Mtodos

histolgicos
"El arte y la ciencia tienen su punto de encuentto en eI mtodo."
Bulwer
La totalidad del conocimiento actual re-
ferido a la estructura y la funcin de los or-
ganismos biolgicos tiene su fundamento
en los mtodos necesarios para Ia investi-
gacin de las clulas y los tejidos. En algu-
nos casos, los grandes avances en Ia com-
prensin
v
el conocimiento fueron conse-
^cuencia
directa del desarollo de una nue-
va tcnica. La creacin de la microscopia
electrnica, los mtodos de fracciona-
miento celular, la inmunohistoqumica
y
Ia tecnologa del DNA son eiemplos claros.
Es necesario contar con ciertos conoci-
mientos respecto de los principios funda-
mentales de los mtodos aplicados con
mayor frecuencia, para que el estudio de la
histologa no sea tan slo un aprendizaie
de determinados hechos, sino que adems
permita adoptar una postura crtica frente
ellos. En consecuencia, se comenzar el
estudio de Ia histologa con un breve an-
lisis de las generalidades de los mtodos
histolgicos, si bien a menudo ser de gran
utilidad revisar algunos de estos mtodos,
relacionados con el estudio especfico de
las clulas y los teiidos.
En general, los mtodos histolgicos se
clasifican en dos grupos: los que se basan
en la observacin directa de clulas y teli-
dos vivos, y los que analizan material
muerto o inanimado. En un lugar interme-
dio se ubican las tcnicas de aislamiento
de los componentes de clulas vivas me-
diante mtodos de cenfrifugacin. En to-
dos los casos se comienza con el anlisis
microscpico, de importancia fundamen-
tal para todos Ios mtodos histolgicos.
Ocular
Pri sma
Estativo
Tornillo
macromtrico
Tornillo
micromtrico
oio
Tubo
Anlisis microscpico
EI microscopio es el instrumento ms
importante en la histologa, debido al pe-
ouo tamao de las estructuras analiza-
das. Cabe destacar que cuando en este texto
se alude al trmino
"microscopio" siempre
se refiere al microscopio ptico, a menos
que se especifique otra cosa.
Revlver
Obetivo
Platina
Condensador
Tornillo de centrado
Fi l t ro de l uz di urna
Brazo del condensador
Diafragma
Fig.2-1. Dibujo esque-
mtico
que
muestra un
microscopio ptico co-
mn. (Di buj o cedi do
gentilmente por Fa. Carl
Zeiss AG.)
CAP TUt O
Lmpara Colector Espejo
MTODOS HTSTOLOGTCOS 1s
Cuando la luz atraviesa un material bio-
lgico, por ejemplo un preparado histol-
gico, cambian sus caractersticas, y
estas
modi fi caci ones se hacen vi si bl es medi an-
te los sistemas de lentes. El ojo puede di-
ferenciar variaciones de intensidad de la
luz (contraste
entre luz y sombras) y de
color (distintas
longitudes de onda). En
consecuencia, es necesario modificar la
luz, para que el preparado se observe co-
mo formado por elementos ms oscuros y
ms cl aros o de di sti ntos col ores. Las c-
lulas y los tejidos no coloreados se suelen
captar con el microscopio como carentes
de color y transparentes, porque no pre-
sentan suficiente contraste. Con la ayuda
de ti nci ones hi stol gi cas se l ogra un ab-
sorcin diferencial de la luz, de modo
que
se visualizan las distintas estructuras.
Poder de resolucin y
aumento. Estos
dos conceptos se empl ean para determi -
nar la utilidad de un microscopio v se de-
ben di ferenci ar con cl ari dad ntr s. Es
Apertura numrica y poder de resolucin
La capacidad de refraccin o ndice de
refraccin de un medio se define como
Ia relacin entre la velocidad de Ia luz
en el vaco y en el medio en cuestin.por
lo tanto, el ndice de refraccin es una
medida de la velocidad de dispersin de
una onda luminosa a travs del medio,
La luz se refracta al atravesar un obieto.
El ngulo de refraccin ser tanto myor
cuanto ms finos sean los detalles.
La aperfura numrica (NA)
es una me-
dida de la capacidad del microscopio de
agrupar las refracciones de la Iuz produ-
cidas por los detalles finos del objeto, da-
do que expresa el tamao del haz de luz
que es captado por el objetivo despus de
Fig.2-2. Este dibujo esquemtico muestra la
mitad del ngulo mximo (u) del haz de luz
captado por el objetivo.
mucho ms importante el poder de reso-
lucin d, que se define como 1o distancia
mnima que debe existir entre dos puntos
del objeto para que se visualicen separa-
dos. La calidad de una imagen (claridad
y
riqueza de detalles) depende del poder de
resol uci n de un mi croscoDi o.
