Seminario 9 Reacción en Cadena de La Polimerasa

Universidad nacional Jos Faustino Snchez Carrin
Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Docente: Dr. HUGO SEGAMI SALAZAR

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NDICE
Introduccin..2
Reaccin en cadena de la polimerasa.3
La tcnica PCR..4
Fundamento e importancia.7
Anlisis de la muestra..8
Reactivos.10
Pasos de la reaccin.11
Tipos de PCR..14
Aplicaciones18
Bibliografa..22



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INTRODUCCIN
Para abordar de lleno el tema de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
debemos hablar primero de Biologa Molecular, esta es una ciencia cuyo objetivo
fundamental es la comprensin de todos aquellos procesos celulares que contribuyen
a que la informacin gentica se transmita eficientemente de uno seres a otros y se
exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras
naturales que existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro
llamado hospedero, empleando tcnicas de ingeniera gentica. Gracias a este avance,
se pueden producir fragmentos de cidos nucleicos a gran escala, abriendo as las
puertas a la secuenciacin de los cidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como
el diagnstico molecular, la terapia gnica o la obtencin de organismos superiores
recombinantes.
Si pudisemos regresar en el tiempo, nos encontraramos con hechos que
contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biologa molecular, por ejemplo:
En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de
segregacin y clasificacin independiente de los genes.
En 1869 Frederick Miescher, cientfico suizo descubre en el ncleo de las
clulas una sustancia de carcter cido a la que llam nuclena.
En los aos veinte el qumico alemn Robert Feulgen, utilizando una tincin
especfica descubri que el DNA estaba situado en los cromosomas.
En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el DNA es el portador de
la informacin gentica.
En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del DNA
Este ltimo hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos que conduciran a lo que
se llama tecnologa del DNA Recombinante.



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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reaccin en cadena de la polimerasa, ya ms conocida como PCR, es una tcnica
que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de
pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de ADN. Uno de los aportes
fundamentales de esta metodologa a la investigacin bsica en biologa molecular
consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una
tarea que antes requera largas y tediosas jornadas.
El producto que se obtiene al finalizar la reaccin -una gran cantidad de un fragmento
gnico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeados en
ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y funcin de los genes. Por su alta
sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una
clula somtica o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible,
la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos,
mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna.
Entre las aplicaciones mdicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de
nuevas estrategias de diagnstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus
de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV
en recin nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos
impide obtener resultados confiables, con los mtodos convencionales, durante el
primer ao de vida. Tambin ha facilitado el diagnstico de enfermedades tales como
las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo posible reconocer
mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncolgicas.
Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de clulas cancerosas en
pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con
una antelacin en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya
modos de evaluar a travs de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como
diabetes de tipo I y la enfermedad celaca. Precisamente los autores del presente
trabajo y colaboradores han obtenido, mediante el empleo de esta tcnica, resultados
que indican la existencia de una vinculacin entre determinadas variantes genticas y
dichas enfermedades en la poblacin argentina.



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LA TECNICA PCR
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la
amplificacin, resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o
bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer
investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la
amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el
consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha
impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El
tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil
nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar
necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total.
El mtodo se basa, en su forma ms simple en la realizacin de tres reacciones
sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten
cclicamente entre veinte y cuarenta veces (vase la figura 1). La muestra se calienta,
en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el
ADN, hecho que se conoce como "desnaturalizacin". En el segundo paso, la
temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas
cortas de nucletidos (oligonucleridos) con cada una de las hebras separadas del ADN
molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio
y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se
desea replicar.
Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos
oligonucletidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser
complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN
molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio
comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras
del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonuclesidos trifosfato
(dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer
paso est condicionada por aqulla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al
cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin)
el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se
encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado
de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin
geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers.



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Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de
la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta
temperatura requerida para desnaturalizarla doble cadena del ADN, por lo cual deba
agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente
fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la
bacteria "termfila" Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este
microorganismo, denominada Taq polimerasa, acta eficientemente entre los 75 C y
los 80 C y resiste ms de dos horas a 93 C. De esta manera es posible mezclar todos
los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reaccin en cadena puede
llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn los ciclos trmicos
programados. Estos equipos son provistos por numerosas empresas extranjeras, pero
ya ha sido fabricado uno por la industria argentina. Todo esto no hace ms que
confirmar la creciente popularidad de la PCR entre investigadores, mdicos y
bioqumicos clnicos.
Una vez finalizada la reaccin se habr logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad
de un fragmento gnico con un alto grado de pureza. Obtener el mismo resultado
utilizando las tcnicas clsicas de clonado llevara varios das de tedioso trabajo. Por
otra parte, la tcnica PCR es el mtodo de deteccin de secuencias de ADN ms
sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a
partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un
instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de
parentesco.


