Estudio de la estructura y dinmica de poblaciones de

especies invasoras en Mxico a travs de microsatlites

Pedro Julin Cavallazzi Huerta, Gemma Guadalupe Estrada Martnez, Brenda Giselle Flores Garza y
Osbert Adair Rodrguez Alans.

Introduccin
Las especies exticas son todas aquellas especies animales o vegetales que se encuentran
en ecosistemas de los que no son nativas, es decir fuera de su rea de distribucin normal, las
cuales han sido introducidas por el hombre ya sea por traslado intencional o accidental. La
mayora de intentos de colonizacin por parte de las especies exticas falla, ya sea por
factores ambientales o porque las especies residentes repelen la invasin, pero se han
observado algunos casos en los que la colonizacin de nuevas especies ha tenido xito; no
obstante, en ocasiones el xito de estas colonizaciones trae consecuencias desastrosas a los
ecosistemas, principalmente impactos ecolgicos, econmicos y en la salud (lvarez et al,
2008). La especie invasora incrementa su densidad en la zona ocupada o coloniza nuevos
territorios a lo largo del tiempo, donde intervienen tanto factores propios de la especie como
de los ecosistemas o comunidades invadidas, causando que muchas especies pueden tener
un crecimiento poblacional con un perodo de retardo temporal, durante el cual resulta difcil
distinguir qu especies sern finalmente invasoras (SAG, 2008).
Un ejemplo de especie invasora es la nutria Myocastor coypus, introducida en Amrica del
Norte desde Amrica del Sur, como un aprovechamiento interno; pero la especie escap de
las explotaciones agrcolas asentndose en el centro y sur de los Estados Unidos (Callahan,
2005) y el noreste de Mxico, en Tamaulipas. Aunque es valioso por su piel, es considerado
plaga, ya que sus tneles daan diques y dems instalaciones de irrigacin, afectan cosechas
de arroz, maz, alfalfa, avena, entre otras, y compite con especies de piel nativas como la rata
almizclera. La nutria es un portador de numerosas enfermedades como encefalitis equina,
leptospirosis, pasturelosis, paratifoidea y salmonelosis y enfermedades parasitarias (lvarezRomero y Medelln, 2005).
Actualmente en Mxico, tanto la informacin (vas de introduccin, listados y distribucin)
como las acciones realizadas para mitigar los daos de las especies exticas (prevencin,
control y erradicacin) son insuficientes (Aguirre et al, 2009). As que para que Mxico logre
conservar y usar sustentablemente su patrimonio natural, es necesario frenar los factores de
presin que amenazan la biodiversidad. Por ende, es importante prevenir la introduccin de
especies exticas o no nativas que pueden llegar a establecerse y causar graves
desequilibrios ecolgicos, as como el manejo, control y erradicacin de aquellas especies que
se han vuelto invasoras, utilizando herramientas biolgicas que permitan su identificacin. Una
de estas herramientas son los marcadores moleculares, los cuales tienen aplicaciones en la
gran mayora de las reas biolgicas como ecologa, evolucin, sistemtica, entre otras, y han
permitido llegar a resolver problemticas como: caracterizar la variabilidad gentica de un
grupo, identificar especies y cepas, asignar paternidad o parentesco, apoyar la trazabilidad,
identificar loci asociados a caracteres cuantitativos y realizar seleccin asistida por
marcadores (Astorga, 2008); por ello, el propsito de esta investigacin es implementar
tcnicas moleculares con el fin de validar los servicios ambientales que ayudan en este tipo de
problemticas.

