Guia Bioquimica Abril 2014

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LABORATORIO DE BIOQUMICA I
CARBOHIDRATOS, LPIDOS Y PROTENAS
Dra. Guadalupe Jibaja
SEPTIEMBRE 2014
CONTENIDO
CAPITULO I......................................................................................................................................... 5
1.
CARBOHIDRATOS....................................................................................................................... 5
1.1
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO.......................................5
1.1.1
Reaccin con -Naftol o Prueba de Molisch.................................................................5
1.1.2
Reaccin de Antrona................................................................................................... 6
1.1.3
Prueba con Naftorresorcina......................................................................................... 6
1.2
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES............................7
1.2.1
Prueba con el hidrxido cprico (II), Reaccin de Trommer.........................................7
1.2.2
Reaccin con el licor de Fehling.................................................................................. 8
1.2.3
Reaccin con sales de bismuto, Nylander...................................................................8
1.2.4
Reaccin con Fenilhidrazina........................................................................................ 9
1.2.5
Reconocimiento de la fructosa en disolucin (Reaccin de A. F. Selivnov)...............11
1.2.6
Reaccin de reconocimiento de las pentosas con Orcina (Prueba del bial)...............12
1.2.7
Reaccin con Floroglucina......................................................................................... 13
1.2.8
Reaccin de Barfoed................................................................................................. 14
1.2.9
Prueba de Benedict................................................................................................... 14
1.3
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE DISACRIDOS.....................................................15
1.3.1
Reaccin de reconocimiento de la sacarosa..............................................................15
1.3.2
Hidrlisis cida de la sacarosa.................................................................................. 16
1.3.3
Hidrlisis enzimtica de la sacarosa.......................................................................... 16
1.3.4
Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa.............................................17
1.3.5
Reacciones de reduccin de iones metlicos...........................................................17
1.4
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE POLISACRIDOS..................................................17
1.4.1
ALMIDN: Reacciones coloreadas del almidn..........................................................17
1.4.2
Hidrlisis cida escalonada del almidn....................................................................18
1.4.3
Hidrlisis enzimtica del almidn.............................................................................. 19
1.5
IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES........................20
1.5.1
Preparacin de las muestras a analizar: extraccin de carbohidratos.......................20
1.5.2
Reacciones de identificacin..................................................................................... 20
1.6
PREPARACIN DE REACTIVOS PARA CARBOHIDRATOS......................................................22
CAPITULO II...................................................................................................................................... 24
2.
LIPIDOS................................................................................................................................... 24
2.1
LOS LPIDOS Y SUS METABOLITOS.................................................................................... 24
2.2
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS GRASAS.......................................................24
2.2.1
Reaccin de la grasa y el aceite con el reactivo de Sudn III....................................24
2.2.2
Determinacin de la glicerina en las grasas..............................................................25
2.2.3
Solubilidad de las grasas.......................................................................................... 25
2.2.4
Determinacin de la temperatura de fusin..............................................................26
2.3
DETERMINACION DE LOS INDICES (CONSTANTES) DE LAS GRASAS Y ACEITES.................28
2.3.1
Determinacin del nmero acdico............................................................................ 28
2.3.2
Determinacin del ndice de iodo.............................................................................. 29
2.3.3
Determinacin del nmero (ndice) de saponificacin...............................................30
2.3.4
Determinacin del ndice (nmero) de ster.............................................................31
2.4
EMULSIFICACIN DE LAS GRASAS.................................................................................... 32
2.5
HIDRLISIS DE LOS GLICRIDOS CON LIPASA...................................................................32
2.6
FOSFOLPIDOS.................................................................................................................. 34
2.6.1
Aislamiento de los fosfolpidos.................................................................................. 34
2.6.2
Aislamiento de los fosfolpidos del tejido nervioso....................................................35
2.6.3
Aislamiento del colesterol del tejido nervioso...........................................................36
2.6.4
Reacciones coloreadas del colesterol........................................................................ 36
2.7
PREPARACION DE REACTIVOS PARA LIPIDOS..................................................................... 38
CAPTULO III..................................................................................................................................... 43
3.
PROTEINAS.............................................................................................................................. 43
3.1
ENZIMAS.......................................................................................................................... 43
3.2
PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS....................................................................................... 44
3.2.1
Labilidad trmica de las enzimas.............................................................................. 44
3.2.2
Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas..................................................45
3.2.3
Especificidad de las enzimas.................................................................................... 46
3.2.4
Influencia de los activadores e inhibidores................................................................47
3.3
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS.......................................................48
3.3.1
Determinacin de la actividad de la dehidrogenasa de cido succnico...................48
3.3.2
Determinacin de la actividad de la catalasa en la sangre........................................49
3.3.3
Cuantificacin de Amilasa Pancretica...................................................................... 50
3.3.4
Actividad de anhidrasa carbnica............................................................................. 51
3.4
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTENAS..................................................53
3.5
REACCIONES DE PRECIPITACIN DE LAS PROTENAS........................................................53
3.5.1
Salificacin de las protenas...................................................................................... 53
3.5.2
Precipitacin de las protenas con sulfato amnico...................................................54
3.5.3
Precipitacin reversible de las protenas con sulfato amnico...................................55
3.5.4
Precipitacin de las protenas con cloruro sdico y sulfato de magnesio...................55
3.5.5
Precipitacin de las protenas con iones de metales pesados...................................55
3.5.6
Precipitacin de las protenas con cidos minerales.................................................56
3.5.7
Precipitacin de las protenas con cidos orgnicos..................................................57
3.5.8
Precipitacin de las protenas con alcohol y acetona................................................58
3.6
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTENAS..................................................58
3.6.1
Biuret)
Descubrimiento de los enlaces peptdicos en las molculas de protenas (reaccin del

59
3.6.2
Ensayo de la ninhidrina............................................................................................. 60
3.6.3
Reaccin con el cido pcrico.................................................................................... 61
3.7
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS AMINOACIDOS.........................................62
3.7.1
Ensayo xantoproteico.............................................................................................. 62
3.7.2
Reaccin de la tirosina.............................................................................................. 63
3.7.3
Reaccin del triptfano............................................................................................. 64
3.7.4
Reaccin de la arginina............................................................................................. 64
3.7.5
Reaccin de los aminocidos que contienen azufre..................................................65
3.7.6
Reaccin de reconocimiento del glutatin.................................................................65
3.7.7
Diazorreaccin de reconocimiento de la tirosina, el triptfano y la histidina.............67
3.8
DESCUBRIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO EN LAS PROTENAS.................................67
3.9
PROTEINAS CONJUGADAS................................................................................................. 68
3.9.1
NUCLEOPROTEINAS.................................................................................................. 68
3.9.2
Aislamiento de la desoxirribonucleoprotena.............................................................68
3.9.3
Reacciones de Reconocimiento del ADN...................................................................69
3.9.4
Obtencin de la nucleoprotena a partir de levadura................................................70
3.9.5
Hidrlisis de la nucleoprotena.................................................................................. 70
3.9.6
Deteccin de las protenas sencillas......................................................................... 71
3.9.7
Deteccin de las pentosas........................................................................................ 71
3.9.8
Deteccin de las bases pricas................................................................................. 72
3.9.9
Deteccin del cido fosfrico.................................................................................... 72
3.10
GLICOPROTENAS............................................................................................................. 73
3.10.1
Aislamiento de la mucina de la saliva....................................................................... 73
3.11
PREPARACIN DE REACTIVOS PARA ENZIMAS...................................................................74
3.12
PREPARACION DE REACTIVOS PARA RECONOCIMIENTO DE PROTENAS............................74
BIBLIOGRAFIA.................................................................................................................................. 76
CAPITULO I
1. CARBOHIDRATOS
1.1
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO
1.1.1
Reaccin con -Naftol o Prueba de Molisch
Esta reaccin es general para hidratos de carbono y se aplica para detectar la presencia de estos en
los materiales biolgicos. El quimismo de la reaccin se reduce al hecho de que mediante la accin
del cido sulfrico concentrado se forma furfural a partir de las pentosas; 5-hidroximetilfurfural a partir
de las hexosas
Furfural (Pentosas)
5-Hidroximetilfurfural (Hexosas)
Al combinarse los ltimos con -naftol surge una coloracin violeta caracterstica y al combinarse con
timol, una coloracin roja.
Instrumentos:
Soporte con tubos de ensayo
Reactivos:
-naftol, disolucin al 0,2%

Timol, disolucin al 1% en alcohol etlico
cido sulfrico concentrado
Sacarosa, disolucin al 1%
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 2 mL de disolucin de sacarosa en cada uno. En el primer tubo de
ensayo se aaden de 4 a 6 gotas de disolucin de -naftol y en el segundo tubo, igual cantidad de
disolucin de timol. En ambos tubos de ensayo se vierten con cuidado, por la pared, 1 2 mL de
cido sulfrico concentrado sin mezclarlo con la capa acuosa.
En el contacto con las capas aparece:
una coloracin violeta, en el caso de -naftol y,

una roja, en el caso de timol.
1.1.2
Reaccin de Antrona
La presencia de carbohidratos se pone de manifiesto por la reaccin de la antrona. Esta se basa en la

reaccin hidrolizante y deshidratante de los hidratos de carbono que posee el cido sulfrico
concentrado.
Instrumentos:
Reactivos:
Antrona, disolucin al 0,2% en cido sulfrico concentrado

Disoluciones de carbohidratos
Procedimiento:
A dos 2 mL de disolucin de antrona al 0.2% en cido sulfrico concentrado aadir 0.2 mL de la
solucin problema de carbohidratos, mezclar fuertemente y observar el cambio de color. La aparicin
de un color verde o azul verdoso indica la presencia de carbohidratos.
1.1.3
Prueba con Naftorresorcina
La reaccin se basa en la capacidad de los hidratos de carbono de condensarse con los sistemas
aromticos, formando sustancias coloreadas. As, al cido glucurnico al condensarse con
naftorresorcina, forma derivados de dinaftilmetano o xantina:
Instrumentos:
Reactivos:
Glucosa, disolucin al 5%
Naftorresorcina, disolucin alcohlica al 1%
Acido clorhdrico concentrado
ter o benceno
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 5 a 6 mL de disolucin de glucosa, se aade 1 mL de disolucin
de naftorresorcina y 1 mL de cido clorhdrico concentrado. La mezcla se calienta con cuidado y se
hierve durante 1 min. Luego se enfra, se aade de 1 a 2 mL de ter o benceno y se agita. La capa
etrica (bencnica) se tie de color verde azulado. Igual coloracin dan la galactosa y la manosa,
mientras que la xilosa y la arabinosa proporcionan una coloracin azul oscura y los cidos urnicos,
una coloracin violeta.
1.2
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES
FUNDAMENTO: Los hidratos de carbono cuya molcula contiene un grupo carbonilo libre, se
denominan reductores. Estos azcares en medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse,
reduciendo a su vez las sales de xido cprico (valencia +2) a sales de xido cuproso (valencia +1);
las sales de plata, hasta plata metlica; las sales de xido de bismuto, hasta bismuto metlico. En
esto se basa una serie de mtodos de determinacin cualitativa y cuantitativa de los carbohidratos.
1.2.1
Prueba con el hidrxido cprico (II), Reaccin de Trommer
En disolucin alcalina los mono y disacridos reductores reducen el hidrxido cprico (II) a xido
cuproso (I):
Instrumentos:
Reactivos:
Hidrxido sdico, disolucin al 10%
Sulfato cprico, disolucin al 1%
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de disolucin de glucosa, un volumen igual de disolucin
de hidrxido de sodio y, agitndolo, se aade, gota a gota, la disolucin de sulfato cprico. En
presencia de la glucosa, el precipitado de hidrxido cprico (II) formado se disuelve, coloreando el
lquido de color azul claro. La capa superior del lquido se calienta hasta ebullicin. La aparicin de un
precipitado amarillo (hidrxido cuproso (I)) y luego rojo (xido cuproso) indica que la reaccin de
Trommer es positiva.
En otro tubo de ensayo se mezclan de 2 a 3 mL de disolucin de hidrxido de sodio con varias gotas
de disolucin de sulfato cprico. Disolucin de glucosa no se aade. Se forma un precipitado de
hidrxido cprico de color azul claro. Al calentar esta disolucin, se forma un precipitado negro de
xido cprico.
Por lo tanto, en la reaccin de Trommer debe evitarse el exceso de sulfato cprico, ya que la reaccin
entre el hidrato de carbono reductor y el hidrxido cprico transcurre cuantitativamente. El exceso del
ltimo durante el calentamiento pierde agua y se transforma en xido cprico negro, los que oscurece
la reaccin principal y constituye un defecto del mtodo: Cu (OH) 2 CuO + H2O.
1.2.2
Reaccin con el licor de Fehling
La reaccin con el licor o reactivo de Fehling se basa en el mismo principio que la reaccin de
Trommer. La diferencia consiste en que en las reacciones no se emplea hidrxido cprico libre. Este
ltimo se encuentra en estado combinado y forma parte del reactivo de Fehling.
El licor de Fehling representa un compuesto complejo de cobre con tartrato de sodio y potasio de
color azul. En su composicin el ion cobre en estado de oxidacin +2 se encuentra en forma de un
compuesto complejo con tartratos. Por eso durante el calentamiento, incluso con exceso de reactivo
dado, no se forma el precipitado negro CuO y no oscurece la reaccin con pequeas cantidades de
glucosa.
Instrumentos:

Bao Mara
Reactivos:
Reactivo de Fehling: A y B
Procedimiento:
A 1 2 mL de disolucin de glucosa se aaden igual volumen de reactivo de Fehling y se agita. La
capa superior del lquido se calienta hasta la ebullicin. Aparece, al igual que en la reaccin de
Trommer, un precipitado amarillo de hidrxido cuproso (CuOH) o bien un precipitado rojo de xido
cuproso (Cu2O).
1.2.3
Reaccin con sales de bismuto, Nylander
Para detectar los azcares reductores se emplean frecuentemente las sales de bismuto. En la
composicin del reactivo de Nylander, anlogo al de Fehling, entra nitrato dibsico de bismuto que, en
presencia de hidrxido de sodio, forma hidrxido de bismuto. Este ltimo se encuentra en estado
combinado con el tartrato de sodio y potasio. Al reaccionar con la glucosa, el hidrxido de bismuto se
reduce a bismuto metlico y el lquido adquiere un color negro.
Instrumentos:
Reactivos:
Reactivo de Nylander
Procedimiento:
A 2 mL de disolucin de glucosa se aade 1 mL de reactivo de Nylander y se hierve durante 2 3
min. El lquido oscurece debido a la formacin de un precipitado negro de bismuto metlico.
1.2.4
Reaccin con Fenilhidrazina
Una particularidad importante de los monosacridos consiste en su capacidad de entrar en reaccin

con la fenilhidrazina y formar fenilhidrazonas y osazonas.
La reaccin de formacin de osazonas transcurre en 3 etapas. Al reaccionar los monosacridos con
fenilhidrazina, en la primera etapa se forman fenilhidrazonas solubles en agua (reaccin de
sustitucin). En la segunda etapa, con la fenilhidrazona formada reacciona otra molcula de
fenilhidrazina y, oxidndola, transforma el grupo hidroxilo en grupo carbonilo. La tercera molcula de
fenilhidrazina entra en reaccin de sustitucin con el grupo carbonilo recin formado, lo que conduce
a la formacin de compuestos poco solubles en agua: osazonas, que producen cristales de color
amarillo, de forma caracterstica. La forma de los cristales de osazonas es variable y depende de la
estructura de los monosacridos, de los cuales se forman las osazonas.
Las osazonas de diferentes monosacridos se distinguen por la forma de los cristales, punto de
fusin, solubilidad y actividad ptica. Por eso, estas propiedades se utilizan para aislar los
monosacridos de la disolucin, como tambin para distinguir unos azcares de otros. (Ver figura 1)
Instrumentos:

Bao Mara
Vaso con hielo
Portaobjetos y cubreobjetos
Pipeta
Microscopio
Reactivos:
Mezcla de clorhidrato de fenilhidrazina cristalino y acetato de sodio anhidro (2:3)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de disolucin de glucosa, se aade 0,5 g de mezcla de
clorhidrato de fenilhidrazina y acetato de sodio, se agita y se calienta durante 5 min en el bao Mara
hirviendo. Luego se coloca el tubo de ensayo en el vaso con hielo. Al enfriarse lentamente, de la
disolucin precipitan cristales de osazona. Estos ltimos se observan bajo el microscopio.
Figura 1 Cristales de osazonas de mono y disacridos
Fila superior: Glucosa, galactosa, arabinosa:

Fila inferior: Lactosa, maltosa, xilosa
1.2.5
Reconocimiento de la fructosa en disolucin (Reaccin de A. F. Selivnov)
Esta reaccin se aplica especialmente para el reconocimiento de las cetosas; sobre todo va bien con
la fructosa y con aquellos azcares complejos que por hidrlisis dan fructosa (sacarosa, inulina). La
reaccin se basa en la formulacin del 5-hidroximetilfurfural, mediante el calentamiento de la fructosa
con un cido. El 5-hidroximetilfurfural da con la resorcina (meta-dihidroxibenceno) un producto de

condensacin de color rojo.
Las aldohexosas tambin dan esta reaccin, pero transcurre ms lentamente y en condiciones
especiales (temperatura y acidez del medio).
Instrumentos:

Bao Mara
Reactivos:
Fructosa, disolucin al 1%
Reactivo de Selivnov
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de reactivo de Selivnov, se aaden 2 3 gotas de
disolucin, de fructosa
y se calienta de 1 a 2 min en el bao Mara hirviendo. Se observa la
coloracin roja del lquido. En el caso de ebullicin prolongada, esta reaccin tiene lugar tambin con
la glucosa, maltosa y sacarosa. Por eso, si en la disolucin a investigar estn presentes dichos
hidratos de carbono, la concentracin del cido clorhdrico no deber sobrepasar el 12%. En el
proceso de la reaccin el precipitado y la coloracin debern aparecer no ms tarde que a los 20 30
segundos desde el inicio de la ebullicin.
1.2.6
Reaccin de reconocimiento de las pentosas con Orcina (Prueba del bial)
Bajo la accin del cido clorhdrico concentrado las pentosas, al calentarse, se deshidratan y se
transforman en furfural. Este ltimo se condensa con la orcina (metildihidroxibenceno) en presencia
de trazas de cloruro frrico (+3) y forma un compuesto que da coloracin verde.
Instrumentos:
Reactivos:
Pentosa (arabinosa o xilosa), disolucin al 1%

Reactivo de orcina
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierte 1 mL de disolucin de pentosa e igual volumen de reactivo de orcina.
La mezcla se calienta en el bao Mara hirviendo durante 20 min. Aparece coloracin verde de la
disolucin. La coloracin verde la proporciona tambin los cidos urnicos, pero despus de un
calentamiento ms prolongado.
1.2.7
Reaccin con Floroglucina
Durante el calentamiento de las pentosas con HCl, stas se transforman en furfural, el cual al
condensarse con la floroglucina (trihidroxibenceno), da color rojo guinda.
Instrumentos:

Pipeta
Esptula
Bao Mara
Reactivos:
Pentosa (arabinosa o xilosa), disolucin al 1%

Floroglucina cristalina
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de disolucin de pentosa o una pequea cantidad de
serrn de madera, se aade igual volumen de cido clorhdrico concentrado y varios cristales de
floroglucina. El tubo de ensayo se coloca en el bao Mara caliente.
Durante el calentamiento
aparece una coloracin roja.

