Rotular e incubar a temperatura ambiente.
e) Evaluar a partir de las 48 horas de incubacin por observacin a 4X en Estereoscopio.
f) Si se observa esporulacin, hacer un montaje con azul de lactofenol. Con una aguja entomolgica y
observando a travs del estereoscopio coger la fructificacin y colocar sobre la gota del lquido de
montaje contenida en una lmina portaobjetos. Con la ayuda de otra aguja extender adecuadamente la
fructificacin, siempre observando a travs del estereoscopio.
g) Cubrir con cubreobjetos evitando la formacin de burbujas.
h) Observe a 4X y 40X al microscopio. Si corresponde a una estructura madura haga el sellado del
montaje para obtener montajes permanentes.
i) Identificar con la ayuda de claves taxonmicas.
Nota: Los montajes no deben contener residuos. Use lminas portaobjetos y cubreobjetos de primer uso y
verifique que estn rigurosamente limpias.
Cultivo:
a) Con una pinza, colocar los 4 trozos de la muestra desinfectada, enjuagada y secada; en cuatro puntos
equidistantes sobre la superficie del agar PDA + antibitico. Presionar suavemente con la pinza para
permitir un contacto seguro.
b) Incubar a 25C hasta observar crecimiento de la colonia. Evaluar a partir del tercer da de incubacin.
c) Aislar en cultivo puro, en agar PDA + antibitico dispuesta en placa, por siembra en superficie. Incubar
a 25C hasta observar crecimiento.
d) Realizar un cultivo monosprico. Incubar a 25C hasta el desarrollo de la colonia.
e) Resembrar en tubos con agar PDA, incubar a 25C hasta el desarrollo de la colonia. Conservar en
refrigeracin a 4C.
f) As mismo, realice un montaje a partir del cultivo monosprico. El montaje realice, obteniendo la
fructificacin, con una aguja finsima y observando simultneamente el estereoscopio. Aydese de otra
aguja para extender adecuadamente la fructificacin sobre la gota del lquido de montaje. Coloque la
lmina cubreobjetos evitando la formacin de burbujas.
g) Identificar de acuerdo a las caractersticas de la fructificacin, utilizando claves taxonmicas.

PRCTICA N 2
PRUEBA DE PATOGENICIDAD

I.

OBJETIVOS:
Demostrar que los hongos aislados de plantas de cebolla con decoloracin del disco basal y de
plntulas de sanda con sntoma de chupadera son los causantes de la enfermedad.

II.

FUNDAMENTO TERICO:
Muchas enfermedades de las plantas pueden ser diagnosticadas con relativa facilidad, a partir de la
observacin de las estructuras del organismo patgeno. Sin embargo, en otras ocasiones, el agente
patgeno no es visible o fcilmente identificable. Tambin puede producirse la presencia simultnea de
varios organismos, uno de los cuales, causa la enfermedad, mientras que los restantes estn asociados
con carcter saprofito. En este caso es imposible determinar cul de los agentes es el responsable de la
enfermedad, a menos que se aplique la prueba de patogenicidad para verificar los postulados de Koch.
En 1884, Koch postul que para comprobar que un parsito causa enfermedad se debe demostrar que el
parsito y la enfermedad no solo estn correlacionados, sino relacionados en cuanto a causa, la causa
verdica y directa de enfermedad, esto depende de la separacin del patgeno, y su reintroduccin a un
organismo, con la subsiguiente produccin de sntomas, incluyendo la reaparicin del agente causal en
el organismo inoculado.
Los postulados de Koch son los procedimientos normalizados que ponen de manifiesto la relacin
causa efecto entre la enfermedad y el organismo estudiado.
Cuando un patgeno se encuentra en una planta enferma es probable que represente la causa de la
enfermedad, pero si no existen registros anteriores que apoyen esa suposicin; debe demostrarse
mediante los postulados de Koch para comprobar que el patgeno es la causa de la enfermedad.
Koch propuso cuatro postulados:
1 El patgeno debe encontrarse consistentemente asociado con la enfermedad en todas las plantas
enfermas que se examinen.
2 El patgeno debe aislarse y desarrollarse en un cultivo puro en medios nutritivos y se deben
describir sus caractersticas (parsito facultativo), o bien debe permitirse que se desarrolle sobre una
planta hospedante susceptible (parsito obligado) y registrar su presencia y los efectos que produzca.
3 El patgeno que se desarrolle en un cultivo puro debe ser inoculado en plantas sanas de la misma
variedad o especie en que apareci la enfermedad y debe producir los mismos sntomas que en el
campo.
4 El patgeno debe re aislarse en cultivo puro y sus caractersticas deben corresponder a las anotadas
en el segundo punto.
No todos los microorganismos pueden ser cultivados in vitro. Este es el caso de los bitrofos
obligados como los mildius, oidios, royas, los virus, viroides, fitoplasmas y nematodos.
La prueba de patogenicidad se realiza en cinco etapas:
1.
2.
3.
4.
5.

Descripcin de sntomas de la enfermedad.

Cultivo del patgeno en un medio artificial e identificacin.
Inoculacin de una planta sana con el patgeno.
Reproduccin de los sntomas de la enfermedad en la planta inoculada.
Reaislamiento del patgeno.

III. MATERIALES:

IV.

Plntulas sanas de cebolla roja y sanda de 45 das.

