TCNICAS DE IDENTIFICACIN CITOHISTOLGICA II

Inmunohistoqumica:

La IHQ es el conjunto de tcnicas que permite la deteccin de antgenos en
clulas o tejidos, mediante el uso de anticuerpos especficos, siendo identificada
esta unin mediante un sistema de deteccin que permite la visualizacin
microscpica. La particularidad de esta tcnica es que utilizando anticuerpos muy
especficos para la deteccin de antgenos en los tejidos se conserva el entorno
morfolgico, es decir se reconocen los antgenos por la morfologa clsica: ncleo,
citoplasma, matriz intercelular, hecho que es muy valioso, por lo que es utilizada
incluso en trabajos de lnea ms bien bioqumica (en que se usan tecnologas que
implican el rompimiento del tejido para cuantificar y analizar elementos
particulares, pero que no conserva el entorno), de hecho se encuentran en
muchas publicaciones de investigacin bioqumica fotografas de reacciones IHQ
que respaldan toda la informacin obtenida en el anlisis bioqumico.

Existe una interaccin entre antgeno unido al tejido, anticuerpo especfico
(esta es la clave de la tcnica; se requiere que tenga adems una alta
selectividad) y un sistema de deteccin que es un tipo de reaccin luminosa,
enzimtica o electrondensa que permite la visualizacin microscpica. Las
tcnicas IHQ son mltiples y reciben su nombre de acuerdo al sistema de
deteccin:
1. fluorocromos: inmunofluorescencia (fluorescena, rodamina; se emplean en
microscopa confocal)
2. enzimas: inmunoenzimtica (peroxidasa, fosfatasa alcalina)
3. sales metlicas: inmunometlicas (microscopa electrnica, oro coloidal,
ferritina como pigmentos electrondensos)


Inmunofluorescencia:

Inmunofluorescencia Directa o IFD: tcnica en que directamente en un tejido
encontraremos la reaccin de antgeno anticuerpo, es decir tenemos el antgeno, a
este antgeno se pega el anticuerpo y con un antisuero marcado contra ese
anticuerpo, vamos a detectar al antgeno.

Inmunofluorescencia indirecta o IFI: cuando nosotros tenemos que armar nuestro
complejo antgeno anticuerpo, tenemos una etapa ms donde nosotros armamos
nuestro complejo antgeno anticuerpo, por ejemplo detectamos un apo anticuerpo
que anda circulando, anticuerpo ya sea antinuclear, anti tiroideo, anti clula
muscular lisa, anti DNA; etc.

Se utiliza un anticuerpo primario (dirigido contra el antgeno de inters); la
IFI por su parte requiere que el marcador est conjugado a un Ac secundario
dirigido contra el anticuerpo primario; en el caso del mtodo PAP tenemos el
marcador unido a un complejo PAP unido al Ac antiperoxidasa; y en el caso de
ABC el anticuerpo secundario est conjugado con biotina, que es afn por la
avidina o streptavidina (protena presente en la clara de huevo o en
streptococcus). La biotina puede estar unida adems con peroxidasa. Cuando se
tiene un anticuerpo primario unido a un Ac 2 biotinilado, en un tercer paso
tenemos un complejo AB y peroxidasa, agregndole un complejo peroxidasa, la
reaccin obtenida es ms sensible. Se han ideado sistemas de deteccin que
emplean molculas de dextrano a las que se agrega una gran cantidad de
peroxidasa, varios tipos de anticuerpos secundarios que se obtienen de ratn,
conejo, cabra, etc. Se pueden disear anticuerpos contra cualquier componente
en estos polmeros; adems es ms fcil de aplicarlo, aunque su costo por la
forma de producirlo es ms elevado.

Las aplicaciones en clnica se han desarrollado principalmente en 3 reas:

DIAGNSTICO HISTOPATOLOGICO

Clasificacin de tumores con gran detalle de caractersticas
Tipificacin de linfomas

PRONSTICO EN TUMORES MALIGNOS

Receptores hormonales, por ejemplo para CA mamario la presencia de receptor
de estrgenos o de progesterona
Estatus proliferativo-apopttico
Evaluacin de capacidad metastsica (determinar la mejor o peor probabilidad de
sobreviva)

TRATAMIENTO DE PACIENTES CON CANCER

Calificacin de pacientes para tratamiento antitumoral. Por ejemplo el test de
Herceptina (Herceptest) HER2: Human epidermal growth factor receptor 2; ello
porque su sobreexpresion esta relacionada a mal pronstico. Todas las pacientes
HER2 positivas, califican para una terapia con Herceptina.

Fluorescencia (fenmeno de fotoluminiscencia): Propiedad que tienen
algunas sustancias de emitir luz visible de modo instantneo mientras son
excitadas (fotn) por medio de radiaciones de longitud de onda corta, cesando el
fenmeno cuando se interrumpe la radiacin incidente; en este aspecto difiere de
la fosforescencia (fenmeno en el que persiste la emisin una vez interrumpida la
excitacin).

