TRANSFORMACIN GENTICA DE PLTANO (Musa sp. CV.

HARTN) MEDIANTE BIOBALSTICA APLICADA A TEJIDOS

MERISTEMTICOS
Rosanna Valerio C. y Eva C. de Garca
RESUMEN
El pltano es uno de los cultivos ms importantes en el
mundo por constituir el alimento bsico de millones de personas y una importante fuente de ingresos para los pases
productores. En los ltimos aos la produccin mundial de
pltano se ha visto afectada por numerosas enfermedades
causadas por virus, bacterias, insectos y hongos, las cuales
provocan grandes prdidas en la produccin y ameritan el
uso de diversos tipos de funguicidas e insecticidas, perjudiciales para el ambiente y relativamente costosos. Mltiples
instituciones han centrado sus investigaciones en el desarrollo de variedades de pltano y cambures resistentes mediante el uso de distintos mtodos modernos de fitomejoramiento, tales como mutagnesis, variacin somaclonal y

transformacin gentica. En este trabajo se utiliz el mtodo de biobalstica para transformar pices caulinares in
vitro de plantas de pltano (Musa cv. Hartn) con micropartculas de tungsteno recubiertas con ADN del plsmido
CAMBIA3201 portador de los genes gus y bar, en una mquina de bombardeo de baja presin de fabricacin local.
La transformacin de los pices se logr a una distancia
tejido-can de 9,5cm, presin de He de 150psi y concentracin de ADN de 2g/disparo. Se obtuvo un total de 22
plantas transformadas con los genes gus y bar, cuya presencia fue demostrada por la prueba histoqumica de GUS,
y su insercin al ADN mediante la amplificacin (PCR) de
fragmentos con iniciadores especficos.

GENETIC TRANSFORMATION OF PLANTAIN (Musa sp. CV. HARTN) BY A BIOBALISTIC METHOD APPLIED TO
MERISTEMATIC TISSUE

Rosanna Valerio C. and Eva C. de Garca

SUMMARY

Plantain is one of the most important crops in the world

as it is the basic food staple of millions of people and an
important source of income for producing countries. In the
last years, world plantain production has been affected by
numerous diseases generated by viruses, bacteria, fungi and
insects, resulting in large production loses and requiring
the use of fungicides and insecticides that cause important
environmental damage and contribute to production cost
increase. Multiple institutions focus their research on the
development of resistant varieties of plantain and banana
through different plant improvement methods such as mutagenesis, somatoclonal variation and genetic transformation.

In this research, the biobalistic method was used to transform in vitro caulinar buds of plantain (Musa cv. Hartn)
with tungsten microparticles covered by the DNA plasmid
CAMBIA3201 carrying the gus and bar genes, at different distances and pressures, with a homemade low pressure
bombardment machine. Apex transformation was accomplished at a tissue-cannon distance of 9.5cm, He pressure
of 150psi and DNA concentration of 2g/shot. A total of 22
transformed plants carrying the gus and bar genes were obtained as shown by the GUS histochemical test. PCR with
specific initiators was used to verify their insertion in the
genomic DNA.

Introduccin

por el hongo Mycosphaerella fijiensis, han ocasionado

grandes prdidas en la produccin. Aunque la sigatoka
se controla comnmente a
travs del uso de fungicidas,
ello resulta en un elevado
costo de produccin y provoca daos al ambiente, lo
que ha hecho necesario el

El pltano es uno de los

cultivos ms importantes a
nivel mundial al constituir el
alimento bsico de millones
de personas en los pases tropicales en vas de desarrollo
y una importante fuente de
ingresos para los mercados lo-

cales e internacionales (Frison

y Sharrock, 2000) y representa uno de los rubros frutales
de exportacin ms importantes para Venezuela.
An cuando el cultivo de
pltanos en Venezuela se ha
incrementado en los ltimos
aos, enfermedades como la
sigatoka negra, producida

desarrollo de variedades de
pltano y cambures resistentes a travs de la aplicacin
de distintos mtodos tales
como hibridacin, mutagnesis, variacin somaclonal
y t r a nsfor m a cin gent ica. Media nte h ibr idacin,
por ejemplo, la Fundacin
Hondurea de Investigacin

PALABRAS CLAVE / Transformacin Gentica / Biobalstica / Musa / Gen bar. /

Recibido: 30/11/2006. Modificado: 12/02/2008. Aceptado: 20/02/2008.