1.2.8
Reaccin de Barfoed
El reactivo de Barfoed es dbilmente cido y solamente puede ser reducido por monosacridos. Si se
deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar disacridos dando as reacciones
falsamente positivas. El fundamento radica en la reduccin del acetato cprico a xido cuproso. El
precipitado de xido cuproso es menos denso que en los mtodos previos y se recomienda dejar el
tubo hasta que el precipitado sedimente. El color del xido cuproso es tambin diferente, tendiendo
ms a rojo ladrillo que al pardo naranja obtenido en la prueba de Benedict.
Instrumentos:
Reactivos:
Disoluciones de carbohidratos
Reactivo de Barfoed
Procedimiento:
A 2 mL del reactivo de Barfoed aadir 1 mL de la solucin problema, hervir durante 5 min y dejar
reposar. La aparicin de un precipitado rojo, antes de los 6 min indica la presencia de un
monosacrido. La aparicin de un escaso precipitado rojo, entre 9 y 12 min indica la presencia de
lactosa o maltosa.
1.2.9
Prueba de Benedict.
Una de las reacciones ms comunes en la identificacin de carbohidratos, es la reaccin de Benedict.

Esta reaccin es especifica para azcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los
monosacridos poseen un grupo reductor libre. Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos
reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus
componentes cuando sta es formada. Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu
(2+) en un medio alcalino. Este Cu (1+) se oxida y precipita en forma de Cu 2O, lo que proporciona la
coloracin positiva de la reaccin. La coloracin depender de la concentracin de xido de cobre y
sta a su vez de la reduccin del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo
de la coloracin.
Instrumentos:

Pipetas de varios volmenes
Bao Mara en ebullicin
Reactivos:
Reactivo de Benedict
Soluciones de carbohidratos
Procedimiento:
Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de reactivo de Benedict y 4 5 gotas de solucin del azcar.
Caliente a ebullicin por 5 min y observe el cambio producido durante el calentamiento. Deje enfriar a
temperatura ambiente. Un precipitado cuya coloracin vara entre amarillo, anaranjado, rojo o
verdoso, con decoloracin de la solucin, indica prueba positiva.
1.3
1.3.1
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE DISACRIDOS

Reaccin de reconocimiento de la sacarosa
La sacarosa es un disacrido no reductor y durante la hidrlisis (cida o enzimtica) su molcula se

descompone en glucosa y fructosa:
La sacarosa da con el sulfato de cobalto en un medio alcalino un complejo de color violeta.

Instrumentos:
Reactivos:
Sulfato de cobalto, disolucin al 2%
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 2 a 3 mL de disolucin de sacarosa, se aaden varias gotas de
disolucin de sulfato de cobalto. Al aadir exceso de hidrxido sdico (1 mL), el lquido adquiere un
color violeta.
1.3.2
Hidrlisis cida de la sacarosa
La sacarosa puede ser hidrolizada por un cido o su enzima sacarasa.

Instrumentos:
Soporte de tubos de ensayo

Bao de agua
Reactivos:
Disolucin de sacarosa al 2 %
cido clorhdrico concentrado
NaOH, disolucin al 10 %
Reactivo de Fehling
Procedimiento:
A 2 mL de disolucin de sacarosa al 2 %, aadir 3 a 6 gotas de HCl concentrado. Calentar a ebullicin
durante 5 minutos en Bao Mara, neutralizar con NaOH al 10 %. Realizar la reaccin de Fehling,
observar la aparicin de un precipitado rojo ladrillo debido a la presencia de azcares reductores
(glucosa y fructosa).
1.3.3
Hidrlisis enzimtica de la sacarosa
Instrumentos:
Soporte de tubos de ensayo

Bao de agua
Reactivos:
Disolucin de sacarosa al 2 %
Sacarasa, disolucin al 10%
Reactivo de Fehling
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 a 3 mL de sacarosa y se aaden de 2 a 3 mL de sacarasa. El
contenido del tubo se mezcla y se lleva a incubacin durante 10 min en el bao de agua a 37C.
Colocar al tubo 2 mL de Fehling y se calienta a ebullicin en Bao Mara. Observar la aparicin de un
precipitado rojo ladrillo debido a la presencia de azcares reductores (glucosa y fructosa).
1.3.4
Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa
La maltosa y lactosa son disacridos reductores:
1.3.5
Reacciones de reduccin de iones metlicos
La reaccin positiva con el hidrxido cprico, con el licor de Fehling y las sales de bismuto se explica
por la presencia en las molculas de maltosa y lactosa del grupo aldehdo libre. Las reacciones de
reduccin de los iones metlicos transcurren con los disacridos algo ms lentamente que con los
monosacridos.
Reactivos:
1.4
1.4.1
Maltosa, disolucin al 1%
Lactosa, disolucin al 1%
Lo dems, igual que para el anlisis de los monosacridos
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE POLISACRIDOS

ALMIDN: Reacciones coloreadas del almidn
Una reaccin caracterstica para reconocer el almidn es la aparicin de una coloracin azul al
combinarse con la disolucin de iodo en ioduro potsico. La reaccin de los polisacridos, en
particular del almidn, con iodo es un proceso complejo. La coloracin que aparece depende de la
estructura de polisacrido. En el curso de la reaccin se forma un complejo de polisacrido con yodo.

Este proceso es bien expresado en el caso de la amilosa.
En el caso de polisacridos de cadenas ramificadas, por ejemplo, la amilopectina y el glicgeno, junto
con el proceso de formacin del complejo, tiene gran importancia tambin el proceso de adsorcin de
iodo sobre la superficie de las molculas ramificadas. Se ha demostrado la relacin entre la longitud
de las cadenas laterales y la coloracin resultante de la reaccin con iodo (B. N. Stepanenko).
Instrumentos:
Reactivos:
Almidn, disolucin al 1%
Disolucin de lugol
Alcohol etlico
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 3 mL de disolucin de almidn y se aade 1 gota de disolucin
de Lugol. El lquido se colorea de azul.
El contenido del tubo de ensayo se divide en tres partes:
a la primera parte se aade 1 2 mL de disolucin de hidrxido sdico,

a la segunda, 2 3 mL de alcohol etlico y
la tercera parte se calienta.
La coloracin desaparece siempre. En la tercera muestra la coloracin vuelve a aparecer despus del
enfriamiento. Esto indica que la prueba con iodo debe realizarse slo con disolucin de almidn fra.
Debido a la inestabilidad del complejo de adsorcin entre iodo y almidn, esta reaccin es sensible a
la presencia de alcohol, al calentamiento y a la accin de los lcalis con los cuales el iodo forma
hipoioditos.
1.4.2
Hidrlisis cida escalonada del almidn
En el curso del calentamiento del almidn con cido clorhdrico diluido, l se descompone con la
formacin de los fragmentos de diferente tamao llamados dextrinas. stas se distinguen entre s en
cuanto a la masa molecular y al carcter de la coloracin que surge al tratarlas con la disolucin de
iodo. Ms abajo se
hidrlisis cida del
da el esquema de la
Almidn
HCl diluido, t = 100 C 1 2 min

Amilodextrinas + I2 coloracin violeta azul
Eritrodextrinas + I2 coloracin rojiparda
Acrodextrinas no dan coloracin
Maltodextrinas no dan coloracin
Maltosa no da coloracin
Glucosa no da coloracin
almidn:
Instrumentos:

Pipetas
Reactivos:
cido clorhdrico concentrado
Disolucin de Lugol
Papel de tornasol
Licor de Fehling
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 8 a 10 mL de disolucin de almidn y se aaden 8 gotas de HCl
concentrado. Se mezcla cuidadosamente y se hierve a fuego abierto. Luego de 1 2 minutos iniciada
la ebullicin se toma una muestra para la reaccin con yodo. Para esto se extraen varias gotas de
disolucin con una pipeta y se vierten en un tubo de ensayo que contenga 5 6 mL de agua
destilada, se aaden 1 2 gotitas de disolucin de Lugol. La coloracin violeta azul aparecida indica
la presencia de las amilodextrinas en la disolucin. El tubo de ensayo con la disolucin de almidn se
hierve 1 2 minutos ms y se repite la misma prueba con yodo; aparece una coloracin rojiparda
condicionada por la presencia de las eritrodextrinas. Se hierve nuevamente la disolucin y pasado los
2 3 minutos se repiten las pruebas con iodo. El almidn se desintegra al final hasta glucosa,
produciendo como productos intermedios acrodextrinas, maldodextrinas y maltosa. La reaccin con
iodo ser negativa: cuando el lquido adquiere un color amarillo a cuenta de la coloracin de la
disolucin de Lugol.
El hidrolizado de almidn se neutraliza, segn un papel de tornasol, con disolucin de hidrxido
sdico, se aade el licor se Fehling y se calienta. Se forma un precipitado amarillo de hidrxido
cuproso, o rojo, de xido cuproso, lo que indica la presencia en la disolucin de productos de la
hidrlisis que poseen propiedades reductoras.
1.4.3
Hidrlisis enzimtica del almidn
Bajo la influencia de la enzima amilasa el almidn se desdobla con la formacin de un disacrido, la

maltosa, que luego se descompone por la maltasa hasta la glucosa.
Instrumentos:
Pipetas
Bao Mara con termmetro
Reactivos:
Preparado de saliva (1 2 mL de saliva se coloca en un vaso y se diluyen 5 veces con agua
destilada, se mezclan cuidadosamente)

Amilasa comercial
Los dems reactivos son los mismos que en el experimento anterior
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten de 1 mL de disolucin de almidn, al primer tubo se aade 2 mL
de saliva, se mezcla cuidadosamente, al tubo dos se aade 1 mL de amilasa comercial. Ambos tubos
se llevan a bao Mara durante 10 o 15 minutos a una temperatura de 37 a 40 C.
Se hacen repetidamente las pruebas con yodo, la ausencia de la coloracin caracterstica demuestra
que la hidrlisis ha finalizado. La presencia de la glucosa se confirma por la reaccin positiva con el
color de Fehling.
1.5
IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES
1.5.1
1.5.1.1
Preparacin de las muestras a analizar: extraccin de carbohidratos

A partir de frutas
Quitar la corteza de una manzana, licuar con 50 mL de agua destilada, filtrar y conservar el extracto
para reacciones de identificacin de carbohidratos.
1.5.1.2
A partir de leche
A 20 mL de leche aadir gotas de limn o 1/8 de pastilla de cuajo, dejar reposar hasta que se
produzca separe el suero de la leche por accin del cido o de la enzima que contiene la pastilla de
cuajo, centrifugar, el suero sirve para las reacciones de identificacin de carbohidratos.
1.5.1.3
A partir de tusa de maz
Rallar finamente la tusa de maz, y suspenderla en 10 mL de agua.

1.5.1.4
Jarabe de maz
Licuar los granos de un choclo tierno con 250 mL de agua destilada.

1.5.2
Reacciones de identificacin
Instrumentos:

Bao de agua
Pipetas
Reactivos:
1.5.2.1
-naftol o timol
Reactivo de Selivnov
Reactivo de Benedict
Reaccin de Molisch
Esta es una reaccin cualitativa que sirve para determinar la presencia de carbohidratos en una
muestra desconocida.
En 9 tubos de ensayo correctamente identificados, colocar 2 mL de las siguientes sustancias:
glucosa, lactosa, sacarosa, filtrado de manzana, arabinosa, suero de leche, jarabe de maz y almidn.
Se aade 1 2 mL de -naftol o timol y luego se adiciona cido sulfrico concentrado. La presencia
de carbohidratos se detecta por la aparicin de un anillo de color violeta en el caso del -naftol y rojo
en el caso del timol. El anillo aparece en la interfase.
1.5.2.2
Reaccin de Benedict
Mezclar 1 mL de muestra (todos los extractos y las soluciones indicadas para la reaccin de Molisch)
ms 1 mL de reactivo de Benedict, calentar el tubo en bao de agua hirviente, si se produce un
precipitado rojo ladrillo, la reaccin es positiva para azcares reductores.
1.5.2.3
Reaccin de Selivnov
En 6 tubos de ensayo colocar 2 mL de Selivnov aadir 5 gotas de distintas soluciones a cada uno.
Calentar por 2 minutos en bao de agua hirviente y observar la coloracin roja del lquido. Las
cetosas dan positivo mximo hasta los 2 minutos. Las aldosas necesitan mayor tiempo para que se
produzca la reaccin.
1.6
PREPARACIN DE REACTIVOS PARA CARBOHIDRATOS

-NAFTOL 0.2 %
Disolver 0.5 g de -naftol en 50 mL de alcohol etlico.
TIMOL 1 %
Disolver 1 g de timol en 100 mL de alcohol etlico.
NAFTORRESORCINA 1 %
Disolver 1 g de naftorresorcina en 100 mL de alcohol etlico.
REACTIVO DE LA ANTRONA 0.2 % y H2SO4
Disolver 0.1 g de antrona en 2.5 mL de etanol absoluto y llevar a un volumen final de 50 mL con
H2SO4 al 75 % agitar con mucho cuidado. Preparar en el momento y conservar a 4 C en frasco
mbar.
REACTIVO DE FEHLING
FEHLING A: Disolver 34.65 g de cristales no aireados de CuSO 4.5H2O en una porcin de agua
destilada y llevar este volumen a 500 mL.
FEHLING B: Disolver 173 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) en una porcin de agua
destilada, se aaden 62.5 g de sosa custica disuelta en 100 mL de agua destilada; mezclar bien
estas dos soluciones y llevar a 500 mL.
REACTIVO DE NYLANDER
Disolver 2 g de nitrato dibsico de bismuto y 4 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) en