Las molculas capaces de emitir son conocidas como fluoroforo. El
fluoroforo puede emitir en distintas longitudes de onda (). El tipo de emisin (rojo,
verde, azul, etc) depende fundamentalmente de cmo est dispuesta la
molcula, por ejemplo: FITC se excita a 488nm, emitiendo color verde, yoduro de
propidio se excita con 543-550nm y emite a 590nm aprox. DAPI se excita con
350nm y emite en azul 460-480nm.
Hoy en da existen miles de fluoroforos que se ocupan en el rea biolgica
con nuevas propiedades y que permiten usarse como marcadores de este tipo de
molculas, por ejemplo: Retculo endoplasmico, Ap. de Golgi, DNA. La tendencia
es encontrar fluoroforos que emitan a distintos , pero que se exciten dentro del
espectro visible (V) y no en el ultravioleta (UV). Cuando se trabaja con clulas de
tejido conviene trabajar a ms largas para evitar producir dao biolgico, incluso
se usan sustancias que emiten en el infrarrojo (IR) de tal manera que se ha
excitable a ms largas, sobre todo cuando uno trabaja en inmunocitoqumica o
en inmunofluorescencia en vivo, es til cuando se trabaja con molculas marcadas
que no son anticuerpos (AB), y queremos observar incorporacin dentro de la
clula.

Hoy en da existen ciertas protenas naturales que tienen la propiedad de
emitir fluorescencia y se conocen como protenas autofluorescente, stas son
utilizadas para mapear genes, construyendo un constructo por biologa molecular.
Conocido el gen de la protena autofluorescente se coloca como gen reportero
junto al gen de estudio, solamente si el gen se transcribe aparece la protena que
va a producir fluorescencia natural, lo que permite estudiar adems, donde esta
ubicada dentro de la clula. Se han encontrado protenas autofluorescentes en
algas e insectos de los cuales se ha aislado el gen y se puede observar en clulas
animales y humanas.

El fluoroforo tiene la propiedad de emitir onda electromagntica que tiene
un espectro de emisin. Al comprar el reactivo, siempre es adjuntado el espectro
con los respectivos mximos, lo cual es importante si se quiere realizar doble
marcaje, ya que debemos observar que los respectivos espectros sean diferentes
para que se puedan visualizar por separado, de esto ltimo depende el xito de la
calidad de la fluorescencia que se observa. Es importante tener un filtro de
excitacin que seleccione la , de tal manera que puede tener filtros de banda
corta o ancha altamente selectivos, dependiendo de la cantidad de fluorescencia
que se observa.

Para observar molculas fluorescentes, se requiere de un microscopio de
fluorescencia, el cual consta de las siguientes caractersticas:

Fuente de luz: tiene que ser de amplio espectro hacia el rango del ultravioleta
largo, de tal manera que se puedan excitar compuestos con corta, como
el DAPI


Utilizando una lmpara de alta presin de mercurio, llamada HBO. Una de
las propiedades ms importantes de esta lmpara es poseer un nodo y un
ctodo, sin continuidad fsica entre ellos, de tal manera que cuando se aplica
corriente se genera un arco voltaico que produce luz. El material de que esta
hecha la lmpara es quarzo ya que no absorbe la luz UV. Dentro de la ampolleta
existe un alto vaco con Hg lquido, que al producir el arco este se vaporiza
aumentando la presin interna considerablemente, todo esto permite que emita
en el UV. Deben existir cuidados con el manejo de la lmpara por ejemplo: Jams
prender la lmpara si sta estuvo previamente prendida por largo periodo de
tiempo (sobre 1 hora prendida), slo se puede volver a encender una vez enfriada
la lmpara. Debido a la alta presin de Hg, se debe tener presente que a mayor
temperatura es mayor la presin del gas, entonces la lmpara al encenderse
nuevamente, teniendo el gas caliente, puede sobrevoltar el sistema generando
una temperatura extra que alza a su vez la temperatura del gas venciendo la
resistencia del cuarzo y EXPLOTAR. Nunca quedarse en el lugar.

Filtro de excitacin: Selecciona la adecuada para el peak del fluoroforo, es
decir 2 fluoroforo, 2 filtros.
El microscopio debe tener un sistema de epifluorescencia (episcpico).
Epifluorescencia: el objetivo acta como condensador, la muestra se ilumina
por el objetivo esto se llama sistema epi; todos los otros sistemas que se
utilizan por transparencia se llama sistema diascpico. El episcpico es
ms seguro para el operador ya que no lo expone a longitudes de onda
corta.
Se necesita un filtro en el lente ptico, el cual tiene la propiedad de
comportarse como espejo para las longitudes de onda corta, ste se
denomina espejo o filtro dicroico, el cual es transparente para la emisin del
fluoroforo, la longitud de onda seleccionada por el filtro corresponde al peak
de emisin del fluoroforo recibida por el filtro de emisin.
Filtro de emisin: deja pasar a partir de una determinada seales ms
angostas o ms anchas, es importante cuando se trabaja con varios
fluoroforos para que no se topen las fluorescencias y se mezclen las
seales, sobre todo cuando se quiere cuantificar.