Rosanna Valerio C. Licenciada

en Biologa, Universidad de
Oriente (UDO), Venezuela.
Doctor en Ciencias en Botnica, Universidad Central de

MAR 2008, VOL. 33 N 3

Venezuela (UCV). Profesora,

UDO, Venezuela. Direccin:
Laboratorio de Fisiologa y
Cultivo de Tejidos Vegetales,
UDO, ncleo Sucre, Venezue-

la. e-mail: rosanna_valerio@

hotmail.com
Eva C. de Garca. Licenciada
en Biologa, UCV, Venezuela.
M.Sc., University of Wiscon-

0378-1844/08/03/225-07 $ 3.00/0

sin, EEUU. Doctor en Ciencias

en Botnica, UCV, Venezuela.
Profesora, UCV, Venezuela. email: egarcia@reacciun.ve

225

TRANSFORMAO GENTICA DO PLTANO (Musa SP. CV. HARTN) MEDIANTE BIOBALSTICA APLICADA A
TECIDOS MERISTEMTICOS
Rosanna Valerio C. e Eva C.de Garca
RESUMO
O pltano (banana-da-terra) um dos cultivos mais importantes no mundo por constituir o alimento bsico de milhes de pessoas e uma im portante fonte de ingressos para
os pases produtores. Nos ltimos anos a produo mundial
de pltano tem sido afetada por numerosas enfermidades
causadas por vrus, bactrias, insetos e fungos, as quais
provocam grandes perdas na produo e se faz necessrio
o uso de diversos tipos de fungicidas e inseticidas que so
prejudiciais para o meio ambiente e relativamente custosos.
Mltiples instituies tm centrado suas investigaes no desenvolvimento de variedades de pltano e banana resistentes
mediante a utilizao de distintos mtodos modernos de fitomelhoramento, tais como metagneses, variao somaclonal

e transformao gentica. Neste trabalho se utilizou o mtodo de biobalstica para transformar pices caulinares in
vitro de plantas de pltano (Musa cv. Hartn) com micro partculas de tungstnio recobertas com ADN do plasmideo CAMBIA3201 portador dos genes gus e bar, em uma
mquina de bombardeio de baixa presso de fabricao local. A transformao dos pices foi alcanada a uma distancia tecido-canho de 9,5cm, presso de He em 150psi e
concentrao de ADN em 2g/disparo. Obteve-se um total
de 22 plantas transformadas com os genes gus e bar, cuja
presena foi demonstrada pela prova histoqumica de GUS,
e sua insero ao ADN mediante a amplificao (PCR) de
fragmentos com iniciadores especficos.

Agrcola (FHIA) ha obtenido variedades de pltano y

cambures resistentes a travs de cruzamientos clsicos
ent re genot ipos d iploides
mejorados. Entre estas var iedades se encuent ra n el
FHIA-21 (AAAB), FHIA-01
(AAAB), FHIA-02 (genoma
AAAB) y FHIA-03, bananos
resistentes a la sigatoka negra y a otras enfermedades.
A travs de variacin somaclonal se han producido
bananos resistentes a sigatoka
(Trujillo, 1994; Trujillo y De
Ga rca, 1996 ; Gimnez et
al., 2001). Mediante mutagnesis fsica y qumica se
han desarrollado bananos con
crecimiento vigoroso y floracin temprana (Novak et al.,
1990), y plantas con resistencia a la infeccin por Fusarium (Smith et al., 1993).
Con relacin a la transformacin gentica, la introduccin efectiva de genes en
el genoma de plantas de banano y pltano se ha obtenido mediante transformacin
directa con Agrobacterium
(Arntzen y Lam, 1992; May
et al., 1995; Ganapathi et
al., 2001), electroporacin
(Andreason y Evans, 1988;
From m et al., 1985; De
Garca y Villarroel, 2007)
y bombardeo de microproyectiles (Sagi et al., 1995;
Becker et al., 2000; Gmez
Lim et al., 2002; Finalet et
al ., 20 02 ; Sreera ma na n y

de pices mer istemticos

caulinares y se multiplicaron
por inmersin temporal. Los
pices fueron transformados
con el vector portador del
gen de inters, y se verific la expresin transitoria y
su insercin molecular del
gen inyectado en las plantas
transformadas.

226

Marziah, 2002a, b; GmezKosky et al., 2002).

