Ao 2012 - Qumica Biolgica I - TPN 2:

Estructura de protenas
Objetivos del prctico
Reforzar los conocimientos bsicos sobre estructura de protenas brindados en la clase terica.
Familiarizarse con el uso de programas de visualizacin molecular.
Luego de este prctico deber comprender:
La relacin de los ngulos (phi) y (psi) con la estructura de una cadena polipeptdica.
Los distintos tipos de estructura secundaria presentes en las protenas.
La distribucin diferencial de aminocidos hidrofbicos e hidroflicos en las protenas.
La relacin estructura-funcin para la hemoglobina humana.
Introduccin
Las estructuras atmicas de ms de 80.000 biomolculas han sido determinados y sus coordenadas depositadas
en una base de datos denominada Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Dada la fuerte relacin
que existe entre la estructura y la funcin, estas estructuras permiten entender la biologa celular a un nivel atmico y
dan herramientas para controlar tecnolgicamente su funcin. Por ejemplo, casi todas las enzimas involucradas en la
produccin de energa celular (gliclisis, ciclo del cido ctrico y transporte de electrones) han sido estudiadas y sus
estructuras determinadas. Tambin se conocen estructuras tridimensionales de diversas protenas involucradas en la
sealizacin celular, transporte, regulacin y defensa.
El conocimiento de las estructuras moleculares de las protenas permite numerosos desarrollos tecnolgicos,
principalmente en la industria farmacolgica como por ejemplo:
Descubrimiento y diseo de nuevas drogas: Una de las aplicaciones mas importantes de la estructura
biomolecular es el diseo de frmacos. El conocimiento de la estructura de una protena nos permite intentar disear
pequeas molculas que se unan a la misma, bloqueando o exacerbando su funcin. La potencialidad de esta
aproximacin qued demostrada en la lucha contra el VIH y el SIDA (Prevelige, 2011). Muchas de las drogas anti-VIH
actualmente en uso fueron obtenidas a travs de programas de desarrollo inteligente de frmacos.
Diseo de nuevas nano-mquinas o nano-herramientas: las estructuras biomoleculares han abierto una nueva
disciplina de la ingeniera biomolecular y la bionanotecnologa. De la mano de la comprensin viene el control, y los
investigadores se encuentran actualmente modificando biomolculas existentes para obtener nuevas funciones e incluso
diseando nuevas biomolculas. Por ejemplo, se estn construyendo estructuras a nanoescala con DNA.
Bioteraputica, enzimas industriales: muchos bioteraputicos han sido desarrollados con la ayuda de los
modelos 3-D de protenas. El diseo, construccin y humanizacin de anticuerpos ya es una rama desarrollada de la
biotecnologa, asimismo se pueden disear fragmentos pequeos de anticuerpos con actividad biolgica, aumentar su
especificidad, su afinidad o su vida media. Las enzimas son ampliamente usadas en la industria y en la biotecnologa,
son componentes de jabones, detergentes y empleadas para la elaboracin de pan, vino, jugo de frutas y para el
tratamiento de telas, papel y cuero. Su uso permite ahorrar agua, energa y evita el empleo de compuestos qumicos que

pueden resultar nocivos para el medio ambiente y la salud humana. El modelado de las enzimas permite el entendimiento
de sus propiedades biofsicas para luego modificarlas y obtener molculas con propiedades biolgicas optimizadas para
el uso que se pretende darle o con alta estabilidad a la oxidacin, a las altas temperaturas, a la alta fuerza inica o con
mejor especificidad por un sustrato.
Determinacin de las estructuras moleculares
Entre las tcnicas utilizadas para determinar las estructuras de protenas se dispone actualmente de mtodos
experimentales y mtodos biocomputacionales (tericos pero que obtienen sus datos de la experimentacin). Entre los
mtodos experimentales podemos diferenciar los mtodos de alta y de baja resolucin. Los de alta resolucin son la
cristalografa de rayos X y la resonancia magntica nuclear. Proveen las coordenadas (x,y,z) de cada tomo, pero
presentan la desventaja de ser tcnicas de alto costo operativo y no dan informacin dinmica (es decir los cambios que
va sufriendo una biomolcula, por ejemplo durante una reaccin qumica o unin a un ligando). Las tcnicas de baja
resolucin en cambio son de bajo costo operativo, dan informacin global del sistema y pueden ir midiendo los cambios
estructurales con el tiempo. La microscopa electrnica y la dispersin de Rayos X a ngulo bajo (SAXS) dan
informacin de la forma de la molcula pero no coordenadas atmicas. El dicrosmo circular (DC) y la espectroscopa
infrarroja (IR) son muy tiles para determinar el contenido de cada tipo de estructura secundaria que hay en una
protena. Es importante destacar que las tcnicas de alta y baja resolucin son complementarias entre si, pues para
comprender un sistema es fundamental no slo conocer la distribucin espacial de sus tomos sino tambin seguir su
movimiento. Las tcnicas de DC, IR y espectroscopia de fluorescencia son muy tiles para determinar interacciones
entre protenas, subunidades proteicas, para monitorear cambios en funcin del tiempo y para estudiar el plegamiento de
las protenas. La Figura 1 muestra la complementariedad escalar, es decir a que escala podemos aplicar los diferentes
mtodos.