Estos tres filtros vienen en un kit (filtro excitatorio, dicroico, emisin). Se
puede cambiar un solo filtro transformando el kit, as aumenta la cobertura, para
reducir el costo del fluoroforo.

La ptica utilizada para longitudes de onda cortas transparente a la UV, se
denomina ptica de fluor, la cual es adecuada para fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia tiene:
Fuente de luz
Kit de filtros
ptica adecuada.

Es importante elegir fluoroforos estables que no decaigan rpidamente en el
tiempo, utilizar pelculas de alta sensibilidad las cuales reducen el tiempo de
exposicin al mnimo, por lo tanto, el tiempo de excitacin se reduce
adecuadamente.

Debe existir un mejoramiento de la microscopa sobre todo cuando se
trabaja con clulas enteras, debido a que la imagen se ve como en una nebulosa,
porque la luz de los planos focales sobre y bajo foco se meten en el sistema ptico
y se pierde resolucin desde donde proviene la fluorescencia, por ejemplo si se
hace marcaje de membrana la fluorescia del plano de membrana debajo y sobre
foco hace ver fluoresc. en el ncleo y citoplasma, si bien el lente hace profundidad
de foco no se distingue slo el marcaje de membrana.

En citologa, el anlisis de molculas dentro de la clula, es un gran
problema sobre todo cuando queremos ver localizacin de elementos que estn
dentro de la clula, o si se quiere seguir molculas que pasan del citoplasma al
ncleo, por lo tanto, se requiere un sistema de observacin tal que permita obtener
un corte ptico que corresponda a la fluorescencia de ese plano y elimine la
fluorescencia sobre y bajo foco.

En 1956 se crea la primera imagen confocal a partir del estudio de las redes
neuronales. La microscopia confocal permite al investigador ver slo la imagen de
inters, con este instrumento cambia la tecnologa de cmo iluminar la muestra.
Se utiliza un lser en vez de la lmpara HBO. El lser no es monocromtico, emite
en un espectro entre 420-510nm con un peak a 488nm. El lser hace un barrido
sobre la muestra de tal manera que no se ilumina todo el campo, excitando por
punto, al no existir fluoroforo el resultado es negro. Si existe un fluoroforo y si se
excita lo detecta con distintos grados de intensidad, dependiendo de la
concentracin y as sucesivamente. La emisin del fluoroforo se asocia a un
sistema de registro como es un fotomultiplicador, el cual es un milln de veces
ms sensible que el ojo humano.

Los tubos fotomultiplicadores (PMT) toman una fotografa de cada punto y
lo guardan en la memoria de un computador, por lo tanto se requiere de un
computador para integrar la imagen de todo el barrido en un sistema de ejes
coordenados x e y.

En resumen los requisitos de la microscopia confocal son:

Lser (distintos tipos de lser con distintas para la cobertura).
Sistema de deteccin del lser (barrer el lser sobre el espcimen)
Sistema de registro de la imagen (PMT), registra la emisin del espcimen
excitado por la adecuada.

El lser tiene capacidad de destruccin (fotones muy concentrados),
logrando penetrar la muestra de un determinado grosor, excitando as en todos los
planos. El microscopio tiene colocado antes del PMT un dispositivo que permite
seleccionar la luz correspondiente al plano focal, ste se conoce con el nombre de

DIAFRAGMA DE PINHOLE El diafragma de Pinhol permite seleccionar el plano
focal de inters, si el pinhole disminuye, ms delgada es la torreja que se va a ver
en profundidad en el sentido del eje Z, por lo tanto se tienen los conos de emisin
de las estructuras que estn en ese plano, si el pinhol, se aumenta detecta luz de
distintos planos, por lo tanto la nitidez de la imagen se pierde.

Realizar microscopia confocal es hacer microscopia de fluoresc., tal manera
que permita afinar el plano focal, por esto se llama confocal. Con la microscopia
confocal se puede obtener una galera de fotos correspondientes a distintos
planos y se reconoce en el eje Z distinta informacin, con un software se toma la
imagen y se reconstruye tridimensionalmente colocando los planos unos sobre
otros, la imagen de esta forma es integrada, logrando as tener imgenes limpias
(reconstruccin tridimensional).

Si el microscopio no es cofocal, no se puede decir que la imagen es
colocalizada. Podemos determinar cuntos pixeles estn colocalizados para
ambos colores y a travs de un grfico de colocalizacin (en la misma zona)
determinar donde las molculas estn juntas y donde no. La microscopia confocal
permite medir con que velocidad una protena de localizacin intranuclear pasa del
citoplasma al ncleo, utilizando una tcnica llamada fotobright que permite
cuantificar la cantidad de fluorescencia que aumenta en el tiempo en el paso de la
protena desde el citoplasma al interior del ncleo, es decir si se conoce la
fluorescencia por molcula, se puede determinar cuantas molculas llegaron por
unidad de tiempo al espacio planteado.