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Para lograr la duplicacin de un tramo de ADN, cada ciclo de la tcnica PCR incluye tres etapas: a)
desnaturalizacin, durante la cual se separan las dos hebras constituyentes del ADN; b) apareamiento de
los "iniciadores" o primers del tramo a replicar; c) extensin de las cadenas de primers gracias a la accin
de una enzima ADN polimerasa. La repeticin de los ciclos permite multiplicar geomtricamente los
tramos de ADN elegidos.


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FUNDAMENTO E IMPORTANCIA
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de
replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que
vuelvan a duplicarlas. La reaccin en cadena de la polimerasa fue desarrollada por Kary
Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar
los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN)
suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN
polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas
temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos,
generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus
(Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se
emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con correccin de
errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional. Hoy, todo el proceso
de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite
calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para
cada etapa de la reaccin (ver ms abajo). Muchos termocicladores modernos hacen
uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente
invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy
fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance
rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema
que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de
reaccin. Los termocicladores ms antiguos que carecan de este sistema,
solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte
superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en
laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la
filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos
hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y tests
de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas.



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ANLISIS DE LA MUESTRA
El hecho de que las molculas de ADN obtenidas al finalizar la reaccin en cadena
correspondan efectivamente al fragmento de inters queda asegurado por la
intervencin de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese
fragmento. As, una vez que la reaccin a finalizado, el tamao del fragmento
multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reaccin a una
electroforesis en gel de azarosa o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separacin
por difusin bajo la accin de un campo elctrico.
Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin
(unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de
bases est contenida en el fragmento de inters. En este caso se procede as: el ADN
fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana
de nitrocelulosa o nylon, que acta como soporte slido (Southern blot), y luego es
puesto en contacto con la sonda, que se unir al fragmento buscado ya que ha sido
preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo.
Tambin es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de
pequeas manchas (dot blot) para su posterior hibridacin con la sonda (vase la
figura 2). La localizacin de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante
autorradiografas.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en
realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alcuota de la
misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicacin tras haber colocado dos
primers internos. Mediante el empleo de esta metodologa, conocida como nested PCR
(PCR anidada), la filiacin de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho
de que poseen tamaos previsibles.
En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas y
clivadas por ciertas enzimas llamadas en donucleasas de restriccin. La determinacin
del tamao al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la
enzima de restriccin adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de
inters.
Para disear los primers que hacen posible replicar un fragmento de ADN mediante la
tcnica PCR es necesario conocer, en la mayora de los casos, la secuencia de bases
total o parcial de dicho fragmento. Por esta razn, aunque la PCR supera en
sensibilidad y rapidez a las tcnicas de clonado y de secuenciacin convencionales, no
se puede prescindir de la informacin brindada por las mismas.


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Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la tcnica PCR. A: visualizacin
directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la accin de un campo elctrico
(electroforesis) migran de una manera caracterstica que se puede visualizar por tincin (coloreado) del
ADN. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamao conocido.) B:
Southern blot. El ADN es desnaturalizado (separacin de sus hebras constituyentes) y transferido a una
membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridacin (unin) con una sonda radiactiva.
sta quedar fijada donde se encuentre el tramo de ADN de inters y su presencia se revelar a travs de
una autorradiografa (placa fotogrfica sensible a la emisin radiactiva de la sonda). C: dot blot. Mtodo
anlogo al anterior, pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a
analizar previamente desnaturalizados.



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REACTIVOS
Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 L. Para realizar la
tcnica se necesitan:
Desoxinucletidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores (o primers), oligonucletidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de
entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de 18 a 22, que son
reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Deben estar
situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a
amplificar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como
cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede
emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que
altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis
de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima
alrededor de 70C (la ms comn es la Taq polimerasa).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada
una de las etapas que conforman un ciclo.

Tubos de PCR Termociclador



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PASOS DE LA REACCIN

1-Inicializacin
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96C ( 98C si se
est usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9
minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por
calor.



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2-Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est
constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento
(94-95C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide
realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga
la hebra, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados
en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de
realizar la desnaturalizacin.
3-Alineamiento/Unin del cebador
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a
su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 50-65C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el
alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin
ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el
cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin
de la molcula que va a ser amplificada.
4-Extensin/Elongacin de la cadena
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis
de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la
hebra molde aadiendo los dNTP's complementarios en direccin 5' 3', uniendo el
grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN
creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN
polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad
est en 75-80C (comnmente 72C). El tiempo de extensin depende tanto de la ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.
Hay una regla bsica: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar
mil bases en un minuto.
5-Elongacin Final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74C durante 5-15 minutos
tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple
restante sea totalmente ampliado.