El aumento se define como 1o rclocin
entre el tamao de Ia imagen y del objeto,
en valores Lineales. El aumento no denen-
de del poder de resol uci n, pero se ti ene
en cuenta esta propiedad al elegir el au-
mento. En cuanto todos los detalles re-
sueltos se visualizan con facilidad, todo
aumento ulterior slo hace ms borrosa la
rmagen, porque no se incrementa el poder
de resolucin. La imagen no adquiere ms
detalles y se habla de aumento vaco.
Microscopio ptico
El mi croscopi o pti co est compuesto
por partes mecni cas y pti cas. Los com-
haber atravesado el objeto, Se expresa co-
mo N.A
=
n x sen u, donde n es el ndice
de refraccin del medio que separa el cu-
breobjeto del preparado de la lente fron-
tal del objetivo, y u es la mitad del ngu-
lo superior del haz de luz (fig.
2-2).
Como se vio antes, el poder de resolu-
cin es funcin de Ia apertura numrica
y de la longitud de onda de la luz utili-
zada,X"
(lambda).
El poder de resolucin
(d)
se puede expresar segn la siguiente
frmula:
0,61 x l ,
/'l
-
NA
donde d es la menor distancia entre dos
puntos que permite visualizarlos separa-
dos. Ntese que cuanto menor sea d, tan-
to mayor ser el poder de resolucin. Da-
do que u no puede superar
g0o,
el seno
de u debe ser inferior a i.. En consecuen-
cia, el N mximo ser de alrededor de
1,4, puesto que eI ndice de refraccin a
lo sumo se puede acercar a 1,b si se
reemplaza el aire que separa el cubreob-
jeto
y el objetivo con aceite (denominada
tcnica con aceite de inmersin para la
que se emplean objetivos de inmersin
especiales). La longitud de onda de la
Iuz empleada suele ser de alrededor de
0,500 pm, que corresponde a la luz ama-
rillo-verdosa, para la cual el ojo humano
tiene especial sensibilidad. De este mo-
do, se obtiene un poder de resolucin de
aproximadamente 0,25 pm.
20 METODOSHISTOLOGICOS
CAP T L
ponentes pticos constan de tres sistemas
de lentes: condensador, obietivo y ocular
retina del ojo del observador'
El aurnento total resultante se determi-
na mediante el producto del aumento del
obietivo
por el aumento del ocular
(even-
tualmente se debe multiplicar por un fac-
tor
que
depende del tubo).
E[ poder de resolucin depende de la
longitud de onda de la luz utilizada y de
las perturas numricas del objetivo y el
condensador
(el
ocular slo acta aumen-
tando la imagen del obietivo, no meiora el
poder de resolucin).
El mximo poder de resolucin que se
puede obtener es de 0,2
Jm,
pero con los
preparados de rutina habifuales rara vez ex-
cede de 0,5 pm.
Como se vio antes, los detalles resueltos
se deben aumentar lo suficiente para poder
ser observados sin esfuerzo, lo cual se lo-
gra con el aumento adicional del ocular.
Paa obtener el mximo poder de resolu-
cin, de alrededor de 0,2
pm, se requiere
un aumento de unas 1.000-1.400 veces' da-
do que el poder de resolucin del ojo, a la
distancia normal de observacin
(25
cm)'
es de aproximadamente 0,2 mm. Como re-
gla mnmotcnica vale que, pIra evitar el
umento vaco nunca se debe empleor ma'
Sobre la base del microscopio ptico
comn se han desarrollado varios micros-
copios especiales, cada uno de los cuales
prsenta ventaias y limitaciones especfi-
cas, segn veremos a continuacin.
Microscopio de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro se uti-
liza para analizar partculas pequeas,
que presentan muy escaso contraste con
la microscopia ptica o que se encuentran
de en esta lente la luz desviada o esparci-
da por las pequeas partculas qu_e se_ de-
sea investigar. Estas se observan lumino-
sas sobre un fondo oscuro
(del
mismo mo-
do que las partculas de polvo se visuali-
zrn por la dispersin que realizan de la
luz de un rayo de sol).
En histologa se utiliza a menudo el
crmpo oscuro para el anlisis de prepara-
dos radioautogrficos
(vase ms adelan-
te), mientras que es una importante aplica-
cin clnica la determnacin de la espito-
queto de la sfilis, el Treponemo palldum.