Figura 1: Representacin esquemtica de la resolucin

obtenida con las diferentes tcnicas para la obtencin de
estructuras de protenas.

Tcnicas de alta resolucin:

o

Cristalografa de rayos-X: permite determinar la ubicacin de cada tomo en la molcula. La biomolcula de

inters es purificada, cristalizada y entonces el cristal es sometido a un intenso haz de rayos-X (a menudo,
provistos por un sincrotrn). Los rayos X son difractados en un arreglo caracterstico de manchas. Analizando el
espaciado y la intensidad de estas manchas, se puede determinar como se acomodan las molculas en el cristal y
donde se ubica cada tomo.

Espectroscopa RMN: revela las distancias entre los tomos en una biomolcula, as como tambin la
conformacin local de porciones de cadenas macromoleculares. Esta informacin es usada para inferir la

estructura de las biomolculas. Actualmente, la espectroscopa de RMN es efectiva para determinar la estructura
de molculas orgnicas pequeas y protenas u oligonucletidos de baja masa molecular, ya que las mediciones
experimentales son difciles o imposibles de llevar a cabo para molculas grandes.
Tcnicas de baja resolucin:
o

Microscopia electrnica: es efectiva para estructuras muy grandes, tales como virus o ensambles proteicos tales
como el poro nuclear. Las pticas usadas para enfocar los electrones no son lo suficientemente precisas para
resolver los tomos individuales, pero la microscopa electrnica puede dar una buena aproximacin de la forma
general de las estructuras subcelulares. Es una herramienta poderosa usada en combinacin con las tcnicas de
resolucin a nivel atmico mencionadas antes (cristalografa de rayos X y RMN).

Dispersin de Rayos X a ngulo bajo (SAXS): La dispersin de rayos X a bajos ngulos, o SAXS (Small Angle
X-ray Scattering) es una tcnica basada en analizar la dispersin de rayos X producida por un material al paso de
un haz de rayos X a ngulos muy prximos a cero. Cualquier evento de dispersin est caracterizado por una ley
recproca entre tamao de partcula y ngulo de dispersin. La radiacin electromagntica incidente interacta
con los electrones en una muestra. Una parte de ellos emitir radiacin coherente. En el lugar donde las ondas
interfieran constructivamente tendremos un mximo, que es lo que detectamos. Del anlisis matemtico de las
interferencias constructivas podemos obtener la forma global de una protena.

Dicroismo Circular (DC): es una tcnica espectroscpica de absorcin que provee informacin acerca de la
estructura de macromolculas biolgicas. La seal medida en DC es la diferencia entre las Abs (A) de la luz
polarizada circularmente hacia la izquierda (l) y hacia la derecha (r): DC = A(r) - A(l)
Se utiliza como fuente luz polarizada (UV-VIS) y las muestras a analizar, adems de absorber, deben ser
pticamente activas. DC es una de las tcnicas ms sensibles para determinar las estructuras secundarias y
monitorear cambios en dicha estructura. El cromforo en el UV lejano (180 a 250nm) es el enlace peptdico; y
en el UV cercano (250 a 350nm) son los residuos aromticos, Tyr, Trp y Phe, y el puente S-S de Cys. El DC en
el UV lejano permite obtener medidas empricas de los elementos de estructura secundaria de la protena y en
muchos casos se puede obtener la proporcin de cada uno de ellos que se encuentra presente (es decir % de hlices, hojas , giros y random coil). La intensidad en el cercano es mucho menor que en el lejano por lo que
se requiere mayor concentracin de protena. Esto es debido a que en una protena hay menos residuos
aromticos que enlaces peptdicos. El espectro de DC en el UV-cercano depende del plegamiento de la protena
(estructura terciaria) y es como una huella dactilar de la misma en condiciones nativas (plegada). Esto implica
que este mtodo es til para saber si la protena est correctamente plegada. Tambin se puede seguir el cambio
conformacional provocado por algn ligando que se una a un residuo aromtico.