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6-Conservacin
Este paso se lleva a cabo a 4-15C durante un tiempo indefinido para conservar la
reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 0.2-0.5 ml, en
pequeos tubos de 15-100 l que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean
tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a
su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada,
a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para
fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y
aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.[3] El/los
tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se
corre en el gel junto con los productos de PCR.
7-Optimizacin de la PCR
En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, pero normalmente es debido a su
sensibilidad a la contaminacin, que a veces provoca la amplificacin de ADN "falso".
Por esto, se han desarrollado un gran nmero de tcnicas y procesos para optimizar la
PCR:
La contaminacin con ADNs extraos puede solucionarse con protocolos y
procedimientos que separen las reacciones pre-PCR de los contaminantes potenciales
del ADN. Esto normalmente implica la separacin espacial de las reas de realizacin
de la PCR de las de anlisis o purificacin de los productos de PCR, y la limpieza
exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente.
Las tcnicas de diseo de primers son importantes en la mejora de la obtencin de
productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos, y el uso de
componentes alternativos para los buffers o las enzimas polimerasas pueden ayudar
en la amplificacin de regiones de ADN largas o, de cualquier otra forma,
problemticas.



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TIPOS DE PCR
1-PCR anidada: Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una
amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con
cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR
es muy especfica.

2-PCR in situ: PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. La PCR in
situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada
sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una
primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ
convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de
amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin.

3-PCR multiplex: PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma
reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en nico tubo con el fin de amplificar
simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica
reaccin toda par de cebadores de los sistemas que queremos amplificar
simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades
suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin,
menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida
construccin de base de datos.

4-PCR en Transcriptasa reversa (RT-PCR): Donde el molde inicial es ARN y se requiere
de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversin del ARN a un tipo
de ADN llamado ADNc (ADN complementario).

5-PCR tiempo real (Q-PCR): Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que
permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para
identificar con una muy alta probabilidad, muestras de DNA especficas a partir de su
temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting
temperature).
Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en tcnicas
basadas en sondas especficas.


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En las tcnicas basadas en fluorocromos, el ADN, que ve multiplicada su cantidad con
cada ciclo se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo
fluorescencia que es medida por el termociclador apto para Real Time PCR. Permite
cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar primers
normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la realizacin de Real time
PCR con sondas especficas.
Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos
fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el
inverso (reverse), cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica
de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda
est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3'
exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de
fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.
La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR
realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que
monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A
diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin ADN al
final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el
proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es
proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar
fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su
vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el
mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado
fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de
amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos
determinados. ADN complementario

6-Variaciones de la PCR bsica:
PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para
identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs).
PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas secuencias de ADN,
realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucletidos largos con
secuencias solapantes cortas.
PCR asimtrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN
original con respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli
pueden ser rpidamente examinadas para construcciones viables de vectores
de ADN.


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Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy parecida a la PCR
convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura
constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de
desnaturalizacin-extensin.
PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica durante las
etapas iniciales de la PCR.

PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un mtodo de PCR para su
uso en huella gentica, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia
simple para producir una huella gentica nica de longitudes de fragmento
amplificadas.
PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es
conocida una secuencia interna. Muy til en la identificacin de secuencias que
flanquean insertos genmicos.
PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al
ADN de inters y mltiples primers hibridando estos linkers.
PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas
CpG de ADN genmico.
Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda: permite amplificar varias
secuencias objetivo con un nico par de primers, evitando as las limitaciones
de resolucin de la PCR multiplex.
PCR cuantitativa: es usada para medir la cantidad de un producto de PCR
(preferentemente en tiempo real).
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una
secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se
desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de
modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el
alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico
bajando gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de
la PCR.
PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede
ser usado en clulas vivas.



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APLICACIONES
La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como
herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de
inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en
diagnstico clnico.
1-Investigacin
La PCR convencional se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio
debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar
y detectar los fragmentos de ADN de inters.

Clonacin de un segmento de ADN mediante
amplificacin con cebadores que contienen una
secuencia apta para la recombinacin dirigida
con un plsmido.
Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de secuencias de ADN
en vectores, como pueden ser los plsmidos. Para ello, se emplean cebadores que
contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interaccin posterior
con otra complementaria situada en el vector de clonacin a emplear.
Por ejemplo, se puede incluir una diana de restriccin en dichos cebadores, de modo
que, y si sta no exista previamente en el fragmento y es nica en el vector, pueda
efectuarse una ligacin mediante la ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de
restriccin apropiada de ambos elementos. Otro mtodo asimilable a esta va es el
empleo de la recombinacin dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una
secuencia que faculta a una recombinasa la recombinacin dirigida con un vector
dado.