100 mL de sosa custica al 10% y se hierven hasta disolver la mayor parte de la sal de bismuto. El
precipitado formado se enfra y se separa por filtracin.
REACTIVO DE SELIVNOV
Se disuelven 0.05 g de resorcina en 100 ml de cido clorhdrico al 20%, conservar en un frasco

mbar.
REACTIVO DEL BIAL
Disolver 1.5 g de orcinol en 500 mL de HCl concentrado, agregar a esta solucin 20 a 30 gotas de
FeCl3 al 10 %. Guardar el reactivo en frasco mbar.
REACTIVO DE ORCINA
Se prepara disolviendo 0,2 g de orcina en 100 mL de cido clorhdrico al 30% y aadiendo 0,1 g de
cloruro frrico.
REACTIVO DE BARFOED
Disolver 13.3 g de acetato de cobre en aproximadamente 200 mL de agua destilada y agregar 1.8 mL
de cido actico glacial. Filtrar si es necesario. Este reactivo no se lo debe guardar.
REACTIVO DE BENEDICT
Consta de 3 soluciones:
Solucin 1: pesar 100 g de NaCO3 anhidro y disolver en 200 mL de agua destilada hervida.
Solucin 2: pesar 175 g citrato de sodio y disolverlo en 200 mL de agua destilada hervida.
Solucin 3: Pesar 17.3 g de CuSO4.5H2O y disolverlo en 300 mL de agua destilada hervida.
Mezclar las tres soluciones cuando estn fras. Aforar a 1 L con agua destilada hervida.
REACTIVO DE LUGOL
En 100 mL de agua destilada se disuelven 20 g de yoduro de potasio y 10 g de yodo. Para le reaccin

con el almidn, la disolucin obtenida se diluye con agua destilada en proporcin 1:5.
CAPITULO II
2. LIPIDOS
2.1
LOS LPIDOS Y SUS METABOLITOS
Se denomina lpidos un grupo numeroso de sustancias constituidas como los steres y caracterizadas
por su solubilidad en disolventes orgnicos y por su insolubilidad en agua. A ellos pertenecen los
glicridos (grasas), las ceras, los esteroles (estearinas), fosfolpidos y glicolpidos (cerebrsidos,
ganglisidos).
Los lpidos desempean un papel muy importante en calidad de componentes estructurales de las
membranas celulares, como fuente de energa, disolvente para las sustancias orgnicas y como
precursores de otros componentes de la clula (vitaminas del grupo D, cidos biliares y hormonas de
naturaleza de esteroides).
En el organismo de los animales casi todos los lpidos se encuentran en complejo con las protenas,
los hidratos de carbono y otras sustancias.
2.2
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS GRASAS
2.2.1
Reaccin de la grasa y el aceite con el reactivo de Sudn III
Las grasas se colorean en rojo anaranjado por el colorante denominado Sudn III. El colorante Sudn
III se aplica en las investigaciones histolgicas para localizar las grasas en los tejidos.
Instrumentos:
Vidrio reloj o placas de vidrio

Reactivos:
Sudn III, disolucin al 0,2%

Aceite vegetal
Procedimiento:
PARTE 1: Sobre el vidrio de reloj se aplica una gota de aceite, se aade una gota se Sudn III y se
mezcla. Se observa la aparicin de una coloracin naranja de la mezcla.
PARTE 2: En un tubo de ensayo colocar 2 mL del aceite, aadir 4 a 5 gotas del reactivo de Sudn III,
agitar el tubo y dejar reposar. Se observa que todo el aceite aparece teido cuya coloracin es rojoanaranjado.
2.2.2
Determinacin de la glicerina en las grasas
En el curso del calentamiento de una grasa en presencia de agentes deshidratantes, en particular, de

hidrosulfatos de potasio o sodio se desprenden fcilmente de la glicerina dos molculas de agua, y
ella se convierte en acrolena, que es un aldehdo no saturado.
La reaccin de formacin de la acrolena se hace con el propsito de reconocer la glicerina libre o

ligada en la molcula de grasa. Los lpidos que no contienen glicerina (ceras, esterinas,
inositolfosfolpidos y esfingolpidos) dan reaccin de acrolena negativa.
Instrumentos:

Mechero de gas o infernilla
Reactivos:
Grasa o aceite vegetal

Cera de abeja
Hidrosulfato potsico (sdico), cristalino
Procedimiento:
El experimento debe realizarse en la campana de humos. En un tubo de ensayo se vierten 8 a 10
gotas de aceite, en el otro se pone de 0,3 a 0,5 g de cera. En ambos tubos se aade
aproximadamente 1 g de hidrosulfato potsico. La mezcla en los tubos de ensayo se calienta, con
cuidado pero fuertemente. La formacin de la acrolena en el
tubo de ensayo con la grasa se
reconoce por la aparicin de un olor caracterstico, acre intenso. En el otro tubo de ensayo no se
forma acrolena.
2.2.3
Solubilidad de las grasas
Las grasas son insolubles en agua; cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequesimas
gotitas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece por
reposo. Por el contario las grasas son solubles en disolventes orgnicos como ter, benceno, xilol,
cloroformo, etc.
Instrumentos:
Reactivos:
Aceite de girasol
Alcohol etlico
Compuestos orgnicos: benceno, cloroformo, acetona hexano
Procedimiento:
En 6 tubos de ensayo se vierten 5 a 7 gotas de aceite de girasol. En el primer tubo se aaden 2 mL
de agua, en el segundo 2mL de alcohol, en el tercero 2 mL de benceno, en el cuarto 2 mL de
cloroformo, en el quinto 2 mL de acetona y en el sexto 2 mL de hexano. La mezcla de los tubos de
ensayo se agita enrgicamente. Se observan los siguientes cambios: en el primer tubo se forma una
emulsin inestable que se separara rpidamente; en el segundo, una disolucin turbia, que indica la
mala solubilidad del aceite en alcohol; en el tercero, cuarto, quinto y sexto tubos de ensayo se forman
disoluciones transparentes debido a una buena solubilidad del aceite en estos disolventes.
Tabla 2-1 Solubilidad de los lpidos
Solvente
Lpido
2.2.4
Determinacin de la temperatura de fusin
La temperatura de fusin de una grasa es uno de los indicadores que permite, en cierta medida,
juzgar sobre su asimilamiento. Las grasas que funden a baja temperatura se emulsifican ms
fcilmente y, en consecuencia, se asimilan con mayor facilidad.
La temperatura de fusin de los glicridos es condicionada por sus cidos grasos constituyentes.
Como regla, el punto de fusin de la grasa es tanto ms bajo, cuanto ms alto es el contenido de los
cidos de cadena corta o no saturados.
A la temperatura ambiente las grasas de origen vegetal son lquidos, puesto que en su composicin la
cantidad de cidos grasos no saturados alcanza un 95 97%. En la composicin de las grasas
slidas poco fusibles de origen animal prevalecen los cidos grasos de cadenas de carbono largas.
Las grasas naturales no poseen un punto de fusin determinado, ya que no son sustancias qumicas
individuales, sino mezcla de diferentes glicridos, cidos grasos libres, pigmentos, vitaminas y otras
sustancias.
La temperatura de fusin de las grasas depende de la especie del animal y oscila dentro de los lmites
siguientes:
Especie
Ovejas
Venados
Temperatura de fusin (C)

49 54
48 52
Ganado vacuno
Cabras
Camellos
Cerdos
Caballos
Perros
Conejos
48 50
46 48
36 48
37 45
28 32
23 27
22--25
Instrumentos:
Capilar de vidrio de 1,5 2 mm en dimetro

Termmetro
Tubo de ensayo
Vaso de precipitacin
Lupa
Reactivos:
Grasa de origen animal (fundida y filtrada)

Manteca de cacao
Cera de abeja
Mantequilla o margarina
Procedimiento:
El capilar limpio y seco se llena de grasa a una altura de unos 2 cm y se mantiene durante 1h sobre
hielo o en agua corriente fra. Terminando el enfriamiento, la parte del capilar llenada de grasa se
corta, dejando la columna de grasa de 0,5 cm de altura. El capilar se ajusta mediante un anillo de
goma en la parte inferior del termmetro de tal manera que su punta llena de grasa sea dirigida hacia
arriba y su otro extremo libre de grasa, hacia abajo. El termmetro con capilar se mete en el tubo de
ensayo donde se ajusta con ayuda de un tapn. El tubo de ensayo se sumerge en el vaso con agua y
se sujeta en la patilla del soporte en posicin vertical. El nivel de agua en el vaso debe ser ms alto
que el trmino superior del capilar. El agua se calienta poco a poco, removindola frecuentemente, y
a travs de la lupa se observa el aumento de la temperatura y el estado de la columna de grasa en
los capilares. La indicacin del termmetro en el momento cuando la grasa empiece a fluir por el
capilar y en la parte superior de este ltimo se forme un espacio libre, se anota como la temperatura
de fusin.
Entre el inicio y el final de la transicin de la grasa desde el estado slido al lquido transcurre cierto
tiempo. Por lo tanto, para evitar errores, la temperatura de fusin de la grasa se determina por lo
menos dos veces, y el resultado se calcula como promedio.
2.3
DETERMINACION DE LOS INDICES (CONSTANTES) DE LAS GRASAS Y ACEITES
Sobre la naturaleza y la calidad de una grasa se puede juzgar a partir de sus constantes fsicas y
qumicas o sus nmeros (ndices), las constantes fsicas de las grasas ms importantes son sus
temperaturas de fusin y de endurecimiento y la viscosidad; entre las qumicas se destacan:
nmero acdico o ndice de acidez

ndice de yodo
nmero o ndice de acetilo (ndice de ster) y
nmero o ndice de saponificacin.
2.3.1
Determinacin del nmero acdico
El nmero acdico caracteriza la presencia de cidos grasos libres en la grasa. El nmero acdico se
expresa en cantidad de mg de hidrxido de potasio necesarios para neutralizar los cidos grasos
libres contenidos en 1 g de grasa o aceite.
El ndice es uno de los indicadores ms importantes de la calidad de la grasa. El nmero acdico de la
grasa fresca de distintos tipos no sobrepasa, comnmente, una magnitud de 1,2 a 3,5. En el curso de
almacenaje de la grasa tiene lugar la hidrlisis de los glicridos y acumulacin de los cidos grasos
libres. Una elevada acidez de una grasa indica la prdida de su calidad.
Instrumentos:
Balanza analtica
Matraz Erlenmeyer 250 mL
Bureta
Pipetas de 1 y 10 mL
Reactivos:
Aceite de girasol
Mezcla neutralizada de alcohol con ter
Hidrxido potsico, 0,1 N
Fenolftalena, disolucin 0,1%
Procedimiento:
En el matraz erlenmeyer se vierte 1 g de aceite de girasol, se aaden 10 mL de mezcla de alcohol
con ter, el contenido se agita cuidadosamente. Se agregan 2 3 gotas de fenolftalena, y la
disolucin se valora rpidamente con la disolucin de hidrxido potsico 0,1 N, con agitacin
vigorosa, hasta la aparicin de una coloracin rosa que persista ms de 1 minuto.
El nmero acdico se calcula segn la frmula:
x=
a5,6K
c
Donde: x es el nmero acdico, en mg

a es el volumen de KOH 0,1 N consumido para la valoracin de la muestra, en mL
5,6 es la cantidad de hidrxido potsico (mg) que contiene 1 mL de disolucin de KOH;
K es el coeficiente de correccin de la disolucin KOH 0.1 N
c es la muestra pesada de aceite, en g
2.3.2
Determinacin del ndice de iodo
Se denomina ndice de iodo la cantidad de g de iodo que pueden combinarse con 100 g de grasa.
Este nmero permite evaluar el grado de no saturacin de la grasa provocada por la presencia de
glicridos con cidos grasos de dobles enlaces, la capacidad de la grasa para la oxidacin, para la
reduccin y otras reacciones. Cuando mayor es el contenido de cidos grasos no saturados en la
grasa, tanto mayor es su ndice de iodo.
El ndice de iodo de algunas grasas y aceite oscila dentro de los siguientes lmites:
Grasa/Aceite
Res
Carnero
Cerdo
Aceite de girasol
Aceite de camo
Aceite de linaza
ndice de iodo
27 - 47
31 - 46
46 - 66
129 - 136
145 - 162
175 - 201
Principio del mtodo: La determinacin del ndice del iodo se basa en la reaccin de adicin del
iodo al lugar de ruptura de los dobles enlaces en las molculas de cidos grasos, que se verifican
cuantitativamente segn el esquema:
El iodo que no ha reaccionado se valora con tiosulfato.

Instrumentos:
Balanza analtica
Matraces erlenmeyer de 50 mL con tapones
Bureta
Pipeta volumtrica de 10 mL
Reactivos:
Aceite de girasol
Cloroformo
Iodo, disolucin 0,1 N en alcohol
Tiosulfato sdico, disolucin 0,1 N
Procedimiento:
En un matraz (prueba experimental) se pone 0,1 de aceite de girasol (se pesa en una balanza
analtica), en el otro (prueba de control) 0,1 mL de agua, y se aaden de la bureta 5 mL de cloroformo
en cada uno. Cuando la muestra de aceite se disuelta, en los matraces se aaden 10 mL con la
pipeta (Exactamente!) de disolucin 0,1 N de iodo en alcohol, los matraces se cierran con tapones, el
contenido se remueve agitndolo, y los matraces se dejan en la oscuridad.
Al cabo de 5 min las pruebas se evalan, valorando con disolucin de tiosulfato sdico 0,1 N, primero
hasta que la coloracin se ponga amarilla clara, y luego, al aadir 1 mL de disolucin de almidn al
1%, hasta la fase incolora.
El ndice de yodo (x, g) se calcula segn la frmula.
x=
( ba )K0.01269
100
c
Donde:
b volumen de tiosulfato sdico 0,1 N, consumidos en la valoracin de la prueba de control,
en mL
a volumen de tiosulfato sdico 0,1 N consumidos en la valoracin de la prueba
experimental, en mL
K es el coeficiente de correccin del ttulo de la disolucin 0,1 N de tiosulfato sdico
0,01269 es la cantidad de iodo (g) equivalente a 1 mL de tiosulfato sdico 0,1 N
100 es el coeficiente de recuento para los 100 g de grasa
c es la muestra pesada de grasa, g.
2.3.3
Determinacin del nmero (ndice) de saponificacin
Nmero de saponificacin se denomina el nmero de mg de hidrxido potsico que se necesitan para

neutralizar todos los cidos grasos (libres y ligados en forma de glicridos) que se contienen en 1 g
de grasa o aceite.
El nmero de saponificacin de algunos aceites y grasas de buena calidad tiene los valores
siguientes:
Grasa
Grasa de buey
Grasa de carnero
Manteca de cerdo
Manteca de vaca
Aceite de linaza
ndice de saponificacin
190 - 200
192 - 198
193 - 200
212 - 247
187 - 195
Instrumentos:
Balanza analtica
Bao Mara
Matraces Erlenmeyer de 50 mL con refrigerantes de reflujo
Bureta
Pipetas graduadas de 1 mL
Reactivos:
Aceite de girasol
Hidrxido potsico, disolucin alcohlica 0,5 N
cido clorhdrico, disolucin 0,5 N
Fenolftalena, disolucin al 0,1%
Procedimiento:
En un matraz (prueba experimental) se pone 0,5 g aceite de girasol, en el otro (prueba de control) 0,5
mL de agua, y en cada uno se aaden con la bureta 15 mL de disolucin alcohlica de hidrxido
potsico 0,5 N.
A los matraces se conectan los refrigerantes de reflujo, y la mezcla se calienta con agitacin gentil en
el bao Mara hasta la ebullicin dbil durante 30 40 min.
Terminada la saponificacin, a cada matraz se le aaden 4 gotas de fenolftalena en cada uno, y su
contenido se valora con disolucin de cido clorhdrico 0,5 N hasta la desaparicin de la coloracin de
rosa.
El nmero de saponificacin se determina segn la frmula:
x=
( ba )K28.05
c
Donde: x es el nmero de saponificacin, g

b volumen de HCl 0,5 N consumido en la valoracin de la prueba de control, mL
a volumen de HCl 0,5 N consumido en la valoracin de la prueba experimental, mL
28,05 es la cantidad de KOH en mg que corresponde a 1 mL de HCl 0,5 N
K el coeficiente de correccin del ttulo de la disolucin de HCl 0,5 N
c es la muestra pesada de grasa, g
2.3.4
Determinacin del ndice (nmero) de ster
Se denomina nmero de ster el nmero de miligramos de hidrxido potsico que se necesita para
neutralizar los cidos grasos formados en el curso de la saponificacin de 1 g de grasa.
Este nmero se determina por la diferencia entre el nmero de saponificacin de la grasa y su
nmero acdico.
2.4
EMULSIFICACIN DE LAS GRASAS
A la accin de las enzimas del tracto gastrointestinal y de los tejidos son accesibles las grasas que se
encuentran en estado emulsificado. En el tacto gastrointestinal existen las condiciones para
transformar las grasas en emulsin, y los estabilizadores (emulsionantes) principales de sta son las
sales de cidos biliares, las protenas, los fosfolpidos, jabones e hidrocarbonatos de metales
alcalinos. Las molculas de los emulsionantes se adsorben en la capa exterior de las gotitas de grasa
y disminuyen bruscamente la tensin superficial en el contacto de las fases, lo que se traduce en un
aumento de la estabilidad de la emulsin. Cuando ocurre esto, los grupos hidrfobos se disuelven en
la grasa, favoreciendo a su atomizacin en gotas menudas, esto es, a la emulsificacin.
Instrumentos:
Reactivos:
Aceite de girasol
Bilis diluida dos veces
Disolucin de protena
Jabn, disolucin al 1%
Hidrocarbonato sdico disolucin al 1%
Lecitina
Procedimiento:
Se toma 6 tubos de ensayo. En los dos primeros tubos se vierte 1 mL de agua, en el tercero 1 mL de
bilis, en el cuarto 1 mL de disolucin de protena, en el quinto 1 mL de disolucin de jabn, en el sexto
1 mL de disolucin de hidrocarbonato sdico. En el segundo tubo de ensayo se introduce un pedacito
de lecitina. En cada tubo de ensayo se aaden 5 gotas de aceite de girasol, los tubos se agitan
enrgicamente y se dejan en reposo durante 5 min. En todos los tubos, menos en el primero, se
forman emulsiones estables.
2.5
HIDRLISIS DE LOS GLICRIDOS CON LIPASA
En el organismo las grasas se digieren bajo la accin de una enzima, la lipasa, que se contiene en los
jugos gstricos, del pncreas y de los intestinos. La lipasa cataliza el desdoblamiento hidroltico de las
grasas en glicerina y cidos grasos libres:
En ste proceso desempean un papel importante los cidos biliares que no slo participan en la
emulsificacin y adsorcin de las grasas, sino que tambin activan la lipasa.
El principio del mtodo. Sobre la actividad de la enzima se juzga por el incremento en el medio de
incubacin de los cidos grasos libres que se liberan en el curso de la descomposicin de la grasa
por la lipasa pancretica. La concentracin de los cidos grasos libres se determina mediante la
valoracin con hidrxido sdico por la fenolftalena.
Instrumentos:
Vasos qumicos de 50 mL
Matraces Erlenmeyer de 250 mL
Pipetas de 1, 2 y 10 mL
Termostato ajustado a 38C
Bureta
Reactivos:
Leche hervida y diluida dos veces

