UNIVERSIDAD MAYOR

FACULTAD DE CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS

ESCUELA MEDICINA VETERINARIA

Laboratorio de Microbiologa Veterinaria

Dra. Maria Teresa Calderon.

Dra. Nicole Cuthbert.

Santiago
2012

LABORATORIO N 1
Materiales de toma de muestra; Tcnicas de obtencin de muestras; Medidas
de Bioseguridad, Manejo de desinfectantes y enfermedades de riesgo
profesional.
Esterilizacin
Introduccin
Se entiende por esterilizacin, la destruccin completa o la eliminacin total de
los microorganismos patgenos y saprfitos que se encuentran en el interior o en la
superficie de los objetos o sustancias.
La eliminacin de los microorganismos puede conseguirse mediante
procedimientos fsicos o qumicos. Los mtodos fsicos se incluyen en el trmino
esterilizacin y los mtodos qumicos en el de desinfeccin.
Sin embargo, ello no constituye una regla fija, cualquiera que sea el mtodo
empleado, fsico o qumico, la accin letal para el microorganismo puede ser la
misma, as por ejemplo; la ebullicin (fsico) coagula el protoplasma de las bacterias,
esto mismo puede conseguirse con una sal de metal pesado.
Clasificacin
Los procedimientos de esterilizacin pueden clasificarse, como se ha dicho, en
dos grandes grupos: fsicos y qumicos.
Los mtodos fsicos conducen especialmente a lo que se designa con el nombre
de asepsia (ausencia total de grmenes patgenos) y se basan en la aplicacin de
agentes fsicos corrientes o naturales, como son por ejemplo: la temperatura (calor),
la luz y la filtracin.
Los mtodos qumicos, conducen ms bien a la antisepsia (impedimento o
retraso del desarrollo de microorganismos patgenos en relacin con el organismo
vivo) y la desinfeccin (destruccin de microorganismos patgenos y saprfitos por
fuera del organismo vivo). Ambos resultados derivan de la aplicacin de ciertas
sustancias qumicas que poseen poder bactericida y que conocemos como antispticos
y desinfectantes.
Esterilizacin por calor
a) Esterilizacin por calor seco.
A la llama: La destruccin de los microorganismos mediante la llama es un
procedimiento muy eficaz cuando el material a esterilizar es indestructible o se va
a inutilizar. Se aplica para esterilizar el asa de platino que se calienta al rojo blanco
(1300C), esptulas, pipetas, bocas de tubos o matraces, etc. Empleando la llama
del mechero Bunsen (en estos ltimos casos se habla mas bien de flameado).

Por aire caliente: El aire caliente confinado a temperatura de 160C a 180C

mantenido durante una hora, destruye con seguridad, todas las bacterias y sus
esporas. Para su aplicacin se recurre al horno de aire caliente, siendo el ms
usado el Horno Pasteur, que se compone de una caja metlica de pared triple, la
central de menos altura, disposicin que determina los espacios concntricos que
se comunican superiormente, un canastillo metlico colocado en su interior, puerta
y termmetro. Como fuente de calor lleva un mechero para gas o resistencias
elctricas.

El horno Pasteur se emplea para esterilizar material de vidrio (tubos, cajas Petri,
pipetas, etc.) inalterable a esa temperatura. Nunca se emplea para esterilizar
medios de cultivo.
b) Esterilizacin por calor hmedo (coagulacin de las protenas microbianas

Por agua en ebullicin: el agua en ebullicin es suficiente para matar las formas
vegetativas de las bacterias, pero no sus esporas.
Se utiliza para esterilizar jeringas, agujas, pinzas, etc. Que se depositan en un
recipiente u otro artefacto especial que contiene agua. El calor es suministrado por
mecheros Bunsen o resistencias elctricas. Se mantiene la ebullicin del lquido
durante el tiempo que se considere necesario (mnimo 10 minutos).

Por vapor fluente: Es un hecho conocido, que el vapor fluente o vapor activo que
emana de receptculo sometido a una fuente calrica es un efectivo modo de
esterilizacin. Se utiliza para la esterilizacin de instrumentos de ciruga, equipos
de lechera, industria conservera, etc. Su temperatura alcanza aproximadamente a
100C. si se mantiene sin presin y a nivel del mar. Una simple exposicin al vapor
fluente por 15 minutos es suficiente para destruir todas las formas vegetativas de
las bacterias, pero no sus esporas, para conseguir este ltimo objetivo es necesario
repetir el mtodo en forma intermitente, como se describe ms adelante.
Esterilizacin intermitente, fraccionada o tindalizacin: Consiste en el
calentamiento discontinuado a 100C durante 30 minutos, operacin que se repite
3 veces con intervalos de 24 horas.
En bacteriologa, se usa principalmente, para esterilizar medios de cultivo que
llevan sustancias que se someten a temperaturas mayores durante largo tiempo
(medios con azcares).

Por vapor de agua a presin: Las esporas de algunas bacterias resisten

temperaturas de 100C. Slo son destruidas cuando se aumenta la temperatura,
sometiendo el vapor a presin. En ausencia de aire, el vapor a presin tiene una
temperatura constante, por lo tanto, si conocemos la presin podemos fcilmente
determinar la temperatura.
Vapor
Vapor
Vapor
Vapor
Vapor

a
a
a
a
a

100C
105C
110C
115C
120C

1,0
1,2
1,4
1,7
2,0

atm
atm
atm
atm
atm

En el laboratorio este procedimiento tiene aplicacin en la esterilizacin de

lquidos, medios de cultivo, etc. susceptible de evaporacin y para los cuales no puede
emplearse el calor seco.
Los aparatos empleados para la esterilizacin, bajo las condiciones sealadas se
denominan autoclaves. El ms usado es el autoclave de Chamberland, que est
constituido por un depsito cilndrico de paredes metlicas a cuya abertura se adapta
una tapa tambin metlica, por medio de un anillo de caucho y que se cierra tambin
hermticamente por tornillos articulados u otros sistemas mecnicos especiales, lleva
adems un manmetro, un termmetro, llave de escape y vlvula de seguridad. El
calor es suministrado por resistencias elctricas o por gas.
La esterilizacin de material de laboratorio se hace generalmente, a 120C
durante 20 minutos, dependiendo esto ltimo de la cantidad o volumen de material o
medio de cultivo a esterilizar. Si este mtodo se realiza en condiciones adecuadas se
asegura una absoluta esterilizacin.
Pasteurizacin
Su principio bsico es el calentamiento a temperaturas inferiores a 100C. Este
procedimiento se emplea para destruir la mayora de los microorganismos patgenos
no esporulados y enzimas. Tienen gran aplicacin en higiene, en la pasteurizacin de
la leche y en otros productos derivados.
Se tom como referencia para la eliminacin de esos microorganismos. La
temperatura mnima mortal del Mycobacterium tuberculosis, que es de 63C
durante 30 minutos. En la pasteurizacin de la leche se pueden seguir los siguientes
procedimientos.
a) Mtodo lento (VAT): Se coloca leche en depsitos especiales y se le somete a
la temperatura de 65C durante 30 minutos. Tiene la desventaja de alterar
aunque en un grado mnimo las cualidades fsico qumicas de la leche y de
reducir el contenido de vitamina A y D.
b) Mtodo rpido (HTST): Segn este procedimiento, la leche se hace pasar por
capas delgadas, de 1 mm. de espesor, a 71C por 15 segundos.

c) Mtodo UHT: Es un proceso similar al anterior, en donde la leche pasa por

capas delgadas, de 1 mm. de espesor a 138C por 2 segundos.
Cualquiera sea el procedimiento seguido, la leche una vez que sale del aparato de
pasteurizacin, debe ser rpidamente enfriada a 10C.
Preparacin de material a esterilizar
Debe estar rigurosamente limpio. Los tubos, matraces, pipetas, etc. deben
taponarse con algodn card (no hidrfilo) cuidando que el algodn no quede muy
apretado. Las placas de petri, vasos, pipetas graduadas, etc. se envuelven en papel
corriente, no engomado. Los objetos que se van a esterilizar en el Horno Pasteur
deben estar completamente secos para evitar su ruptura.
Esterilizacin por filtracin
Este mtodo se emplea cuando no es posible utilizar calor para lograr la
esterilizacin. Se basa en fenmenos fsico qumicos observados entre los cuerpos
microbianos o elementos en suspensin y una sustancia semiporosa. As se consigue
separar microorganismos y micelas orgnicas de los lquidos que los contienen.
Los lquidos a filtrar deben atravesar por presin o aspiracin, por pequeos
canalculos
a nivel de cuyas paredes los microorganismos son retenidos por
adsorcin. En la adsorcin influyen factores como la viscosidad del lquido, pH, carga
elctrica, tiempo, presin y temperatura.
Los filtros de uso corriente en los laboratorios son aquellos cuyos elementos
porosos tiene forma de discos o bujas.
Radiaciones
Luz: Probablemente la luz es uno de los bactericidas ms poderosos que se conocen.
Para juzgar el efecto de la luz solar y otras radiaciones sobre las bacterias deben
considerarse los siguientes factores.

Longitud de onda e intensidad de la radiacin: Tienen propiedades

bactericidas las longitudes de onda oscilantes entre 2100 a 3000 A (ngstrom). La
mayor actividad bactericida del espectro corresponde a las radiaciones de la regin
ultravioleta. Los rayos catdicos infrarrojos refuerzan la accin de los rayos
ultravioletas.
Tipo de bacteria: La resistencia de las bacterias a la accin de la luz es muy
variada. Las especies esporgenas son ms resistentes que las asporgenas. Lo
mismo sucede con las bacterias fluorescentes (los pigmentes fluorescentes
convierten las ondas cortas germicidas en ondas de mayor longitud a menos
activas).

Medio en que se encuentra la bacteria: Un medio turbio u opaco no permite la

penetracin de la luz. En la naturaleza las bacterias estn protegidas de la luz solar
por los productos en que viven.
Radiacin ultravioleta
Los rayos ultravioletas tienen escaso poder de penetracin, lo que hacen que
ejerzan su accin principalmente sobre la superficie de material expuesto a la
irradiacin. Estos explican su limitada aplicacin en el laboratorio.
Radiaciones ionizantes (Rayos alfa, beta, gamma, X)

Rayos gamma: Son radiaciones de alta energa emitidas por istopos

radiactivos, como el Cobalto 60. Se emplean en la conservacin de alimentos
y esterilizacin de productos sensibles al calor, por ejemplo: hilos de sutura
quirrgica, jeringas desechables, etc.

Rayos catdicos: Se emplean haces de electrones de alta energa

producidos por un calentador. Tienen utilidad en la esterilizacin de
productos biolgicos y farmacuticos envasados. Tambin de trata de aplicar
en la industria de los alimentos.
La esterilizacin por radiaciones produce poca elevacin de la temperatura en
el material irradiado, por esta razn esta indicada en la esterilizacin de
sustancias termolbiles y de ah la denominacin de esterilizacin fra.

MTODOS DE ESTERILIZACIN

Antispticos
Qumicos
Desinfectantes

Flameo
Llama
Incineracin
Seco
Aire caliente
(HORNO PASTEUR)
(160C 180C por 1 hora)
Calor
Fsicos
Ebullicin
Hmedo
Vapor fluente
Vapor de agua a presin
(AUTOCLAVE)
(120C por 20 minutos)
Filtracin
Ultravioleta
Radiaciones
Radiaciones
(alfa, beta, gamma,etc.)

BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS
Para comenzar a trabajar en un Laboratorio Microbiolgico es necesario que el
alumno conozca y aplique las Normas de Bioseguridad y las Buenas Prcticas de
Laboratorio(GLP). Esto le permitir por una parte, mantener sus cultivos microbianos
en condiciones libres de contaminacin para as obtener resultados confiables, y por otra
parte, evitar accidentes y contaminaciones no deseadas de si mismo, de sus compaeros
y del medio ambiente.
La Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiologa estudia el riesgo de dao a las
personas y medio ambiente, para limitarlo o reducirlo a un nivel aceptable mediante el
uso de prcticas seguras. El riesgo se ha definido como el producto entre la magnitud de
un peligro potencial y su probabilidad de ocurrencia.
Las tcnicas de Bioseguridad han surgido de acuerdo a las necesidades de evitar
los accidentes en los laboratorios, debido a la existencia de distintos grados de riesgos
determinados por la variedad de microorganismos y el avance de las tcnicas de cultivo
y mantencin de cepas in vitro.
Adems es necesario considerar que muchos de los accidentes no slo pueden
afectar al operario sino, que tambin a la comunidad en general, al infiltrar cepas que
sean exticas para el pas.
Bioseguridad: Es un conjunto de normas destinadas a regular diversas acciones
tendientes a proteger la salud de las personas frente a riesgos por agentes biolgicos,
qumicos o fsicos.
El cumplimiento de estas normas, unidos al empleo de tcnicas adecuadas de trabajo en
los laboratorios, disminuye el riesgo para el personal y para la integridad de los
productos.
La manipulacin de agentes biolgicos representa un riesgo para las personas expuestas
directa o indirectamente, y para el ambiente.
L
a exposicin a un riesgo biolgico se puede producir en forma directa o
indirecta. En forma directa ocurre cuando las personas manipulan directamente un
agente biolgico mediante tcnicas y procedimientos establecidos. Si durante la
manipulacin ocurriese un accidente, el material biolgico puede ser esparcido al medio
ambiente del laboratorio. Esto podra contaminar a las personas, a los equipos, mesones
instrumentos, etc.
La exposicin indirecta a un riesgo biolgico puede ocurrir, por ejemplo, al tratar
inadecuadamente (sin seguir las normas establecidas), material biolgico contaminado.
Por ejemplo, descuidar las normas para desechar los medios de cultivo con crecimiento
de bacterias, provenientes de muestras de clnicas veterinarias o de cepas puras. Esto
podra contaminar el ambiente externo y a las personas que vivan en l, sin que ellas
tengan conocimiento de lo ocurrido. Es por esto que el riesgo indirecto constituye un
peligro potencial mayor, ya que al ser desconocido no puede ser evitado.

La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ha definido ciertos criterios para

clasificar agentes biolgicos segn su peligrosidad para el laboratorio y para la
comunidad. Estos son los siguientes:
1.- Capacidad patognica de la bacteria
2.- Modo de transmisin: contacto directo, indirecto, va area
vehculo(utensilios,alimento), vectores (otros organismos vivos)
3.- Rango de hospederos
4.- Disponibilidad de medidas de control eficaces
5.- Disponibilidad de tratamiento eficaz (vacuna, antibiticos, sueros)
6.- Concentracin y volumen del material con que se trabaja

(aerosoles),

En base a estos criterios, los laboratorios se clasifican en diferentes niveles de

riesgo, segn el tipo de bacterias que pueden manejar, de acuerdo a sus caractersticas
de diseo, construccin y medios de contencin de que disponen.
Riesgos por agentes biolgicos:
a) Por agentes microbiolgicos: El riesgo de infeccin por agentes microbiolgicos
se produce por inhalacin, ingestin, contacto directo a travs de la conjuntiva del
ojo.
b) Por animales de laboratorio: Se produce por la inhalacin de polvo contaminado
por desechos de animales o pelos, mordeduras, rasguos, o autoinoculacin
durante la manipulacin de ellos.
Riesgos por agentes qumicos:
a) Se produce por ingestin, inhalacin y/o contacto con la piel, tejidos, mucosas u
ojos, de sustancias txicas, irritantes y/o corrosivas, nocivas.
b) Grado de susceptibilidad de la persona para con la sustancia.
c) Capacidad de la sustancia de liberara energa (reactividad o inestabilidad)
Riesgos por agentes fsicos:
El riesgo a que se est expuesto por la manipulacin o ingestin de gases o partculas
radiactivas, exposicin a radiaciones ionizantes, exposicin a ruidos y vibraciones, a una
carga calrica sobre la superficie corporal y quemaduras.
Conceptos:
a) Los agentes biolgicos, qumicos y/o fsicos se clasifican; segn grado de riesgo
tanto como para el individuo como para la comunidad en grupos 1, 2, 3, 4.
b) Los laboratorios se clasifican de acuerdo al nivel de riesgo, diseo y barreras de
contencin que requieren en; bsico, de contencin y de contencin mxima.
c) Los niveles de Bioseguridad se clasifican segn el nivel de riesgo, tipo de
laboratorio, requerimiento de barreras de contencin y los procedimientos y
tcnicas a realizar, en niveles de Bioseguridad 1, 2, 3, 4.

Grupo de riesgo Niveles de

Bioseguridad

Clasificacin Ejemplos de
del
laboratorios
laboratorio
Grupo 1
Nivel 1
Bsico
Docencia
Agentes que en
Corresponde a
Recinto de
general constituyen actividades
diseo estndar,
bajo riesgo para el desarrolladas
en el cual, la
individuo y el
en un laboratorio
mayora del
laboratorio
bsico, con el personal
trabajo se
capacitado para
desarrolla en el
dicha labor
mesn. Se puede
trabajar con
agentes de
riesgo 1 y 2
Grupo 2
Nivel 2
Bsico
Laboratorios
Agentes que
Corresponde a
Hospitales y
constituyen
las actividades
Universidades

Ejemplo de
microorganismos

Contencin
Laboratorios
Recinto cuyo Especializados
disea contempla
acceso
restringido y
barreras de
contencin que
protegen al
operador
Contencin
Laboratorios
mxima
especializados
Recinto separado
con sistemas de
apoyo exclusivo
cuyo diseo
incluye barreras
de contencin
mxima al
personal y/o
comunidad

Legionella sp.
Bacillus anthracis
Mycobacterium
tuberculosis

riesgo moderado desarrolladas en,

para los individuos un laboratorio
del laboratorio y bsico con
limitado para la
personal
comunidad
capacitado en el
manejo de
agentes de
riesgo moderado
Grupo 3
Nivel 3
Agentes que
Corresponde a
constituyen alto
actividades
riesgo para
desarrolladas en
los individuos del un laboratorio de
laboratorio y bajo contencin, el
riesgo para la
personal debe
comunidad
contar con
adiestramiento
especfico
Grupo 4
Nivel 4
Agentes que
Actividades
constituyen un
desarrolladas en
alto riesgo para
laboratorio de
los individuos y
contencin
la comunidad
mxima, el
personal debe
estar
especficamente
adiestrado para
el manejo de
agentes de alto
riesgo y exticos

Lactobacillus sp.
Acidophyllus sp.
Bacillus cereus
Escherichia coli
Sarcinas

Enterobacterias
Clostridium tetani

Virus lassa
Virus Herpes
Virus Ebola
Citomegalovirus
Virus Respiratorio
Sincicial

AGRUPACIN DE LOS MICROORGANISMOS

Se ha considerado para agrupar a los microorganismos en cuatro grupos de
riesgo que representan una clasificacin en funcin del peligro creciente para la salud
humana :
Grupo 1- Organismos que no es probable que ocasionen enfermedad en humanos.
Grupo 2- Organismos que pueden causar enfermedad pero que son incapaces de
dispersarse por la comunidad y frente a los cuales se dispone de tratamientos eficaces
y profilaxis.
Grupo 3- Organismos que originan enfermedad grave en humanos y que pueden
extenderse por la comunidad pero frente a los cuales hay tratamientos eficaces y
profilaxis.
Grupo 4- Organismos que causan enfermedad grave en humanos y que pueden
suponer un alto riesgo por su extensin por la comunidad, frente a los cuales no
existe ni tratamiento adecuado ni profilaxis
Ejemplos de algunos microorganismos de los Grupos de Riesgo 2 y 3 capaces
de causar enfermedades humanas y que pueden encontrarse en un
laboratorio veterinario
Grupo 2
Virus: Virus influenza tipos A, B y C; virus Newcastle.
Bacterias: Campylobacter spp.; Chlamydia psittaci(cepa no aviar) ;Clostridium
tetani;
Clostridium botulinum;
Corynebacterium spp.; Erysipelothrix
rhusiopathiae; Eschericihia coli; Haemophilus spp.; Leptospira spp.; Listeria
monocytogenes;
Moraxella spp.;
Pasteurella spp.;
Pseudomonas spp.;
Salmonella spp.
Hongos: Aspergillus fumigatus; Microsporum spp.; Trichophyton spp.
Grupo 3
Virus: Virus de la rabia; virus de la encefalomielitis equina ; virus de la
encefalitis ovina.
Bacterias: Bacillus anthracis; Brucella spp.; Chlamydia psittaci (solo cepas
aviares);
Coxiella burnetti; Mycobacterium bovis.

Las necesidades esenciales de cualquier trabajo con agentes infecciosos, por

muy inocuos que puedan ser, son las siguientes:
1. El laboratorio debe ser fcil de limpiar, con superficies impermeables al agua y
resistentes a agentes qumicos. Deben tener una pila de lavado de manos y una
ducha de emergencia, incluyendo tambin un lavador de ojos en cada laboratorio para
los peligros de tipo qumico y de otro tipo presentes.
2.- El acceso de personal al laboratorio debe ser restringido.
3. En el laboratorio se debe de llevar puesta ropa adecuada de proteccin, incluyendo
guantes, mscaras y gafas protectoras apropiadas, que debe uno quitarse cuando
abandona el laboratorio.
4. La puerta del laboratorio debe cerrarse cuando hay trabajo en curso y debe existir
ventilacin por extraccin del aire de la habitacin. (Cuando se usan cabinas de
bioseguridad se debe tener cuidado en equilibrar los sistemas de ventilacin).
5. No se pueden guardar ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio.
6. No se debe fumar o aplicarse cosmticos en el laboratorio.
7. Deberan implementarse planes de respuesta de emergencia para el caso de
derramamiento de materiales de peligro biolgico. Entre los elementos de ese plan
deben figurar desinfectantes efectivos para limpiar los vertidos, descarte y
descontaminacin de la ropa de proteccin contaminada, lavado de manos y limpieza
y desinfeccin de las mesas de trabajo.
8. El material de vidrio usado y cualquier otro material de laboratorio debe ser
guardado con seguridad antes de su desinfeccin. Los materiales de desecho deben
transportarse sin vertido en contenedores fuertes. La basura debe ser esterilizada en
autoclave, incinerada o convertida en material seguro antes de su evacuacin. El
material reutilizable debe ser descontaminado por medios adecuados.
9. Nunca se eliminar material infeccioso por el desage del laboratorio ni ningn otro
tipo de escape similar.