Microscopa electrnica

Transmisin

El microscopio electrnico de transmisin se ha instituido desde su creacin
en los aos 30 en una herramienta de apoyo fundamental para el entendimiento
de la ultraestructura de entidades biolgicas y no biolgicas. En esta presentacin
haremos una revisin prctica orientada a aspectos tcnicos del funcionamiento
del microscopio electrnico.

Aquellos que hemos trabajado con microscopios pticos hemos logrado
obtener aumentos prcticos de 1000 veces, pero sabemos que cambiando la
fuente de luz o radiacin (por ejemplo empleando radiaciones UV), puede variarse
el aumento de un microscopio. Esto se basa en la limitacin que pone la longitud
de onda utilizada en el poder o lmite de resolucin de un microscopio. En la
medida que la longitud de onda empleada es menor, la resolucin (distancia
mnima a la que 2 cuerpos cercanos deben estar separados para ser distinguibles
como entidades distintas) aumenta. Si consideramos que el ojo humano tiene una
limitada capacidad de visin, que slo comprende las radiaciones ubicadas entre
los 350 y 700 nm (violeta a rojo, rango visible del espectro de longitudes de onda),
y que no percibe ni las longitudes de onda inferiores a 350 nm (UV, radiacin X, ,
, , rayos csmicos) ni aquellas superiores a 700 nm (IR, microondas, ondas de
radio, TV), nos encontramos con la sorpresa de tener una pobre percepcin de
nuestro entorno (Figura 1). Nuestro lmite inferior llega a niveles de longitudes de
onda que
cumplen con las condiciones exigidas a la luz, es decir, reflejadas, focalizadas y
colimadas (concentradas), pero no deflectadas, salvo que sufran efecto de masas
tal como lo explica la teora de la relatividad de Einstein.


El manejo de las longitudes de onda nos permite determinar los lmites de
ampliacin de las imgenes. En la microscopa de luz empleamos fotones, en
tanto que en microscopa electrnica la muestra es iluminada por electrones.

stos son de un manejo relativamente fcil. Se ilumina puntualmente, con
un menor lmite de resolucin. Puede tomarse una seal y trasladarla al
espectro visible.

Sin embargo, tienen una baja penetracin pese a la alta aceleracin que se
les puede imprimir, por lo que es necesario que las muestras sean muy finas.
Dependiendo del espesor y el peso atmico (P.A.) de la masa en observacin,
ser la penetracin que tengamos. A mayor peso atmico, menor penetracin.

Generalmente, el material observado en biologa es de PA bajo.

El MET empleado en biologa se caracteriza por tener bajas aceleraciones
de electrones, entre 40 y 100 kV. Al aumentar la energa de los electrones por
mayor kV aplicados, se les imprime mayor velocidad, pudiendo pasar desde el
estado esttico a la velocidad de la luz.

Componentes del Microscopio Electrnico de Transmisin:

En el esquema que sigue, se presentan de manera simplificada los
diferentes componentes del MET:

(i). Sistema de iluminacin: Constituido por un can de electrones, encargado de
emitir el haz electrnico que incidir sobre la muestra, y por un sistema de lentes
condensadoras que coliman o pulen el haz, mantenindolo recto.

(ii). Sistema ptico o de magnificacin: Constituido por una lente objetivo, lentes
intermedias y una lente de proyeccin, que amplifican la imagen del espcimen.

(iii). Pantalla: Encargada de convertir la seal del haz de electrones que traspas
la muestra, en luz visible, permitiendo que se vea el espcimen.

(iv). Sistema de grabacin: Consistente en placas fotogrficas, sistema de video o
sistema de captura digital, que permite el almacenamiento de la informacin ptica
de la muestra, lo que es necesario para el anlisis de las muestras.

a. Can: El can es la fuente de electrones que incidirn en la muestra. Se
comporta como una fuente electromagntica (FEM), aportando aceleracin a los
electrones. El can est constituido por un sistema de transmisin termoinica,
que se comporta como un conductor (que tiene electrones libres; diferente es el
caso de los aislante, cuya cantidad de electrones libres es nfima o nula) en que al
calentar el conductor aumenta la cantidad de electrones libres en el material
conductor, por fuerzas que producen una nube electrnica en torno a este
material. Estos electrones libres, al ser estimulados con una energa mayor a
aquella que los mantiene unidos al tomo del que forman parte, son expulsados
del orbital en que se encuentran y pueden viajar por el vaco hasta que encuentren
un objeto en su camino.