Extracto de pncreas (lipasa)
Bilis diluida dos veces
Fenolftalena, disolucin al 0.1%
Hidrxido sdico, disolucin 0,01 N.
Procedimiento:
En dos vasos se pone 10 mL de leche y 1 mL de extracto de lipasa en cada uno. En uno de ellos se
aade 1 mL de agua, en el otro 1 mL de bilis (para activar la lipasa), y el lquido se mezcla
rpidamente aspirndolo con la pipeta y dejndolo derramarse. De cada vaso se toman 2 mL de
mezcla y se traslada en matraces para valoracin, se aaden 2 gotas de fenolftalena y se valora con
la disolucin de hidrxido sdico 0,01 N hasta la aparicin de una coloracin rosada dbil. La mezcla
que se qued en los vasos se incuba en el termostato a 38C. Tras cada 15 min, de los vasos se
toman 2 mL de mezcla y se valoran del modo descrito anteriormente.
Resultado de las valoraciones pueden anotarse en la tabla.
Tiempo de
toma de las
pruebas para
la valoracin
Cantidad de hidrxido sdico 0.01 N, mL

Prueba sin bilis
Prueba con bilis
Consumida en la
Neutralizada por
Consumida en la
Neutralizada por
valoracin
los cido grasos
valoracin
los cido grasos
La cantidad de lcali consumida para la neutralizacin de los cidos grasos libres formados en el
curso de la hidrlisis de la grasa se determina por la diferencia entre los resultados de la primera y las
siguientes valoraciones.
Basndose en los datos obtenidos se traza el grfico de la accin de la lipasa en el tiempo, con y sin
bilis. En el eje de abscisas del grfico se pone el tiempo y en el eje de ordenadas el nmero de mL de
disolucin de NaOH 0,01 N consumida en la valoracin de los cidos grasos libres formados
mediante un intervalo de tiempo determinado.
2.6
FOSFOLPIDOS
Los fosfolpidos componen uno de los grupos importantes de sustancias semejantes a las grasas
ampliamente distribuidas en las clulas de los tejidos en el organismo animal. Son esteres complejos
de alto peso molecular en cuya composicin entran alcoholes de distintas clases, cidos grasos
saturados y no saturados, acido fosfrico y una base nitrogenada.
Su frmula general es la siguiente:
Los fosfolpidos, junto con las protenas, son los principales componentes de las membranas de las
clulas y de sus organelas. Los fosfolpidos se distinguen por su capacidad de disolverse en
solventes orgnicos.
2.6.1
Aislamiento de los fosfolpidos
Unos objetos cmodos para el aislamiento y el estudio de la composicin qumica de los fosfolpidos
son el tejido nervioso, la yema de huevo, el hgado, la leche, donde ellos se encuentran en
considerable cantidad.
2.6.1.1
Aislamiento de las lecitinas de la yema de huevo
Instrumentos:
Vaso qumico
Soporte con tubos do ensayo
Embudos
Filtros de papel
Varilla de vidrio
Reactivos:
Yema de huevo
Alcohol etlico, al 96%
Acetona.
Procedimiento:
En el vaso se pone la mitad de una yema, se aaden 20 mL de alcohol caliente y se mezcla con una
varilla de vidrio. La mezcla se enfra y se filtra en un tubo de ensayo seco. Al ser turbio el extracto, la
filtracin se repite.
Para detectar la lecitina en el filtrado, en un tubo de ensayo seco se vierten 5 rnL de acetona y se le
aade, gota a gota, el filtrado obtenido. La aparicin de turbidez indica precipitacin de lecitina. En el
otro tubo de ensayo seco se vierten 3 mL de filtrado y se aade, gota a gota, "agua. Se forma una
emulsin estable. El filtrado que queda se utiliza para otras reacciones de reconocimientos de las
lecitinas.
2.6.2
Aislamiento de los fosfolpidos del tejido nervioso
Instrumentos:
Balanza de torsin
Mortero de porcelana
Arena de cuarzo
Matraz erlenmeyer
Embudos
Filtros de papel
Desecador
Reactivos:
Cerebro de animal
ter dietlico
Acetona
Procedimiento:
El tejido cerebral (de 3 a 4 g) se homogeniza en el mortero con arena de cuarzo, se le aade volumen
5 veces mayor de ter y se extraen en frio los fosfolpidos durante un tiempo de 24 a 48 h. Luego la
disolucin etrica se filtra en un matraz erlenmeyer y al filtrado transparente se le aade un volumen
triple de acetona. La lecitina precipitada se separa por filtracin, se lava con acetona y se seca en el
desecador sobre cido sulfrico. La lecitina obtenida se protege de la oxidacin en tubos de ensayo
soldados.
2.6.3
Aislamiento del colesterol del tejido nervioso
Instrumentos:
Estufa
Mortero de porcelana
Placa de vidrio
Esptula
Embudos
Filtros de papel
Reactivos:
Sesos de un animal, desmenuzados en una picadora de carne

Cloroformo
Yeso
Procedimiento:
3 g de cerebro desmenuzados se trituran cuidadosamente en el mortero con 6 g de yeso. La masa
espesa obtenida se aplica con la ayuda de la esptula sobre la placa de vidrio en una capa fina y se
seca en el armario secador a 40C. La masa reseca se separa de la placa en un mortero seco y se
tritura convirtindola en polvo. El polvo se traslada a un tubo de ensayo, se le vierten 6 mL de

cloroformo, se agita cuidadosamente durante 5 min y se filtra. El filtrado obtenido se utiliza para las
reacciones coloreadas de reconocimiento del colesterol.
2.6.4
Reacciones coloreadas del colesterol
El principio del mtodo. Bajo la accin de los agentes deshidratantes el colesterol se transforma en
un hidrocarburo con dobles enlaces conjugados: el colesterileno, que al interaccionar con el cido
sulfrico y el anhdrido actico, da compuestos complejos intensivamente coloreados. Reacciones
semejantes son caractersticas tambin para otros esteroles.
Instrumentos:
Reactivos:
2.6.4.1
Colesterol: extracto en cloroformo

cido actico glacial
Anhdrido actico
Reaccin con el cido sulfrico (Reaccin de Schiff)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo seco se vierte 1 mL de extracto de colesterol en cloroformo y con cuidado, por
la pared, se hace deslizar 1 mL de cido sulfrico concentrado. En el contacto de los lquidos se
observa la aparicin de un anillo de color rojo.
2.6.4.2
Reaccin con el cido sulfrico (Reaccin de Salkovsky)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo seco se vierten 1 mL de extracto de colesterol en cloroformo y 1 mL de cido
sulfrico, los lquidos se mezclan agitando el tubo de ensayo. Al separarse las capas, el estrato
superior de cloroformo resulta coloreado de rojo y el inferior de un color amarillento con fluorescencia
verde. Si al estrato inferior de lquido se le aade 1 mL de cido actico glacial, aparece una
coloracin roja rosada, mientras que la fluorescencia se mantiene.
2.6.4.3
Reaccin con el anhdrido actico y cido sulfrico (Reaccin de Liebermann

Burkhardt)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de extracto de colesterol en cloroformo, se aaden 10 gotas de

anhdrido actico, 2 gotas de cido sulfrico, y se mezcla todo cuidadosamente. El lquido adquiere
primero una coloracin roja, luego una violeta, azul y, por ltimo, verde.
2.7
PREPARACION DE REACTIVOS PARA LIPIDOS

REACTIVO SUDAN III
Disolver 200 mg del reactivo Sudn III en 100 mL de alcohol etlico al 70 % calentado en bao Mara,
mezclar y dejar en reposo durante 24 horas.
MEZCLA NEUTRALIZADA DE ALCOHOL CON ETER
Mezcla de alcohol con ter 1:2 que se neutraliza con disolucin 0.1 N de hidrxido de potasio segn
la fenolftalena, hasta la aparicin de una coloracin rosa plida que persista 30 segundos.
HIDROXIDO DE POTASIO 0.1 N
Clculo del peso de KOH p.a. necesario para preparar 1 litro de solucin 0.1 N:
N=
g soluto
peq KOHV ( L )
g soluto=Npeq KOHV (L)

g soluto=0.156.111
g soluto=5.611
Pesar 5.611 g de KOH p.a y aforar a 1 L con agua descarbonatada.

NORMALIZACION DEL KOH
Para valorar el hidrxido de potasio (sodio) se emplea ftalato cido de potasio.
Clculo del peso de KHF p.p. necesario para que reaccione con 15 mL de KOH 0.1 N:
meq KHF= meq KOH
meq KHF=15 mL( 0.1 N )

meq KHF=1.5 meq
g KHF =meq KHFpfg KHF
g KHF =
1.5204.23
1000
g KHF =0.3063
PROCEDIMIENTO:
Se procede a secar una cantidad suficiente de ftalato cido de potasio grado patrn primario durante
2 horas a 110 C, despus de transcurrido este tiempo enfriar en el desecador.
Pesar varias muestras de 0.7 a 0.8 g en erlenmeyers y disolver en 5075 mL de agua destilada.
Aadir dos gotas de fenolftalena, valorar con el KOH hasta que el color rosa del indicador persista
durante 30 segundos. Calcular la normalidad de la base.
CALCULO DE LA NORMALIDAD DEL KOH A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS.
N=
g KHF
peq KHFV ( L )KOH empleada
peq KHF=204.23 g
HIDROXIDO DE POTASIO ALCOHLICA 0.5 N

Clculo del peso de KOH p.a. necesario para preparar 1 litro de solucin 0.5 N:
N=
g soluto
peq KOHV ( L )
g soluto=Npeq KOHV (L)

g soluto=0.556.111
g soluto=28.1
Pesar 30 g de KOH p.a, disolver en 30 mL de agua destilada, aforar a 1 L con alcohol etlico al 96 %;
al cabo de 24 horas la solucin se filtra.
ACIDO CLORHIDRICO 0.1 N
Clculo del volumen de HCl al 36 % P/P y = 1.18 g/cm 3 necesario para preparar 1 L de HCl 0.1 N
N=
g soluto
peq KOHV ( L )
g soluto=Npeq HClV (L)
g soluto=0.136.451
g soluto=3.645 g HCl puro
36 g HCl puro 100 g solucin HCl concentrado

3.645 g HCl
X= 10.125 g
m
V
V=
10.125
1.18
V =8.58 mL
Tomar con una pipeta 8.6 mL de HCl concentrado y llevar a volumen de 1 L.

VALORACION DEL HCl 0.1 N
Los cidos se valoran con cantidades conocidas de Na2CO3.
Clculo del peso de Na2CO3 patrn primario necesario para que reaccione con 23 mL de HCL 0.1 N
meq Na2 CO3 = meq H Cl

meq Na 2 CO3 =23 mL( 0.1 N )
meq Na2 CO3 =2.3 meq
g Na2 CO3 =meq Na2 CO3pfg Na2 CO3

g Na 2 CO3 =
2.3106
2000
g Na2 CO3 =0.1219
PROCEDIMIENTO:
Se procede a secar una cantidad suficiente de carbonato de sodio grado patrn primario durante 2
horas a 110 C, despus de transcurrido este tiempo enfriar en el desecador.
Pesar varias muestras de 0.20 a 0.25 g en erlenmeyers y disolver en 50 mL de agua destilada.
Aadir en cada erlenmeyer 3 gotas de indicador verde de bromocresol, valorar con el HCl hasta que
la solucin comience a cambiar de color, de azul a verde.
Hervir la solucin por 2 a 3 minutos, enfriar a la temperatura ambiente y completar la titulacin.
Calcular la normalidad del cido.
CALCULO DE LA NORMALIDAD DEL HCl A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS.
N=
g Na 2 CO 3
peq Na 2 CO3V ( L )HCl empleada
peq Na2 CO3 =53 g
ACIDO CLORHIDRICO 0.5 N

Clculo del volumen de HCl al 36 % P/P y = 1.18 g/cm 3 necesario para preparar 1 L de HCl 0.5 N
N=
g soluto
peq KOHV ( L )
g soluto=Npeq HClV (L)

g soluto=0.536.451

18.225 g HCl
X= 50.625 g
m
V
V=
50.625
1.18
V =42.90 mL
Tomar con una pipeta 43.0 mL de HCl concentrado y llevar a volumen de 1 L. Para realizar la
valoracin del cido, se procede de la misma forma que se realizada para el HCl 0.1 N.
FENOLFTALENA 0.1 %
Se pesan 0.1 g de fenolftalena y se lleva a 100 mL con alcohol etlico 96%.

IODO 0.1 N EN ALCOHOL
Se pesan 12.691 g de iodo recin sublimado y se disuelven en 1 L de alcohol etlico al 96 %.
TIOSULFATO SDICO 0.1 N
Clculo del peso de Tiosulfato de sodio p.a. necesario para preparar 1 L de Na 2S2O3 0.1 N:
N=
g soluto
peq Na2 S 2 O 3V ( L )
g soluto=Npeq Na2 S 2 O3V ( L)

g soluto=0.1248.181
g soluto=24.818
Se pesan 25.0 g de tiosulfato de sodio y se aforan a 1 L, la solucin preparada se la conserva en un

frasco mbar.
NORMALIZACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO FRENTE A DICROMATO DE POTASIO.
Desecar una cantidad adecuada de dicromato de potasio, a 110 C durante dos horas.
Dejar enfriar en el desecador.
Pesar varias muestras de 0.2 a 0.23 g de dicromato de potasio en erlenmeyers, y disolverlos en 80
mL de agua que contiene 2 g de KI.
Aadir 20 mL de HCl 1 M y colocar en un lugar oscuro durante 10 minutos.
Al terminar este tiempo proceder a titular con el Na 2S2O3 preparado, en presencia de almidn hasta la
aparicin de una coloracin blanquecina. Calcular la normalidad de la solucin.
CALCULO DE LA NORMALIDAD Na2S2O3 CON LOS DATOS OBTENIDOS
N=
g K 2 Cr 2 O71000
mL Na2 S2 O 349.032
ACIDO CLORHIDRICO 1 M
Clculo del volumen de HCl al 36 % P/P y = 1.18 g/cm 3 necesario para preparar 1 L de HCl 1 M
M=
M=
Moles soluto
V ( L )soluci n
moles=
g soluto
PM soluto
g soluto
PM solutoV ( L )soluci n
g soluto=MPM HClV ( L)
g soluto=136.451