Etapas del Metodo Directo

Toma de muestra
Tincion
Siembra
Incubacion
Crecimiento del Agente
Pruebas
Identificacion
Antibiograma
Cepa Conservada
Etapas del examen Bacteriologico y Antibiograma
1.- Tincion

2.- Aislamiento Bacteriano

3.- Antibiograma

TOMA DE MUESTRAS
Para obtener un resultado que identifique correctamente la infeccin, tiene
importancia recoger una muestra apropiada, usar condiciones de transporte correctos
y enviar con rapidez las muestras al laboratorio. Todas estas condiciones afectan la
exactitud del informe de laboratorio y, por lo tanto, su valor para el clnico y por ende
para el paciente. Tiene importancia extrema una buena comunicacin entre el clnico y
el microbilogo. El microbilogo puede aconsejar al clnico sobre la recogida de
muestras ptimas y estar mejor capacitado para guiar el procesamiento de estas
muestras si se han comentado los problemas del paciente.
PUNTOS CLAVE PARA LA TOMA DE MUESTRA
Tomar las muestras adecuadas
Recoger la muestra en el momento adecuado, es decir, durante la fase
aguda de
la enfermedad
S es posible, recoger la muestra antes de que el animal reciba
antimicrobianos
Recoger material suficiente y un nmero adecuado de muestras, por
ejemplo
sangre, suero suficientes para ms de un hemocultivo
Evitar contaminacin por:
a) Flora normal, por ejemplo, orina recogida de la segunda miccin
b) Equipo no estril
Usar contenedores y medios de transporte apropiados
Etiquetar las muestras adecuadamente
Rellenar el formulario de peticin, incluyendo informacin clnica suficiente
y una exposicin de la posible etiologa
Hablar con el microbilogo e informar al laboratorio si se requieren
pruebas especiales
Transportar las muestras con rapidez al laboratorio
La responsabilidad del clnico no termina con la recogida de la muestra y la
solicitud de las pruebas. Es esencial una buena comunicacin con el microbilogo.

Reglas generales de la toma de muestra

1. El tipo de muestra debe ser representativa del proceso infeccioso
2. Se debe tomar una cantidad adecuada de material
3. Se debe usar material estril y actuar aspticamente para no contaminar la
muestra
4. Deben tomarse antes de administrar agentes antimicrobianos
TOMA DE MUESTRA
1. Toma de muestra con trula estril.
2. Sujecin del animal y uso de bozal en
razas potencialmente agresivas
3. Uso de guantes estriles.
4. Transporte en contenedor refrigerado
5. Se debe enviar rpidamente al laboratorio
usando los medios de transporte adecuados
6. La muestra se debe obtener del sitio que
ms probablemente contenga el agente en ese
particular momento de la enfermedad
7. Debe ser manejado de tal modo que
favorezca la sobrevivencia y crecimiento del
mismo

Laboratorio N2
Examen en fresco, tcnicas de tincin y grupos bacterianos de importancia
mdica
Movilidad bacteriana
Otra caracterstica importante que poseen las bacterias es su movilidad, la cual
se realiza a partir de una muestra que halla sido colocada en un medio nutritivo que
permita el crecimiento y sobrevivencia de los microorganismos.
La muestra se toma utilizando pipetas Pasteur, esta alcuota es colocada en un
portaobjetos y protegida por el cubreobjetos para luego ser observada al microscopio
con lente de mediano o mayor aumento, y as determinar si el microorganismo es
mvil o no.
Se debe tener la precaucin de no confundir los movimientos propios del
microorganismo, con pseudos movimientos provocados por un exceso de lquido
(todos los microorganismos se observan en un mismo sentido), o bien, con
movimientos provocados por el exceso de microorganismos que genera el llamado
movimiento browniano, en el cual se observa un incesante movimiento de las
partculas microscpicas que estn en suspensin (en este caso se observan colisiones
entre los microorganismos).
Tincin de Gram
El examen microscpico de las muestras teidas y sin teir es relativamente
simple y econmico, aunque el cultivo es un mtodo mucho ms sensible para
detectar cantidades pequeas de bacterias.
La tincin de Gram es un procedimiento sencillo y til en la microbiologa
diagnstica.
La tincin por el Mtodo de Gram es la ms utilizada para teir bacterias.
Proporciona informacin sobre propiedades estructurales de la pared celular de las
bacterias. Mediante la Tincin de Gram se puede diferenciar entre bacterias Gram
(+) color azul y bacterias Gram negativo(-) color rosado. La tincin de Gram
adems, permite apreciar la morfologa y agrupacin bacteriana.
Cuando se sospecha de una infeccin bacteriana, la mayor parte de las
muestras remitidas debern extenderse en portaobjetos, teirse con Gram y
examinarse al microscopio.

Las bacterias se clasifican como Gram positivas o Gram negativas segn su

respuesta a la tcnica de tincin de Gram, este procedimiento denominado as por el
histlogo Christian Gram, quien desarrollo este procedimiento diferencial de
Las clulas se tien primero con cristal violeta y lugol, y luego se lavan con
alcohol tincin en un intento por teir bacterias en tejidos infectados. La ltima
etapa decolorar a una bacteria Gram negativa pero no a las Gram positivas.
La diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas reside en la
pared celular.
En la observacin microscpica, deber notarse por una parte la reaccin de
Gram, es decir, el color azul o morado que indica bacterias Gram positivas y el color
rojo bacterias Gram negativas, y en segundo lugar su forma, ya sean, cocos,
bastones, fusiformes y otros.
El aspecto de las bacterias en los frotis teidos con Gram no permite la
identificacin de las especies. Los informes de cocos Gram positivos en cadenas
sugieren estreptococos, pero no son definitivos; los bacilos Gram negativos pueden
ser grandes o pequeos o aun coco bacilares. Se debe tener en cuenta tambin que
algunas bacterias Gram positivas no viables pueden tomar la tincin Gram negativa.
Mtodo de Tincin de Gram

Extensin de la muestra: con asa, extender una gota de lquido sobre el

portaobjetos (si la muestra es slida tocar con el ansa y emulsionarla con una
gota de suero fisiolgico, agua peptonada o agua destilada).

Secado de la muestra: al aire caliente, con leve movimiento de vaivn; en

este paso se elimina el exceso de lquido, pero las bacterias continan vivas.

Fijar el frotis con calor (Mtodo de Kch): consiste en pasar 3 veces el

portaobjetos por la llama con un ngulo de 45, evitando un calentamiento
excesivo que carbonice la muestra. Puede fijarse con metanol o acetona fra (20C) y dejar actuar hasta la evaporacin.

Aplicar cristal- violeta ( 2 minutos)

Eliminar cristal- violeta
Aplicar lugol ( 30 segundos)
Eliminar lugol
Aplicar alcohol- acetona
Lavar con agua
Aplicar safranina o fucsina ( 1 minuto)
Lavar con agua y secar
Observar al microscopio con lente de inmersin
Interpretacin

Bacterias Gram positivas

color azul o violeta

Bacterias Gram negativas

color rojo o rosado

Esterilizar el ansa

Extendido de la muestra

4
45

Secado de la muestra

Fijado de la muestra
(Mtodo de Kch)

Bacterias Piogenas Gram (+)

1. Staphylococcus intermedius.
2. Staphylococcus aureus.
3. Streptococcus zooepidemicus.
4. Streptococcus equi.
5. Streptococcus agalactiae.
6. Corynebacterium pyogenes.
Bacterias Piogenas Gram ( - )
1. Pseudomoga aeruginosa.
2. Esxherichia coli.
3. Klebsiella pneumoniae.
4. Proteus spp
Bacterias piogenas causantes de otitis externa
1. Streptococcus intermedius.
2. Pseudomona aeruginosa.
3. Streptococcus zooepidemicus.
4. Corynebacterium pyogenes.

Tincin de Ziehl- Neelsen

Las bacterias cido-alcohol resistentes son aquellas que retienen la fucsina aun
cuando se intente decolorarlas con una mezcla de cido y alcohol.
Las bacterias cido alcohol resistentes (Las especies Mycobacterium, como la
que produce tuberculosis) son las nicas que poseen esta propiedad, tienen forma de
bacilos y se tien de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste.
Mtodo de Tincin de Ziehl Neelsen

Extensin (Igual procedimiento que en la tcnica anterior)

Secado de la Muestra (Igual procedimiento que en la tcnica anterior)
Fijar el frotis con calor (Igual procedimiento que en la tcnica anterior)
Aplicar fucsina concentrada ( 5 a 10 minutos) calentando la muestra
Lavar con alcohol cido y agua
Aplicar azul de metileno ( 1 minuto)
Lavar con agua y secar
Observar al microscopio con lente de inmersin
Interpretacin

Bacilos cido alcohol resistentes

Bacilos no cido alcohol resistentes

color rosado
color azul

Tincin de Cpsula
(Tincin de Olt)
La principal aplicacin de la tincin de Olt se realiza a nivel de matadero, ya
que permite observar la cpsula correspondiente al Bacillus anthracis, causante de la
enfermedad llamada Carbunco bacteridiano que afecta a los bovinos.
Las muestras en el caso de animales muertos se toman a partir de la mdula
sea del metacarpo (canilla) del animal y slo a nivel de laboratorio.
Mtodo de Tincin de Olt

Extensin (Igual procedimiento que en la tcnica anterior)

Secado de la Muestra (Igual procedimiento que en la tcnica anterior)
Fijar el frotis con calor (Igual procedimiento que en la tcnica
anterior)
Aplicar solucin de safranina (durante 5 a 10 minutos) calentando la
muestra
Observar al microscopio con lente de inmersin
Interpretacin
Cpsula de B. anthracis

color amarillo - anaranjado

Laboratorio N 3
Procesamiento de muestras clnicas, tcnicas de manejo y aislamiento a
partir de material infeccioso
Medios de cultivo y tcnicas de siembra
I.-Medios de cultivo:
Para que las bacterias puedan vivir y multiplicarse necesitan una serie de
sustancias: de estas tres son esenciales para su metabolismo; las sustancias
nitrogenadas, las sustancias hidrocarbonadas y sales minerales.
Definicin de medios de cultivo:
Son preparados estriles que contienen sustancias necesarias para el
desarrollo de los microorganismos.
Utilidad de los medios de cultivo:
Las finalidades mas importantes que cumplen estos medios nutritivos son:
1.- Aislamiento de las bacterias a partir de un material patolgico (pus, deposicin,
orina, etc.) o de producto natural (agua, leche, etc.)
2.- Estudio morfolgico de colonias.
3.- Conservacin de cepas identificadas (coleccin de cepas microbianas o cepario)
4.- Clasificacin y tipificacin de las bacterias por la observacin y estudio de su
comportamiento, caractersticas y reacciones que determinan en los diferentes
medios.
5.- Obtencin de toxinas o investigacin de sus caractersticas.
6.- recoleccin o cosecha de bacterias patgenas para la elaboracin de productos
biolgicos (vacunas, bacterinas)
Condiciones que deben tener los medios de cultivo:
a.- Contener las sustancias nutritivas, necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Generalmente se emplean materiales complejos obtenidos de
maceracin, infusin o caldo de tejidos de animales o vegetales, pero tambin se
pueden emplear soluciones salinas adicionadas de un complejo hidrocarbonado.
b.- Tener un pH conveniente. Por lo general, los microorganismos patgenos
requieren una reaccin neutra o ligeramente alcalina: pH 7 a 7,4.
c.- Estar previamente esterilizados.
d.- Estar protegidos de la contaminacin ambiental, mediante tapones de algodn
(algodn sin desgrasar) cardado o card.