Microscopio de conhaste de fase
Los teiidos no coloreados producen muy
escaso contraste, dado que no absorben
cantidades importantes de luz. Sin emba-
go, producen cierfo retardo en las longitu-
des de onda, de acuerdo con Ia "densidad
ptica" variable de los teiidos, es decir, los
distintos ndices de refraccin. Este retraso
variable de Ias ondas sinusales produce
cierto desfasamiento entre ellas' Mediante
el microscopio de contraste de fase es posi-
ble transformo estas diferencias de
fose,
no visibles, en diferencias de amplitud, es
decir, que las diferencias de refraccin en-
tre los componentes del tejido se transfor-
man en diferencias de intensidad, que pue-
den ser captadas por el oio humano. De es-
ta manera es posible transformar en visibles
componentes de las clulas wvos que,
_de
otra manera, slo se observan en tejidos
muertos y teidos
(fig. z-3).
Fig.2-3. Se observan dos fotomicrografas
(A y
B) de las mismas clulas vivas (fibroblastos
de cultivo de teiido), A obtenida con un mi-
croscopio ptico comn y B captada con un
microscopio de contraste de fase. En la imagen
de contraste de fase se observan con clardad
el lmite entre las clulas (flechas), el ncleo
(A/), los nuclolos (Nu), mitocondrias alargadas
(rVl), lisosomas redondos (L) y otros detalles
que apenas se distinguen con el microscopio
ptico comn. (Segn Novikoff y Holtzman.)
\
cAP r ut o
MToDosHtsroLctcos
21
Microscopio de interferencia
El microscopio de interferencia est
construido sobre la base de principios si-
milares al microscopio de contraste de fa-
se, dado que tambin en este caso se utili-
zan las diferencias de fase producidas por
la luz que atraviesa el objeto. Mientras que
eI microscopio de contraste de fase slo es
un instrumento cualitativo, mediante el
microscopio de interferencia es posible
obtener datos cualtitativos. Esto se logra
al dividir la luz de una nica fuente en dos
haces luminosos, de los cuales uno se en-
va a travs del objeto y el otro no se alte-
ra, por lo que acta como haz de referen-
cia. Despus se vuelven a unir ambos ha-
ces, que interfieren entre s del mismo mo-
do que en el microscopio de contraste de
fase. El haz que atraves el objeto sufre un
retraso respecto al haz de referencia, es de-
cir, sufre una modificacin de fase. Dado
que el retraso es funcin del ndice de re-
fraccin y del espesor, el valor del retaso
se puede emplear para determina la masa
por unidad de superficie del preparado y,
en consecuencia, Ia mosa de los elementos
celulares individuale s.
_
Una variate especial del microscopio
de interferencia es el microscopio de cn-
traste por interferencia diferencial (tam-
bin denominado microscopio de interfe-
rencia de Nomarski), en el cual los dos ha-
ces luminosos separados tienen polaridad
opuesta, por lo que se aumenta el conhas-
te y se obtiene una imagen de aspecto fridi-
mensional del objeto investigado (hg.
2-a),
Microscopio de luz polarizada
Los componentes cristalinos y fibrosos
del material biolgico poseen una orienta-
cin caracterstica de las molculas. En
consecuencia, cuando se ilumina el obie-
to con luz polarizada plana (luz
que slo
vibra en un plano), sta se divide en dos
componentes con distinta velocidad, es
decir, desfasados entre s. Se habla de es-
tructuras birrefringentes o anistropas (gr.
on, no; isos, igual; frope, movimiento). En
contraste, se denomina estructuras istro-
pas a las que no dividen la luz polarizada,
por lo que el ndice de refraccin es igual
en todas direcciones.
Se obtienen datos referidos a la anisotro-
pa del objeto mediante el microscopio de
luz polarizada,
llue
se diferencia al ml-
croscopio ptico comn por tener dos fil-
22 MTODOSHISTOLGICOS
ha las modificaciones de Ia polarizacin
de la luz que ha atravesado el preparado.
I.a
birrefringencia de un objeto depen-
de de una estructura regular determinda.
En las clulas y los tejidos puede ser una
disposicin asimtrica regular de molcu-
las o iones, por ejemplo, en cietas inclu-
siones celulares, birrefringencia cristali-
na, o una distribucin reqular de unida-
des submi croscpi cas aJi mtri cas, por
ejemplo, en Ias fibras musculares, biire-
fingencia de forma. En consecuencia, me-
diante el microscopio de luz polarizada es
posible obtener informacin respecto a la
estructura a nivel molecular. Adems, el
microscopio de luz polarizada se puede
utilizar para el estudio de clulas vrvos.