36.45 g HCl
X= 100.25 g
m
V
V=
100.25
1.18
V =85.80 mL
Tomar con una pipeta 85.80 mL de HCl concentrado y llevar a volumen de 1 L. Para realizar la
valoracin del cido, se procede de la misma forma que se realizada para el HCl 0.1 N.
DISOLUCION DE PROTENA
Disolucin de clara de huevo (de tres huevos de gallina) que se prepara mezclando las claras de
huevo con 700 mL de agua destilada y 300 mL de disolucin saturada de cloruro de sodio con
posterior filtracin a travs de varias capas de gasa.
JABON 1%
Se pesa 1 g de jabn y se lleva a 100 mL
HIDROCARBONATO DE SODIO 1 %
Pesar 1 g de hidrocarbonato de sodio y aforar a 100 mL con agua destilada.
LECITINA
En un vaso se pone la mitad de una yema, se le aaden 20 mL de alcohol caliente y se mezcla con
una varilla de vidrio. La mezcla se enfra y se filtra en un tubo de ensayo seco. Al ser turbio el
extracto, la filtracin se repite.
EXTRACTO DE PNCREAS
1g de pancreatina comercial se disuelve en 100 mL de disolucin de hidrocarbonato sdico al 0,4%.
CAPTULO III
3. PROTEINAS
Las protenas son polmeros biolgicos de alto peso molecular. Ellas se forman de 20 residuos de
aminocidos, y de 2 amidas de aminocido dicarboxlico (asparagina y glutamina). Las protenas son
los componentes ms importantes de las clulas de todos los tejidos animales.
Ellas desempean diferentes funciones en el organismo:
sirven de material estructural fundamental en la clula

catalizan todas las reacciones del metabolismo en los tejidos (enzimas, hormonas)
desempaan un papel protector (anticuerpos)
junto con los cidos nucleicos participan en la transferencia gentica de los indicios, producen
energa al oxidarse los aminocidos, etc.
3.1
ENZIMAS
Las enzimas son protenas que catalizan todas las reacciones bioqumicas. Un catalizador es una
sustancia que disminuye la energa de activacin de una reaccin qumica. Al disminuir la energa de
activacin, se incrementa la velocidad de la reaccin.
La mayora de las reacciones de los sistemas vivos son reversibles, es decir, que en ellas se
establece el equilibrio qumico. Por lo tanto, las enzimas aceleran la formacin de equilibrio qumico,
pero no afectan las concentraciones finales del equilibrio.
Tipo de enzimas
Hidrolasas
Isomerasas
Ligasas
Liasas
Actividad
Catalizan reacciones de hidrlisis. Rompen las biomolculas con molculas
de agua. A este tipo pertenecen las enzimas digestivas.
Catalizan las reacciones en las cuales un ismero se transforma en
otro, es decir, reacciones de isomerizacin.
Catalizan la unin de molculas.
Catalizan las reacciones de adicin de enlaces o eliminacin, para
producir dobles enlaces.
Catalizan reacciones de xido-reduccin. Facilitan la transferencia de
Oxidorreductasas
electrones de una molcula a otra. Ejemplo: la glucosa, oxidasa cataliza la

oxidacin de glucosa a cido glucnico.
Tansferasas
Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a otra. Ejemplo:

la transmetilasa es una enzima que cataliza la transferencia de un grupo
metilo de una molcula a otra.
3.2
PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
3.2.1
Labilidad trmica de las enzimas
La temperatura del medio influye mucho en la actividad de las enzimas. La temperatura ptima para
la accin de las enzimas es la temperatura del cuerpo de los animales que oscila en el intervalo de 36
a 41C. Con cierto aumento de la temperatura del medio ocurre aceleracin de la reaccin a
consecuencia de la activacin de las molculas de sustrato. A la vez, incluso un aumento pequeo de
la temperatura conduce al debilitamiento de los enlaces que mantienen la conformacin de la
molcula de enzima, necesaria para la manifestacin de su actividad cataltica.
Empieza, gradualmente, la desnaturalizacin de la enzima que se acelera bruscamente a la
temperatura que sobrepase 50C. La inactivacin de la enzima con aumento de temperatura del
medio es irreversible. Al bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad tambin.
El mecanismo de este proceso no est claro. Sin embargo, el enfriamiento no causa
desnaturalizacin de la enzima y por lo tanto su inactivacin puede ser reversible.
Principio del mtodo.- Se investiga la influencia del cambio de la temperatura del medio exterior
sobre la actividad de la enzima amilasa de la saliva.
Instrumentos:

Vaso de 50 mL
Termostato (37C)
Vaso con hielo
Reactivos:
Saliva diluida (se enjagua la boca con agua destilada y luego, tomar en la boca de 20 a 25 mL
de agua, y colectar en un vasito)

Amilasa comercial, en disolucin
Cloruro sdico, disolucin al 0.3%
Almidn, disolucin al 1% en disolucin de cloruro sdico al 0.3%
Reactivo de Lugol
Procedimiento:
En 3 tubos de ensayo se vierten 2 o 3 mL de saliva diluida (amilasa comercial) en cada uno. La saliva
en el tubo 1 se hierve durante 1 2 min. Luego en todos los tubos se aaden de 4 a 5 mL de
disolucin de almidn. Los tubos 1 y 2 se colocan en le termostato a 37C, donde se mantienen
durante 10 minutos. El tubo 3 se sumerge en hielo y se mantiene durante 10 min.
Al transcurrir este tiempo, en cada tubo se aade 10 lambdas de reactivo de Lugol. Los resultados del
experimento se anotan en la tabla de labilidad trmica de las enzimas y sacar conclusiones.
Tabla 1: LABILIDAD TRMICA
N tubo
3.2.2
Condiciones del
Enzima
experimento
Sustrato
Incubacin
Amilasa
Enzima desnaturalizada
Almidn
10 min, 37C
Amilasa
Enzima nativa
Almidn
10 min, 37C
Amilasa
Enzima nativa
Almidn
10 min, 0C
Coloracin
con Iodo
Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas
Para cada enzima existe un ptimo del pH a que se crean las condiciones ms favorables para el
mantenimiento de la conformacin funcionalmente activa de la molcula. Los grupos amino y
carboxlico de los restos de aminocidos, ionizados a una magnitud de pH determinada, participan en
el mantenimiento de la conformacin de la molcula protenica necesaria para la formacin de los
centros catalticos de enzima y favorecen tambin a su ligacin con el sustrato. A una magnitud de pH
distinta se altera la ionizacin de los grupos correspondientes, y como resultado se rompen los
enlaces que se aseguran la formacin de los centros catalticos, y la enzima se inactiva. A los calores
de pH muy altos o muy bajos las enzimas se desnaturalizan.
Principio del mtodo.- Se investiga la actividad de la enzima amilasa de la saliva a diferentes
magnitudes de pH del medio.
Instrumentos:

Pipetas
Termostato 37C
Reactivos:
Disoluciones amortiguadoras: pH 5,0; pH 6,8 y pH 8,0

Reactivo de Lugol
Procedimiento:
En 3 tubos de ensayo se vierten de 2 a 3 mL de disoluciones amortiguadoras de distintos pH (5,0; 6,8
y 8,0). En todos los tubos se aaden de 2 a 3 mL de amilasa comercial y de 4 a 5 mL de disolucin de
almidn, se mezcla y se incuba durante 10 minutos en el bao de agua a 37C. Luego, en cada tubo
se aade 10 lambdas de reactivo de Lugol.
Los resultados de la observacin se anotan en la tabla que indica la influencia del pH sobre la
actividad de la amilasa.
Tabla 2: INFLUENCIA DEL pH
N tubo
Enzima
pH
Sustrato
Incubacin
Amilasa
5,0
Almidn
10 min, 37C
Amilasa
6,8
Almidn
10 min, 37C
Amilasa
8,0
Almidn
10 min, 37C
3.2.3
Coloracin con
Iodo
Especificidad de las enzimas
Las enzimas se distinguen de los catalizadores inorgnicos por su especificidad excepcionalmente

alta. La etapa inicial del acto cataltico consiste en la formacin del complejo enzima-sustrato, es
decir, la ligacin del sustrato con el centro cataltico de la enzima.
La conformacin espacial del centro e sustrato debe estar en la correspondencia geomtrica exacta
con la estructura de la molcula de sustrato. Solamente en este caso es posible la formacin del
complejo enzima-sustrato y el cumplimiento de la funcin cataltica de la enzima. De tal modo, la
esencia de la especificidad de las enzimas consiste en el hecho que el sustrato le corresponde a la
enzima, como una llave a cerradura.
Principio del mtodo.- Se investiga la influencia de las enzimas amilasa y sacarasa sobre diferentes
sustratos: el almidn y la sacarosa.
Instrumentos:

Pipetas
Termostato (37C)
Reactivos:
Sacarasa, disolucin 10 %
Reactivo de Lugol
Reactivo de Fehling
Procedimiento:
En los tubos de ensayo 1 y 2 se vierten de 4 a 5 mL de disolucin de almidn, en tubos de ensayo 3 y
4, de 4 a 5 mL de disolucin de sacarosa. En los tubos 1 y 3 se aaden de 2 a 3 mL de amilasa
comercial, y en los tubos 2 y 4, de 2 a 3 mL de disolucin de sacarasa. El contenido de los tubos de
ensayo se mezcla y se incuba durante 10 min en el termostato a 37C. Luego en los tubos de ensayo
1 y 2 se aade 10 lambdas de reactivo de Lugol, en cada uno y en los tubos de ensayo 3 y 4, de 1 a 2

mL de reactivo de Fehling y se calienta.
Las observaciones se anotan en la tabla la especificidad de las enzimas amilasa y sacarasa.
Tabla 3: ESPECIFICIDAD ENZIMATICA
No. de
Sustrato
Enzima
Incubacin
Almidn
Amilasa
10 min, 37C
Almidn
Sacarasa
10 min, 37C
Sacarosa
Amilasa
10 min, 37C
Sacarosa
Sacarasa
10 min, 37C
tubo
3.2.4
Coloracin
Reaccin de
con Iodo
Fehling
Influencia de los activadores e inhibidores
La regulacin de la actividad de las enzimas se realiza, tanto en la clula como fuera de ella,
mediante la fijacin sobre la molcula de enzima de una serie de sustancias de bajo peso molecular.
Tales sustancias pueden causar efectos positivos o negativos.
Agentes que causan efecto positivo, o activadores, al adicionarse a la molcula de precursor no
activo, son capaces de cambiar su conformacin dando lugar a la formacin de un compuesto que
posea una actividad cataltica.
La funcin de activadores se cumple, con frecuencia, por iones de metales y algunos aniones. Accin
depresiva de los agentes que causan efecto negativo (inhibidores) se realiza mediante la alteracin
de la conformacin nativa de la enzima. Inhibidores pueden ser las sales inorgnicas, los metabolitos,
las hormonas. El lugar de fijacin del agente ala molcula de enzima se denomina centro alostrico.
Principio del mtodo.- Se investiga la actividad de la amilasa de saliva en presencia de sustancias
que poseen propiedades de los agentes positivos y negativos.
Instrumentos:

Pipetas
Termostato a 37C
Reactivos:

Cloruro sdico, disolucin al 1%
Reactivo de Lugol
Procedimiento:
En 2 tubos de ensayo se vierten de 4 a 5 mL de disolucin de almidn. En el tubo 1 se aaden de 1 a

2 mL de disolucin de cloruro sdico, en el tubo 2 de 1 a 2 mL de disolucin de sulfato cprico. En
ambos tubos se aaden de 1 a 2 mL de saliva diluida (amilasa), el contenido se mezcla y se incuba
durante 10 min en termostato a 37C. Luego en cada tubo se aade 10 lambdas de reactivo de Lugol.
En otros 2 tubos de ensayo se vierten de 4 a 5 mL de disolucin de sacarosa. En el tubo 1 se aaden
de 1 a 2 mL de disolucin de cloruro sdico, en el tubo 2 de 1 a 2 mL de disolucin de sulfato cprico.
En ambos tubos se aaden de 1 a 2 mL de sacarasa, el contenido se mezcla y se incuba durante 10
min en termostato a 37C, trascurrido este tiempo se realiza la prueba de azcares reductores
(Fehling).
Las observaciones se anotan en la tabla que indica la influencia del cloruro sdico y el sulfato cprico
sobre la actividad de la amilasa y sacarasa:
Tabla 4: INFLUENCIA DE LOS ACTIVADORES E INHIBIDORES
N
Enzima
Agente
Sustrato
Incubacin
Amilasa
NaCl
Almidn
10 min, 37C
Amilasa
CuSO4
Almidn
10 min, 37C
Sacarasa
NaCl
Sacarosa
10 min, 37C
Sacarasa
CuSO4
Sacarosa
10 min, 37C
tubo
3.3
Coloracin
Prueba azcares
con Iodo
reductores
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
3.3.1
Determinacin de la actividad de la dehidrogenasa de cido succnico.
La deshidrogenasa de cido succnico (succinato deshidrogenasa) es una enzima que cataliza la

oxidacin del cido succnico. De coenzima sirve el dinucletido de flavin-adenina (FAD). En las
clulas la enzima est unida establemente con la membrana de mitocondrias. La enzima reducida
devuelve fcilmente el hidrgeno cuyo aceptor pueden ser los colorantes aptos para la reduccin.
Principio del Mtodo: El hidrgeno que se desprende del cido succnico bajo la influencia de la
enzima deshidrogenasa, reduce al azul de metileno (AM) transformndolo en un compuesto incoloro
(AMH2).
Instrumentos:
Mortero con pistilo

Arena de vidrio
Pipetas
Termostato (50C)
Reactivos:
Msculo fresco (desmenuzado en picadora de carne)

cido succnico, disolucin al 3%
Azul de metileno, disolucin acuosa al 0.001%
Aceite de vaselina o aceite vegetal
cido Tricloroactico, disolucin al 20%
Procedimiento:
En el mortero se tritura cuidadosamente, con la arena de vidrio, aproximadamente 1 g de tejido de
msculo desmenuzado, aadiendo 3 a 4 mL de disolucin de acido succnico. La masa
homogeneizada obtenida se reparte en dos porciones iguales que se ponen en dos tubos de ensayo.
En el tubo de ensayo 1 (de control) se aade 1 mL de disolucin de cido tricloroactico para destruir
la enzima. En el tubo de ensayo 2 (experimental) la enzima es activa. En ambos tubos se aade 1 2
gotas de disolucin de azul de metileno, se mezcla y sobre la superficie del lquido se vierte de 0.5 a 1
mL de aceite para aislar del oxgeno del aire. Ambos tubos de ensayo se incuban en el bao Mara a
50C durante 10 minutos. Al pasar este tiempo, en el tubo de ensayo 2 se observa la decoloracin del
azul de metileno.
3.3.2
Determinacin de la actividad de la catalasa en la sangre
Cierta parte de hidrgeno transferido por el sistema de enzimas de oxidacin-reduccin puede

combinarse con el oxgeno directamente, formando el perxido de hidrgeno, una sustancia
venenosa para las clulas. La enzima catalasa, descomponiendo el perxido de hidrgeno, protege
las clulas de la accin daina de este compuesto:
Particularmente sensible a la accin oxidante del perxido de hidrgeno es la hemoglobina, por lo

tanto la catalasa de eritrocitos tiene una importancia especial en el organismo. La variacin de la
actividad de la catalasa ocurre durante el embarazo, en la etapa inicial sta disminuye, en los ltimos
meses aumenta.
Principio del mtodo: De ndice de actividad de la enzima sirve el desprendimiento del oxgeno
molecular que se forma en la descomposicin del perxido de hidrgeno por la catalasa de la sangre.
Instrumentos:

Pipetas
Reactivos:
Sangre entera, tratada con citrato

Perxido de hidrgeno, disolucin al 3 %
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten de 2 a 3 mL de agua destilada, se aade 1 2 gotas de sangre, y
el contenido del tubo de ensayo 1 (de control) se calienta hasta la ebullicin para destruir la enzima.
En el tubo de ensayo 2 (experimental) la enzima permanece activa. En ambos tubos de ensayo se
aade 1 mL de disolucin de perxido de hidrgeno. En el tubo de ensayo 2 se observa un
desprendimiento tempestuoso del oxgeno.
3.3.3
Cuantificacin de Amilasa Pancretica
La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce en las glndulas salivales y en la porcin
exocrina del pncreas. Su accin es romper los enlaces alfa 1-4 glucosdicos de los polisacridos
como el almidn y el glucgeno. Se eleva en procesos inflamatorios pancreticos, en procesos
infecciosos u obstructivos del tracto gastrointestinal, as como en las parotiditis y paperas. Cuando el
pncreas est enfermo o inflamado, se libera amilasa en la sangre.
Fundamento del mtodo: En este mtodo el sustrato, almidn tamponado se incuba con la
muestras, producindose la hidrlisis enzimtica, esta se detiene al agregar el reactivo de yodo que al
mismo tiempo produce color con el almidn no hidrolizado. La disminucin de color respecto al de un
sustrato control (sin muestra) es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en Unidades
Amilolticas (UA/dL), comparables con las Unidades Sacarognicas (Somogy/dL).
Instrumentos:
Tubos vacutainer (Tapa roja)
Jeringuilla 3 cc y torniquete
Pipetas y micropipetas
Espectrofotmetro con cubetas de espectrofotmetro
Bao Mara 37 C
Centrfuga
Reactivos:
Almidn tamponado: solucin de almidn 500 mg/L, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0.1
mol/L en NaCl 0.15 mol/L.