Preparacin de los medios de cultivo:

En general, la preparacin de los medios de cultivo comprende 6 tiempos
fundamentales:
a.- Extraccin de los materiales nutritivos de los tejidos animales o vegetales que los
contienen.
b.- Adicin de las sustancias de sostn en medios slidos (agar - agar, gelatina, etc.)
c.- Ajuste del pH ptimo.
d.- Reparticin (en tubos, matraces, etc.)
e.- Esterilizacin.
f.- Control de esterilidad.
Clasificacin de los medios de cultivo
1.- Segn su estado fsico, los medios pueden ser lquidos o slidos.
a.- Medios lquidos: Fueron los primeros medios nutritivos empleados en
bacteriologa e ideados por Pasteur en sus investigaciones sobre fermentacin lctica
(1857) y aplicados en sus estudios sobre microorganismos del aire y durante su
controversia sobre la "generacin espontnea".
Su importancia en los trabajos diarios es indudable y en muchos casos es imposible
sustituirlos por los medios slidos (elaboracin de exotoxinas, pigmentos, enzimas,
etc.) Ejemplo: Caldo comn, agua peptonada, leche tornasolada, etc.
b.- Medios slidos: El primero en utilizar este tipo de medios fue Koch en el ao
1881, mtodo valioso de cultivo que ha contribuido enormemente en el progreso de la
microbiologa. Su ventaja primordial es la posibilidad de obtener el aislamiento de
especies microbianas por la formacin de colonias lo que es imposible en los medios
lquidos.
Estos mtodos slidos se componen por lo general, de las mismas sustancias
nutritivas que los medios lquidos, pero llevan adems una sustancia diferente, de
escaso o nulo valor nutritivo que sirve como sostn, como el agar - agar o gelosa.
Ejemplos: Agar corriente o agar comn, agar sangre, agar SS, etc.
2.- Segn aplicacin prctica:
Los medios de cultivo pueden dividirse en dos grandes grupos:
a.- Medios corrientes o bsicos: Son los medios apropiados para el cultivo y la
conservacin de la mayora de las bacterias y sirven de base para la preparacin de
los medios especiales. Los ms importantes son: Caldo comn, Agua peptonada, etc.
b.- Medios especiales: Son aquellos que por su riqueza en material nutritivo,
sirven para el cultivo de microorganismos muy exigentes; o bien que por la
presencia de sustancias inhibidoras para ciertas bacterias, permiten el aislamiento
y diagnstico precoz de otras que nos interesan y son agentes etiolgicos de

enfermedades infecciosas; finalmente estn comprendidos en este tipo de medios

especiales, aquellos que por la adicin de compuestos qumicos determinados
facilitan la diferenciacin ( por los caracteres bioqumicos ) de las especies
microbianas.
Segn estos diferentes objetivos, los medios especiales se clasifican en:
1.- Medios mejorados: Estos se obtienen aadiendo a los medios bsicos,
sustancias de mayor valor nutritivo, que tienen como efecto proporcionar
condiciones favorables para el cultivo de microorganismos exigentes,
(Streptococcus, Corynebacterium, etc.). Tales sustancias son: sangre (de conejo,
oveja, caballo), suero sanguneo, lquido asctico, huevo, cerebro, trozos o extracto
de hgado, bazo, etc. La gran mayora de estas sustancias, por ser albuminosas
coagulan por el calor, lo cual impide su esterilizacin mediante autoclave; ellas
deben mezclarse a los medios bsicos previamente esterilizados, procediendo con
rigurosa asepsia.
Agar sangre: Est compuesto de agar comn adicionado de sangre en proporcin
de un tercio. Es entre los medios mejorados, uno de los ms usados para el
aislamiento, estudios de hemlisis etc.
2.- Medios selectivos: En la prctica del diagnstico bacteriolgico ocurre con
frecuencia que el microorganismo patgeno que se pretende aislar del material de
examen no est puro, sino que convive con otras especies sin inters para el
diagnstico. As por ejemplo: las deposiciones, orina, las sustancias alimenticias,
las aguas de consumo, etc. estn altamente contaminadas con bacterias saprfitas
que por su desarrollo exuberante en los medios de cultivo inhiben el crecimiento o
enmascaran la presencia del agente patgeno buscado. Los medios selectivos se
caracterizan por estimular el desarrollo de determinada especie microbiana o
inhibir el metabolismo de otras especies morfolgicamente semejantes o no. Estas
caractersticas se obtienen por la adicin de sustancias tales como colorantes
anilina, sales biliares, antibiticos, etc. Este tipo de medios a favorecido un avance
formidable en la bacteriologa, ya que permite el aislamiento y diagnstico de una
especie microbiana con facilidad y rapidez.
3.- Medios indicadores o diferenciales: Son medios comunes o mejorados,
pero adicionados de ciertas sustancias que ponen de manifiesto determinadas
propiedades bioqumicas, inherentes a algunas especies microbianas, a saber;
produccin de gas,
de cido, accin proteoltica, etc. Estas sustancias o
indicadores permiten diferenciar rpidamente una especie microbiana de otra
semejante; por esta razn los medios adicionados de ellas se denominan
indicadores indicadores o diferenciales. As por ejemplo: Escherichia coli se
revela por el color rojo que presentan sus colonias en los medios lactosados a los
que se ha agregado Tornasol como indicador. Proteus vulgaris que no fermenta
la lactosa, da en ese mismo medio colonias transparentes.
Para emplear estos medios es indispensable trabajar con cepas aisladas y puras.

II.- TCNICAS DE SIEMBRA:

Siembra o cultivos: Operacin que
microorganismos en un medio de cultivo.

consiste

en

depositar

aspticamente

Principios generales:
1.- Realizarla en medios de cultivo favorables y previamente esterilizados.
2.- Emplear instrumentos estriles.
3.- No contaminar ni destruir los microorganismos.
4.- Depositarlos aspticamente en los medios elegidos.
5.- Esterilizar los instrumentos empleados inmediatamente despus
operacin.

de

cada

Los instrumentos ms corrientes empleados en las siembras son:

1.- Alambre de platino o nicrom: Sujeto a un porta asa o Mango de Klle. El
alambre puede ser recto (aguja) , en anillo de ms o menos 3mm de dimetro ( asa)
o aplastado en un extremo ( esptula ). Puesto en la llama del mechero Bunsen llega
rpidamente al rojo blanco (1300 C) y rpidamente tambin se enfra.
2.- Pipeta Pasteur: Tubo de vidrio con una extremidad afilada y cerrada, la otra
abierta, est protegida con algodn card (hidrfobo).
La tcnica general de siembra vara segn el estado fsico del material y del mtodo
de cultivo. Igualmente depende del ambiente en que ha de crecer el microorganismo
(aerobiosis o anaerobiosis)
Una siembra puede ser para aislar bacterias o bien para trasplantar (o repicar) una
cepa bacteriana pura.
Tcnica de diseminacin en una placa
Para poder realizar la diseminacin debemos tener los siguientes instrumentos:
a.
b.
c.
d.

Mango de Klle con su respectiva asa de niquel-cromo.

Mechero Bunsen.
Placa de Petri con medio de cultivo.
Muestra en estudio.

Para el aislamiento, podemos tomar una ansada de la muestra en estudio (materia

fecal, orina, sangre, esputo,etc.) en un punto perifrico de la placa, y con el ansa,
trazar una estra apretada de poca extensin; quemar y enfriar el ansa. Si se utiliza
un hisopo para obtener la muestra realizar la diseminacin apretada con el hisopo y
luego seguir con el asa.

Para realizar la primera siembra ciega, la placa se gira en el sentido contrario a

las agujas del reloj y se arrastra material de la estra primaria al medio sin sembrar,
en forma perpendicular, quemar y enfriar nuevamente el ansa.
Seguido de una segunda siembra ciega, se gira nuevamente la placa arrastrando
material de la segunda estra al medio nuevo en forma perpendicular.
Girando finalmente por tercera vez la placa sin esterilizar el asa, trazar una estra
final de agotamiento en el medio sin sembrar e incubar en la estufa de cultivo.
Al quemar el asa el nmero de colonias disminuir de la primera a la ltima estra,
permitiendo el aislamiento buscado.

III. MORFOLOGA
MICROBIANAS

ASPECTO

DE

LAS

COLONIAS

POBLACIONES

Desarrollo del cultivo en medio lquido

El cultivo de rutina en caldo se realiza en tubo de ensayo con 10 ml de medio o
en tubos de hemlisis con 3 ml de caldo. Las caractersticas de las poblaciones son:
Desarrollo superficial
A. Formacin de anillo: puede ser de tamao variado, adherido o no a la
pared del tubo; consistencia variada (pelcula tenue, grumosa o
membranosa); aspecto diverso (seco, hmedo, etc.).
B. Formacin de pelcula o velo: puede ser de diferente consistencia, gruesa
o fina, lisa o rugosa, hmeda o seca, ascendente por el tubo; al agitar puede
mantenerse o caer al fondo del mismo.
C. Formacin de precipitado floculoso: al agitar el tubo el precipitado
desciende formando largos flculos hasta el fondo del tubo (la floculacin es
la dispersin de grumos slidos en una solucin coloidal)
D. Formacin de pelcula membranosa: formada por una membrana ms
gruesa que la forma pelicular o de velo.
E. Desarrollo de superficie ausente: cuando se trata de bacterias
microaerfilas o anaerobias absolutas no se observa ningn desarrollo
superficial, pero si se advierte turbidez del medio en la parte inferior.
Turbidez del medio
Muchas bacterias se desarrollan produciendo enturbiamiento del medio debido a
la abundante suspensin celular. Esta turbidez tiene distintos grados y se la clasifica
segn su mayor o menor intensidad en leve, moderada o fuerte y por su duracin en
transitoria o persistente.
Formacin de sedimento
Muchos cultivos presentan sedimentos de diferente aspecto. Se clasifican en:
floculoso cuando el aspecto es granuloso grueso, granular cuando es granuloso fino,
escamoso y viscoso. La cantidad puede ser nula, escasa o abundante.

Desarrollo del cultivo en medio slido

La morfologa colonial en medio slido es caracterstica de cada tipo bacteriano.
Es til su observacin en un cultivo primario, para determinar si se trata de un cultivo
puro o la muestra est contaminada. Las caractersticas ms importantes son:
pigmentacin, forma, dimensiones, elevacin, contorno y superficies.
El color depende si existe presencia de pigmentos carotenoides. El
Staphylococcus aureus, por ejemplo, presenta pigmentacin amarilla.
La superficie puede ser lisa, rugosa, mucosa, anular concntrica o con surcos radiales.
La superficie lisa se debe a la presencia de cpsula o a las cadenas laterales de los
polisacridos de la membrana externa de los gram negativos y est muchas veces
asociada a la virulencia del microorganismo.
Las colonias rugosas tienen una superficie seca formada por clulas que carecen de
cpsula o que crecen en forma filamentosa. En algunos microorganismos las cepas
rugosas no poseen virulencia.
Un caso inverso es el Mycobacterium tuberculosis cuyas cepas patgenas presentan
colonias secas por el factor cuerda y las cepas mutantes de menor virulencia son de
aspecto mas liso. La superficie mucosa se observa en bacterias fuertemente
capsuladas como Klebsiella.
Las formas varan de puntiformes (< 1 mm de dimetro) hasta circular,
filamentosa, rizoide o irregular.
El borde puede ser entero, ondulado, lobulado, mellado, filamentoso o
festoneado. Otros rasgos son el olor y los caracteres pticos, el olor es caracterstico a
veces de algunas bacterias; por ejemplo: Pseudomonas tiene olor a flores y una
coloracin verdosa en el medio de cultivo lquido. Los caracteres pticos incluyen
aspecto opaco, traslcido, opalescente o iridiscente.

Siembra en anaerobiosis
Los medios de cultivo para las bacterias anaerobias poseen, en general, las
mismas sustancias nutritivas que los medios para las bacterias aerobias, pero es
necesario privarlos de oxgeno libre o en disolucin mediante procedimientos fsicos,
qumicos o biolgicos.
a.- Mtodos fsicos:
1.- Expulsin del aire por ebullicin.
2.- Extraccin del aire mediante bomba de vaco.
b.- Mtodos qumicos:
1.- Sustancias reductoras txicas para las bacterias por cuyo motivo no deben
adicionarse directamente a los medios de cultivo, sino en un lugar adecuado del frasco
o contenedor donde se han depositado los tubos, placas, etc. sembradas.
2.- Sustancias reductoras no txicas para las bacterias y que se agregan directamente
a los medios de cultivo. Ej.: glucosa al 1 2 %, Cistina al 0,05 %, etc.
c.- Mtodos biolgicos:
1.- Cultivo simbitico de una especie aerbica con otra anaerbica. La bacteria
aerbica estricta utiliza el oxgeno.
2.- Tejidos animales que pueden adicionarse a los medios lquidos. Ej.: Trocitos de
carne, hgado, cerebro, etc.