Los mtodos de transformacin usados hasta ahora
han brindado buenos resultados, pero la bsqueda de
resistencia contra diversas
enfermedades que atacan al
gnero Musa apenas comienza. Aunque el desarrollo e
introduccin de los cultivares mejorados FHIA en diversos pases ha contribuido
a la mejora significativa de
la sit uacin, la obtencin
de cult iva res comercia les
mejor a dos de Mu s a sp. a
travs de hibridacin resulta
d ifcil e i nvolucra mucho
tiempo. Por ello las tcnicas
de propagacin in vitro se
han convertido en una alternativa promisoria. La regeneracin de plantas a partir
de clulas en suspensin o
de embriones somticos ha
abier to el ca m ino pa ra la
incorporacin de determinados caracteres va transformacin gentica.
El objetivo de esta investigacin consisti en el establecimiento de un sistema
eficiente de transformacin
gentica de plantas de pltano (Musa sp. cv. Hartn)
mediante la aplicacin de
bomba rdeo de micropa r tculas (biobalstica) a tejidos
meristemticos. Para ello se
obtuvieron pices caulinares
in vitro de pltano cv. Hartn por micropropagacin

Materiales y Mtodos
Iniciacin y multiplicacin
de pices
El proceso de iniciacin de
pices meristemticos caulinares se realiz de acuerdo
a la metodologa de Hardy
y Garca (1994). Este proceso involucra la obtencin
y esterilizacin del pice a
sembrar mediante una serie
de lavados y reducciones sucesivas del cormo inicial en
soluciones de cloro comercial
a distintas concentraciones.
Una vez obtenido el pice,
ste es lavado con agua destilada estril en cmara de
f lujo laminar y reducido a
un ta ma o adecuado pa ra
su posterior siembra en medio slido de Murashige y
Skoog (1962) suplementado
con 2,5mgl -1 de BAP (MSMAP). Transcurridos 30 das
posteriores a la siembra, el
pice iniciado es cortado longitudinalmente en dos partes
iguales con el fin de inducir
la ruptura de la dominancia

apical y la consecuente activacin y desarrollo de las

yemas laterales.
Para la multiplicacin de
las yemas obtenidas durante
el cultivo in vitro se emplearon dos procedimientos: 1) el
procedimiento convencional
consistente de la siembra del
material vegetal en medio
MS-BAP slido (Ha rdy y
Garca, 1994) y 2) el uso del
sistema de inmersin temporal (SIT) consistente de
varios recipientes de inmersin temporal automatizados
(RITA), dentro de los cuales
se coloc 250ml de medio
MS-BAP lquido y el material vegetal a proliferar, en
este caso pequeos brotes
del cultiva r de pltano en
estudio, que fueron inmersos
por 30min cada 6h. Tanto
el RITA como el medio de
cultivo fueron esterilizados
en autoclave durante 20min
a 121C y 15lb de presin. El
sistema fue mantenido a una
temperatura de 24 1C en
luz continua.
Material blanco y medios
de cultivo
El tejido vegetal blanco
del bombardeo consisti de
grupos de yemas (multiyemas) extradas directamente
del medio de multiplicacin
MS-BAP, constituidos por 3
a 8 yemas cada uno (Figura
1) que fueron colocados sobre

MAR 2008, VOL. 33 N 3

Bar2: 5-CAGGAACCGGCAGGAGTGGA-3 ( Posicin

9471-9489 del pCAMBIA

3201).

Figura 1. Aislamiento de multiyemas de Musa sp. cv Hartn a partir de grupos grandes de yemas cultivadas en medio
MS-BAP (Hardy y Garca, 1994). a: Recipiente con yemas sobre medio MS-BAP, b: grupo de yemas aisladas en
placa de Petri con medio MS-BAP, c: dos yemas aisladas sobre medio MS-BAP en placa de Petri.

medio MS-BAP en placas de

Petri e incubados en oscuridad por 1-2 das (tratamiento
pre-bombardeo), antes de ser
disparados sobre esas mismas
placas. Posterior al bombardeo, las multiyemas fueron
transferidas a placas de Petri
con medio fresco hasta la
aparicin de brotes, los cuales se trasfirieron entonces a
medio MS sin hormonas.
Plsmido vector
Se utiliz el plsmido
CAMBIA3201 (Figura 2), desarrollado por el laboratorio
de Biologa Molecular del Medical Research Council, Inglaterra, y donado al Centro para
la Aplicacin de la Biologa
Molecular en la Agricultura
Internacional (CAMBIA, por
sus siglas en ingls) de Canberra, Australia. Este plsmido multicopia es un vector de
11459pb, provisto de un origen
de la replicacin para su replicacin autnoma y mltiple en
la clula anfitriona, del gen
cat de resistencia al cloranfe-