Antecedentes
Los microsatlites son utilizados ampliamente en estudios genticos debido a que poseen
ventajas importantes sobre otras tcnicas, como la obtencin de marcadores moleculares, la
utilizacin de muestras de baja calidad y baja concentracin de DNA, la rapidez de su
metodologa y su bajo costo. Permitiendo no slo ahorrar recursos, sino tambin comparar la
diversidad entre taxones con un mismo conjunto de loci (Dawson, 2013).
Ash y colaboradores (2004) emplearon los microsatlites para estudiar el pltano acutico de
hojas de lanza, una planta invasora en Australia. Sus anlisis de los marcadores de ISSR
mostraron que la distribucin de distintas poblaciones de esta planta en diferentes reas
ocurri probablemente debido a importaciones separadas de esta maleza, principalmente por
transportacin de las semillas en las reas infestadas; resaltando as, las implicaciones para
futuros esfuerzos en el control biolgico contra esta maleza.
En el 2005, se document el aislamiento y caracterizacin de 27 microsatlites como
marcadores de DNA de la nutria Myocastor coypus, con el objetivo de resolver los patrones de
migracin, subpoblaciones, estructura reproductora y demografa de esta especie invasora en
humedales de Estados Unidos, con el fin subsecuente de erradicar por completo la especie y
prevenir futuras recolonizaciones (Callahan, 2005).
En el rea de acuacultura, el barcoding, permite identificar la presencia de ms de una
especie, y conocer si sta tiene algn efecto sobre la especie de importancia econmica. Por
ejemplo, en los moluscos bivalvos, el barcoding es fundamental al inicio de cualquier
investigacin, permitiendo adems la identificacin de los estados del organismo y la
diferenciacin de organismos con una alta similitud entre especies utilizando microsatlites
como marcadores de alta resolucin (Astorga, 2008).
En el 2012, se analizaron a nivel molecular dos especies que habitan el Archipilago de Tierra
del Fuego: una especie endmica (Ctenomys magellanicus o tuco-tuco) y una invasora
(Castor canadensis); utilizando marcadores moleculares de mtDNA y microsatlites, se
estudi la variabilidad gentica y la estructura gentico-poblacional de ambas especies. Los
resultados mostraron una alta variabilidad para C. magellanicus mientras que para C.
canadensis la variabilidad fue menor. Por lo que debido a que en la Isla Grande no existen
barreras a la dispersin para los castores, se propona realizar un control simultneo en toda
la isla para evitar posibles recolonizaciones (Fasanella, 2012).
En 2013, se realiz un estudio que permitiera la erradicacin de la poblacin de mapache
(Procyon lotor L.) en la Comunidad de Madrid, donde el estudio gentico consista en calcular
los parmetros de diversidad gentica a partir de los microsatlites, mediante un software
especfico, para inferir el nmero de poblaciones presentes en la muestra y asignar cada
individuo a una de ellas, as como el nmero de fundadores. A partir de sus resultados
concluyeron que la poblacin de mapache del sureste de Madrid procede de muy pocos
individuos fundadores, lo que corrobora la gran capacidad de expansin de esta especie
extica invasora, generando una estrategia que permitiera su eliminacin (Ceballos, 2013).
Finalmente, Dawson y colaboradores (2013) disearon marcadores de microsatlites de
amplio espectro para aves seleccionando secuencias altamente conservadas con un gran
nmero de unidades repetitivas de las especies Gallus gallus y Taeniopygia guttata; sto con
el fin de generar un marcador molecular que permitiera la reduccin de la necesidad y costo
del aislamiento de microsatlites especficos de cada especie, y as poder realizar anlisis
poblacionales, tanto de individuos de una misma especie, como de especies de distintas
poblaciones.

Estrategia experimental
A continuacin, se describe una estrategia general aplicable a la mayora de las especies
invasoras para generar un estudio ms comprensivo acerca de la distribucin, orgenes,
migracin y dinmica de las poblaciones.

Recoleccin de especmenes
La captura y toma de muestras de organismos se debe ajustar segn el medio en el que
habite el organismo, si son organismos terrestres o acuticos; y el tipo de tejido se deber
optimizar segn la clase de organismo, si son animales o plantas.

Extraccin del DNA

La extraccin del DNA genmico total se puede llevar a cabo mediante kits especializados,
segn el organismo en cuestin y el tipo de tejido utilizado. La concentracin del DNA deber
ser determinada, ya sea por espectrofotometra o ensayos de fluorescencia, y su integridad
deber ser corroborada mediante electroforesis en geles de agarosa.

Procesamiento del DNA: generacin de libreras de microsatlites

La creacin de libreras de microsatlites se llevar a cabo mediante el protocolo de Nunome y
colaboradores (2006). El DNA genmico ser digerido con 100 unidades de AluI, HaeIII o RsaI
y los fragmentos sern purificados mediante un kit de purificacin de DNA en gel/PCR.
Posteriormente
se
ligarn
adaptadores
especiales
(Linker1:
5GTTTAGCCTTGTAGCAGAAGC -3, Linker2: 5- GCTTCTGCTACAAGGCTAAACAAAA -3),
los cuales presentan la ventaja de formar un sitio XmnI si ambos se ligan (dimerizacin).
Adems, los adaptadores insertan la secuencia GTTT en el extremo 5 de los fragmentos, lo
que promueve la poliadenilacin del extremo 3 de los productos de PCR. Para comprobar que
la ligacin se llevar a cabo, se realizar una PCR. La electroforesis de los productos de PCR
deber formar una mancha de 300-1500 pb si los adaptadores se ligan al DNA genmico; si
los dmeros se forman en abundancia, se observar una banda de aproximadamente 50 pb.
La hibridacin substractiva para el enriquecimiento per se, se llevar a cabo en una reaccin
de volumen final de 200 L con 50 ng del DNA genmico ligado a los adaptadores, 20 nM de
sondas biotiniladas con repeticiones [b(GA)15 o b(CA)15] y 100 L de la solucin de
hibridacin 2X. La reaccin se desnaturalizar por 15 min a 95C y se incubar a 60C
durante la noche. Para su purificacin, la reaccin de hibridacin se mezclar con 600 g de
perlas magnticas cubiertas con estreptavidina.
El DNA enriquecido ser sometido a una reaccin de PCR para su posterior clonacin en
vectores TA y se purificar mediante un kit comercial. La reaccin de adenilacin se llevar a
cabo en un volumen final de 5 L, conteniendo 150 ng de productos de PCR purificados. A
partir de all, se proceder a su clonacin en vectores T, su transformacin en bacterias
competentes y su seleccin mediante el uso de antibiticos o sustratos que corroboren la
ligacin.