Laboratorio N 4
Interpretacin y valoracin de los hallazgos obtenidos en cultivos a partir de
muestras patolgicas y preparacin de antibiogramas por mtodo de difusin
en agar
Antibiticos y Antibiogramas
Antibiticos
Segn Waksman, ANTIBIOTICO es toda sustancia qumica producida por
organismos vivos (Bacterias, hongos o plantas) que tienen poder de inhibir el
desarrollo o destruir bacterias y otros microorganismos en soluciones dbiles.
En general los antibiticos se dividen en 3 grandes grupos:
1.-Naturales:
Aquellos que son sintetizados directamente por microorganismos.
2.-Semisintticos:
Son aquellos que siendo sintetizados por microorganismos, se utiliza su ncleo
estructural y se modifican por agregacin de ciertos radicales qumicos. Ej:
Amoxicilina, Cloxacilina, derivan todas de la Penicilina G.
3.- Sintticos:
Son aquellos sintetizados por el hombre una vez que se ha conocido forma
estructural. Ej: Cloranfenicol.
Modo de accin de los antibiticos
Los antibiticos actan como bacteriostticos o como bactericidas. Segn esto, Jawetz
ha dividido los antibiticos en 2 grupos:
Bactericidas:
Penicilina Estreptomicina, Bacitracina, Neomicina, Polimixina B
Bacteriostticos:
Tetraciclina, Cloranfenicol, Eritromicina, Novobiocina.

Medida de actividad
La actividad de la penicilina se mide por su accin sobre la cepa H de
Estafilococo (o la cepa 209 de la Food and Drug Administration). La unidad Oxford Florey es la cantidad de penicilina que disuelta en 1 ml. de diluyente produce un halo
de inhibicin de 24 mm. de dimetro.
La actividad de la penicilina se expresa en unidades Oxford. La actividad de
todos los dems se expresa en microgramos de droga pura cristalizada. Una unidad
Oxford de penicilina es igual a 0,6 ug. de penicilina pura cristalizada.

Antibiograma: Para comprender la importancia del antibiograma,

saber lo que es el espectro antimicrobiano y la resistencia de las
frente a un antibitico.
Espectro antimicrobiano: Es la capacidad que tiene un antibitico
sobre un determinado nmero de especies microbianas.
Resistencia: Es la capacidad que poseen ciertas bacterias de
multiplicarse en presencia de un antibitico.

debemos
bacterias
de actuar
crecer y

De estas dos definiciones se deduce que antes de hacer un tratamiento con un

antibitico, es necesario hacer el estudio In vitro de la sensibilidad o susceptibilidad
del microorganismo causante de la enfermedad frente a los diversos antibiticos, o lo
que es lo mismo, hacer un antibiograma.
Existen varios mtodos de antibiograma, los que pueden clasificarse en dos
grupos.
a.- Mtodo de dilucin en serie de antibitico.
b.- Mtodo de difusin del antibitico en agar.
a.- Mtodo de dilucin en serie:
Son mtodos cuantitativos, se realizan en medios lquidos. El antibitico se
distribuye en concentraciones progresivamente decrecientes en una serie de tubos
con un medio apropiado y se siembra despus en este medio cantidades idnticas de
cultivo de 18 horas de las bacterias cuya sensibilidad se estudia. Se incuba a 37 por
24 horas y se busca el ltimo tubo en que hay ausencia de desarrollo. La
concentracin de antibitico en este tubo nos indica el ttulo de sensibilidad
(Concentracin Mnima Inhibitoria MIC). Veamos en el siguiente cuadro un ejemplo de
ANTIBIOGRAMA POR DIL.

ANTIBIOTICO

CANTIDAD DE ANTIBIOTICO por ml.

Primera Segund
Tercera
Dilucin a
Dilucin
Dilucin

PENICILINA
ESTREPTOMICINA

10

01

0,5 U por ml.

CLORANFENICOL
AUREOMICINA

30

15

7,5 mc/gr por ml.

TERRAMICINA

08

04

2 mc/gr. por ml.

Con los mtodos de dilucin del antibitico se puede titular exactamente la

sensibilidad de una cepa bacteriana pero demanda gran cantidad de material, su
tcnica es demorosa y adems debe hacerse siempre el aislamiento previo de la cepa
o de las cepas infectadas para poderlas someter a prueba.
b.- Mtodos de difusin del antibitico en agar
Mtodo del disco de papel: Se emplean en placas Petri con una capa de 5mm. de
altura de medio Mueller Hinton, * cuya cara externa o inferior se ha dividido en
tantos espacios como antibiticos se va a probar.
Se debe disponer adems de discos de papel filtro de un grosor standard y de 0,7 cm.
de dimetro que han sido impregnados de antibiticos, de modo de obtener las
concentraciones de cada uno por disco.

Medio Mueller Hinton permite obtener siempre resultados comparables,

solo si la cepa es exigente, agregar 5% de sangre ovina.

Para hacer el antibiograma se procede en la siguiente forma:

1.- Se hace la siembra de la cepa aislada y cultivada durante 18 horas, a la
concentracin de 0,5 del nefelmetro de Mac Farland, en toda la superficie de la
placa, extendindola con una trula de algodn impregnada en la suspensin a
sembrar.
2.- Se deja secar la superficie de la placa por 5 a 10 minutos.
3.- Se coloca el disco de papel con antibitico en su respectivo lugar en la
superficie de la placa. El disco debe ser tomado con una pinza esterilizada.

4.- Se incuba la placa por 18 a 24 horas y se mide el dimetro de Inhibicin

producida por cada uno de los antibiticos (incluyendo los 0,7 cm. del papel).
El dimetro del halo de inhibicin no depende solo del antibitico de que se
trate, sino tambin de su pH, cantidad del inculo y concentracin del agar. Por esta
razn, el mtodo de difusin del antibitico debe ser realizado bajo las condiciones
standard, mencionadas anteriormente.
En el comercio existen discos de papel ya preparados, lo que facilita mucho la
tcnica y puede probarse un nmero mayor de antibiticos.
El mtodo de los discos de papel es el ms empleado entre los mtodos de
difusin del antibitico, los dems son slo variantes.
Prueba de sensibilidad in vitro (Antibiograma por difusion en agar)
Tecnica de Kirby-Bauer
Suspencion de 4-5 colonias en caldo comun.
Inoculacion de las placas.
Aplicacion de los sensidiscos.
Incubacion a 37C por 24 horas.
Lectura de placas e interpretacion de resultados

Laboratorio N 5
Interpretacin de antibiogramas e identificacin de mecanismos de accin,
espectro bacteriano de los antimicrobianos de uso clnico.
Tabla de interpretacin de las medidas de las zonas o halos de inhibicin
Dimetro halo de inhibicin en milmetros (Valores aproximados)
Antibitico
Potencia
Resistente
Sensibilidad
Sensible
Intermedia
Ampicilina
10ugr
20 o menos
21 - 28
29 o ms
Estafilococo
10 ugr
20 o menos
21 - 28
29 o ms
G(-)
Enterococo
10 ugr.
11 o menos
12-13
14 o ms
Bacitracina
10 U
8 o menos
9-12
13 o ms
Garbenicilina
100 ugr
13 o menos
14- 16
17 o ms
Cefaloridina
30 ugr
11 o menos
12-15
16 o ms
Cloranfenicol
30 ugr
12 o menos
13- 17
18 o ms
Colistn
10 ugr
8 o menos
9-10
11 o ms
Eritromicina
15 ugr
13 o menos
14- 17
18 o ms
Gentamicina
10 ugr
12 o menos
13- 16
17 o ms
Kanamicina
30 ugr
13 o menos
14 - 17
18 o ms
Lincomicina
2 ugr
9 o menos
10-14
15 o ms
Meticilina
5 ugr
9 o menos
10-13
14 o ms
Oxacilina
1 ugr
10 o menos
11-12
13 o ms
Ac. Nalidixico
30 ugr
13 o menos
14-18
19 o ms
Neomicina
30 ugr
12 o menos
13-16
17 o ms
Novobiocina
30 ugr
17 o menos
18-21
22 o ms
Nitrofurantona
300ugr
14 o menos
15-16
17 o ms
Penicilina G
Estafilococos
10 U
20 o menos
21-28
29 o ms
Otros
10 U
11 o menos
12-21
22 o ms
Polimixina B
300 U
8 o menos
9-11
12 o ms
Estreptomicina
10 ugr
11 o menos
12 - 14
15 o ms
Sulfamidas
300 ugr
12 o menos
13-16
17 o ms
Tetraciclina
30 ugr
14 o menos
15-18
19 o ms
Vancomicina
30 ugr
9 o menos
10-11
12 o ms
Cloxacilina
9 o menos
10-13
14 o ms
Sulfametoxazol
23,75 ug
10 o menos
11- 15
16 o ms
Trimetoprim
1,25 ugr
Estafilococo
27 o menos
28 o ms
E. coli
32 o menos
33 o ms
Ps. aeruginosa
26 o menos
27 o ms
Estreptomicina
10 ugr
11 o menos
12-14
15 o ms
Clindamicina
2 ugr
14 o menos
15- 16
17 o ms
Nitrofurantona
300 ugr
14 o menos
15- 16
17 o ms
Amikacina
11 o menos
14 o ms

MTODOS DE DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

El diagnstico microbiolgico se sustenta en el anlisis de aspectos tan

diversos de los microorganismos, tales como la: Fisiologa, inmunologa, biologa
molecular y reacciones husped-parsito involucradas en el proceso infeccioso.
Existen diversas estrategias que permiten abordar el diagnstico de un
agente infeccioso. Por un lado se investiga la presencia del agente o de sus
componentes en forma directa a travs de mtodos tradicionales, inmunolgicos y
moleculares. Por otro lado, en algunas situaciones el diagnstico se realiza en
forma indirecta a travs de la deteccin de la respuesta inmune generada por la
presencia de ste en el husped.

ECOLOGA MICROBIANA DEL CONDUCTO AUDITIVO NORMAL

La piel del conducto auditivo del perro sano posee una flora microbiana variada
de microorganismos comensales, que bajo ciertas condiciones pueden transformarse
en
patgenos,
stos
microorganismos
son:
Staphylococcus
intermedius,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus alfa y beta hemoltico, Micrococcus sp,
Corynebacterium sp y ocasionalmente Coliformes.
Los microorganismos que ms comnmente se han aislado del conducto
auditivo en perros afectados de otitis externa son: bacterias del gnero
Staphylococcus y hongos levaduriformes del gnero Malassezia.
La especie de Staphylococcus aislada con mayor frecuencia como parte de la
flora normal del conducto auditivo externo del perro es el Staphylococcus
intermedius. ste microorganismo del tipo coagulasa positivo ha sido aislado en el
47,6% del odo de animales sanos; otros microorganismos que a menudo se
encuentran como parte de la flora normal corresponden a bacterias del gnero
Pseudomonas y Proteus mirabilis, este ltimo en perros sanos se encuentra en una
frecuencia cercana al 5%. Entre los hongos levaduriformes ms frecuentemente
aislados de odos sanos, se mencionan los gneros: Rhodotorula, Cndida,
Cryptococcus y Malassezia, esta ltima se ha reportado como parte de la flora
normal, en un 20 a un 49% de los casos.
Debido a que los hongos unicelulares (levaduras), colonizan la superficie del
canal tico y se encuentran habitualmente adheridas a clulas escamosas exfoliadas,
sin embargo, en un odo sano, no deberan encontrarse en un frotis ms de dos o tres
microorganismos por campo.
Estudios realizados en la ciudad de Santiago de Chile, se ha observado que
Malassezia pachydermatis sola o asociadas a otros microorganismos, es la
responsable de aproximadamente del 90% de las otomicosis externas en perros.
(Court, 1988)