Solucin de iodo: 0.01 eq/L de iodo en cido clorhdrico 0.02 mol/L.
Procedimiento:
Se lo puede realizar en suero u orina, en caso de usar suero se procede de la siguiente manera:
1. Obtener 3 mL de sangre por puncin venosa
2. Centrifugar a 10000 r.p.m. por 10 minutos

3. En un tubo limpio separar el suero
4. En dos tubos marcados como Control (C) el uno y Desconocido (D) el otro, coloque 1 mL de
sustrato
5. Deje en reposo durante 5 minutos en bao de agua a 37 C.
6. Agregue en el tubo Desconocido (D) 20 L de suero.
7. Mezcle e incube ambos tubos a 37 C durante 7 minutos y medio exactos.
8. Agregue en ambos tubos 1 mL de reactivo de yodo.
9. Retire los tubos del bao Mara y mezcle por agitacin suave.
10. Agregue 8 mL de agua destilada a cada tubo.
11. Mezcle por inversin.
12. Lea en un fotocolormetro con filtro rojo o un espectrofotmetro a 640 nm de longitud de onda,
llevando a cero el equipo con agua destilada.
13. Transforme a absorbancia las lecturas obtenidas.
Clculos:
Amilasa
UA CD
=
1000
dL
C
Valores Referencia:
En Suero (UA/dL) y orina (UA/hora) condicin clnica:
3.3.4
Normal: menos de 120 y menos de 260

Pancreatitis aguda, de 300 a 1200, y ms de 900
Pancreatitis crnica, hasta 200, y ms de 300
Parotiditis 200 a 350 y de 350 a 750
Parotiditis y pancreatitis, ms de 350 y ms de 750
Procesos abdominales agudos sin pancreatitis, normal y normal.
Actividad de anhidrasa carbnica
La anhidrasa carbnica, una metaloprotena que contiene zinc, es una enzima que permite la
hidratacin del CO2 metablico para formar Acido Carbnico, as como la reversibilidad de este
proceso:
La anhidrasa carbnica se encuentra en los eritrocitos, en las clulas de los tbulos renales, en la
mucosa gstrica, en la corteza suprarrenal, siempre, catalizando el tipo de reaccin descrita. El
plasma no contiene anhidrasa carbnica.
El papel de esta enzima es fundamental para el transporte de CO2 desde los tejidos hacia los
pulmones, indirectamente la enzima influye en el mantenimiento del pH sanguneo, ya que las cuotas
necesarias de bicarbonato son promovidas a partir del Acido Carbnico.
La cistina, el glutatin y la histidina, activan la accin enzimtica de la Anhidrasa Carbnica. Por

desnaturalizacin trmica esta enzima se inactiva en forma irreversible; a bajas temperaturas detiene
su actividad, que la recobra a la temperatura del medio. La zona ptima de temperatura oscila entre
25 y 40 C.
Instrumentos:
Tubos de ensayo de 20 mL
Vaso de precipitacin con hielo
Proveedor de CO2
Cronometro
Termmetro
Pipetas de 5 a 10 mL
Reactivos:
Indicador (azul de bromofenol al 0.04 %)
Solucin de cloruro de sodio al 0.9 % (Solucin fisiolgica)
Bicarbonato de sodio al 5 %
Anticoagulante
Agua destilada
Procedimiento:
-
Extraiga 3 mL de sangre y virtalos en un tubo de ensayo que contenga anticoagulante,

Mezcle por inversin y lleve luego a centrifugar por 10 minutos para separar el plasma.
Retire cuidadosamente el plasma y deje en el tubo de ensayo la fraccin globular, vierta sobre
los glbulos 5 mL de solucin fisiolgica y lleve a centrifugacin.
Retire el sobrenadante y aada sobre la fraccin globular 10 mL de agua destilada para

conseguir hemlisis (el agua destilada es hipotnica al eritrocito).
Tome un tubo de ensayo con 15 mL de agua destilada y disponga en el 0.1 mL del

hemolizado. Rotule el tubo problema.
En otro tubo de ensayo con 15 mL de agua destilada disponga 0.1 mL del plasma inicial.
Rotule el tubo testigo.
Lleve los dos tubos a baja temperatura (vasos de precipitacin con hielo) hasta los 4 C,
aadiendo antes 1 mL de indicador azul de bromofenol a cada tubo; la solucin toma color
azul.
Saque del bao de hielo los tubos y aada a cada uno de ellos 0.5 mL de solucin de
bicarbonato de sodio al 5 %.
Mezcle por inversin.
Haga burbujear CO2 en el tubo problema controlando cuidadosamente el tiempo en que se

produzca el cambio de color (al verde) en la solucin. Anote el tiempo, repita lo mismo con el
tubo testigo.
Fundamento: La hidratacin del CO2 por la accin de la enzima, se puede demostrar burbujeando
CO2 en una solucin de bicarbonato que contenga un indicador.
NOTA: Como las enzimas se destruyen rpidamente, es necesario extraer y manipular la sangre con
rapidez y cuidado.
Reaccin Qumica:
3.4
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTENAS
Todas las reacciones de reconocimiento de las protenas se basan en la presencia en ellas de ciertos
grupos qumicos, de ciertos enlaces o en las propiedades fsico-qumicas.
Las reacciones de reconocimiento de las protenas pueden ser divididos en dos grupos
independientes: reacciones de precipitacin y reacciones coloreadas.
Las reacciones de precipitacin de las protenas pueden dividirse en dos subgrupos: la precipitacin
de las protenas sin su desnaturalizacin (sales de los metales pesados, temperatura, cidos
minerales y orgnicos, reactivos de reconocimiento de los alcaloides).
3.5
3.5.1
REACCIONES DE PRECIPITACIN DE LAS PROTENAS

Salificacin de las protenas
En el curso de estas reacciones las protenas precipitadas no se someten a las alteraciones

profundas, y los precipitados de las protenas obtenidos (gel) pueden ser disueltos de nuevo en el
mismo disolvente de partida (transformacin en sol). Las macromolculas de las protenas en este
caso, conservan sus propiedades iniciales (nativas) y no sufren variaciones considerables
(desnaturalizacin).
La precipitacin reversible de las protenas se logra por adicin a las disoluciones acuosas, de las
sales neutras de los metales alcalinos o sales amnicas. A tales sales pertenecen las sustancias
siguientes:( NH4)2SO4, NH4 Cl, Na2SO4, NaCl, KCl, etc. El mecanismo de accin de estas sales sobre
la partcula coloidal se reduce a la adsorcin, sobre esta ltima, de los iones con carga opuesta. De
esta manera, la partcula protenica se vuelve elctricamente neutra (sucede la anulacin de la carga),
lo que resulta en la disminucin de su estabilidad en la disolucin. Adems, las sales de los metales
alcalinos, al disolverse, enlazan grandes cantidades de agua, par concentraciones elevadas, esto
provoca la deshidratacin de las partculas coloidales y las priva del segundo factor de la estabilidad
del estado de agregacin, su envoltura de hidratacin. Las protenas se precipitan.
Este mtodo de precipitacin de las protenas, es decir, la precipitacin por iones de las sales de
metales alcalinos, se denomina salificacin. Los precipitados de las protenas (gel) obtenidos por
salificacin pueden ser disueltos de nuevo al disminuir la concentracin de las sales mediante dilisis
o por disolucin en agua. De esta manera, la salificacin de las protenas es un proceso reversible.
Como es sabido, las protenas de los tejidos son heterogneas con respecto a su masa molecular, y
esta dispersin de la masa molecular se usa para su separacin fraccionada empleando las sales de
diferente concentracin.
Las disoluciones concentradas de sulfato amnico salifican casi todas las protenas. Por ejemplo,
todas las fracciones de globulinas se precipitan anta la semisaturacin de la disolucin de protenas
con sulfato amnico, mientras que las albminas se precipitan con una saturacin absoluta.
Los cloruros de sodio y potasio, as como el sulfato de magnesio, precipitan las globulinas en estado
de saturacin: con acidulacin dbil (en punto isoelctrico) estas sales precipitan tambin las
albminas, y en este caso se utilizan disoluciones de ms baja concentracin.
3.5.2
Precipitacin de las protenas con sulfato amnico.
Instrumentos:

Embudo con filtro
Reactivos:
Suero de sangre o disolucin de clara de huevo

Sulfato amnico, disolucin saturada
Sulfato amnico en forma de cristales desmenuzados finamente
Hidrxido sdico, disolucin al 10 %
Sulfato cprico, disolucin al 1 %
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 3 mL de suero de la sangre o de disolucin diluida de clara de
huevo, se aade igual volumen de disolucin saturada de sulfato amnico y se agita. Se precipitan
unas protenas: las globulinas. Luego de 5 7 min, el contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el
filtrado quedan las albminas y sobre el filtro, las globulinas.
Para precipitar las albminas, al filtrado se le aade sulfato amnico cristalino hasta la saturacin
completa, es decir, hasta que quede un polvo no soluble. Se precipitan las albminas que se separan
por filtracin.
Con 2 3 mL de filtrado se hace la reaccin de Biuret. La reaccin negativa indica la ausencia de
protenas en el filtrado y la plenitud de la precipitacin.
El precipitado de albminas junto con el filtro se traslada a un tubo de ensayo y se disuelve en 4 5
mL de agua, agitando el tubo de ensayo.
La disolucin de albminas se filtra; con ella se hace la reaccin de Biuret.
3.5.3
Precipitacin reversible de las protenas con sulfato amnico
Los instrumentos y reactivos son los mismos que en el experimento anterior.

Procedimiento:
En el tubo de ensayo se vierten 2 3 mL de suero de la sangre o clara de huevo diluida. Se agregan
2 3 mL de disolucin saturada de sulfato amnico y se agita. Se precipitan protenas. Entonces se
aade igual volumen de agua destilada, se mezcla bien y se observa la desaparicin paulatina del
precipitado de protenas.
3.5.4
Precipitacin de las protenas con cloruro sdico y sulfato de magnesio
Instrumentos:
Los mismos que en experimento en la precipitacin con sulfato amnico.
Reactivos:
Cloruro sdico cristalino

Sulfato de magnesio cristalino
cido actico, disolucin al 1 %
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 2 3 mL de suero de la sangre o clara de huevo diluida en cada
uno. En uno de los tubos de ensayo se aade, hasta la saturacin completa, el cloruro sdico y en el
otro, el sulfato de magnesio. Al cabo de 2 3 min en ambos tubos aparece el precipitado de
globulinas. El contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el filtrado quedan las albminas que en
disoluciones neutras no son precipitadas por dichas sales incluso con saturacin completa.
Al filtrado se le aaden 4 6 gotas de disolucin de cido actico al 1 %, entonces, las albminas se
precipitan. Al pasar 5 min, estas se filtran. Por medio de la reaccin del Biuret se comprueba la
ausencia de las protenas en el filtrado.
3.5.5
Precipitacin de las protenas con iones de metales pesados.
Bajo la influencia de los iones de las sales de metales pesados (Pb, Cu, Ag, Hg, etc.), las protenas
desde el estado de sal coagulan irreversiblemente en gel. Los iones de las sales de metales pesados
forman con las protenas compuestos complejos estables. Adems, los metales pesados anulan la
carga elctrica y, por lo visto, cambian profundamente la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria
de la protena.
Para la precipitacin de las protenas con sales de metales pesados se necesitan bajas
concentraciones y pequeas cantidades de estas sales, en comparacin con la precipitacin de las
protenas con sales neutras de metales alcalinos.
En presencia de un exceso de acetato de plomo y sulfato cprico el precipitado formado por ellos se
disuelve, lo que se explica por la adsorcin de un exceso de iones de metal y la recarga del complejo
protenico; como resultado, a la disolucin pasa un complejo de protenas obtenidos por la accin de
las sales de metales pesados son insolubles en disolvente de partida, es decir, en agua o en
disoluciones dbiles de sales, incluso despus de la eliminacin de las sales por dilisis o despus de
la dilucin con agua.
La capacidad de las protenas de enlazar los metales pesados se aprovecha ampliamente en la
prctica medicinal y veterinaria: las protenas sirven de antdotos en caso de envenenamiento con
sales de mercurio, cobre, plomo, etc.
Las reacciones de precipitacin de las protenas con sales de metales pesados transcurren con
plenitud, y ellas se utilizan no slo para el aislamiento de las protenas desde disoluciones y lquidos
biolgicos sino tambin para liberar estos ltimos de las protenas.
Instrumentos:

Varillas de vidrio
Reactivos:
Disolucin de clara de huevo en 20 volmenes de agua que se filtra a travs de varias capas
de gasa
Acetato de plomo, disolucin al 0.5 %
Sulfato cprico, disolucin al 5 %
Nitrato de plata, disolucin al 3 %
Disolucin saturada de cloruro sdico
Procedimiento:
En tres tubos de ensayo se vierten en cada uno de 1 a 2 mL de disolucin de protena. En el primer
tubo se aade, gota a gota, la disolucin de acetato de plomo; en el segundo la de sulfato cprico; en
el tercero la de nitrato de plata. En los tres tubos se forman precipitados de protenas.
En los tubos de ensayo con los precipitado obtenidos con acetato de plomo y sulfato cprico se aade
el exceso de estas sales, observndose, entonces, la disolucin de los precipitados.
3.5.6
Precipitacin de las protenas con cidos minerales.
Los cidos minerales concentrados (menos el cido fosfrico) causan precipitacin irreversible de las
protenas desde sus disoluciones. Esta precipitacin se explica por el fenmeno de la deshidratacin
de las partculas coloidales de protena, la anulacin de su carga, formacin de sales de la protena y
el cido, etc. La reaccin con cido ntrico se emplea ampliamente para las investigaciones
diagnsticas.
Instrumentos:
Reactivos:
Acido sulfrico concentrado

cido ntrico concentrado
Disolucin de protena para las reacciones de precipitacin
Procedimiento:
En 3 tubos de ensayo se vierten con cuidado 1 mL de cidos en cada uno: cido clorhdrico en el
primero, cido sulfrico en el segundo y el ntrico en el tercero.
En todos los tubos de ensayo se aplica con cuidado sobre el cido una capa de disolucin de protena
(alrededor de 1 mL). En el contacto de dos lquidos aparece un precipitado de protenas en forma de
pequeo crculo (anillo) blanco.
Cada tubo de ensayo se agita con cuidado. El precipitado se disuelve en los dos primeros tubos de
ensayo donde hay exceso de cidos clorhdrico y sulfrico; en el tercer tubo, que contiene cido
ntrico, el precipitado no desaparece en el curso de la agitacin, ya que las protenas no se disuelven
en el exceso de cido ntrico.
3.5.7
Precipitacin de las protenas con cidos orgnicos.
Las protenas pueden precipitarse de sus disoluciones tambin con cidos orgnicos, aunque
distintos cidos actan sobre la protena de diferentes maneras. As, por ejemplo, el cido
tricloroactico (CCl3COOH) y el cido sulfosaliclico [C6H3 (OH) COOHSO3H] son, en relacin a las
protenas, reactivos muy especficos y fuertes y se aplican ampliamente en la prctica de
investigacin.
La precipitacin de las protenas con ayuda de cido tricloroactico de concentracin final de 2,5 a
5% se usa para eliminar completamente las protenas desde los lquidos biolgicos u
homogeneizados de los tejidos, puesto que el cido tricloroactico precipita slo las protenas,
mientras que los productos de su desintegracin (metabolismo), esto es, la urea, el cido rico, las
amidas de los aminocidos, los aminocidos, los pptidos de bajo peso molecular etc., se quedan en
disolucin. Esto tiene importancia para determinar por separado el nitrgeno protenico y no
protenico (restante) en los tejidos.
Instrumentos:
Reactivos:
cido tricloroactico, disolucin al 5 %

cido sulfosaliclico disolucin al 20%
Disolucin de protena utilizado en las reacciones de precipitacin
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 1 2 mL de disolucin de protena y se aaden al primer tubo

varias gotas de disolucin de cido tricloroactico al 5 % y al segundo, varias gotas de cido
sulfosaliclico. Los tubos de ensayo se agitan y se observa la precipitacin de la protena.
3.5.8
Precipitacin de las protenas con alcohol y acetona
Los disolventes orgnicos precipitan las protenas de una disolucin neutra o dbilmente cida. Ellos
desplazan las protenas de las disoluciones acuosas. El mecanismo de accin del alcohol y otros
disolventes orgnicos puede ser explicado por la deshidratacin de las micelas de protena, lo que
conduce a la merma de su estabilidad en disolucin. Si en la disolucin de protena hay presentes
sales (NaCl), el precipitado se forma ms rpidamente debido a la anulacin de la carga desde la
partcula coloidal. Este fenmeno disminuye an ms estabilidad de la disolucin de la protena.
Si la precipitacin se hace en fro y el precipitado se separa rpidamente del alcohol, entonces, la
protena puede ser de nuevo disuelta en agua, es decir, sus propiedades no varan, la
desnaturalizacin no logra realizarse, y la precipitacin resulta ser reversible. Durante una estancia
prolongada con alcohol, la protena se desnaturaliza y se vuelve insoluble en el disolvente inicial.
Instrumentos:
Reactivos:
Disolucin de protena para las reacciones de precipitacin

Alcohol etlico al 96 %
Acetona
Cloruro sdico cristalino
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 1 2 mL de disolucin de protena, con cucharita se aade un
poco (0.2 0.3 g) de cloruro sdico y se agita enrgicamente.
Al primer tubo de ensayo se aaden gradualmente (gota a gota) 2 3 mL de alcohol, y al segundo, 2
3 mL de acetona.
Los tubos se agitan enrgicamente y despus de 3 6 min se observa la formacin de un precipitado
fino de protenas.
3.6
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTENAS
La determinacin cualitativa de las protenas se basa en dos tipos de reacciones:

a) las reacciones en que intervienen los enlaces peptdicos de la molcula protenica.
b) las reacciones de los grupos amino presentes en la molcula de la protena.
Estas son reacciones coloreadas de reconocimiento de las protenas.
3.6.1
Descubrimiento de los enlaces peptdicos en las molculas de protenas (reaccin del