Secuenciacin y anlisis bioinformtico de los microsatlites

Los plsmidos sern secuenciados utilizando la plataforma de preferencia y sern analizadas
mediante programas bioinformticos para la identificacin de microsatlites, como GeneScan,
GeneMapper, o Tandem Repeat Finder. Una vez seleccionados los alelos de microsatlites,
se disearn oligonucletidos especficos de las secuencias conservadas que flanquean los
microsatlites.
Los iniciadores que amplican un locus de microsatlite necesitarn ser muestreados para
determinar que el locus microsatlite es polimrco y que ningn alelo nulo est presente. Los
alelos nulos son casos donde los iniciadores son incapaces de amplicar el locus microsatlite
(Selkoe y Toonen, 2006). Las mutaciones en las regiones donde los iniciadores se unen a las
secuencias complementarias para los locus microsatlites son la causa de la falla de los
iniciadores para amplicar. Los alelos nulos deberan ser evitados porque muchos de los
mtodos estadsticos usados para analizar el ADN de microsatlites asumen que, dentro de
las poblaciones, los alelos estarn en un equilibrio Hardy-Weinberg. Si los alelos nulos estn
presentes, entonces los individuos que son heterocigotos para uno de los alelos nulos sern
marcados como homocigotos.
Los parmetros de diversidad gentica (n de alelos, riqueza allica, heterocigosidad
observada y esperada y coeficiente de consanguinidad) se calcularn a partir de los
microsatlites mediante el software FSTAT 2.9.3. Para inferir el nmero de poblaciones
presentes en la muestra y asignar cada individuo a una de ellas se ha utilizar el programa
STRUCTURE. Por ltimo, el nmero de fundadores se ha estimar con el programa BottleSim
2.6

Resultados esperados
El diseo de biomarcadores basado en STR requiere la generacin de libreras de
microsatlites especficas de un o de un conjunto de especies. Numerosos protocolos de
aislamiento y enriquecimiento de microsatlites han sido reportados (Edwards et al., 1996;
Fischer and Bachman, 1998; Hamilton et al., 1999; Kijas et al., 1994; Koblizkova et al., 1998;
Paetkau, 1999; Phan et al., 2000; Zane, 2002 citado por Nunome et al., 2006), sin embargo,
el seleccionado posee la ventaja de bajos niveles de redundancia (8.9-25.6%, dependiendo de
la enzima utilizada), su universalidad y su gran potencial para el desarrollo de marcadores
molecular a larga escala (Nunome et al., 2006). En la figura 1 se observan los resultados
esperados tras la amplificacin de los fragmentos ligados a adaptadores; y en la figura 2 se
observa la amplificacin de los fragmentos enriquecidos para microsatlites.

Figura 1. Amplificacin de los fragmentos genmicos unidos a adaptadores. En el carril 1-3 se observa el protocolo
original, usando las enzimasSau3AI, Hsp92II y TaqI respectivamente. Con el protocolo mejorado no se observan
dmeros de adaptadores; carril 4-6 digestiones con AluI, HaeIII y RsaI, respectivamente. La flecha indica la posicin
del dmero de adaptadores. Fuente: Nunome et al., 2006.

Figura 2. Amplificacin de los fragmentos de microsatlite enriquecidos. En los carriles 4-6 se observa la
amplifiacin con el protocolo de Nunome (carril 4-6 digestiones con AluI, HaeIII y RsaI, respectivamente). Con el
protocolo tradicional los fragmentos no fueron detectados con la misma intensidad (enzimas Sau3AI, Hsp92II y
TaqI respectivamente). Fuente: Nunome et al., 2006.