Espectroscopia infrarroja (IR): proporciona informacin sobre el contenido de estructura secundaria de

protenas y pptidos, ya que los mismos presentan un conjunto caracterstico de bandas de absorcin en su
espectro. Las bandas caractersticas encontradas en un espectro IR de una protena son las bandas amida I y
amida II. La absorcin asociada a la banda amida I depende de las vibraciones de estiramiento del enlace C = O
(figura 2), en cambio la banda amida II depende principalmente de las vibraciones de flexin del enlace N-H.
Debido a que tanto el C = O y los enlaces N-H estn implicados en el enlace de hidrgeno que tiene lugar entre
los diferentes elementos de estructura secundaria, las ubicaciones en el espectro de ambas bandas depende del
tipo de la estructura secundaria presente en la protena. Estudios con protenas de estructura conocida se han
utilizado para correlacionar la forma de la banda amida I con el contenido de estructura secundaria.
Figura 2: vibraciones de los enlaces responsables de las bandas de

Vibracin
Amida I
Vibracin
Amida II

absorcin en el espectro IR de las protenas.

Espectroscopia de Fluorescencia: es el mtodo espectroscpico ptico ms utilizado en determinaciones

analticas y para la investigacin cientfica. Se aplica, entre otras cosas, para estudiar los procesos fsicos
fundamentales de las molculas, la relacin entre la estructura y la funcin e interacciones entre biomolculas
(por ejemplo entre una protena y un cido nucleico, entre dos protenas o entre una protena y un ligando). El
estudio de la fluorescencia de los aminocidos aromticos, principalmente Trp y Tyr puede dar mucha
informacin del entorno en el que se encuentran los mismos y de la estructura terciaria y cuaternaria de las
protenas cuando se las somete a diferentes perturbaciones. Al tener un alto nivel de sensibilidad se pueden
estudiar las protenas en soluciones muy diluidas y su amplio rango dinmico (hay equipos que pueden hacer
determinaciones en tiempos extremadamente cortos) permite realizar estudios de plegamiento o de interaccin
con ligandos en funcin del tiempo. Otra gran ventaja es que se puede aprovechar la fluorescencia intrnseca de
las protenas (de los residuos Trp y Tyr) y realizar estudios dinmicos con la protena sin modificaciones.
Tcnicas Biocomputacionales:

El dogma central que fundamenta la modelizacin terica de protenas a partir de su secuencia se basa en que la
estructura tridimensional de una protena est determinada slo por su secuencia y por las caractersticas del
entorno, sin la participacin obligatoria de factores externos. Existen numerosos mtodos que van desde el
modelado de novo de una protena hasta los que utilizan como molde una protena de la misma familia cuya
estructura est ya resuelta. Estos mtodos tuvieron un desarrollo exponencial en la ltima dcada y permiten
obtener mucha informacin til cuando esta es inaccesible para las tcnicas experimentales.

Acceso a la informacin sobre estructuras de protenas

Toda la informacin estructural derivada de las tcnicas de alta resolucin ha sido cuidadosamente almacenada
en una gran base de datos, el PDB. Desde 1971 los investigadores depositan all sus resultados los que son
cuidadosamente revisados antes de ser aceptados. Hoy en da, hay ms de 80.000 estructuras y para consultarlas se puede
visitar su sitio web: http://www.pdb.org/pdb/home/home.do
Visualizacin de las estructuras atmicas
La informacin que depositan los autores en PDB debe estar en el formato de la figura 3. Para poder manejar
esta informacin, se necesita un software adecuado que represente espacialmente a cada tomo segn sus coordenadas.
Actualmente existen numerosos programas de visualizacin molecular. Entre los ms utilizados para la generacin de
grficos profesionales como los que encontramos en publicaciones cientficas y libros de texto podemos nombrar
Rasmol, PyMOL y VMD. Para observar los distintos detalles de las estructuras de protenas haremos uso del programa
Mage, que se encuentra especialmente adaptado para su uso en docencia. (Recomendamos que lo bajen antes del trabajo
prctico para facilitar el estudio). Alternativamente se puede utilizar el programa King que es una versin Java
(multiplataforma) del mismo. Los mismos pueden ser descargados de:
http://kinemage.biochem.duke.edu/software/index.php.
Este programa nos permitir navegar a travs de tutoriales personalizados para repasar los conceptos bsicos de
estructura de protenas y estudiar la relacin entre estructura y funcin de la hemoglobina humana. Los archivos de
tutoriales pueden descargarse de la pgina de la ctedra (http://www.qbiologica.ecaths.com/trabajos-practicos/).