nicol para seleccin en bacteria, del gen gus como reportero para la identificacin de las
clulas transformadas, del gen
bar como marcador de seleccin que confiere resistencia
al herbicida glufosinato de
amonio (BASTA) y de la secuencia promotora constitutiva
CAMV35S, la cual permite la
expresin constitutiva de los
genes gus y bar en la clula
anfitriona.
Extraccin del ADN
plasmdico
En la extraccin del ADN
plasmdico utilizado para el
bombardeo de los pices se
parti de 1ml de cultivo de
Escherichia coli contenedoras
del plsmido CAMBIA3201
(500l de cultivo de bacterias
+ 500l de glicerol estril)
vertido en 100ml de medio
LB (10g bactotriptona, 5g
extracto de levadura y 10g
NaCl) con 250l de cloranfenicol (10mgml-1). El medio
LB con bacterias se incub
toda la noche a 37C con agi-

tacin constante. La extraccin

del ADN se realiz segn dos
protocolos, el Wizard Plus
Midipreps DNA Purification
System (1999) de Promega y
el protocolo de Sambrook et
al. (1989). El pellet de ADN
obtenido al final de cada proceso se resuspendi en agua
estril y se almacen a -20C
hasta el momento de la evaluacin de su integridad y
cuantificacin. Luego de realizadas las diluciones del ADN
plasmdico requeridas para el
bombardeo, ste se almacen
en tubos Eppendorf a -40C.
Verificacin de la presencia
de los genes gus y bar
La amplificacin de fragmentos de ADN de los genes gus y bar presentes en
el ADN del plsmido CAMBIA3201 se hizo mediante
PCRs especficas utilizando
iniciadores (primers) sintetizados qumicamente y homlogos a las secuencias de dichos
genes. Las secuencias especficas empleadas para el gen
gus permiten la amplificacin
de un fragmento de 1200pb,
mientras que las secuencias
para el gen bar amplifican un
fragmento de 372pb. Dichas
secuencias son:
G u s1: 5- G G T G G GA A
AGCGCGTTAC-3 (Posicin

307-324 del pCAMBIA

3201).
Gus2: 5-GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3 (Posicin

1485-1506 del pCAMBIA

3201).

Bar1: 5-CCAGAAACCCACGTGATGCC-3 ( Posicin

Figura 2. Mapa del vector pCAMBIA3201

MAR 2008, VOL. 33 N 3

9118-9137 del pCAMBIA

3201).

La reaccin de amplificacin (PCR) se realiz en un

volumen final de 25l y los
productos fueron visualizados en gel de agarosa 1,5%
en buffer TAE 1X a 50V.
Las condiciones de amplificacin usadas fueron para
el gen gus 95C (5min), 40
ciclos de 94C (30seg), 63C
(30seg) y 72C (1min) y, finalmente, 72C (10min). Para
el bar 95C (5min), 40 ciclos
de 94C (30seg), 60C (30seg)
y 72C (1min) y, finalmente,
72C (10min).
Bombardeo de los pices
Mquina de biobalstica. Se
emple una mquina de baja
presin fabricada localmente
segn diseo de Finer et al.
(1992). La misma puede alcanzar un vaco mximo de
21lb de Hg y presiones de
He entre 0 y 400psi. Est
provista adems de controles
para seleccionar el tiempo de
vaco e inyeccin del disparo,
as como la carga y descarga
del vaco.
Parmetros de bombardeo.
Se utilizaron micropartculas de tungsteno de 1,1m
de dimetro ester ilizadas
con etanol 70-100% y posteriormente incubadas con
ADN, CaCl 2 estril 2,5M y
espermidina 0,1M (Klein et
al., 1988). La distancia de
disparo fue de 9,5cm, a una
presin de 150psi. La concentracin de ADN utilizada fue
de 2,0g/disparo (modificado
de K lein et al ., 1988). Se
emple un vaco de 21lb de
Hg y un tiempo de inyeccin
de 0,1seg. Para evita r que
los explantes fuesen expelidos al recibir la descarga
de microproyectiles, sobre
el tejido blanco se colocaron
mallas metlicas con poros
de 1mm.
En las placas de Petri con
medio MS-BAP slido (8gl-1
de agar) se dispusieron 12
yemas por placa, distribuidas
en tres yemas por cuadrante,
colocadas en el sitio proba-