Es sabido por otra parte que Malassezia pachydermatis es un comensal de la

piel y del conducto auditivo externo del perro y que tiene una relacin simbitica con
los Staphylococcus que son comensales de las mucosas aprovechando as algunos
metabolitos y sustancias producidas por ste, las que constituyen factores de
crecimiento de beneficio mutuo. Es por ello que es comn que odos de perros
afectados por Malassezia pachydermatis, pesenten tambin un elevado nmero de
Staphylococcus intermedius en la piel y lesiones cutneas del tipo Piodermas
recurrentes.
En los laboratorios de diagnstico veterinarios, se observa en la prctica de los
anlisis de las muestras de secrecin tica recepcionadas para estudios
microbiolgicos, que muchas veces las bacterias pigenas aisladas van asociadas de
este hongo oportunista que corresponde a Malassezia pachydermatis.
Existe evidencia de que este hongo levaduriforme en el canino corresponde a un
microorganismo comensal que tambin puede ser aislado desde los sacos anales y
vagina, adems del conducto auditivo.
Malassezia pachydermatis, se desarrolla con facilidad en agar Sabouraud entre
35 C y 37 C, comnmente se asla asociada con bacterias, frecuentemente del
gnero Staphylococcus sp, pero tambin puede encontrarse en cultivos puros,
especialmente en animales que han sido sometidos a tratamientos con antibiticos,
por perodos prolongados.
OTITIS MIXTA CAUSADA POR BACTERIAS Y LEVADURAS
En la prctica clnica no es infrecuente observar otitis de tipo mixta, en donde se
asocian
bacterias
pigenas
como:
Pseudomonas,
Corynebacterium
o
Staphylococcus y el hongo levaduriforme Malassezia pachydermatis, en algunos
de estos casos es posible incluso que el animal afectado presente adems de la
sintomatologa tpica de otitis, compromiso de su estado general acompaado de un
cuadro febril.

CLASIFICACIN MICROBIANA DE COCACEAS

Staphylococcus intermedius
Staphylococcus aureus
Staphylococcus hycus
Streptococcus zooepidemicus
Streptococcus equi
CLASIFICACIN MICROBIANA DE BACILOS ( Diferenciar G(+) y G(-) )
Bacillus anthracis
Bacillus subtilis
Corynebacterium pyogenes
Clostridium septicum
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus vulgaris
CLASIFICACIN MICROBIANA DE ESPIRILOS Y ESPIROQUETAS
ESPIRILOS:
Vibrio cholerae
Campylobacter coli
Campylobacter jejuni
ESPIROQUETAS:
Leptospira icterohemorragica
Leptospira canicola
Borrelia burgdorferi
Treponema hyodisenteriae

Laboratorio N6

Principales agentes causantes de micosis en veterinaria, manifestaciones

generales de la enfermedad y procedimientos para su diagnstico, control y
prevencin.
I.- Micologa general
A.- Introduccin
Micologa; de "Miketos": hongos es aquella rama de la Microbiologa que estudia los
hongos.
Los hongos microscpicos, forman parte del grupo de clulas eucariotas, las
condiciones ambientales que favorecen el crecimiento de los hongos son la hmedad
relativa y temperatura alta, se caracterizan por ser de mayor tamao que las
bacterias midiendo aproximadamente 5 micras de dimetro, poseen un ribosoma 80
S, y se caracterizan porque tienden a formar filamentos. La mayora de los hongos que
son patgenos para hombres y animales presentan esporas externas o conidias o
aleuriosporas, que son las responsables de la reproduccin y pigmentacin del hongo.
Los hongos microscpicos de acuerdo al tipo de clula que presentan, se dividen en
dos grandes grupos: Hongos levaduriformes (unicelulares) y Hongos miceliados
(pluricelulares).

Hongos levaduriformes

Hongos miceliados

Los hongos crecen en todos los climas de la Tierra, viven en medios acuticos o
en ambientes hmedos, pero tambin en ambientes relativamente secos. La nica
condicin para el crecimiento de los hongos en la naturaleza es la presencia previa o
simultnea de otros organismos. Los hongos pueden encontrarse prcticamente en
todas partes, incluso en lugares en los que no se aprecian rastros de materiales
nutritivos.
Completando la definicin de hongos, podramos agregar, que se trata de
microorganismos carentes de clorofila, con clulas de un dimetro superior a 5
micrones, tienden a formar filamentos. Nutricin de tipo heterotrfico (Saprfitos o
parsitos). Tpicamente inmviles. Generalmente acumulan glicgeno como sustancia de
reserva.
Ramas de la micologa
Al igual que la Bacteriologa, comprende varias ramas:
a.- Micologa Agrcola:
Que se ocupa de los hongos patgenos para los vegetales superiores.
b.- Micologa Mdica:
Que trata de los hongos patgenos para el hombre y los animales.
c.- Micologa de la Leche:
Que se ocupa de los hongos y levaduras que contaminan la leche y derivados (queso y
mantequilla).
d.- Micologa Industrial:
Que estudia los hongos que tienen utilidad en la industria, especialmente en la
elaboracin de diversos productos orgnicos mediante procesos llamados de
"fermentacin" en la que intervienen activamente cepas seleccionadas de algunos
hongos. As por ejemplo se incluyen aqu, la fermentacin alcohlica, ctrica, oxlica,
glucnica, fumarica, etc. Dentro de esta rama se estudian tambin algunas levaduras
que tienen valor alimenticio como es la Torulopsis utilis (rico en vitaminas del
complejo B y protenas), el Endomyces vernalis (utilizado en la produccin de grasas),
etc.
Actualmente la Micologa industrial, ha desarrollado un captulo de enorme importancia
en medicina, cepas de hongos de los gneros Streptomyces y Penicillium
principalmente.
B.- Clasificacin:
Los Hongos verdaderos, llamados tambin "Eumycetes" o "Fingi" se dividen en 4 clases:

1.- Clase Phycomycetes (Phyco=alga) llamados as porque se les consideraba como

algas degeneradoras. Su caracterstica principal es la de presentar un micelio continuo,
sin tabiques y provisto de numerosos ncleos en su interior.
2.- Clase Ascomycetes. (Askos=saco). Hongos de micelio tabicado que se multiplican
por esporas exgenas o conidias o por esporas endgenas o ascosporas, stas
ltimas, formadas en el interior de clulas en forma de sacos, llamadas "ascos".
3.- Clase Basidiomycetes. Hongos que se multiplican por esporas de origen sexuado,
externos y que se desarrollan en el extremo de las clulas llamadas "basides".
4.- Clase Deuteromycetes o Fingi Imperfecti. Comprende aquellos hongos que no
presentan reproduccin sexuada o estos procesos son desconocidos (hongos
imperfectos); forman generalmente esporas externas o conidias originadas en
conidiforos de forma variada; nunca en ascos o basides. Algunos no producen esporas
de ningn tipo. En esta clase estn incluidos la mayora de los hongos patgenos para el
hombre y los animales (hongos mdicos).

C.- Morfologa general:

El conjunto de desarrollo de un hongo se denomina TALO (Thallo) trmino que es similar
al de COLONIA usado con mayor propiedad en Bacteriologa. El talo entonces, es la
masa visible a simple vista del hongo y que se representa con un aspecto algodonoso,
velloso, cremoso, etc.
El talo puede estar constituido por un conjunto de elementos unicelulares o bien por
elementos multicelulares o filamentosos, en cuyo caso, el talo recibe ms bien el
nombre de micelio.
1.- Talo de elementos unicelulares. Es propio de las levaduras verdaderas. Est
constituido por clulas aisladas que por lo comn se multiplican vegetativamente,
pudiendo hacerlo por tres procesos diferentes.
a.- Por brotacin en que la clula emite un brote o pequeo mameln, cuya
base de unin se estrecha hasta que se produce la estrangulacin completa y queda
libre de la clula madre (Torulopsis).
b.- Por divisin transversa o escisin, como sucede en las levaduras del
gnero Schizosaccharomyces, en que la clula madre forma un tabique medio, el cual
se abre por desdoblamiento dando lugar a dos clulas hijas del mismo tamao.
c.- Por proceso intermedio, entre brotacin y escisin; ejemplo:Gnero
Saccharomyces.

2.- Talo multicelular. O como ya se dijo "micelio" puede ser de dos tipos segn su
formacin:
a.- Verdadero si los filamentos miceliados se originan de un tubo germinativo del
esporo que crece longitudinalmente, pudiendo tabicarse o no y luego ramifica
numerosas veces, recibiendo cada rama el nombre "hifa".
b.- Pseudomicelio (falso micelio) si los filamentos se forman por simple proceso
de yemacin o brotacin, pero en que las clulas hijas no se separan de la clula madre,
sino que quedan unidas por sus polos y al mismo tiempo se alargan dando la impresin
de filamentos (Candida albicans).
Los hongos filamentosos o "mohos" en su totalidad presentan micelio verdadero en que
sus ramas o hifas se diferencian biolgica y morfolgicamente sus funciones de
reproduccin o propagacin de la especie. Desde este punto de vista, es necesario
distinguir en un hongo de dos tipos de micelio:
a.- Micelio vegetativo. Cuyas funciones son de nutricin,
sostn o defensa. Es en realidad, el conjunto de filamentos o hifas que se originan de la
germinacin del esporo. Estas hifas pueden presentar en su trayecto, tabiques
transversales, en cuyo caso se habla de micelio tabicado, en otros casos los
filamentos carecen de tabiques y se observan como una masa protoplasmtica continua
multinuclear, es el llamado micelio continuo, caracterstico de la Clase Phycomycetes.
b.- Micelio reproductivo. Est constituido por el conjunto de hifas que naciendo
del micelio vegetativo se diferencian para dar origen a clulas destinadas a funciones de
reproduccin que son los ESPOROS. Este tipo de hifas, se llaman "hifas frtiles".
3.- Los esporos, pueden ser a su vez uni o plurinucleados, hialinos o pigmentados
(verde, azul, pardo, rojo, amarillo, negro, etc.) a ellos se debe el color de la superficie
del talo o colonia. La forma de estos elementos es tambin variable, pueden ser
esfricos, ovales, elpticos, cilndricos, etc. La cubierta de los esporos puede ser simple o
doble (endosporio y exosporio). La cubierta externa suele ser lisa o bien rugosa.
De acuerdo con la presencia de tabiques o no los esporos se clasifican de la
siguiente forma:

Amerosporas, los que carecen de tabiques (Aspergillus, Penicillium).

Didimosporos, si presentan un tabique central (Cephalothecium).

Fragmosporos,
Fusarium).

si

poseen

varios

tabiques

transversales

(Microsporum;

Dictiosporos, si adems se presentan tabiques transversales se observan

tambin tabiques en el sentido longitudinal (Alternaria).