Figura 3: Vista de un archivo pdb. En el rectngulo resaltado se pueden ver las coordenadas atmicas (x,y,z) de los tomos
de cada aminocido y tambin de tomos no pertenecientes a la protena (heterotomos).

PARTE PRCTICA:
Conceptos bsicos de estructura de protenas (tutorial: practico_A.kin)
Fragmento polipeptdico: ngulos de rotacin (phi), (psi) y (omega)
El esqueleto de la cadena polipeptdica de las protenas est formado por los enlaces entre los tomos de
nitrgeno (N), el carbono (C ) y el carbono del carbonilo (C) pertenecientes a un residuo de aminocido y continua
unindose mediante enlace peptdico el C con el N del siguiente residuo de aminocido. La figura 4-A muestra un
fragmento de la cadena polipeptdica, para ilustrar su geometra, los nombres de los tomos y los ngulos diedros o
ngulos de torsin de la cadena principal (, y ). Los ngulos diedros (que involucra los tomos Ci-1-Ni-Ci-Ci
alrededor del enlace Ni-Ci; es decir, es el ngulo entre el plano que contiene los tomos C i-1-Ni-Ci y el plano que
contiene los tomos Ni-Ci-Ci) y (Ni-Ci-Ci-Ni+1 alrededor del enlace Ci-Ci) moldean la estructura tridimensional de
la protena. En la figura 4-B y 4-C se muestran las proyecciones de Newman (Ni, Jirt, Koata, Jenkins, & McNaught,
2012) de los enlaces Ni-Ci y Ci-Ci, respectivamente, mostrando los ngulos y . Por convencin, cuando el ngulo
de torsin debe tener un valor absoluto < a 180 y se mide en el sentido de las agujas del reloj es positivo y en sentido
inverso es negativo.

Ri

C'i-1

Ci

Ni

C'i

C'i
H

Ci+1
Ri+1

H
C'i-1

Ri

Unidos a C'i

Ni

C'i+1

Ni+1

Unidos a Ci

Ri
Ci

Ni

Ni+1

Figura 4: A) angulos diedros , y de la cadena principal. B) y C), proyecciones de Newman para mostrar como se miden los
ngulos , .

Debes abrir el archivo practico_A.kin con el programa Mage. Algunos pares de valores para y generan un
alto impedimento estrico lo cual resulta en que algunos pares tienen mayor preferencia que otros. Esto queda expuesto
en un Grfico de Ramachandran (figura 5) donde se representan los pares de ngulos - para todos los residuos de
aminocidos de una protena.
Hoja
antiparelala

Hoja paralela

Hlice triple del

colgeno

Hoja torsionada a la
derecha
hlice
levgira

hlice
dextrgira

Figura 5: grfico de Ramachandran mostrando las

regiones favorables en azul oscuro y en celeste.
Tomado y traducido de (Nelson & Cox, 2004).