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2-Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses
Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la medicina y antropologa
forense se han visto enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas
ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas
gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biolgicos que ms
informacin puede proporcionar es el ADN.
La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante
largos periodos de tiempo si las condiciones son propicias. En ocasiones las muestras
intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeas o estn
deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades tiles para
posteriores pasos de anlisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material
recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente,
en teora basta una sola molcula para que el proceso pueda tener lugar.
Tambin debido a la naturaleza de la tcnica y su propsito de amplificacin de
fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que este ADN pueda ser
empleado como molde para una reaccin de PCR.
En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas cantidades de
ADN que an no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podra preservarse
son la brea las cenizas volcnicas, el mbar, hielos histricos polares o glaciares y
ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales de apatita de restos de
esqueleto, siendo posible de ese modo caracterizar cadveres, fsiles u otros restos
mediante genotipado por anlisis de microsatlites o incluso genomas de taxones
extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN
genmico del hombre de Neanderthal. El propsito sera utilizar este ADN amplificado
para posteriormente realizar estudios filogenticos o etnogrficos o de poblaciones
mediante la comparacin de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la
separacin evolutiva de dos especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona o para
obtener pruebas a partir de muestras mnimas dejadas por el autor de un crimen como
saliva, semen u otros restos de tejidos (Butler, 2005).

3-Agronoma y diversidad
Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genticas de individuos
concretos, dentro del marco de la gentica forense, existen mtodos basados en la
PCR que permiten discernir entre grupos infraespecficos de cultivos de inters
agronmico; por ejemplo, de cultivares. Para ello, se emplean oligonucletidos de un


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tamao lo suficientemente pequeo como para que ceben de forma relativamente
inespecfica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrn de bandas
discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los
fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un
comportamiento similar, de los que divergen.

4-En el diagnostico medico
La PCR ha permitido el desarrollo de nuevas estrategias de diagnstico en numerosos
campos de la medicina. Por ejemplo, existen mtodos de deteccin por PCR de
agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de
Epstein Barr y citomeglico. En relacin con el SIDA es posible detectar regiones del
genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) amplificadas por PCR a partir
de sangre extrada de pacientes seropositivos.
Esta tcnica puede ayudar a resolver resultados inciertos provenientes de las pruebas
habituales y ha sido aplicada en el diagnstico de la infeccin en recin nacidos de
madres seropositivas. En tales casos, el uso de la tcnica PCR evita el problema que se
plantea por el hecho de que la presencia de anticuerpos recibidos de la madre impide
saber, hasta que stos desaparecen aproximadamente un ao despus del nacimiento,
si el propio organismo del nio ha generado anticuerpos porque se encuentra
infectado (vase "El nio infectado con HIV', en Ciencia Hoy, vol. 4, n 21, pgs. 46-47).
Pueden detectarse tambin otros microorganismos patgenos como las clamidias, la
bacteria Escherichia coli enterotoxignica, el vibrin del clera y los tripanosomas.
La tcnica PCR ha facilitado enormemente el diagnstico de enfermedades
hereditarias como hemoglobinopatas (talasemias y anemia falciforme), la
fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia
muscular y la fibrosis qustica. Esta ltima es la ms comn de las enfermedades
autosmicas recesivas severas que afectan a la poblacin blanca. El aislamiento del
gen afectado ha permitido identificar las mutaciones que causaran esta patologa. La
anulacin de tres bases que provocan la ausencia del aminocido fenilalanina N 508
en la protena que es producto del gen de la fibrosis qustica constituye la mutacin -
llamada - ms frecuente en caucsicos (60% de los afectados en la poblacin
argentina), por lo que su anlisis resulta ser el primer paso destinado tanto a la
deteccin de portadores sanos como a la confirmacin del diagnstico en individuos
afectados y al diagnstico prenatal.



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En enfermedades oncolgicas pueden detectarse, mediante la tcnica PCR,
mutaciones de oncogenes (literalmente "genes inductores de cncer") como en el caso
del oncogn ras en carcinomas de colon, de pncreas y en leucemias mieloides; del
"antioncogn" de retinoblastma, o del llamado cromosoma Philadelphia. Este
cromosoma aparece en pacientes con leucemia mieloide crnica y es el resultado de la
translocacin de una porcin del gen bcr desde el cromosoma 22 al 9, donde se ubica
junto al oncogn c-abl.

La consiguiente activacin de este ltimo, que codifica para una enzima denominada
tirosina quinasa, parece ser el desencadenante de la enfermedad. La tcnica PCR es
especialmente til, en este caso, para detectar la presencia de ARN mensajero hbrido
bcr/abl. El ARN es analizado mediante la ya mencionada tcnica RT-PCR, con primers
especficos que revelan la presencia de mensajeros normales o hbridos. En pacientes
sometidos a quimioterapia, la gran sensibilidad del mtodo lo hace ideal para
identificar poblaciones residuales de clulas cancerosas no detectables mediante
tcnicas convencionales, de manera tal que permite diagnosticar tempranamente un
nuevo avance de la enfermedad.



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Universidad nacional Jos Faustino Snchez Carrin

Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Docente: Dr. HUGO SEGAMI SALAZAR

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