Los esporos pueden nacer en cualquier punto del micelio vegetativo o de hifas frtiles
sin que proceda a su formacin, proceso sexuado alguno, en este caso, se habla de
esporos asexuados. Cuando se originan a partir de la fusin de clulas sexuadas o
gametos, se habla de esporos sexuados. (Himenomycetes).
4.- Elementos vegetativos de reproduccin.
En ciertos hongos, el micelio vegetativo suele dar origen a elementos que sin ser
esporos verdaderos son capaces de multiplicarse; entre estos elementos tenemos los
artrosporos que se generan en cualquier punto del micelio por fragmentacin. As es
posible observar que al lado de filamentos largos y ramificados aparecen elementos
rectangulares libres o en va de desprenderse del filamento con el cual forman un
ngulo diedro. Son caractersticos de los hongos del gnero Geotrichum y
Trichophyton.
5.- Elementos vegetativos de resistencia.
a) Clamidosporos: Tanto las levaduras como los hongos filamentosos, suelen
formar en condiciones desfavorables, clulas que conservando la morfologa general de
las clulas vegetativas, tienen a veces, un dimetro mayor que ellas y al mismo tiempo,
estn revestidas de un doble y gruesa pared. Estas clulas se llaman Clamidosporos que
pueden ser intercalares o terminales.
b) Bulbillos: Son ovillos microscpicos constituidos por pelotones de filamentos
densamente entrelazados. Cuando son visible a simple vista (1 mm. de dimetro)
reciben ms bien el nombre de esclerotes.
D.- Reproduccin de los hongos:
Como ya lo explicamos, existe un grupo de hongos que solo se propaga por fragmentos
de su micelio vegetativo (Geotrichum). Al lado de este grupo, la mayora de los hongos
forman clulas especialmente diferenciadas para las funciones de multiplicacin y
diseminacin de la especie, pudiendo adems, servir como elementos de
resistencia, sobre todo cuando poseen una membrana gruesa y un contenido denso,
pobre en agua. Estas clulas as diferenciadas reciben el nombre de esporos y los
elementos que los originan hifas o filamentos frtiles. El conjunto de las hifas
frtiles, a veces tambin diferentes de hifas vegetativas y agrupadas en ocasiones en
formaciones especiales, es lo que se denomina micelio reproductivo o de
fructificacin.

Los esporos, pueden nacer en cualquier punto del micelio vegetativo o de hifas frtiles
sin que preceda a su formacin, proceso sexual alguno, esporos asexuados, que
pueden ser internos, endosporos, o externos, exosporos o conidias, o por el
contrario, originarse como consecuencia de un acto sexual consistente en la fusin de
dos clulas sexuales o gametos con formacin de un diplocito; se llaman entonces,
esporos sexuados, que tambin pueden ser internos o externos, como veremos ms
adelante.

MICOSIS
Por lo general se sospecha en la posibilidad de una Micosis en aquellos casos de
afecciones crnicas, ya sea de tipo cutnea o visceral, de aspecto descamativo,
nodular o supurativo y que no pueden atribuirse a una causa bacteriana a pesar de los
exmenes de laboratorios repetidos y bien practicados.
En el diagnstico de laboratorio de las infecciones por hongos en general, el
mtodo ms rpido es el examen microscpico directo del material para as poder
determinar la presencia de elementos micticos. Sin embargo cuando esto son
negativos, es necesario proceder a los mtodos de cultivo para obtener la informacin
definitiva. Fuera de los cultivos pueden emplearse tambin otros procedimientos
adicionales que ayudan al diagnstico como la Lmpara de Wood, la inoculacin
experimental, pruebas inmunolgicas y tcnicas de anticuerpos fluorescentes.
Segn el tipo de tejidos en que se localiza la infeccin las micosis se dividen en :
Micosis sistmicas o profundas: afectan fundamentalmente los
rganos internos y las vsceras.
Micosis subcutneas: afectan la piel, tejido subcutneo, fascias y
huesos.
Micosis cutneas o Dermatomicosis: afectan la epidermis, pelos y
uas.

II.- Tcnicas micolgicas

Se pensar en la posibilidad de una micosis en aquellos casos de afecciones crnicas, ya
sea de tipo cutnea o visceral, de aspecto descamativo, nodular o supurativo y que no
pueden atribuirse a una causa bacteriana a pesar de los exmenes de laboratorios
repetidos y bien practicados.
En el diagnstico de laboratorio de las infecciones por hongos, el mtodo ms rpido es
el examen microscpico directo del material para determinar presencia de elementos
micticos. Sin embargo, cuando stos son negativos, es necesario proceder a los
mtodos de cultivo para obtener la informacin definitiva. Fuera de los cultivos pueden
emplearse tambin otros procedimientos adicionales que ayudan al diagnstico como la
luz de Wood, la inoculacin experimental, las preparaciones teidas, los cortes

histolgicos, las pruebas inmunolgicas y la tcnica de los anticuerpos fluorescentes

(Rogers y Beneke, 1970).
1.- Recoleccin del material
Es necesario obtener suficiente material para los exmenes directos y por cultivos. Las
muestras que corrientemente se recolectan para investigacin micolgica, ya sea
cutnea o viceral son : pelos , escamas, uas, frotes a partir de lceras, pus, lquido
cfalo raqudeo, y otros fluidos, orina, esputo, sangre, mdula sea, lavados bronquiales
y biopsias.
Para nuestro estudio slo nos referiremos a las tcnicas para recolectar muestras de
lesiones superficiales.
a Pelos: Es absolutamente necesario arrancarlos mediante pinzas de depilar a
fin de poder examinar hasta el bulbo piloso y lograr as una nocin exacta de
la invasin del hongo cuando se realiza el examen microscpico. Por lo
general, el borde de las lesiones proporciona mejor material que a nivel del
centro. La muestra recogida deber ser colocada en lo posible entre dos
portaobjetos bien flameados (para esterilizarlos) o bien en tubo o frasquito
esterilizado, los cuales deben ser envueltos en un formulario con los datos
necesarios. Cuando no es posible contar con un depsito adecuado para
enviar la muestra al laboratorio puede recurrirse al simple mtodo del
papelillo el cual, en todo caso debe introducirse en un sobrecito de papel
grueso para evitar contaminaciones a otras personas.
b Escamas: No hay ningn inconveniente en limpiar previamente el rea de la
lesin con alcohol de 70 a fin de remover algunos algunos contaminantes
superficiales. Las escamas deben tomarse de preferencia de las zonas ms
activas de la lesin, especialmente a nivel de los bordes. Para este objeto se
emplearn dos portaobjetos flameados, colocando uno de ellos de canto
contra la pared inferior de la lesin y con el otro se raspar la superficie
enferma de arriba abajo para hacer caer las escamas sobre el portaobjeto
que se mantiene fijo. Tambin se puede raspar la superficie con un bistur o
una lanceta.
c Pstulas: Se las punzar, previa asepsia de la epidermis que las cubre, con
alcohol de 70, con una pipeta Pateur afilada y se aspirar su contenido. La
misma operacin puede hacerse mediante una jeringa provista de una aguja
relativamente gruesa.
d De lesiones bucales, farngeas o vaginales: Se obtendr el material
mediante una trula o hisopo de algodn hidrfilo esterilizado el que se
pasar o frotar varias veces por la superficie enferma. El hisopo se repone
en el tubo en que venia introducido y as se enva al laboratorio junto a su
correspondiente formulario de datos.
2.- Examen directo del material obtenido
Todo producto extrado de lesiones que contenga sustancia crnea (pelos, escamas,
uas) debe examinarse con un lquido clarificante a fin de facilitar la observacin

microscpica de los elementos de hongos si estn presentes. Pueden emplearse los

mtodos de gran uso en la prctica:
a Solucin de potasa custica al 30 o 40 % (til sobre todo para el examen de
escamas)
b El Cloral lactofenol, que adems de clarificante conserva la preparacin por
largo tiempo. Es usado de preferencia para el examen de pelos. La frmula
de este lquido es la siguiente:
Hidrato de coral cristalizado
2 partes
cido lctico puro
1 parte
Fenol
1 parte
Tcnica
Depositar el material en un portaobjeto, luego en el centro de un cubreobjeto colocar
una gota gruesa de algunos de los lquidos mencionados. Se invierte el cubreobjeto
sobre el material para que el lquido lo bae totalmente y se calienta suavemente a la
llama gua del mechero Bunsen hasta el desprendimiento de burbujas (cuidar de no
calentar demasiado porque puede saltar el cubreobjeto por excesiva ebullicin). Luego
se suspende el calentamiento y se deja enfriar. Examinar al microscopio, primero con
objetivo seco de pequeo aumento; una vez localizado el campo que nos interesa
usar el objetivo seco de mayor aumento.
En las escamas y fragmentos de uas es posible observar filamentos septados y
ramificados; a veces artrosporos. Dichos filamentos pueden presentarse aislados o
bien entrelazados; su nmero depende del grado.
Para el examen de cualquier otro material que no contenga sustancias crneas
(exudados, serosidades, pus, etc.) no es necesario el empleo de lquido clarificante,
basta en tales casos, observar directamente la muestra entre la lmina y laminilla
diluyndolo en una gotita de solucin salina.
Como se ve el examen directo del material para investigar hongos difiere
fundamentalmente del empleado en bacteriologa ( frotis) y las preparaciones son en
general de tipo conservados, es decir, en lo posible de mantener la estructura del
material a examinar. Slo en algunos casos como ocurre por ejemplo con las
levaduras, resulta de utilidad la tcnica de extensiones coloreadas con Gram u otro
colorante bsico.

Laboratorio N7
Principales tecnicas de cultivo de muestras para estudio micologico
Siembra del material.
a Pelos y escamas: En una pequea caja Petri, dividirlos en partculas tan
pequeas como sea posible verlas a simple vista a objeto de obtener un
cierto nmero de cultivos puros (Negroni). Esta operacin puede efectuarse
con un pequeo bistur afilado o en su defecto con una hoja de afeitar. Nunca
se depositar en la superficie de un medio de cultivo un pelo entero o un
fragmento grande de escama o ua.
Para sembrar se toma un
porta asa que lleve un hilo de platino o nicrom doblado en ngulo recto en su
extremo (gancho o hilo en forma de L). Se calienta al rojo y se enfra
clavndolo en el medio de cultivo slido; en esta forma su extremidad queda
barnizada con una delgada capa de medio que facilitar la toma de las
partculas. Se colocar sucesivamente una partcula en la superficie del
medio a una distancia de 1,5 cm. una de otra. Se deben sembrar en esta
forma 4 a 6 tubos para obtener xito. Temperatura de incubacin es de 20
25 C. Conviene, sin embargo, colocar por lo menos 2 tubos a la temperatura
de 37C (algunos Trichophytoncrecen mejor a esta temperatura).
b Pus, serosidades, exudados: Se vierte una pequea cantidad con el
mismo instrumento con que han sido recogidos (pipeta, jeringa, asa,etc.) en
la extremidad superior del medio de cultivo, en este caso la tcnica es muy
semejante a la usada en bacteriologa.

Hongos patgenos en animales y hombre

Micosis superficiales
Enfermedad

Gnero
Microsporum
Trichophyton

Tias

Especie
canis, gypseum
mentagrophytes
verrucosum
gallinae
rubrum

Candidiasis

Epidermophyton
Candida

Otomicosis

Aspergillus

Micosis ocular
Dermatitis
mictica

Fusarium
Alternaria
Scopulariopsis sp.

tonsurans
schoenleinii
floccosum
Albicans
Krusei
Tropicalis
fumigatus
niger
roseum sp.