Semillas y bulbos de cebolla roja
Sustrato: mezcla de tierra de campo, arena de rio y humus estril en una relacin de 2:1:1
respectivamente.
Bolsas para almacigo de medio kilo
Aguja hipodrmica
Hisopo estril
Pipetas y vaso de precipitado estril

PROCEDIMIENTO:
1. Descripcin de sntomas:
Observe y escriba los sntomas de las plantas de cebolla y sanda enfermas tradas al laboratorio,
examinando minuciosamente todos los rganos.
2. Cmara hmeda y cultivo del patgeno:
Extraiga segmentos de la zona de avance de la enfermedad. Desinfecte en hipoclorito de sodio al
5% o 10% por 5 minutos y enjuague en agua destilada estril por tres veces consecutivas. Seque
colocando los trozos sobre papel absorbente.
Cmara hmeda: El segmento tratado previamente coloque sobre un dispositivo en un recipiente
con papel toalla humedecida e incube a 25C por 5 das examinando diariamente a travs del
estereoscopio.
Cultivo: Realice cortes de aproximadamente 0.5cm. de los segmentos tratados previamente en
condiciones aspticas y coloque sobre la superficie del medio agar PDA + cloranfenicol en cuatro
zonas equidistantes. Incube a 25C hasta el desarrollo completo del patgeno.
Incubacin: Realice montajes a partir del cultivo y cmara hmeda utilizando azul de lactofenol y
observacin microscpica. Identifique el patgeno aislado con el uso de claves de Barnett y Hunter
u otros.
3. Prueba de Patogenicidad en cebolla:
Preparacin del inculo:
- Realice la multiplicacin del inculo sembrando el patgeno aislado de cebollas con
marchitez y decoloracin vascular (Fusarium oxysporum) en agar PDA e incubado a 25C
por 10 das.
- Prepare una suspensin haciendo un lavado y raspado de las esporas del cultivo de
Fusarium oxysporum con 100ml de agua destilada estril y colecte en un vaso de
precipitado.
- Centrifugue a 3500 rpm por 5 minutos y elimine el sobrenadante.
- A partir del sedimento obtenga una suspensin de 105 conidias/ml utilizando la cmara de
Newbauer.
Inoculacin en semillas: (Mtodos por contacto)
- Desinfecte las semillas de cebolla con hipoclorito de sodio al 5% por 5 minutos y enjuague
en agua destilada estril.
- Coloque 5 semillas sobre una placa con cultivo de Fusarium oxysporum de 10 das de
desarrollo. Realice 5 repeticiones.
- Utilice como testigo placas con agar PDA sin el patgeno.
- Incube a 25C por 15 das y realice observaciones diarias a partir del 3er da de incubacin.

- Observe la pudricin a nivel radicular.

Inoculacin en plntulas: (Mtodo por inmersin)
- Hacer 5 punciones a nivel del disco basal de las plntulas.
- Sumerja en una suspensin de 105 conidias/ml de Fusarium oxysporum durante 3 minutos.
- Trasplante en una bolsa de almcigo conteniendo 0.5 Kg. de sustrato estril y riegue a
condicin de campo. Mantenga en condiciones de invernadero.
- Observe diariamente hasta la aparicin de sntomas a nivel del follaje.
- Utilice como testigo plntulas sumergidas en agua destilada estril.
Inoculacin de bulbos: (Mtodo por inmersin)
- Desinfecte los bulbos de cebolla con hipoclorito de sodio al 5% por 5 minutos.
- Hacer 5 punciones a nivel del disco basal del bulbo de la cebolla.
- Sumerja en una suspensin de 105 conidias/ml de Fusarium oxysporum durante 3 minutos.
- Coloque los bulbos en una cmara hmeda e incube a 25C por 10 das.
- Utilice como testigo bulbos de cebolla sumergida en agua destilada estril.
- Observe la presencia de decoloracin del disco basal del bulbo de cebolla.
4. Prueba de Patogenicidad en plntulas de sanda:
Preparacin del inculo:
- Realice la multiplicacin del inculo sembrando el patgeno aislado de plntulas de sanda
con chupadera (Rhizoctonia solani) en agar PDA e incubado a 25C por 5 das.
- Con un hisopo humedecido en agua destilada estril frote levemente la zona del cuello de
la plntula de sanda.
Inoculacin: (Mtodo por contacto)
- Utilizando un sacabocado obtenga dos crculos del cultivo de Rhizoctonia solani y
coloque en la zona del cuello de la plntula de sanda y sujtela utilizando cinta adhesiva.
- Trasplante en bolsas de almcigo conteniendo sustrato estril y realice un riego pesado.
- Mantenga en condiciones de invernadero durante 10 das y observe diariamente la
presencia de sntomas.
- Riegue diariamente si fuera necesario.
- Como testigo se emplear plntulas con crculos de PDA sin el patgeno.
Re aislamiento:
- De las plntulas y rganos inoculados hacer el re aislamiento sembrando porciones de la
zona de avance de la enfermedad desinfectada y enjuagada, sobre el agar PDA mediante la
tcnica en superficie.
5. Resultados:
Si los sntomas son los mismos que los observados en las plntulas enfermas obtenidas de
almcigo y las caractersticas del hongo corresponden al aislado de estas, entonces se dice que tal
hongo es el patgeno causante de la enfermedad.