Cuando se pone una placa positiva (+) respecto del elemento, sta atrae los
electrones libres que se mueven por el espacio; debemos recordar que esta
libertad de movimiento est condicionada a que no exista algn elemento que
interfiera en el trayecto de estos electrones.

Para que los electrones se desplacen libremente el camino a seguir por ellos debe
estar completamente libre, por lo que es necesario proporcionar vaco extrayendo
gases de la columna.

El aire que respiramos tiene una densidad de 1kg por m3; cuando lo
calentamos se aumenta el volumen por aumento de la energa cintica de los
tomos que lo componen. Por cada kg de aire, cuando es calentado, aumenta en
la carga que ste puede elevar. Por ejemplo, para elevar a una persona de 100
kg se requieren 200 m3. Los electrones que se encuentran en el aire tienen poca
masa comparados con los de algunos metales, principalmente aquellos
empleados en microscopa electrnica. Uno de ellos es el oro, cuya densidad es
20 kg/l; el aire
por contrapartida tiene una densidad y peso equivalente a 20000 veces menos.

Cuando existe una perforacin en la pantalla, la mayora de los electrones
quedan detenidos en el nodo, pero aquellos que pasan a travs de la perforacin
viajan por el vaco en direccin al infinito con una baja eficiencia. El nodo mide de
4 a 5 mm2, en tanto la perforacin mide 3 mm de dimetro. El filamento generador
de electrones tiene forma de punta en V y est conectado a la FEM. Cuando
alcanza la temperatura de 1000 C este filamento incandesce, generando trabajo y
potencia.

El filamento es un pequeo alambre de 1 cm por lado; no importa la
polaridad pues la FEM se encarga de calentar el filamento aumentando con ello la
energa cintica de los electrones de la punta del filamento. En el otro extremo del
circuito hay un nodo, que es un elemento circular con una perforacin central,
cuyo potencial es (+). Dado que los electrones se repelen entre s por similitud de
cargas, estos se dirigen hacia el nodo.

Protegiendo al filamento se encuentra un componente denominado Cilindro
de Wehnelt, que focaliza el haz de electrones. A travs de la apertura central de
este cilindro se produce el cruce de electrones, formndose un embudo de
electrones, de los que la gran mayora pasan a travs de la perforacin. La fuente
del filamento genera una tensin de 6 a 12 V, en el cilindro de Wehnelt se produce
una tensin de 100 V, y en la FEM de 400 a 250 kV. Algunos microscopios,
particularmente los de alta aceleracin, emplean FEM de 2 MV. Los kV aplicados
al filamento dan energa a los electrones para acelerar y ser liberados desde el
filamento al vaco.

En la fuente del filamento, la intensidad o corriente final define la cantidad
de electrones que fluyen en el haz. Al aumentar la cantidad de energa, se
incrementa el kV, y al elevarse la cantidad de electrones, tambin la Vf.

Un concepto importante es la corriente de saturacin, que corresponde al
mximo
contraste o brillo a obtener. Para que todos los electrones tengan la misma
energa el voltaje debe ser estable. En caso de haber fluctuaciones en el voltaje,
las diferencias de energa de los electrones se traducir en la alteracin de las
imgenes obtenidas. Lo mismo ocurre con el flujo o corriente de electrones. La
medicin de la estabilidad del sistema se hace en ppm.

b. Lentes: El haz de electrones tiene un comportamiento similar a la luz con los
lentes pticos, es decir, iluminan el sector a observar. La iluminacin debe ser
uniforme.

c. Portamuestra: Permite mover la muestra en los planos X e Y, as como en
direccin oblicua (ngulo Till). Cuando se estudia material cristalino, se produce
una imagen de difraccin de electrones al mover el portamuestra.

Las imgenes obtenidas pueden ser transparentes (por transparencia del
objeto), u opacas (obtenidas por reflexin de la imagen del objeto). En el MET las
imgenes se obtienen por transmisin. Cuando se estudia material cristalino, por
difraccin de electrones se configuran puntos que permiten al especialista en
cristales analizar las estructuras.

Retomando el anlisis del sistema de lentes, mencionaremos las
componentes y posteriormente cmo se forman las imgenes.

(i). Lente Objetivo: Es el que realiza el aumento, focalizando la imagen en la
pantalla. Aumenta en aproximadamente 20 veces (20x) el objeto.

(ii). Lentes Intermedia y Proyectiva: Aportan la potencia ptica al microscopio,
contribuyendo a un aumento ms alto. La lente proyectiva, que da una alta
magnificacin, es una pieza polar intercambiable (anloga a los objetivos de los
microscopios), dando un aumento de unas 5000 veces (5000x). por su parte, la
lente intermedia da un aumento de 100x.