Funcin de los aminocidos en la estructura proteica

Los residuos fuertemente hidrofbicos Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Val, Trp se empaquetan predominantemente unos
contra otros para formar el ncleo interior de las protenas, mientras que los aminocidos cargados Asp, Glu, Lys, Arg se
encuentran casi siempre en el exterior. Los grupos neutros y polares muestran una distribucin mas uniforme, con una
ligera preferencia hacia el exterior. Los residuos de prolina (Pro) tambin se ubica por lo general hacia fuera, a pesar de
que su cadena lateral no tiene tomos polares, ya que es bueno para inducir la terminacin de las hlices y formacin
de giros. Gly tiene 3 diferentes tipos de funciones: se encuentra a) en los extremos de las piezas de estructura secundaria
(a menudo con valores de ngulos diedros poco comunes), b) en contactos bien compactos en el interior de una protena,
y c) en lugares donde es requerida una cierta flexibilidad en el movimiento.
Muchos aminocidos juegan roles especficos en algunas posiciones particulares de estructuras secundarias. Gly
es por lejos el aminocido mas comn en el extremo C-terminal de las hlices mientras que para el extremo N-terminal
son muy comunes Ser, Thr, Asn y Asp, por lo general haciendo un puente-H del oxgeno de la cadena lateral con el grupo
NH libre de la cadena principal en el primer giro de la hlice. Curiosamente, Gln es el residuo menos preferido para la
posicin N-terminal (el grupo metileno extra en su cadena lateral no permite que el oxgeno de la cadena lateral pueda
ubicarse en una geometra correcta para formar el puente-H). Esto demuestra que los residuos cuyas propiedades parecen
superficialmente similares no siempre juegan un papel equivalente en la estructura de una protena. Es especialmente
comn en las posiciones expuestas en el centro de hlices. Pro prefiere las esquinas en la cadena principal, muchas de las
cuales estn alojadas en un extremo de una pieza de estructura secundaria. Arg y Lys son otro par de residuos similares
con roles a menudo divergentes: la parte aliftica de su cadena lateral establece contactos hidrofbicos, mientras que el
grupo guanidinio de carga positiva en su extremo es capaz de establecer interacciones electrostticas y puentes
hidrgeno. El grupo guanidinio de la Arg puede establecer hasta 5 puentes hidrgeno con tomos de oxgeno en un
plano, y a menudo lo hace, por lo tanto tienden a tener una posicin bien definida. Lys, en cambio, forma puentes
hidrgeno a travs de su grupo NH3, de amplia libertad rotatoria, que suele ser muy mvil en protenas e interacta bien
con el solvente.
La funcin principal de los residuos hidrofbicos grandes es la de formar los ncleos hidrfobos. De las cadenas
laterales alifticas, las que tienen C ramificados (Ile, Val) prefieren ubicarse en lminas , mientras que Leu y Met
prefieren hlices .
Motivos estructurales proteicos (practico_B.kin)
Los ejercicios guiados nos permitirn identificar en las diferentes protenas los tipos de estructura secundaria:
hlice , banda (y su arreglo en hojas) y giros estudiados en la clase terica. Las estructuras secundarias estn
mantenidas por puentes hidrgeno entre diferentes residuos de aminocidos, especficamente entre el grupo N-H de un
enlace peptdico y el grupo carbonilo (C=O) de otro enlace peptdico.
hlice: el esqueleto peptdico esta enrollado, como una estructura en espiral, alrededor de un eje imaginario
(organizacin helicoidal de la cadena peptdica). Hay 3,6 aminocidos en cada vuelta de la hlice. Los grupos N-H de
todos los enlaces peptdicos apuntan en la misma direccin, la cual es aproximadamente paralela al eje de la hlice
mientras que los grupos C=O de todos los enlaces peptdicos apuntan en la direccin opuesta. El grupo C=O de cada
enlace peptdico esta unido por un puente hidrgeno al grupo N-H del enlace peptdico que se encuentra separado de l
por cuatro aminocidos. En la figura 6 se pueden ver dos representaciones esquemticas de hlice.

Figura 6: estructura esquemtica de la hlice. Imagen tomada y modificada de (Koolman & Rhm, 2004).

Hoja antiparalela

Hoja paralela

Figura 7: tipos de hoja . Imagen tomada y modificada de (Koolman & Rhm, 2004).

Bandas : el esqueleto de la cadena peptdica (hebras o tiras ) se extienden en un arreglo en zigzag similar a
una serie de pliegues, con los enlaces peptdicos organizados en planos de inclinacin alterna (alternando planos
descendentes y planos ascendentes). Cuando dos o ms bandas beta interaccionan forman una hoja plegada , que puede
formarse entre dos cadenas peptdicas o entre diferentes segmentos de una misma cadena peptdico (figura 7).
En la hoja , los grupos C=O y N-H de los enlaces peptdicos de cadenas adyacentes (o de segmentos
adyacentes de una misma cadena) estn en el mismo plano apuntando uno hacia el otro, de tal forma que es posible
establecer puentes hidrgeno entre ellos. Los puentes de hidrgeno son ms o menos perpendiculares al eje principal de
la estructura en hoja plegada. Las hojas pueden ser paralelas (cuando las dos cadenas peptdicas corren en la misma
direccin) o antiparalelas (cuando corren en sentido contrario).