Animal suceptible
Perro, gato, nio
Equino, perro, gato y
hombre
Ternero y hombre
Gallinas y pavos
Hombre,
bovino
y
equino
Hombre y bovino
Hombre, bovino y perro
Hombre
Aves, terneros, perros y
hombre
Perro, bovino, equino y
hombre

Micosis Subcutneas
Enfermedad

Gnero

Especie

Esporotricosis

Sporothrix

schenkii

Animales
ms
suceptibles
Equino,
perro,
bovino y hombre

Micosis sistemtica
Enfermedad

Gnero

Hitoplasmosis

Histoplasma

Criptocococis

Criptococcus

Candidiasis

Cndida

Ficomicosis

Mucor
Rhizopus

Neumomicosis
Aspergillosis

o Aspergillus

Especie

Animales
ms
susceptibles
capsulatum
Frecuentemente
en
animales
domsticos
en
reas endmicas,
perro,
cerdo,
bovino y hombre
neoformans
Bovinos
de
lecheras, perro y
hombre
albicans, krusei, Aves,
terneros,
tropicalis
perro y hombre
spp. Bovino,
equino,
nigricans
aves,
perro
y
hombre
fumigatus, niger, Aves,
bovino,
flavus- orizae
equino,
gato,
perro y hombre

Micotoxicosis
Enfermedad

Gnero

Micotoxicosis

Arpergillus
Fusarium
Penicillium
Alternaria

Especie

Animales
ms
susceptibles
flavus-orizae,
Aves,
cerdos,
fumigatus, niger, bovinos, equinos
ochraceum
y hombre
roseum spp.
Cerdos, bovinos,
aves, hombre
spp.
Aves,
cerdos,
bovinos y hombre
tenuis
Aves, bovinos y
hombre

Laboratorio N8
Observacin al microscopio de colonias de hongos miceliados. Caractersticas especificas
por genero de hongo.
A.- Hongos productores de micosis externas o dermatomicosis
Dentro de este grupo tenemos a hongos productores de Otomicosis, ficomicosis,
etc. Pero los ms importantes seran los que se conocen con el nombre genrico de
Dermatofitos que son hongos filamentosos que se caracterizan por su gran afinidad
por la queratina de la piel y sus anexos (pelos, uas). Son los agentes causales de las
lesiones conocidas como tias. Los dermatofitos comprenden 3 gneros siendo slo
dos los ms importantes para nosotros: Microsporum y Trichophyton ya que el
gnero Epidermophyton es exclusivo de la especie humana.
La identificacin del agente causal de estas micosis se establece:
a Por examen directo de pelos y escamas, en los cuales se busca filamentos y
artrosporos.
b Por examen de cultivos, en que debe estudiarse el aspecto macroscpico de
las colonias y el aspecto microscpico del micelio, especialmente la evidencia
de esporas gigantes las macroaleuriosporas (o macroconidias), y de esporas
pequeas las microaleuriosporas. Otras estructuras de valor secundario son:
los clamidosporos (elementos vegetativos de resistencia con funciones de
esporos), las hifas pectneas (en forma de peineta ), los espirales, los
candeleros fvicos (hifas ensanchadas en sus extremos como cabeza de uas
o epfisis de hueso largo).
El hallazgo de estos elementos, su morfologa, nmero dimensiones, etc. son de
gran valor para la identificacin de especie del dermatofito en estudio.
Gnero Microsporum
Est constituido por hongos miceliados cuyo color varia desde el blanco hasta el
pardo. Se reproducen en los cultivos principalmente por macroaleuriosporas
fusiformes, tabicadas transversalmente y accesoriamente por microaleuriosporas
claviformes. Producen la tia microsprica de los animales y el hombre. En los pelos
se localizan por fuera de l formando una vaina irregular de pequeos artrosporos,
disposicin en mosaico. La especie ms importante en medicina veterinaria es:
Microsporum canis: Afecta perro, gato, nio, etc. En los medios de
cultivo (Saboureaud) se desarrolla rpidamente, entre 3 y 4 das, dando
colonias lanosas de color blanco- grisceo. Pigmento difusible amarillo, limn o
anaranjado. Al microscopio lo que ms llama la atencin es la gran cantidad de
macroaleuriosporas fusiformes, pluriseptados, de 50 micras de largo por 16 a 20
micras de ancho, de pared rugosa y espinosa. En los cultivos primarios se
pueden evidenciar microaleuriosporas piriformes no tabicadas, que crecen
lateralmente a lo largo de las hifas.

Microsporum gypseum: Es un dermatofito gefilo, frecuente en jardines

bien abandonados. Puede causar la tia espordica en perro, gato, y nios ( a
veces tambin en adultos).
Colonias: Se desarrollan rpidamente, tienden a ser invasoras y
presentan un micelio areo pulverulento y de color beige o ligeramente caf. El
reverso es de color rojizo o anaranjado.
Examen microscpico: Se observan numerosas macroaleuriosporas
grandes, elipsoides, de paredes delgadas y equinuladas, con 4-6 tabiques
transversales. En los cultivos primarios, escasas macroaleuriosporas en forma
de clave. Puede evidenciarse tambin hifas en raquetas, hifas pectneas y
clamadosporos.
Gnero Trichophyton
Los hongos de este gnero se caracterizan por invadir el pelo ya sea
exteriormente (ectothrix) o bien penetrando en su interior (endothrix). Al
examen directo del palo, se observan filamentos que se resuelven en numerosos
artrosporos dispuestos en cadena o sea perfectamente ordenados (diferencia
con Microsporum). Citaremos las especies ms importantes:
Trichophyton mentagrophytes: Da origen a colonias aplanadas, de
superficie yesosa, aterciopelada o algodonosa, de color blanco con bordes
desflecados.
Al
examen
microscpico
se
observan
abundantes
microaleuriosporos globulosas, dispuestas en racimo, adems es fcil
encontrar hifas en espiral. Las macroaleuriosporas son escasas generalmente
en forma de cigarro y no tan tpicas como en el Microsporum. Afecta al
equino, hombre, etc.
Trichophyton verrucosum: Produce colonias de desarrollo lento, a veces
requiere hasta 2 semanas de incubacin; de aspecto montaoso plegado o
cerebriforme, a veces cubierta por un fino vello blanco o amarillo ocre y
brillante. Microscpicamente, es posible observar un gran predominio de
clamidosporos de diversos tamaos. Son muy escasas las hifas vegetativas
regulares. Las macroaleuriosporas son extremadamente raras, si se llegan a
observar tienen la forma de cola de ratn. Igualmente raras son las
microaleuriosporas, cuya forma es de clava o de lgrima. Produce
corrientemente la tia del bovino (empeine en los terneros). En los pelos
forma artrosporos grandes, de ns de 5 micrones que se disponen por fuera
del pelo (extothrix).
Trichophyton rubrum: Las colonias son algodonosas o aterciopeladas. En el
reverso forman pigmento rojizo o prpura que puede extenderse hasta las
hifas marginales. A la observacin microscpica se presentan numerosas
microaleuriosporas claviformes o redondeadas en grupos a aisladas a lo
largo de las hifas; las macroaleuriosporas son muy escasas y tienen la forma
de un lpiz. Aunque se la describe como propia del hombre; sin embargo se
ha podido aislar el hongo tambin en el equino y otras especies.
Trichophyton schoenleini : Se le relaciona con la tia llamada fvica o
favus. Forma colonias de aspecto cerebriforme, de color blanco amarillento

como la cera. Afecta al bovino y al hombre.

Trichophyton gallinae: Es agente

enfermedad que se localiza en la
descubiertas (cresta, barbillas). En
vellosas y planas. A 30C produce un

causal de favus en gallinas y pavos,

cabeza, especialmente en las partes
los cultivos las colonias son blancas,
pigmento rosa plido difusible.

B.- Hongos productores de micosis internas

Gnero Cryptococcus
Hongos levaduriformes que no forman pseudomicelio ni ascosporas, no
fermentan los azcares con formacin de gas. Los cultivos tienen aspecto mucoide y
son positivos a la reaccin de almidn.
Para ver mejor la cpsula se debe cultivar en medio con maltosa. Crecen en medio
Sabouraud pero sin adicionar Actidiona a temperatura de 30-37C.
Especie tipo y agente patgeno
Cryptococcus neoformans: Es agente causal de la Criptococosis del hombre y los
animales. En los tejidos se presenta como clulas esfricas u ovoides, con o sin brote,
pero rodeadas de una ancha cpsula retrctil y gelatinosa. En cultivos se desarrolla
lentamente (Sabouraud o agar sangre). Tiene caractersticas descritas para el Gnero.
El portador principal son las deyecciones de palomas, se pueden encontrar en todos
los climas.
Gnero Candida
Hongos levaduriformes que se caracterizan por la formacin de pseudomicelio. No
produce ascosporas y puede fermentar los azcares con formacin de gas.
Especie importante:
Cndida albicans: Agente causal de las llamadas moniliasis o candidiasis del
hombre y de los animales. En los medios de Sabouraud origina colonias de color
blanco-amarillentos, cremoso, de superficie lisa. Forma pseudomicelio, micelio
verdadero y clamidosporos cuando se siembra en agua de papas al 20 por mil. En los
medios de fermentacin forma gas de glucosa y maltosa, pero es negativo a lactosa y
sacarosa.
Gnero Aspergillus
Hongos miceliados cuyas hifas frtiles llevan en su extremo una vescula en cuya
superficie se implantan unas clulas en forma de botellitas llamadas esterigmas o

filides que son las que dan origen a las esporas en cadena una de las especies ms
importantes desde el punto de vista patognico es:
Aspergillus fumigatus: Agente causal de la aspergilosis o neumomicosis de las aves
( paloma, gallina, pavo, etc.) y en menor escala de los mamferos entre ellos el
hombre. Desarrolla colonias planas aterciopeladas de color azul-grisceo al cabo de
24-48 horas. Al microscopio se observa la forma caracterstica de la vescula que es
hemisfrica ( como abanico), con una sola corrida de esterigmas y cadenas de
conidias que en conjunto dan una forma columnar.
Gnero Sporothrix
Hongos de micelio muy fino (2 micras de ancho). Forma esporas ssiles, aglobadas o
piriformes, aisladas o en racimos. Especie importante:
Sporothrix schenkii: Agente causal de la esporotricosis del caballo, mula, perro,
hombre, etc. Se desarrolla con relativa facilidad en los medios de Sabouraud a la
temperatura de 25-28C. Las colonias son montaosas, elsticas, espinosas, de color
blanco al principio despus se tornan caf.
C.- Hongos causantes de micotoxicosis
Las micotoxinas son en general, productos txicos del metabolismo de los hongos. Se
entiende por Micotoxinas aquellas sustancias txicas de los hongos saprfitos que
daan por su contenido de producto del metabolismo txico dentro de los alimentos al
hombre y a los animales.
Los alimentos contaminados con micotoxinas no necesariamente presentan
signos de descomposicin o presencia visible del hongo.
Enfermedad producida por:
Hongos oportunistas: Producidas por el hongo mismo, cantidad masiva (cuadros de
aborto, gastroenteritis,etc.).
Producido por la toxina del hongo. Micotoxicosis
Micotoxicosis
Hongos ms frecuentes: A. flavus ; Fusarium sp
A.ochraceum; Penicillum spp .
Toxinas:
Aflatoxina B1 B2-M1 y M2 (carcinoma)
Ochratoxina (hepatotxica y nefrotxica)
Zearalenona (estrognica)
Acido Koji (neurotxico)

;A.fumigatus; A. niger;

Alimentos ms afectados: Maz, heno, pellet de soja, arroz, cebada, cereales

Especies animales afectadas: Aves, cerdos, bovinos, ovinos, hombre.
Fuentes de infeccin y factores que influyen:

a Medio ambiente (fuente comn exterior): Temperatura, humedad, contenido de

nutrientes,almacenaje.
b Factores individuales: Edad, especie, niveles protecos, vitamina A y K, sexo.
Micotoxinas pueden actuar en distintas formas en la produccin normal:
Intoxicacin aguda primaria, con manifestaciones violentas, nefritis, hepatitis
aguda, necrosis y muerte.
Intoxicacin crnica primaria que provoca reduccin en el crecimiento, produccin
de leche o huevos segn el caso.
Intoxicacin crnica secundaria que predispone a las enfermedades infecciosas
por reduccin de mecanismos naturales de resistencia a inmunidad.
Diagnstico de las Micotoxinas debe basarse en la presencia de las toxinas de los
hongos en el alimento como tambin por las lesiones patolgicas y cuando es posible
en los tejidos y orina.
Mtodos de diagnstico para aflatoxinas
Anlisis microbiolgico identificacin del hongo
Mtodo minicolumna presencia o ausencia de la toxina del hongo
Cromatografa en capas finas Mtodo cualitativo y cuantitativo (es el de
mayor exactitud) para la deteccin de la toxina.