(iii). Pantalla: Compuesta por una lmina metlica cubierta por un polvo de
Fsforo, Carbono o Cadmio, convierte la energa elctrica en luz. Los elementos
antes mencionados emiten fotones siguen una onda dentro del espectro visible, al
ser bombardeados por electrones. Se emplea tambin cristales que convierten
electrones en fotones. En la pantalla, las imgenes se forman con tonos de grises,
presentando una gran resolucin de elementos pequeos. Habitualmente, se
asocia a la pantalla un sistema de grabacin o almacenamiento de imgenes,
como cmaras fotogrficas convencionales o digitales, fotomultiplicadores,
sensores, u otros que puedan conectarse a computadores, que capturan las
imgenes a una resolucin que es deseable para su interpretacin.

Forma y funcin de los lentes:

En un conductor, la velocidad de los electrones que fluyen por l depende
de la cantidad de electrones excitados. El valor de la velocidad puede alcanzar la
velocidad de la luz.

La formacin de las imgenes se relaciona con el tiempo de demora de la
ampolleta en encenderse. La velocidad de los electrones, comparada con la de la
luz, es lenta.

Considerando que cada lente tiene una distancia focal fija (distancia entre el
lente y la muestra), uno tiende a pensar que slo cambiando la forma de ste
puede obtenerse una distancia ocal (Df) diferente. Al pasar los electrones por los
condensadores y los lentes (que en el esquema de la figura 2 son representados
con forma de cajn), son focalizados en un punto. La distancia focal es ajustable.

En el caso de la luz, sta puede ser focalizada y reflejada, pero no
reflectada con campos visuales.

En el caso del LASER este se basa en un sistema de reflexin resistente a
espejos. Los electrones, por su parte, pueden ser generados (por el can de
electrones), focalizados, colimados (condensados y enfocados, en ambos casos
por las lentes electromagnticas y el sistema de apertura) y deflectados (por
campos elctricos E, y electromagnticos B). En el universo, la luz es reflectada
por efecto de la masa, tal como ocurre con la luz de los astros al pasar cerca de
algn planeta.
El flujo de electrones sucede a travs de material magntico, formando un campo
en el aire. Cuando el electrn se mueve en el sentido del campo magntico no
existe fuerza sobre l.

En la frmula, el valor de la fuerza ejercida sobre el electrn aparece
cuando el ngulo formado entre su direccin y el campo magntico es mayor que
0.

El microscopio electrnico de transmisin, como hemos visto, proporciona
imgenes carentes de color. En el caso de imgenes coloreadas, el color nos
proporciona informacin de la composicin de los materiales, y facilita el
reconocimiento de estructuras.

Nuestro conocido microscopio ptico tiene como ventaja fundamental la
utilizacin del color para destacar detalles citohistolgicos o de estructuras
inanimadas. Por su parte, el microscopio electrnico de transmisin aporta
resolucin mxima para distinguir el mximo de detalles de estructuras cuyas
dimensiones son del orden de algunos . En ambos tipos de microscopio la
observacin se hace en cortes; cuando se observa el plano de imagen, y
realizando la visualizacin de mltiples cortes, puede conformarse la
reconstitucin del volumen de estas estructuras.

En el caso del microscopio electrnico de barrido (SEM o MEB), que
analizaremos en detalle a lo largo de esta clase, su principal cualidad es la
observacin de estructuras tridimensionales (volmenes); este microscopio
proporciona una resolucin mxima de 30 a 35 .

El MET puede formar 2 tipos de imgenes: imgenes por transmisin de
electrones, e imgenes por difraccin de electrones. Por su parte, el MEB puede
(en teora) formar imgenes en base a:
Electrones secundarios
Electrones retrodifundidos
Electrones de conduccin
Electrones de transmisin??
Fotones *: catodoluminiscencia, Rayos X

Para que los electrones sean transmitidos se necesita un mnimo de 100 kV de
tensin. El MEB trabaja con un mximo de 40 kV de tensin, con una menor
energa de electrn y por ende, menor poder de penetracin.

La informacin de cada tipo de partcula aporta elementos distintos a los que el
MET proporciona.

Debemos recordar que las longitudes de onda del espectro visible ocupan un
pequeo rango dentro del espectro total de longitudes de onda. Fuera del rango
del espectro visible, hacia cada extremo de longitudes de onda (mayores y
menores) existen cambios sustanciales; sin embargo es posible modificar estas
longitudes de onda de tal forma que se hacen visibles y forman imgenes, que
posteriormente deben ser interpretadas. Podemos deducir entonces que el cambio
de longitudes de onda , sea por aumento o disminucin de la frecuencia, nos
proporcionarn informacin distinta.

Como se mencion previamente, los fotones pueden aportar informacin mediante
la catodoluminiscencia, en que fotones dentro del espectro visible pueden ser
observados bajo lupa, o bien en la pantalla del MET. Esto ltimo se debe a la
estimulacin de material liviano (P, C, Cd) con electrones de cierta energa, lo que
produce la estimulacin de los electrones del ltimo orbital de estos elementos
qumicos, los que ingresan a orbitales ms internos liberando fotones que oscilan
con frecuencias que caen dentro del espectro visible.