227

ble de cada de las micropartculas disparadas. Antes

y despus del proceso de
bombardeo las yemas fueron
mantenidas por dos das en
oscuridad. Posterior al disparo, los explantes fueron transferidos a placas de Petri con
medio MS-BAP fresco, y luego de 14-21 das se registr
el nmero total de pices supervivientes y se tomaron las
muestras foliares y radicales
para la prueba histoqumica
de GUS. Los pequeos brotes
obtenidos fueron transferidos
a medio MS sin hormonas
de crecimiento para obtener
las vitroplantas, sin utilizar
agente de seleccin (BASTA)
en el medio de cultivo.
Verificacin de la
transformacin gentica
Seleccin y regeneracin
de las plantas transformadas. No se realiz la prueba
de seleccin con el herbicida
BASTA debido a dos razones.
1) El alto nivel de quimerismo mostrado por las plantas
bombardeadas, revelado por
la evaluacin histoqumica
de la actividad de la -glucuronidasa realizada 15-21
das posterior al bombardeo,
lo que aumentaba la probabilidad de muerte de los pices
disparados en el medio de
seleccin, por la ausencia de
transformacin en muchos
sectores de tejido regenerado;
en efecto, el tejido foliar de
muchas de las plantas tratadas con X-Gluc mostr solo
algunas clulas epidrmicas
(estomas) con coloracin azul
de muy baja intensidad. 2) El
bajo nivel de supervivencia de
los pices debido al dao fsico ocasionado por las micropartculas disparadas, lo que
aumentaba la probabilidad de
muerte de los pices y por
ende el riesgo de eliminar
los posibles transgnicos obtenidos mediante el proceso
biobalstico.
La regeneracin de los
pices caulina res bomba rdeados se logr en medio de
multiplicacin de brotes (con
2,5mgl1 BAP) ~10 das despus de la fecha del disparo.
Una vez ocurrida la apari-

228

cin de brotes, stos fueron

transferidos a medio MS sin
hormonas para la obtencin
de las plantas.
Evaluacin histoqumica de
la actividad -glucuronidasa. Para evaluar la expresin
transitoria del gen gus en el
tejido recin bombardeado, se
emple el sistema reportero
GUS (Jefferson et al., 1987).
La prueba se realiz 15-21
das despus del bombardeo,
una vez ocurrida la aparicin de hojas y races en los
explantes bombardeados. Se
incub segmentos de hoja
(1cm 2 ) y raz (2cm de largo) en solucin del sustrato
X-Gluc (5 bromo-4 cloro-3
indolil -D-glucuronido) por
48h a 37C. A continuacin
se extrajo la solucin de XGluc y se coloc el tejido en
etanol 70% por 24h para extraer la clorofila y lograr una
mejor visualizacin del color
azul. Finalmente se hicieron
desprendimientos epidrmicos
y cortes transversales y longitudinales que fueron fotografiados en fotomicroscopio.
Verificacin molecular de
la transformacin gentica.
El ADN, extrado mediante
protocolo de Doyle y Doyle
(1990) modificado para banano por Gimnez (1997),
fue purificado de acuerdo al
protocolo de Weising y Kahl
(1997) para la remocin de
polisacridos, ARN, polifenoles y otras sustancias contaminantes. Las condiciones de
amplificacin de fragmentos
de ADN fueron las expuestas
arriba. La integridad del ADN
se observ en geles de agarosa al 0,6% en buffer TAE 1X.
Las muestras de ADN fueron
cuantificadas en un espectrofotmetro LKB-Ultrospec III.
Resultados y Discusin
Iniciacin y multiplicacin
de pices
A partir de un total de 50
pices meristemticos caulinares iniciados, de los cuales
sobrevivieron nueve 9 (18%),
se obtuvo un nmero de brotes suficientes y tiles para
la regeneracin de las vitro-

Tabla I
Produccin de brotes de Hartn en
Recipientes de Inmersin Temporal
Automatizados conteniendo medio MS-BAP
lquido, a los tres meses y medio de cultivo
NBI
6
6
8
12
6
16
Total: 54

NEB

NBF

IFB

6
6
6
10
6
12
46

90
90
102
116
40
34
466

15
14
9,56
8,05
6,66
1,59
9,14

NBI: nmero de brotes iniciales, NEB: nmero de explantes con brotes,

NBF: nmero de brotes formados, IFB: ndice de formacin de brotes, el
cual se calcul como IBF= NBF NEB/(explantes cultivados)2, segn Kikuta
y Okazawa (1984), citado por Martel y Garca (1992).