Una vez llevado a cabo la generacin de libreras y su posterior secuenciacin, es necesario el

anlisis bioinformtico de las secuencias para confirmar la presencia de los microsatlites en
los fragmentos aislados y determinar el nmero de alelos.
En las muestras analizadas se encontrarn los distintos haplotipos bien diferenciados, cada
uno asociado a las condiciones en las que se desarrolle la especie. Y a partir de ello se sabr
la cantidad de poblaciones fundadoras basadas en el flujo gentico encontrado en la
poblacin. Tambin se obtendrn los valores de diversidad gentica dentro de la poblacin
estudiada. El nmero de fundadores ser estimado en funcin del nmero de alelos/locus y de
la heterocigosidad indicando los fundadores de la especie invasora y de estar forma tener de
manifiesto la capacidad de crecimiento, as como la expansin que pudo tener la especie.

Discusin
El empleo de los STRs presenta varias ventajas con respecto a otras tcnicas, como la
genotipificacin mediante SNPs o la genotipificacin basada en secuenciacin. Primeramente,
ofrece ms informacin acerca de la gentica de poblaciones por marcador en contra de
marcadores biallicos, ya que los SNPs definen haplogrupos que datan de tiempo atrs, en
cambio los STRs aportan informacin genealgica que determina las relaciones en un marco
de tiempo reciente (Dawson et al., 2013).
Adems, se ha observado que un solo set de marcadores STRs puede ser usado para la
genotipificacin de especies cercanamente relacionadas. Esto tiene una potencial aplicacin
en casos con especies invasoras que compiten por recursos con especies locales que son de
la misma familia o del mismo gnero, donde la informacin resultante puede ser usada con
motivos de monitoreo o de erradicacin. Por el contrario, los SNPs estn limitados al estudio
dentro de una misma especie (Jestes, 2014).
Otra ventaja de los STRs es que pueden ser usados para genotipificar muestras con baja
concentracin de DNA o muestras de poca calidad, esto es ventajoso en casos dnde las
muestras obtenidas de las especies invasoras son difciles de rastrear y las muestras
disponibles pertenecen a plumas, pelos o heces. De igual manera pueden ser usados en
casos de especies invasoras de plantas debido a que pueden ser usados para identificar si un
individuo es un clon de una planta madre (Jestes, 2014).
Tambin posibilita investigaciones de ploida, ya que el uso de STRs puede ayudar a explicar
eventos de poliploida provocados por una evolucin adaptativa o eventos de dispersin
(Beest et al., 2011). Por ltimo, los STRs son eficientes en el uso de identificacin de especies
cripticas, donde es difcil clasificar dos especies debido a su parecido fenotpico como en el
caso de Phragmites australis, una especie invasora de caa en Norte Amrica (Saltonstall,
2002).
Una de las posibles desventajas de los STRs es que es necesario realizar ensayos de
secuenciacin, de ser necesarios, dado que el conocimiento de la secuencia es imprescindible
para la realizacin de la tcnica. As mismo, en el caso de muchas especies invasoras no se
han realizado estudios de microsatlites, por lo que es necesario realizar una librera de estos
para poder usarlos en el monitoreo, identificacin, anlisis y erradicacin de especies
invasoras en etapas ulteriores (Guillemaud et al., 2009).
Los benefactores principales de la implementacin de las tcnicas moleculares en el control
de las especies invasivas son los individuos afines a las reas de la pesca comercial, dado
que stas especies pueden llegar a representar perdidas sustanciales en la utilidad neta, de
igual manera es posible observar daos similares en las actividades ganaderas. Aunado a
esto, es posible hacer alusin a la importancia en la conservacin de la biodiversidad del pas,
donde se busca evitar la prdida de especies endmicas de una regin en especfico.
Inclusive, pueden llegar a representar un dao para la salud humana al actuar como vectores
de ciertas enfermedades, siendo as de gran utilidad el desarrollo de tcnicas que permitan
controlar la distribucin de estos organismos invasores. (lvarez et al, 2008)

Conclusiones
El empleo de la tcnica a base de los STRs es de gran importancia en estudios de control
biolgico, dado que permite llevar a cabo acciones preventivas y de mitigacin frente a un
problema ecolgico. Es importante reiterar que una vez que los marcadores moleculares STR
han sido desarrollados, stos deben ser probados en una poblacin de organismos para
demostrar su polimorfismo y efectividad ante la identificacin de especies, permitiendo por
ende su certificacin y validacin como una prueba confiable y prctica en el campo de
aplicacin o abordaje al que se desee aplicar. En ste caso, el uso de microsatlites para la
dispersin de especies invasoras en Mxico permite implementar medidas ad hoc a los
resultados obtenidos para el desarrollo de estrategias de control y erradicacin de especies no
nativas; importante no slo desde la perspectiva de la conservacin de la biodiversidad en el
pas, sino tambin para el aprovechamiento sustentable de los recursos y evitar grandes
prdidas econmicas.

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