Biuret)
En la disolucin alcalina, al aadir sulfato cprico, tales sustancias como el Biuret, la oxamida, los
polipptidos y las protenas forman sales complejas coloreadas de un color violeta. Esta reaccin
es condicionada por la presencia de la unin peptdica.
El nombre de reaccin del Biuret proviene de un derivado de la urea, el Biuret, que, en

condiciones apropiadas, da esta reaccin. El Biuret se forma en el curso del calenta miento de la
urea con desprendimiento de amoniaco:
La estructura de la sal compleja coloreada de Cu-Na-Biuret que se forma en medio alcalino, puede
representarse del modo siguiente:
Como se ve en la frmula indicada ms arriba. El Biuret en un medio alcalino sufre la ionizacin

completa segn el esquema
Dos molculas de Biuret en forma dienlica se combinan con el hidrxido cprico formando un
complejo en que los enlaces de coordinacin son formados a cuenta de los pares electrnicos de los
grupos imino.
De un modo anlogo esta constituido el complejo de cobre con los grupos enolizados peptdicos
de cualquier protena o polipptido.
Los complejos de este tipo poseen sobre todo, un color rojo (el mximo de absorcin esta
situado en la regin de 520 a 535 nm). En caso de formarse complejos cpricos con
participacin de tres o dos tomos de nitrgeno, su coloracin es preferentemente violeta y azul
(el mximo de absorcin es de 540 a 580 nm y de 615 a 670 nm). Por lo tanto la colora cin de las
disoluciones varia, al verificarse la reaccin del Biuret, del azul al rojo, con preponderancia del
color violeta.
Instrumentos:
Reactivos:
Urea cristalina
Hidrxido sdico disoluciones al 10 % y 30%
Disolucin de protena (claras de dos huevos mezcladas con un litro de agua destilada)
Procedimiento:
Reaccin con el Biuret. En un tubo de ensayo seco se toma una pequea cantidad (0,5 g) de
urea y se calcina con cuidado en la llama de un mechero de gas. La urea primero se funde en el
curso del calentamiento ulterior se desprende amoniaco. Al enfriarse, a la masa fun dida se le
aade 1 2 mL de hidrxido sdico al 10% y varias gotas de disolucin de sulfato cprico al 1 %.
Despus de agitada la mezcla, se desarrolla una coloracin violeta azul de la disolucin.
Reaccin con la protena. A 1 2 mL de disolucin de protena se le aade un volumen doble de
disolucin de hidrxido sdico al 30%. Se mezcla cuidadosamente y se agregan 2 3 gotas de
disolucin de sulfato cprico al 1%. De nuevo se mezcla cuidadosamente. Se desarrolla una coloracin roji-violeta. Siendo pequea la concentracin de la protena, la sensibilidad de la reaccin
puede ser aumentada, aplicando sobre la capa de disolucin de protena en lcali 1 mL de
disolucin de sulfato cprico al 1%. Estando el tubo de ensayo en reposo, en el contacto de dos
capas aparece un anillo violeta. Este mtodo puede emplearse para la determinacin de la
protena en la orina.
3.6.2
Ensayo de la ninhidrina
El ensayo se basa en la reaccin con ninhidrina del grupo amino de aminocidos libres y de los
grupos amino dela molcula protenica. Este proceso transcurre en varias etapas. En un
principio, como resultado de la interaccin del aminocido con la ninhidrina se forma una base
de Schiff. Lugo sta sufre un reagrupamiento, se descarboxila y se pone aldehdo y
aminodicetohidrindeno.
El aminodicetohidrindeno se condensa con otra molcula de ninhidrina ms, y el compuesto
formado, al enolizarse, toma un color violeta azul. En presencia de disolventes orgnicos
(acetona, etanol, etc.) en los cuales se prepara la disolucin de ninhidrina, la reaccin

transcurre. Hoy en da la reaccin de ninhidrina se utiliza ampliamente tanto para la deteccin
de los aminocidos, como para la determinacin de su cantidad en los objetos biolgicos.
Instrumentos:

Bao de agua
Reactivos:
Ninhidrina, disolucin al 0.2% en alcohol o acetona

Glicina, disolucin al 0.1%
Procedimiento:
Primeramente, se efecta la reaccin con glicina o cualquier otro aminocido. En un tubo de
ensayo se vierten 2 mL de disolucin de glicina, se aaden de 6 a 8 gotas de disolucin de
ninhidrina y se calienta. Se forma una coloracin violeta.
En el otro tubo de ensayo se vierten 2 o 3 mL de disolucin de protena, se aaden 10 o 12
gotas de disolucin de ninhidrina. El contenido se mezcla y se calienta durante varios minutos
en bao de agua. Se observa una coloracin violeta azul.
3.6.3
Reaccin con el cido pcrico
El cido pcrico al ser calentado con la protena en un medio alcalino, se reduce formando el cido
picrmico. Esta reaccin puede realizarse tambin con otros reductores, por ejemplo, con la glucosa:
Instrumentos:

Esptula
Reactivos:
Acido pcrico, disolucin saturada

Glucosa, disolucin al 0.1 %
Hidrocarbonato sdico seco
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolucin de protena y se aade de 0.3 a 0.5 g de
Hidrocarbonato sdico, luego se agrega 1 mL de disolucin saturada de cido pcrico. El tubo de
ensayo se calienta durante varios minutos en la llama del mechero. La coloracin amarilla de la
disolucin gradualmente pasa a ser roja debido a la reduccin del cido pcrico en picrmico.
En el otro tubo de ensayo se efecta la misma reaccin con disolucin de glucosa al 0,1 % en lugar
de la protena. Se observan los mismos fenmenos que en el caso de la protena.
3.7
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS AMINOACIDOS
3.7.1
Ensayo xantoproteico
La reaccin xantoproteica (del griego <xanthos>, amarillo) permite descubrir la presencia en la

molcula de protena de los aminocidos cclicos (fenilalalina, tirosina y triptfano). La presencia de
estos aminocidos en la molcula de la protena, da lugar a la reaccin. Los anillos aromticos de los
aminocidos
se someten a la nitracin que lleva a la formacin de los derivados nitro de las
protenas, coloreados de amarillo.

La reaccin xantoproteica la dan los compuestos aromticos sencillos: el benceno y sus homlogos,
le fenol, etc.
La tirosina por nitracin se convierte en nitrotirosina, a partir de la cual, bajo la influencia del lcali, se
forma una sal amnica que tiene agrupamiento quinoidal:
Instrumentos:
Reactivos:
Fenol, disolucin al 0,1%
cido ntrico concentrado
Hidrxido sdico, disolucin al 20%, o amonaco
Procedimiento:
Primeramente, se efecta la reaccin con el fenol. En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de la

disolucin de fenol y se aaden 1 2 mL de cido ntrico concentrado. Se calienta con cuidado,
manifestndose un color amarillo.
En el otro tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolucin de protena, aproximadamente, y se aaden
de 6 a 10 gotas de cido ntrico concentrado. Bajo la influencia del cido aparece el precipitado de
protena que al enfriarse adquiere una coloracin amarilla. Luego el tubo de ensayo se deja enfriar y
se le aade, con cuidado, un exceso de hidrxido sdico o de amoniaco. Esto hace que la coloracin
amarilla se convierte en anaranjada.
3.7.2
Reaccin de la tirosina
La reaccin se debe a la presencia, en la molcula de protena, de la tirosina que tiene en su

composicin un grupo fenlico. ste por calentamiento con el reactivo Millon (una mezcla de nitrato y
nitrito mercricos disueltos en cido ntrico concentrado) proporciona una coloracin roja al cogulo.
El quimismo de la reaccin se reduce a la formacin de la nitroso tirosina que, adicionando el
mercurio en el curso del calentamiento, se transforma en una sal mercrica de color rojo.
Casi todas las protenas dan la reaccin de Millon, puesto que en su composicin entra el aminocido
de tirosina que es un fenol.
Instrumentos:
Reactivos:
Fenol, disolucin al 0.1 %
Reactivo Millon
Gelatina, disolucin al 1 %
Procedimiento:
Primeramente se hace el experimento con el fenol. En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de
disolucin de fenol y 1 mL de reactivo de Millon, calentndose lentamente. Aparece una coloracin
rosada. A continuacin se realiza la reaccin con protena. En el otro tubo de ensayo se vierten 2 mL
de disolucin de protena y se aaden 6 a 8 gotas de reactivo Millon. Al principio aparece un

precipitado de protena que al calentarse toma un color rojo ladrillo.
Debe evitarse el exceso de reactivo Millon, ya que el cido ntrico puede dar coloracin amarilla
(reaccin xantoproteica) que enmascara la reaccin de la tirosina.
De manera anloga se efecta la reaccin con disolucin de gelatina. Como regla, la reaccin de
Millon con gelatina es negativa.
3.7.3
Reaccin del triptfano
Instrumentos:
Pipetas de 1 mL
Reactivos:
Sacarosa, disolucin al 10 %
Procedimiento:
En el tubo de ensayo se vierte 1 mL de disolucin de protena, aproximadamente, y se aaden 2
gotas de disolucin de sacarosa. Luego mediante la pipeta se deja bajar al fondo 1 mL de cido
sulfrico concentrado. En el contacto de los lquidos aparece una coloracin guinda roja en forma de
un anillo.
La esencia de la reaccin se reduce a que bajo la influencia del cido sulfrico ocurre la hidrlisis de
la sacarosa hasta monosacridos que se deshidratan, convirtindose en hidroximetilfurfural. El
triptfano, al combinarse con el hidroximetilfurfural, forma un complejo de color guinda rojo.
3.7.4
Reaccin de la arginina
La arginina en presencia del -naftol se oxida con hipobromito, perdiendo a la vez un grupo imino. La
arginina oxidada, al combinarse con el -naftol, forma una sustancia de color rojo que se supone
posee la estructura siguiente:
Las protenas que tienen en su composicin arginina, dan una coloracin roja con hipobromito o
hipoclorito y -naftol en medio alcalino.
Instrumentos:
Reactivos:
Hidrxido sdico, disolucin al 10%.
-naftol, disolucin al 0.2 % (antes de usar 5 mL de disolucin bsica se diluye 5 veces con
agua)
Hipobromito sdico
Arginina, disolucin al 0.01 % en cido sulfrico 0,1N
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolucin de protena. Se aaden 2 o 3 gotas de disolucin
de hidrxido sdico y 2 gotas de -naftol. El contenido del tubo de ensayo se mezcla y se agrega 1
gota de hipobromito. Aparece una coloracin carmes roja.
En el mismo orden que se efecta la reaccin con la disolucin de arginina. Aparece una coloracin
roja ladrillo.
3.7.5
Reaccin de los aminocidos que contienen azufre
En la composicin molecular de la mayora de las protenas entran aminocidos que contienen azufre:
la cistena, cistina y metionina. Al calentarse con lcali, de estos aminocidos se desprende azufre en
forma de sulfuro de hidrgeno que se detecta en la reaccin con el acetato de plomo:
Instrumentos:
Soporte con tubos do ensayo
Reactivos:
Clara de huevo no diluida

Acetato de plomo, disolucin al 0,5%
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 1 2 mL de clara de huevo y se aade igual volumen de di solucin

de hidrxido sdico, se calienta hasta la ebullicin y se agregan 1 2 gotas de acetato de plomo. Se
observa un oscurecimiento paulatino de la disolucin.
3.7.6
Reaccin de reconocimiento del glutatin
El glutatin es un tripptido compuesto de los restos del cido glutmico, la cistena y la glicina:
En los tejidos y clulas del organismo animal el glutatin se encuentra en forma reducida (como
tripptido GSH) y en forma oxidada (como tripptido GSSSG). La reduccin del glutatin se
realiza a travs de la reaccin con el DANPH2:
En el organismo el glutatin se oxida, interaccionando con los aminocidos de protenas. La funcin

ms importante del glutatin es mantener en el estado reducido los grupos tioles de la cistena en las
protenas. Esta reaccin se describe con la ecuacin siguiente:
El glutatin puede servir de agente de transferencia de hidrgeno intermediario en las reacciones de

oxidacin del aldehdo fosfoglicrico y de activador de una serie de enzimas (proteinasas). Sobre la
catalasa, fosfatasa y algunas otras enzimas el glutatin ejerce una accin inhibidora.
Contienen glutatin la sangre, el hgado, los msculos, los riones, las glndulas suprarrenales y
otros rganos. En la sangre de los animales sanos se contiene de 4,4 a 32,3 mg de glutatin,
mientras que por ejemplo en la sangre de las vacas enfermas de cetosis su contenido alcanza a 22,523,2 mg. Estos indicadores reflejan la alteracin de los procesos de oxidacin-reduccin en los tejidos
del animal.
El principio del mtodo. En el medio alcalino del glutatin se desprende el sulfuro sdico que, al
combinarse con el nitroprusiato de sodio, forma un compuesto de color carmes:
Instrumentos:
Mortero con machaca

Polvo de vidrio
Pipetas
Infernilla
Reactivos:
Hgado fresco
Sulfato amnico, disolucin saturada
Nitroprusiato de sodio, disolucin al 2%
Amonaco concentrado
Procedimiento:
En el mortero se trituran cerca de 1 g de hgado con una pequea cantidad de polvo de vidrio y 3 4
mL de disolucin saturada de sulfato amnico. El contenido del mortero se divide en dos porciones
iguales que se ponen en dos tubos de ensayo. El tubo de ensayo 1 sirve de control, l se calienta
hasta la ebullicin para desnaturar las protenas y el glutatin. En el tubo de ensayo 2 (experimental)
el glutatin queda intacto. En ambos tubos se aaden 2 mL de amonaco y 1 mL de disolucin de
nitroprusiato de sodio. En el tubo de ensayo 2 se observa la aparicin de una coloracin carmes.
3.7.7
Diazorreaccin de reconocimiento de la tirosina, el triptfano y la histidina
Con el diazorreactivo las protenas dan una coloracin roja anaranjada. El color depende de la
formacin de los azocompuestos coloreados a partir de los restos de aminocidos, la tirosina, el
triptfano y la histidina que forman parte de la composicin de la molcula protenica.
La diazorreaccin se emplea para la determinacin cuantitativa y cualitativa de la tirosina e histidina
en los hidrolizados protenicos.
Instrumentos:
Reactivos:
Reactivo diazo
Tirosina, disolucin 0,01 % en cido sulfrico 0,1 N
Carbonato sdico, disolucin al 10 %
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolucin de tirosina, 0,5 mL de disolucin de sosa y 1 mL
de reactivo diazo. Aparece una coloracin roja anaranjada.
De manera anloga se efecta con la protena utilizando la disolucin de protena en lugar de la de
tirosina. En este caso tambin aparece una coloracin roja anaranjada.
3.8
DESCUBRIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO EN LAS PROTENAS
Ciertas protenas (glicoprotenas, nucleoprotenas, etc.) tienen en su composicin hidratos de

carbono. En presencia del cido sulfrico concentrado tales protenas dan una coloracin
caracterstica para los hidratos de carbono: violeta con -naftol y roja con timol. Esta coloracin
aparece como resultado de la interaccin con el a-naftol o el timol del furfural e hidroximetilfurfural que
se forman bajo la influencia del cido sulfrico concentrado (deshidratacin de los monosacridos).
Instrumentos
Reactivos.
-Naftol, disolucin al 0,2 %

Timol, disolucin al 1% en alcohol
Glucosa, disolucin al 0,1%
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten, en cada uno, 2 mL de disolucin de glucosa. Al primer tubo se le
aaden de 4 a 6 gotas de disolucin de -naftol, al otro tubo, de 4 a 6 gotas de disolucin de timol. En
ambos tubos se deposita en el fondo, formando una capa, con cuidado, 1 2 mL de cido sulfrico
concentrado. Se observa una coloracin violeta (en el caso del -naftol) o roja (en el caso del timol)
en la unin del cido sulfrico y la disolucin de glucosa.
Se realiza la misma reaccin con la disolucin de protena. Se anota la reaccin positiva de
reconocimiento del componente de hidrato de carbono.
3.9
PROTEINAS CONJUGADAS
Las protenas conjugadas estn compuestas de protenas sencillas y componentes no protenicos

(grupo prosttico). En dependencia de la naturaleza del grupo prosttico (cido nucleico, sustancia
coloreada, hidrato de carbono, lpidos, vitamina, metal, etc.) las protenas conjugadas se dividen en:
nucleoprotenas, cromoprotenas, glicoprotenas, lipoprotenas, metaloprotenas, fosfoprotenas, etc.
3.9.1
NUCLEOPROTEINAS
Las nucleoprotenas son protenas complejas constituidas de protenas sencillas del tipo de histonas y
protaminas, conjugadas con cido nucleico. Se distinguen dos clases de cidos nucleicos: el
ribonucleico y el desoxirribonucleico.
3.9.2
Aislamiento de la desoxirribonucleoprotena
Las desoxirribonucleoprotenas son la componente principal de los ncleos de las clulas. Se

denominan tambin protenas de ncleo o nucleoprotenas. Una propiedad caracterstica de las
nucleoprotenas es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas en las disoluciones
concentradas de sales (NaCl y otras) y su insolubilidad en las disoluciones salinas diluidas. Al ser
precipitadas desde las disoluciones salinas, las nucleoprotenas sedimentan en forma de hilos.
Instrumentos:
Mortero con machaca

Centrfuga de 2500 3000 revoluciones
Probetas de centrfuga graduadas
Vaso de precipitacin 300 mL
Probeta 100 mL
Varilla de madera con entallados
Vidrio reloj
Reactivos:
Glndula linftica, timo o hgado (de conejo o bovino)