Tabla II
Caractersticas de las extracciones
de ADN plasmdico
Extraccin

ADN
(gl-1)

Disparos posibles
(2g/disparo)

1
2
3

0,8
1,0
17,83

400
500
8915

plantas requeridas pa ra el
aislamiento de las multiyemas
blanco del bombardeo. El alto
porcentaje de mortalidad de
los pices ex vitro iniciados
se debi a contaminacin por
bacterias y/o nemtodos presente en el material vegetal
proveniente del campo utilizado para la iniciacin.
En promedio, luego de tres
y medio meses de cultivo en
R ITAs se produjeron 9,14
veces el nmero de brotes colocados inicialmente en el recipiente (Tabla I). Tal ndice
de formacin de brotes (IFB)
es semejante a los coeficientes de multiplicacin (7,2-9,4)
reportados por Castro et al.
(2002) para explantes de banano en biorreactores de inmersin temporal, y es menor
al obtenido por Colmenares y
Gimnez (2003) para yemas
de pltano Hartn cultivadas
en RITAs con medio MS suplementado con 5mgl-1 BAP.
En este ltimo caso, la mayor
multiplicacin en menos tiempo (1 mes) probablemente se
debi a la mayor concentracin de BAP empleada.
El uso de R ITAs en los
procesos de micropropaga-

cin ha sido recomendado

por algunos autores como una
opcin para reducir costos de
manipulacin y espacio requeridos, y aumentar los volmenes de produccin. Desde que Teisson et al. (1996)
desarrollaron un equipo sencillo de inmersin temporal,
ste ha sido empleado con
frecuencia para el cultivo de
microesquejes y embriognesis somtica en especies de
inters hortcola, con altas tasas de multiplicacin y bajos
costos de produccin (Castro
y Gonzlez, 2002).
Verificacin de la presencia
de los genes gus y bar en
el ADN plsmdico
Las secuencias diseadas
para la verificacin de la
presencia de los genes gus y
bar en el ADN del pCAMBIA3201 permitieron la amplificacin de los fragmentos de
1200pb y 372pb esperados.
Bombardeo de multiyemas
De un total de 1252 yemas bombardeadas a 9,5cm
y 150psi se obtuvieron 268

MAR 2008, VOL. 33 N 3

(21,40%) brotes post-bombardeo. Esta tasa de supervivencia es mayor a las obtenidas

por Maneharan y Dahleen.
(2002) y Cho et al. (2004)
pa ra callos embr iognicos
de tr igo (12,81%), cebada
(3,25%) y tejidos verdes regenerativos de arroz (6,5%),
respectivamente, pero menor que los reportados por
Christou et al. (1991), Dayal
et al. (2003) y Snezana et
al. (2005) para embriones
cigticos de arroz, hojas de
quinchoncho y de remolacha,
respectivamente. Los resultados son comparados con
especies diferentes a Musa
sp. dado que en la mayora
de los estudios acerca de la
transformacin gentica de
Musa sp., as como de otras
especies tanto monocotiledneas como dicotiledneas, se
utilizan suspensiones celulares como tejido blanco, en
lugar de tejidos de naturaleza
multicelular, como en el presente caso. Solo Sreeramanan
y Marziah (2002a, b) usaron
multiyemas de los cultivares
de Musa Pisang rastali y
Mutiara para el bombardeo con m icroproyectiles,
pero no reportan el nivel de
supervivencia.
Por otra parte, los valores de supervivencia citados
fueron calculados en base
al nmero de explantes sobrevivientes en med io de
seleccin, mientras que la
supervivencia de los pices
d ispa rados en el presente
estudio se logr sobre medio
de cultivo sin el agente de
seleccin. En base a esto,
la obtencin de un valor de
supervivencia alto en comparacin con los citados era
muy probable. No obstante,
en general, la supervivencia
obtenida para tejidos expuestos al bombardeo con microproyectiles es baja.
Actividad -glucuronidasa
(GUS)
El total de plantas obtenidas (268) a partir de los
1252 pices bombardeados a
150psi y 9,5cm de distancia,
fue tomado para la prueba de
la -glucuronidasa (GUS). En

Figura 3. Estomas abaxiales en hojas de plantas in vitro del cultivar Hartn regeneradas a partir de pices bombardeados. Se observan diferentes intensidades de azul (gris) como consecuencia de la tincin suministrada por la
prueba histoqumica de GUS (40 ).