Bucles y giros: las estructuras secundarias vistas hasta el momento, hlice alfa u hoja beta, se caracterizan por
ser zonas de conformacin repetitiva, es decir, se repiten los valores de y . Sin embargo, adems de estas estructuras
en las cadenas polipeptdicas podemos encontrar regiones no repetitivas. Muchas de estas zonas no repetitivas son bucles
y giros que provocan cambios en la direccin de la cadena polipeptdica que posibilitan que la protena tenga una
estructura compacta. En ocasiones se han denominado a estas zonas regiones no repetitivas de ovillo aleatorio random
coil). Esta definicin no es del todo correcta, puesto que las cadenas polipeptdicas no son flexibles en dichas regiones.
Sin embargo, en los extremos N- y C-terminal de las protenas pueden encontrarse regiones de ovillo aleatorio con gran
movilidad conformacional.

Figura 8: representacin de un giro o giro reverso.

Los giros son secuencias cortas, tpicamente formadas por tres o cuatro aminocidos con una conformacin
caracterstica que impone un brusco giro de 180 a la cadena principal de un polipptido. Muchos de los cambios de
direccin de la cadena polipeptdica se realizan mediante una unidad estructural comn conocida como giro beta o giro
reverso (beta hairping), ver figura 8. Lo esencial de este giro en horquilla es que el carbonilo de un residuo i forme un
puente hidrgeno con el grupo amino del residuo i+3. En consecuencia la cadena puede cambiar bruscamente de
direccin. A menudo los giros beta conectan hojas beta antiparalelas. Aminocidos como Asn, Gly y Pro, que se
acomodan mal en estructuras de tipo o , aparecen con frecuencia en este tipo de estructura. En una protena globular
los giros pueden incluir a casi un tercio de los residuos de la protena.

Adems de los giros existen regiones de

conformacin no repetitiva de ms de cuatro
aminocidos a las que frecuentemente se las
denomina loops o bucles (figura 9). Los loops que
conectan elementos de estructura secundarias son
generalmente cortos (80% son menores de 10
aminocidos de longitud). Sin embargo, los loops
largos (mayor o igual a 10 residuos) suelen conectar
dominios diferentes en una misma protena (figura 9).

Figura 9: presencia de un bucle en una protena mostrando la

alta flexibilidad conformacional que presenta la regin (rojo).

La transicin T-R en la hemoglobina humana (practico_C.kin)