Cloruro sdico, disolucin 1 N
Procedimiento:
2 g de tejido se desmenuzan primero con tijeras sobre el vidrio reloj y luego se trituran en el mortero.
En el mortero se aaden, por porciones pequeas, de 70 a 80 mL de disolucin de NaCl 1 N,
triturando el contenido cuidadosamente durante 10 15 minutos.
La disolucin viscosa obtenida se reparte en las probetas de centrfuga y se lleva a centrifugar a 2500
3000 rpm. Luego el lquido se decanta en la probeta graduada y se mide su volumen.
Se toma un volumen sxtuplo de agua (con respecto al lquido centrifugado), se vierte en el vaso y
girando lentamente la varilla de madera en el agua, se le agrega el lquido centrifugado.
Los hilos de nucleoprotena formados se arrollan sobre la varilla, se trasladan con cuidado a un tubo
de ensayo y se usan posteriormente para realizar las reacciones de reconocimiento de ADN.
3.9.3
Reacciones de Reconocimiento del ADN
El ADN da una serie de reacciones coloreadas con las cuales ste puede ser distinguido del ARN.
Estas reacciones estn condicionadas por la presencia en la molcula de la desoxirribosa. Para
descubrir el ADN, se emplea las reacciones con la Difenilamina (C 6H5-NH-C6H5) que da con la
desoxirribosa y el ADN una coloracin verde.
Instrumentos:

Bao Mara
Reactivos:
Reactivo de difenilamina
Hidrxido de sodio, disolucin 0.4 %
Procedimiento:
Una pequea cantidad del precipitado de desoxirribonucleoprotena se traslada a un tubo de ensayo y

se disuelve en 1 mL de NaOH. Se aade igual volumen de reactivo de difenilamina (hasta disolver el
precipitado) y el tubo se pone en el bao Mara hirviendo donde se mantiene durante 15 20 minutos.
Se observa una coloracin azul.
3.9.4
Obtencin de la nucleoprotena a partir de levadura
Las levaduras son ricas en ribonucleoprotenas. stas pueden ser extradas de las clulas de
levadura destruidas en un medio alcalino de la disolucin, y precipitadas por acidulacin.
Instrumentos:
Mortero con machaca

Vaso o matraz 100 mL
Probeta graduada 100 mL
Centrfuga y probetas de centrfuga
Pipeta 10 mL
Varilla de vidrio
Arena de vidrio
Reactivos:
Levadura prensada
ter dietlico
NaOH, disolucin al 0.4 %
cido actico, disolucin al 5%
Procedimiento:
En el mortero se colocan 5 g de levadura, se aade 10 gotas de ter y 10 gotas de agua, una pulgada
de arena de vidrio, se tritura cuidadosamente. A la masa homogenizada se le agregan 30 mL de
disolucin de NaOH y se sigue triturando durante 15 minutos ms. El contenido del mortero se reparte
en 3 probetas de centrfuga, llevando el volumen a 10 mL. Se centrifugan durante 5 10 min a 2500
rpm. El lquido de todas las probetas se decanta en un vaso donde se vierte la disolucin de cido
actico (12 mL) removiendo constantemente con la varilla hasta la completa precipitacin de la
nucleoprotena. El precipitado de la nucleoprotena se separa mediante otra centrifugacin y se utiliza
para la reaccin de la hidrlisis.
3.9.5
Hidrlisis de la nucleoprotena
Esta reaccin puede verificarse mediante la ebullicin de la nucleoprotena con el cido sulfrico al
5% durante 1 hora. La nucleoprotena se desdobla en protena y cido nucleico. Este ltimo se
descompone en mononucletidos individuales, de los cuales luego se desprende el cido fosfrico y
las bases pricas (adenina y guanina). La protena mientras tanto, tambin se somete a hidrlisis
parcial hasta polipptidos de bajo peso molecular y aminocidos. En el hidrolizado pueden ser
determinados, la protena, bases pricas, pentosa y cido fosfrico.
Instrumentos:

Matraz con refrigerante de reflujo
Embudo con filtro
Vaso 100 mL
Reactivos:
cido sulfrico, disolucin 5 %
Procedimiento:
La nucleoprotena obtenida a partir de la levadura a partir de la levadura se traslada al matraz para
hidrlisis y se le aade 15 mL de disolucin de cido sulfrico al 5%. El matraz se cierra con un tapn
provisto de refrigerante de reflujo y se hierve con cuidado durante 1 hora.
Al enfriarse, el hidrolizado se filtra en el vaso y se utiliza para el anlisis de los productos de hidrlisis.
3.9.6
Deteccin de las protenas sencillas
Para este fin pueden emplearse dos reacciones, la de Biuret y la de Millon

Instrumentos:
Reactivos:
Hidrxido de sodio, al 10%

Sulfato cprico, al 1%
Reactivo de Millon
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierte 0,5 mL de hidrolizado filtrado, ste se neutraliza por el papel tornasol
con NaOH y se aade 0,5 mL de NaOH, luego se agregan 2 3 gotas de sulfato cprico. El tubo de
ensayo se agita y se observa la reaccin de Biuret positiva (coloracin rosada o violeta).En otro tubo
de ensayo se vierte 1 mL de hidrolizado y se aade 0,3 mL de reactivo de Millon. Se calienta y el
precipitado adquiere un color rosado o rojo ladrillo.
3.9.7
Deteccin de las pentosas
Se realiza una de las reacciones de oxidacin de las aldopentosas. Para ello se realiza la reaccin de
Fehling.
Instrumentos:
Reactivos:
NaOH, disolucin 10 %
Reactivo de Fehling
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierte 0,5 mL de hidrolizado filtrado, ste se neutraliza por el papel tornasol
con disolucin de lcali. Al hidrolizado neutralizado se aade igual volumen de reactivo de Fehling, el
tubo se agita y la capa superior del lquido se calienta. Se observa la aparicin de un precipitado rojo
amarillo de xido cuproso e hidrxido cuproso.
3.9.8
Deteccin de las bases pricas
La esencia de la reaccin se reduce a la formacin de sales de plata de la bases pricas, que se

precipitan al fondo del tubo de ensayo.
Instrumentos:
Reactivos:
Amonaco concentrado
Disolucin de nitrato de plata en amonaco
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL del hidrolizado de la nucleoprotena, se aaden 5 6 gotas de
amonaco concentrado hasta la reaccin alcalina por el papel tornasol, luego se agrega 0,5 mL de la
disolucin amoniacal de plata. Aparece un precipitado en forma de copos de sales de plata y bases
pricas que sedimentan, paulatinamente al fondo.
3.9.9
Deteccin del cido fosfrico
Instrumentos:

Pipeta de 5 mL
Reactivos:
Molibdato amnico
cido ascrbico, disolucin 0,04 %
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL del hidrolizado de la nucleoprotena, se aaden 3 mL de
molibdato amnico y 1 mL de cido ascrbico. Se mezcla cuidadosamente y se observa la aparicin
de una coloracin azul que puede ser acelerada mediante calentamiento en el bao Mara hasta
40C.
3.10 GLICOPROTENAS
Son protenas conjugadas compuestas por las protenas sencillas y grupo prosttico en cuya
composicin entran los hidratos de carbono tanto del tipo de homopolisacridos, como de
heteropolisacridos.
3.10.1 Aislamiento de la mucina de la saliva
Instrumentos:

Varilla de vidrio
Reactivos:
cido actico, disolucin al 1%

Hidrxido de sodio, disolucin al 10%
cido clorhdrico, disolucin 0.1%
-Naftol, disolucin al 0.2%
Procedimiento:
En tres tubos de ensayo se colectan 1 2 mL de saliva en cada tubo y se aade, gota a gota, una
disolucin de cido actico al 1% hasta aparecer flculos de mucina. El precipitado de mucina se lava
cuidadosamente con agua, deteniendo el flculo con la varilla de vidrio.
Despus del lavado, al flculo de la mucina en el primer tubo de ensayo se le aade 1 mL de
disolucin de hidrxido de sodio al 10%, se mezclan y al diluirse la mucina, se realiza la reaccin de
Biuret. Para ello adems se aaden 5 6 gotas de hidrxido de sodio y 1 2 gotas de sulfato cprico.
El tubo de ensayo se agita y se observa un cambio de color por el rosa o violeta.
En el segundo tubo de ensayo se aade 1 mL de disolucin de cido clorhdrico al 0.1%, y se observa
la disolucin de la mucina.
Al flculo de mucina en el tercer tubo se aade 5 6 gotas de -naftol, se mezcla y se agrega, con
cuidado por las paredes, cido sulfrico concentrado. En el lmite entre dos capas del lquido surge
una coloracin violeta. La reaccin es debida a la presencia, en el grupo prosttico, de la mucina de
los monosacridos y sus derivados que bajo la influencia del cido sulfrico se convierten en furfural e
hidroximetilfurfural, y estos ltimos dan color con el -naftol sustancias coloreadas.
3.11 PREPARACIN DE REACTIVOS PARA ENZIMAS
SOLUCIONES DE pH
Fosfato sdico disustituido, disolucin 0.2 M (A).

cido ctrico disolucin 0.1 M (B).
-
Disoluciones amortiguadoras
o pH 5,0: se mezclan 515 ml de disolucin A con 485 ml de disolucin B
o pH 6,8: se mezclan 772,5 ml de disolucin A con 227,5 ml de disolucin B
o pH 8,0: se mezclan 972,5 ml de disolucin A con 27,5 ml de disolucin B
SACARASA
Se pesan 10 g de levadura, se trituran completamente y se homogeniza en 100 mL de agua.
CIDO SUCCNICO 3%
Se pesan 3 g de cido succnico y se disuelven en 97 mL de agua destilada y se neutraliza con

disolucin de hidrxido de sodio al 10 % hasta pH 7.4 segn papel indicador.
ACIDO TRICLOROACETICO 20 %
Pesar 20 g de cido tricloroactico, llevar a volumen de 100 mL con agua destilada.
ALMIDN TAMPONADO
Solucin de almidn 500 mg/L, tamponada a pH 7 con buffer fosfato 0.1 mol/L en NaCl 0.15 mol/L.
Otro mtodo de preparar almidn tamponado, es mezclando 8 mL de almidn al 1% con 4 mL de
solucin tampn de pH 7.
REACTIVO DE IODO
Preparar una solucin de 0.01 eq/L de iodo en cido clorhdrico 0.02 mol/L.
3.12 PREPARACION DE REACTIVOS PARA RECONOCIMIENTO DE PROTENAS
DISOLUCION DE PROTENA
Disolucin de clara de huevo (de tres huevos de gallina) que se prepara mezclando las claras de
huevo con 700 mL de agua destilada y 300 mL de disolucin saturada de cloruro de sodio con
posterior filtracin a travs de varias capas de gasa.
REACTIVO DE MILLON
40 g de mercurio se disuelven en 57 mL de cido ntrico concentrado primeramente temperatura

ambiente y luego con un calentamiento dbil en bao Mara; la disolucin obtenida se diluye en dos
volmenes de agua, se deja sedimentar y se decanta. Preparar bajo la campana de extraccin.
HIPOBROMITO SODICO
Se disuelven 300 g de hidrxido de sodio en 1 L de agua destilada, se enfra y se aaden bajo la

campana de humos, con cuidado y removiendo constantemente, 50 g de bromo puro (alrededor de 16
mL); la disolucin se guarda en un frasco mbar durante 3 meses como mximo.
REACTIVO DIAZO
0,9 g de cido sulfanlico se disuelven en 9 mL de HCl concentrado y se agrega agua hasta completar
100 mL. sta disolucin bsica se puede guardar largo tiempo. Se toma 1,5 mL de disolucin bsica
de cido sulfanlico y se vierte en un matraz aforado de 50 mL puesto en hielo, se aaden 1,5 mL de
disolucin de nitrito de sodio al 5% recin preparado. Al cabo de 5 min, se agregan, agitando otros 6
mL de disolucin de nitrito de sodio. Tras 1 minuto se aade poco a poco (durante el enfriamiento)
agua hasta completar 50 mL. La disolucin se agita y se deja sobre el hielo durante 15 min. La
disolucin puede guardarse en hielo durante 24 horas.
REACTIVO DE DIFENILAMINA
Se pesa 1 g de difenilamina, se disuelve en 10 mL de cido actico glacial; se aade 2,75 mL de

cido sulfrico concentrado y se lleva a 100 mL con cido actico glacial.
MOLIBDATO AMONICO
Pesar 12,5 g de molibdato de amonio y disolver en 250 mL de agua en un matraz de 500 mL. A la
disolucin obtenida se aaden 250 mL de cido sulfrico concentrado.
CIDO ASCORBICO 0,04 %
Disolver 0,04 g de cido ascrbico en 100 mL de agua destilada. Este reactivo debe prepararse en el
momento de realizar la prctica.
BIBLIOGRAFIA
CHECHETKIN A.V.; Prcticas de Bioqumica del ganado y aves de corral. Editorial Mir Mosc
HAWK, PHILIP., Qumica Fisiolgica Prctica. Editorial Interamericana
JAMARDO & JAMARDO; Gua prctica de Qumica Biolgica. Primera edicin. Editorial Universitaria
LENENGER, DAVID, COX M.; Principios de Bioqumica. Editorial Omega 2006
MATHEWS, C. K., VAN HOLDE, K. E., AHEM.; Bioqumica. Tercera edicin. Editorial Pearson E. 2002

Guia Bioquimica Abril 2014

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL

Dra. Guadalupe Jibaja

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO.......................................5

Reaccin con -Naftol o Prueba de Molisch.................................................................5

Prueba con Naftorresorcina......................................................................................... 6

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES............................7

Prueba con el hidrxido cprico (II), Reaccin de Trommer.........................................7

Reaccin con el licor de Fehling.................................................................................. 8

Reaccin con sales de bismuto, Nylander...................................................................8

Reaccin con Fenilhidrazina........................................................................................ 9

Reconocimiento de la fructosa en disolucin (Reaccin de A. F. Selivnov)...............11

Reaccin de reconocimiento de las pentosas con Orcina (Prueba del bial)...............12

Reaccin con Floroglucina......................................................................................... 13

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE DISACRIDOS.....................................................15

Reaccin de reconocimiento de la sacarosa..............................................................15

Hidrlisis cida de la sacarosa.................................................................................. 16

Hidrlisis enzimtica de la sacarosa.......................................................................... 16

Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa.............................................17

Reacciones de reduccin de iones metlicos...........................................................17

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE POLISACRIDOS..................................................17

ALMIDN: Reacciones coloreadas del almidn..........................................................17

Hidrlisis cida escalonada del almidn....................................................................18

Hidrlisis enzimtica del almidn.............................................................................. 19

IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES........................20

Preparacin de las muestras a analizar: extraccin de carbohidratos.......................20

PREPARACIN DE REACTIVOS PARA CARBOHIDRATOS......................................................22

LOS LPIDOS Y SUS METABOLITOS.................................................................................... 24

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS GRASAS.......................................................24

Reaccin de la grasa y el aceite con el reactivo de Sudn III....................................24

Determinacin de la glicerina en las grasas..............................................................25

Solubilidad de las grasas.......................................................................................... 25

Determinacin de la temperatura de fusin..............................................................26

DETERMINACION DE LOS INDICES (CONSTANTES) DE LAS GRASAS Y ACEITES.................28

Determinacin del nmero acdico............................................................................ 28

Determinacin del ndice de iodo.............................................................................. 29

Determinacin del nmero (ndice) de saponificacin...............................................30

Determinacin del ndice (nmero) de ster.............................................................31

EMULSIFICACIN DE LAS GRASAS.................................................................................... 32

HIDRLISIS DE LOS GLICRIDOS CON LIPASA...................................................................32

Aislamiento de los fosfolpidos.................................................................................. 34

Aislamiento de los fosfolpidos del tejido nervioso....................................................35

Aislamiento del colesterol del tejido nervioso...........................................................36

Reacciones coloreadas del colesterol........................................................................ 36

PREPARACION DE REACTIVOS PARA LIPIDOS..................................................................... 38

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS....................................................................................... 44

Labilidad trmica de las enzimas.............................................................................. 44

Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas..................................................45

Especificidad de las enzimas.................................................................................... 46

Influencia de los activadores e inhibidores................................................................47

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS.......................................................48

Determinacin de la actividad de la dehidrogenasa de cido succnico...................48

Determinacin de la actividad de la catalasa en la sangre........................................49

Cuantificacin de Amilasa Pancretica...................................................................... 50

Actividad de anhidrasa carbnica............................................................................. 51

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTENAS..................................................53

REACCIONES DE PRECIPITACIN DE LAS PROTENAS........................................................53

Salificacin de las protenas...................................................................................... 53

Precipitacin de las protenas con sulfato amnico...................................................54

Precipitacin reversible de las protenas con sulfato amnico...................................55

Precipitacin de las protenas con cloruro sdico y sulfato de magnesio...................55

Precipitacin de las protenas con iones de metales pesados...................................55

Precipitacin de las protenas con cidos minerales.................................................56

Precipitacin de las protenas con cidos orgnicos..................................................57

Precipitacin de las protenas con alcohol y acetona................................................58