Otra posibilidad es la emisin de Rayos X, que proporcionan informacin sobre la
composicin del material analizado. Cuando se aaden a un equipo de
microscopa distintos sensores, pueden verse imgenes distintas formadas por los
diferentes tipos de radiacin incidente sobre un material determinado, las que son
el reflejo de la forma y constitucin de stas y de la informacin obtenida con estas
diversas formas de radiacin con que se estimul el material. La radiacin X nos
informa sobre el conteo de existencia de elementos, anlisis cualitativo y
cuantitativo y mapeo de materiales. Este tipo de anlisis es posible realizarlos
tanto en MEB como en MET. Estas radiaciones tienen baja resolucin, al punto
que con lupa puede verse el sector iluminado en la muestra.

En el caso de los electrones retrodifundidos, stos proporcionan informacin de
topografa y contraste de fases de un material.

El MEB no solamente es empleado para observar imgenes tridimensionales o
analizar el contraste de fases de material formado por mezclas de compuestos,
sino tambin es la base para la construccin de otros instrumentos, como la
microsonda, que tiene como principal ventaja trabajar con rayos X para realizar
anlisis.

En el caso de las imgenes de contraste de fases, se sustituye la falta de color de
la imagen con distintos tonos de grises para sustancias parecidas. Se ven
diferentes elementos presentes entre ellos basndose en diferencias de tonalidad.
Una aplicacin de reciente aparicin es el microscopio de efecto tnel, que permite
ver los radios de los tomos (tienen una mayor capacidad).

Componentes y Funcionamiento del Microscopio Electrnico de Barrido
(MEB):
El MEB se compone de un can de electrones, un sistema de lentes
condesadores y un sistema de lentes adicionales, y al final de este sistema se
encuentra el portamuestras; es decir, el haz de electrones no atraviesa la muestra.


La hibridacin in situ es la hibridacin de fragmentos marcados de ADN de una
hebra o de ARN con secuencias complementarias (sondas) a ADN/ARN celular,
que en condiciones apropiadas forman hbridos estables. En general, la
hibridacin puede hacerse sobre soportes slidos (filtros de nylon o nitrocelulosa),
en solucin (in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ). Se
pueden utilizar sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como se
necesita proteccin y manipulacin especiales , no son de eleccin para su uso
rutinario. Las tcnicas no-isotpicas o colorimtricas son ms rpidas y permiten
una localizacin ms precisa de la reaccin. Las sondas marcadas sin elementos
radioactivos son ms estables y ms baratas. La sensibilidad es igual o levemente
inferior a la de los mtodos isotpicos. Se han utilizado sondas marcadas con
biotina y digoxigenina.
La sensibilidad de la tcnica depende de:

1) efecto de la preparacin del tejido sobre la retencin y accesibilidad de ADN
celular blanco o ARN,

2) tipos de sondas, eficiencia de la marcacin de la sonda y sensibilidad del
mtodo utilizado para la deteccin de la seal y

3) efecto de las condiciones de hibridacin in situ sobre la eficiencia de la
hibridacin.

La hibridacin in situ se utiliza primordialmente en la deteccin de bajo nmero de
copias de virus, en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como
agentes carcingenos (HPV, HBV, EBV).

En la tcnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificacin de ADN blanco y
luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas ADN/ARN.
De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma viral.
Tambin se utiliza para la identificacin de microorganismos de desarrollo
intracelular y confirmacin de cnceres.


Citometra de flujo:

La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico
cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas
(generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser
focalizado. El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que
corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por
distintos detectores. Estos convierten dichas seales en seales electrnicas que
posteriormente sern digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios
parmetros en una misma clula. Estos parmetros son:
- Parmetros relacionados con caractersticas intrnsecas de la clula, como su
tamao y la complejidad de su ncleo y citoplasma.
- Parmetros relacionados con caractersticas antignicas de cada clula
(inmunofenotipo).
Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una clula por medio de sus
caracteristicas antignicas y/o por sus caractersticas morfolgicas de tamao y
complejidad.

Las seales producidas por la interaccin de las clulas con el haz de luz son de
dos tipos:
- Seales de dispersin.
- Seales de fluorescencia.
a) Seales de dispersin: La dispersin resulta de la interaccin de la luz con una
partcula que produce un cambio de direccin (no de la longitud de onda) en todas
las direcciones del espacio. Las caractersticas morfolgicas que determinan la
dispersin de la luz son fundamental-mente el tamao celular, la membrana, el
ncleo y el material granular del interior de la clula, llamado complejidad. En los
Citmetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersin:
-La luz dispersada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la
direccin de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida
proporcional al tamao de la partcula que produce la dispersin.
-La luz dispersada en ngulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a
la complejidad de la estructura interna de la partcula.


b) Seales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molcula qumica que
absorbe luz a una determinada longitud de onda (energa) y emite a una longitud
superior (menor energa). El espectro de absorcin o excitacin es el rango sobre
el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisin es el rango sobre el
que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de
excitacin procedente del lser emite energa radiante. Debido a que parte de la
energa se utiliza para la absorcin, la luz emitida es de menor energa que la luz
de excitacin, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la
longitud de onda de absorcin y emisin se denomina Stokes shiff. Los citmetros
de flujo permiten detectar seales de fluorescencia procedentes de complejos
Antige-no/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una clula,
siendo la cantidad de seal de fluorescencia emitida igual a la proporcin de la
cantidad de componentes fluorescentes de la partcula.

CARACTERISTICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

La CMF es una tcnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos
laboratorios clnicos y de investigacin, capaz de proporcionar resultados de forma
rpida que pueden ser aplicables al diagnostico. Gracias a su gran especificidad
es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una
poblacin celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones
celulares mayoritarias. Pero la principal caracterstica de la CMF es que puede
ofrecer informacin simultnea de varios parmetros de cada una de las clulas
analizadas y la relacin entre los parmetros de una clula y los de otra clula
tambin analizada. Permite el anlisis de dos parmetros de dispersin, SSC/FSC
y tres de fluorescencia (en equipos con un solo laser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una
cuarta fluorescencia en equipos con dos lseres. (www.citometriadeflujo.com)
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Debido a la necesidad de utilizar una suspensin de partculas (clulas, ncleos,
cromosomas, etc), para ser ledos de una en una hace que se pierda informacin
sobre la arquitectura de los tejidos que componen las clulas o de las propias
clulas, as como la ineraccin entre estas y el medio que las rodea (patrones
nodulares o difusos de los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta
mltiples ventajas frente al microscopio de fluorescencia y las tcnicas
citoqumicas, como:
- Posibilidad de empleo de multiples marcajes frente a un solo marcaje de la
citoqumica y la microscopia de fluorescencia.
- Posibilidad de analizar un elevado nmero de partculas en un corto perodo de
tiempo (5000 partculas/segundo).
- Posibilidad de cuantificar la intensidad antignica por medio de los canales
medios de fluorescencia.
- Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mnima
residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones
normales como los basfilos.
- Posibilidad de analizar poblacionescelulares y epitopos celulares. - Permite
almacenar informticamente la informacin del anlisis para poderla utilizar en
cualquier momento y reanalizar anlisis hechos con anterioridad.
- Posibilidad de cuantificar las molculas antignicas presentes en un grupo
celular.

El ser humano puede ver medidas limitadas en torno a l; de hecho el metro
fue creado como medida de referencia considerando la estatura del ser humano, y
sobre esta base se crearon subunidades y amplificaciones de la unidad referencial
(micrometros, milmetros, centmetros, decmetros, kilmetros, etc.). El ser
humano puede ver, en trminos inferiores a la unidad, objetos de milmetros de
dimetro, y por debajo de 0.2 mm le es difcil ver a simple vista, en tanto que en
dimensiones grandes, a distancias mayores de 1 km le resulta poco claro distinguir
objetos grandes. Cuando los objetos son muy grandes, debemos alejarnos para
poder contemplarlos. Por ejemplo, hasta el siglo XV el ser humano no se percat
de la redondez de la Tierra, pues se pensaba que era plana y si bien existan
hiptesis sobre la posibilidad de su redondez, no exista la certeza fehaciente de
ello, pues no existan medios de transporte y observacin que permitieran verla
desde lejos. Entonces se deba rehacer poco a poco la geografa para entender
cmo era su forma. Afortunadamente hay objetos ms lejanos que podemos
visualizar, pero que por su distancia debemos acercarlos a la vista, lo mismo que
cuando queremos ver objetos muy pequeos. Dada la capacidad de la vista de ver
slo puntos distantes entre s a un mximo de 0.2 mm (lmite de resolucin,
mnima distancia a la que 2 objetos separados entre s pueden ser distinguidos
como 2 entidades diferentes). Este lmite de resolucin se da porque uno ve
realmente el ngulo bajo el cual esos 2 puntos se observan (lo que est dado por
la distancia a la que los fotorreceptores estn separados entre s).

CUESTIONARIO

1. Realice un cuadro comparativo de las diferentes tcnicas de identificacin
histolgica mencionadas en este apunte y el apunte 03

2. Seale qu tcnicas utilizara en los siguientes casos:

Un paciente con lupus
Cultivo de fibroblastos
Identificacin de estructura histolgica de piel
Identificacin de bacterias
Determinacin del tipo de cncer de mama que presenta una paciente

3. Elabore un esquema de comparacin de los diferentes tipos de microscopio
donde muestre similitudes y diferencias de funcionamiento

4. Para los casos de la pregunta 2 seale adems qu tipos de microscopio
utilizara y fundamente su eleccin

5. Indique qu utilidad prctica tienen, desde el punto de vista diagnstico, los
diversos tipos de microscopios.