Para la hemoglobina (Hb), su funcin como transportadora de oxgeno en la sangre esta fundamentalmente
vinculada al equilibrio entre los dos estados principales de su estructura cuaternaria, conocidos como "estado T", no
ligado o "desoxi" y "estado R" ligado a "oxgeno" u oxi. En estos ejercicios guiados estudiaremos los cambios
estructurales que ocurren durante esta transicin y su importancia en las propiedades funcionales, tales como el proceso
cooperativo de unin al oxgeno y la regulacin alostrica por el pH y los aniones. La Hb no es un sistema puro de dos
estados, pero la transicin de T a R proporciona la explicacin ms importante, de primer nivel de su funcin.
Para estudiar la transicin se llevar a cabo una comparacin entre las estructuras cristalinas de la desoxihemoglobina humana, que est en el estado T sin ligandos en el sitio de unin de O 2, y la carbomonoxi-hemoglobina
humana, que se encuentra en el estado-R y contiene ligandos en los 4 sitios. Estas estructuras de Hb fueron las primeras
resueltas con una resolucin bastante alta y se estudiaron detalladamente (Baldwin & Chothia, 1979). Pueden
encontrarse en el Protein Data Bank (PDB) bajo los cdigos de acceso 3HHB y 1HCO.
La molcula de Hb es un tetrmero de dos cadenas y dos cadenas . En humanos contienen 141 y 146
residuos, respectivamente. Sus secuencias son diferentes, pero homlogas, y comparten una estructura terciaria tipo todo
hlice. Cada subunidad est formada por 6 hlices principales y 2 hlices cortas que conforman el tipo de plegado
conocido como globina. Las hlices se denominan secuencialmente de la A a la H, que es el esquema de nombres
tradicionales. Por ejemplo, la histidina proximal (el residuo encargado de unir el Fe del grupo hemo a la protena) a
menudo se llama His F9, ya que es el residuo 9 de la hlice F. (En la cadena humana se corresponde con el residuo 87).
Las hlices forman un manojo aproximadamente cilndrico, con el grupo hemo y su tomo de Fe central ligado en un
bolsillo hidrofbico entre las hlices E y F.
Ambas cadenas y de la Hb se asemejan a la mioglobina (la protena fijadora de O 2 de cadena nica presente
en el msculo), tanto en la estructura terciaria en general como en el uso de un tomo de Fe en el centro de un grupo
hemo como el sitio donde el oxgeno se une reversiblemente. El hemo est rodeado de un bolsillo hidrofbico, lo cual es
necesario a fin de que el oxgeno se una de forma reversible sin producir oxidacin de la protena junto a otras
reacciones indeseables. De hecho, los residuos hidrofbicos rodean el sitio de unin tan estrechamente que para que el
O2 pueda entrar o salir del mismo, es necesario que distintas partes de la protena se pongan en movimiento para permitir
el paso de la molcula de gas. En consecuencia las propiedades dinmicas son esenciales para que sea posible la unin a
O2 y este proceso restrictivo tambin aumenta la especificidad de la unin del ligando.
Los grupos hemos responsables de la unin al oxgeno se encuentran muy distantes unos de otros en la protena,
de modo que las interacciones entre ellos deben estar mediados por cambios en la estructura proteica. El estado no ligado
(desoxi) se llama "T" (de "tensa"), ya que contiene interacciones estabilizantes extras entre las subunidades. En la
conformacin de alta afinidad del estado-R (de relajado) las interacciones que se oponen a la unin del oxgeno y
estabilizan el tetrmero son algo ms dbiles. En algunos organismos esta diferencia es tan pronunciada que sus
molculas se disocian en dmeros de Hb en forma oxigenada. La Hb humana ligada tambin se disocia cuando se diluye,
lo que plantea problemas en el uso de sustitutos de la sangre libre de clulas basadas en Hb porque la protena disociada
se excreta rpidamente.
El cambio entre los estados R y T requiere la interaccin de subunidades y no se produce en la mioglobina, o en
monmeros de cadena o aislados. Estos monmeros unen O 2 muy bien, lo cual sera til para cargar O 2 en los
pulmones, pero no permitira la liberacin para su entrega a los tejidos. Por lo tanto, la caracterstica central crtica de la
funcin de la hemoglobina es cmo logra, usa y controla alostricamente la cooperatividad entre los 4 sitios de unin en
el tetrmero para ajustar la unin de O 2 para satisfacer las necesidades fisiolgicas. Las interacciones entre las