muestras foliares y radicales

de las plantas regeneradas
a partir de los pices bomba rdeados se obser v que
un 22,01% de stas exhibi
sectores epidrmicos foliares
GUS positivos con estomas
teidos de distintas intensidades de azul (Figura 3).
La presencia de sectores con
distintas intensidades de azul
en hojas y races de plantas
transformadas fue observada
por Sreeramanan y Marziah
(2002a, b). La condicin de
quimerismo en las plantas
transformadas mediante biobalstica a partir de explantes multicelulares no es un
hecho reciente (Christou et
al., 1989; Fitch et al., 1990;
Sautter, 1993); no obstante,
el problema puede ser minimizado por aislamiento y
subcultivo continuo de los
sectores efectivamente transformados (Birch y Franks,
1991; Sautter, 1993; May et
al., 1995).
El nmero de estomas
abaxiales azules fue de 1-8/
cm 2 con promedio de 2/cm 2 ,
de los 9000/cm 2 presentes en
la hoja del cultivar Hartn.
En algunas plantas se observ adems coloracin GUS
positiva en el floema y en el
borde de hojas (Figura 4).
El porcentaje de expresin
transitoria obtenido (22,01%)
es mayor que los reportados
para algunas especies dicotiledneas y monocotiledneas
transformadas a partir de tejidos blancos multicelulares,
tales como los obtenidos por
Christou et al. (1991) para
plantas de arroz y Snezana
et al. (2005) para remolacha,
de 3,75 y 2,4%, respectivamente.
La expresin transitor ia
del gen reportero asociado

MAR 2008, VOL. 33 N 3

Figura 4. a: Tejido vascular GUS positivo en hoja de Hartn regenerada a

partir de pice bombardeado a 150psi (20 ). b: Borde de hoja sometida a
prueba de GUS regenerada a partir de pice bombardeado (40 ).

al gen de inters dentro de

la clula bla nco depende,
entre otros, de factores tales
como composicin qumica
de las micropartculas, concentracin del ADN, grado
de dao sufrido por el tejido,
estado fisiolgico del tejido,
tamao de la construccin
gentica y promotor empleado (Birch y Franks, 1991).
Las micropartculas de oro
son ampliamente utilizadas y
recomendadas por su inercia
qumica, ausencia de reactividad con el ADN y otros
componentes de las mezclas
de precipitacin, textura lisa
y baja toxicidad para las clulas vegetales. Las micropartculas de tungsteno, sin
embargo, an cuando ya no
son de uso tan frecuente, han
sido empleadas en estudios
de transformacin gentica
con resultados satisfactorios.
Es posible que el alto grado
de oxidacin mostrado por
los pices bombardeados del
cultivar Hartn en estudio
sea debido al uso de micropartculas de tungsteno en
lugar de oro, pero tambin
pudo deberse a la presencia
y liberacin elevada de fenoles en los explantes bombardeados. El uso de bajas
concent raciones de A DN
asociadas a bajas concen-

traciones de micropartculas
reduce la formacin de agregados ADN-micropartculas
difciles de separar, lo cual
no facilita la liberacin del
ADN de la partcula una vez
dentro de la clula.
Uno de los factores ms
inf luyentes en el nivel de
expresin transitoria de las
clulas es el grado de dao
sufrido por el tejido durante
el bombardeo. Segn Klein
et al. (1988) en el rea central del tejido se produce una
alta frecuencia de expresin
transitoria que es afectada
por el disparo, por lo que
ha sido referida como zona
de muerte. El dao puede
ser minimizado aumentando
la distancia entre el tejido
y el can de disparo, o colocando una malla de proteccin sobre el tejido. La
malla utilizada, adems de
bloquear algunos de los microproyectiles disparados y
reducir el dao tisular, evit
que el tejido bombardeado
fuera propelido con violencia
durante el disparo.
Cua ndo se opt i m iza un
sistema de bomba rdeo de
microproyectiles, es necesario escoger una construccin
gentica que se exprese en
altas tasas en el tejido modificado. Se debe seleccio-

229

Figura 5. Amplificacin del fragmento de 1200pb del gen gus (a) y amplificacin del fragmento de 372 pb del gen bar (b) en seis plantas positivas al
ensayo de la -glucuronidasa. Carriles 1-6: ADN de plantas bombardeadas
03, 05, 24, 36, 50 y 53; carril 07: ADN del pCAMBIA3201 (Control positivo); carril 08: ADN de planta del cultivar Hartn sin bombardear; carril
09: marcador de peso molecular, escalera de 100 pb.