10

subunidades y son crticas para la cooperatividad en la unin del oxgeno. En una primera aproximacin, la molcula
de hemoglobina se compone de dos "dmeros" (1-1 y 2 -2) que giran uno en relacin al otro como cuerpos rgidos
en la transicin R-T. Al comparar la estructura de ambas molculas notaremos que el dmero 1-1 sufre un
reordenamiento interno relativamente pequeo, pero su rotacin total es considerable. La rotacin neta de los dos
dmeros altera las interacciones entre s, sobre todo en el sitio efector alostrico entre 1 y 2 y en la interfase entre 12 donde las mutaciones tienen el mayor efecto sobre las propiedades alostricas de la Hb.
La relacin del sitio de unin a los cambios en la conformacin de protenas esta mediada por la unin del Fe en
el grupo hemo a la His proximal en la Helice F. La unin del O 2 al Fe resulta en cambios de estructura terciaria que
pueden entonces transmitir sus efectos a otras subunidades en el conjunto tetramrico (figura 9). Esto permite al O 2
unirse en una subunidad y afectar indirectamente la afinidad de otras subunidades. Los cambios en la interfaz de la
subunidad (junto con los cambios en el Fe) alteran el equilibrio entre las estructuras cuaternarias desoxi y oxi al tiempo
que un cambio de estructura cuaternaria altera la afinidad por ligando dentro de una subunidad dada. Cada O 2 que se une
aumenta la probabilidad de llevar el tetrmero al estado oxi, y una vez que sucede este cambio, la afinidad por el O 2 en
todos los sitios aumenta porque los cambios de estructura local ya han ocurrido o son ms fciles de llevar a cabo.
En la interfaz entre 1 y 2, las subunidades se desplazan una contra la otra entre el estado-T desoxi y el estadoR oxi. A pesar que la simetra no es exacta, hay partes similares de las subunidades que contactan entre s: la hlice C, y
el "codo FG" entre las hlices F y G. Dado que la transicin es un movimiento complejo orquestado entre el encaje de
dos conjuntos de contactos muy diferentes en los dos estados, esta interfaz es fundamental para hacer funcionar el
alosterismo en la Hb. Se demostr que las mutaciones de los residuos en esta interfaz tienen especial influencia sobre la
cooperatividad y el alosterismo.
Los puentes salinos que se establecen en las interfases entre las distintas subunidades juegan un rol importante
en la dependencia del pH de la unin de oxgeno, lo cual es conocido como el Efecto Bohr. Los puentes salinos entre 1
y 2 y en el extremo C-terminal de 2 estabilizan el estado-T desoxi. La His 146 se titula a un pH muy cercano al
fisiolgico, por lo cual las interacciones establecidas por este residuo son muy sensibles al pH. A pH bajo, cuando ms
protones estn presentes, es ms probable encontrar protonado al N del anillo de His dndole una carga positiva,
reforzando la interaccin con Asp 94. Esto favorece el estado T, disminuyendo la afinidad por el O 2.
Hay tambin una contribucin al Efecto Bohr debido a las cadenas laterales cargadas en la cavidad central del
tetrmero, donde por ejemplo la unin del anin que favorece el estado T es pH dependiente. El efecto del pH o efecto
Bohr, puede ser considerado como una regulacin alostrica por la unin de protones. Es importante biolgicamente,
porque promueve la descarga de oxgeno en los tejidos donde las concentraciones de protones son elevados debido, por
ejemplo, a la produccin de cido lctico en el msculo.
La desoxi Hb presenta sitios de unin a fosfato en la cavidad central del tetrmero, los cuales estn ausentes en
la oxi Hb. En la oxi Hb, las subunidades se acercan entre si, expulsando los grupos fosfatos del 2,3-bisfosfoglicrato
(2,3 BPG), y permitiendo que los extremos N-y C-terminal interacten. El 2,3 BPG y otros fosfatos se unen mucho ms
fuertemente a la estructura cuaternaria desoxi, por lo que necesariamente desplazan el equilibrio hacia desoxi Hb, y
debido a esto disminuyen la afinidad por O 2. Estas molculas de fosfato de regulacin son tiles en la sangre, debido a
que sus concentraciones se pueden controlar para cambiar la curva de afinidad de la Hb por el O 2 a fin de que se trabaje
en la parte ms pronunciada y eficiente en las condiciones imperantes en los pulmones y los tejidos.

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Figura 9: Alosterismo en la hemoglobina. El ligando, en este caso el O 2 facilita la unin de ms molculas de ligando, estabilizando
alostricamente la estructura relajada de mayor afinidad por el mismo. El O2 se une a la primera subunidad e induce un cambio en la
conformacin que se transmite a las otras subunidades de la protena. Imagen tomada de (Martinez, Jorge, 2012).

Bibliografia:
Baldwin, J., & Chothia, C. (1979). Haemoglobin: the structural changes related to ligand binding and its allosteric
mechanism. Journal of Molecular Biology, 129(2), 175220.
Koolman, J., & Rhm, K. H. (2004). Color Atlas of Biochemistry (2 Rev Enl.). Thieme.
Martinez, Jorge. (2012). el moderno prometeo: Protenas alostricas. Recuperado abril 17, 2012, a partir de
http://elmodernoprometeo.blogspot.com.ar/2011/10/proteinas-alostericas.html
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2004). Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition (4th ed.). W. H. Freeman.
Ni, M., Jirt, J., Koata, B., Jenkins, A., & McNaught, A. (Eds.). (2012). torsion angle. IUPAC Compendium of
Chemical Terminology (2.1.0 ed.). Research Triagle Park, NC: IUPAC. Recuperado a partir de
http://goldbook.iupac.org/T06406.html
Prevelige, P. E., Jr. (2011). New approaches for antiviral targeting of HIV assembly. Journal of Molecular Biology,
410(4), 634640. doi:10.1016/j.jmb.2011.03.074

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