nar un promotor constitutivo

fuerte que asegure la expresin del transgen en el tejido
blanco (Schenk et al., 1999).
Ello depende de la especie
vegetal utilizada, de forma
tal que promotores tiles en
el manejo de la expresin de
un transgen en una especie
podran no ser efectivos en
la regulacin de la expresin
en otras. Por otra parte, el
uso de promotores iguales en
la regulacin de genes distintos dentro del mismo vector
puede inducir silenciamiento
gentico (Flavell, 1994; Matzke et al., 1994; Park et al.,
1996). Schenk et al. (1999)
estudiaron la actividad del
promotor especfico Sc del
virus baciliforme de la caa
de azcar, en comparacin
con la actividad del promotor CaMV35S, en la regulacin de los niveles de expresin del gen reportero gus en
plantas de banano (Musa sp.
cv. Williams), encontrando
que ambos promotores son
efectivos en el manejo de la
expresin del gen gus en ese
cultivar. No obstante, Sagi et
al. (1995) encontraron que el
promotor Ubi (ubiquitina del
maz) es ms efectivo en el
manejo de la expresin gnica del gen gus en plantas
de Musa sp. cv. Willia ms
y el plt a no Musa sp. cv.

230

Three Hand Planty, en comparacin con los promotores

CaMV35S y Emu. El promotor CaMV35S utilizado en
el presente estudio permiti
la expresin efectiva del gen
gus en el cultivar de pltano;
siendo comparable el porcentaje de plantas con clulas
GUS positivas al obtenido en
otros estudios de transgnesis vegetal.
Hay indicios de que plsmidos grandes (>10000pb)
pueden estar sujetos a mayor fragmentacin durante el
bombardeo (Mendel et al.,
1989; Fitch et al., 1990). El
CAMBIA3201 utilizado es
un vector de 11459pb y su
tamao podra constituir un
factor negativo en su transferencia efectiva al genoma
de las clulas; no obstante, su introduccin ntegra
en stas se produjo exitosamente, como se evidenci
por la presencia de ambos
genes (gus y bar) en todas
las pla ntas PCR positivas
obtenidas.
Es posible que el nivel de
expresin transitoria (22,01%)
obtenido haya sido subestimado debido a la falta de
sensibilidad de la prueba de
GUS para revelar clulas con
bajo nivel de expresin del
gus. Birch y Franks (1991)
han referido que el ensayo

h istoqum ico del GUS es

relativamente insensible y las
clulas que expresan poco el
gen gus pueden no ser detectadas. Puede ocurrir que
el sustrato para la -glucuronidasa (X-Gluc) presenta
dificultad para penetrar el
tejido bombardeado por el
grosor de la pared celular,
lo que reduce la posibilidad
de visualizacin del tejido
transformado.
No se descarta que el nivel
de expresin transitoria obtenido haya sido subestimado
por la manera como fueron
manipuladas las plantas (presuntas transgnicas) para la
evaluacin de la presencia
de expresin transitoria GUS
positiva. En efecto, para la
prueba solo se tom una pequea muestra (un fragmento de hoja) del total de la
planta regenerada, debido a
1) el carcter relativamente
rpido (<48h) con que se recomienda realizar la prueba,
antes que ocurra degradacin
por accin de las nucleasas
del ADN introducido; 2) la
disponibilidad limitada del
sustrato X-Gluc con el que
fue realizada la prueba; y 3)
la naturaleza destructiva del
procedimiento, que obliga la
utilizacin racional del material para contar con suficiente cantidad para las pruebas
moleculares.
Presencia de los genes
gus y bar en el genoma de
plantas con expresin transitoria GUS positiva
Un tot a l de 22 pla nt as
mostraron integracin de los
genes gus y bar en el genoma de sus clulas foliares,
equiva lente a l 37,28% de
las 59 plantas con expresin
transitoria GUS positiva y
al 8,21% de las 268 plantas
bombardeadas sobrevivientes.
La amplificacin de fragmentos de estos dos genes para
algunas de las plantas transgnicas obtenidas se muestra
en la Figura 5.
Es comn obtener una alta
frecuencia de expresin transitoria asociada a un porcentaje muy bajo de clulas que
integra y expresa establemen-

te el gen introducido (Birch

y Fra n ks, 1991) . A lg unos
autores han referido que una
de las causas del bajo nivel
de integracin de los transformantes obtenidos mediante biobalstica es la ausencia
de una asociacin efectiva
ADN-protenas (como ocurre
con el A DN-T tra nsfer ido
por Agrobacterium) que contribuya a la proteccin del
ADN bombardeado, una vez
dentro de la clula hospedera, de la accin degradativa
de las nucleasas; por ello,
solo parte del ADN llega al
ncleo donde se produce, con
baja eficiencia, la integracin
al azar en el ADN cromosmico. En este estudio se
obtuvo un nivel de expresin
transitoria de 22,01% asociado a un nivel de integracin
gentica de 8,21%, el cual
es alto en comparacin con
otros repor tados (McCabe
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