Microscopio de fluorescencia
Determinadas sustancias fluorescen, es
decir, tienen la
particularidad
de irradiar
luz de otra longilud de onda (color)
al ser
Fi g. 2-4. Fok
de una cl ul a
odo interno c
microscopio
rencia difere
croscopio de
cia de Noma
vese el notab
di mensi onal . >
Morup Jorgen
CAPI TI ,
Submicroscpico
Por submicroscpico se entiende Io
que "est por debajo de la resolucin del
microscopio". La denominacin est mal
definida y se aplica ocasionalmente con
respecto a las estructuras demasiado pe-
queas para ser reconocidas incluso con
iluminadas. La luz irradiada siempre pre-
senta una longitud de onda ms larga que
la original. Algunos componentes biolgi-
cos
(p. ej ., l a vi tami na A) ti enen fl uores-
cencia natural y se denominan autofluo-
rescentes, mientras que otros adquieren Ia
fluorescencia despus de un tratamiento
con determinados colorantes
fluorescen-
es, por ejemplo fluorescena, que emite
una intensa fluorescencia verdosa al ser
irradiada con luz azul.
En el microscopio de fluorescencia se
ilumina el preparado con intensa luz de Ia
Iongitud de onda capaz de activar el colo-
rante fluorescente empleado. Esto se lleva
a cabo mediante un filtro del color ade-
cuado que se coloca por debajo del con-
densador: as se filtra la luz antes de que
i nci da en el preparado. Adems, se col oca
un filtro por encima del obietivo con un
color correspondiente a la longitud de on-
da de la luz que emite el colorante utiliza-
do cuando fluoresce. De esta manera se lo-
gra que la imagen se forme slo debido a
la emisin de la luz fluorescente. Las es-
tructuras fluorescentes se destacan enton-
ces en color sobre fondo oscuro
(vase fig.
2-14), como
fuentes
luminosas, por lo que
es oosible visualizar estructuras de di-
mesiones mucho ms pequeas que el
poder de resol uci n del mi croscopi o.
En los ltimos aos se ha observado un
notable incremento en el empleo de la mi-
croscopia de fluorescencia, debido funda-
mentalmente a la aplicacin de colorantes
fluorescentes que ie ligan a anticuerpos
especficos, que reaccionan con determi-
nados componentes tisulares
(vase ms
adelante en este captulo).
Fig.2-5. lmagen de las clulas
productoras de
insulina en los islotes de Langerhans del pn-
creas, captada con microscopio de barrido
confocal. Se distinguen grnulos citoplasmticos
que
contienen insulina mediante reaccin con un
aniicueroo fluorescente azul contra insulina, se
determina la presencia de una molcula ligada a
la membrana celular (denominada transportado-
ra de glucosa) con un anticuerpo fluorescente ro-
jo y se observa una molcula localizada sobre el
ncleo celular
(llamada factor de transcripcin
para insulina) mediante un anticuerpo fluores-
cente verde. (Cedida por L.-1. Larsson.)
el microscopio electrnico. Sin embargo,
su uso ms frecuente se aplica a estruc-
turas demasiado pequeas para ser de-
tectadas con el microscopio ptico
(la
oalabra comenz a utilizarse antes de la
ra del microscopio electrnico).
Microscopio de barrido confocal
Una l i mi taci n de l a mi croscopi a de
fluorescencia radica en la necesidad de
que todo el espesor del preparado emita
fluorescencia, pero slo es posible enfocar
el objetivo en un plano del corte a Ia vez.
En consecuencia, la luz emitida por fluo-
rescencia desde zonas del preparado ubi-
cadas por encima y por debaio del plano
focal puede restar nitidez a Ia imagen. Me-
diante el microscopio de barrido confocal
se impide esta tendencia, dado que se ex-
cluye Ia Iuz no emitida por el plano focal.
EI preparado se ilumina por un rayo lser
que barre todos los puntos del plano focal,
mientras que la luz emitida por el prepa-
rado atraviesa una hendidura muy estre-
cha que detiene la luz emitida por otros
ni vel es, di sti ntos del pl ano focal , De esta
manera se logra obtener la informacin
necesaria para formar una imagen bidi-
mensional
(fig. z-5) que se registra sobre
una pantal l a de tel evi si n. AI recoger con
una computadora una serie de imgenes
de di sti ntos pl anos focal es es posi bl e re-
construir una imagen tridimensional del
obi eto.
CAP TUt O
METODOSHISTOLOGICOS 23
Microscopio de luz ultravioleta
Con el empleo de luz ultravioleta con
Iongitud de onda de alrededor de 2b0 nm,
es decir, casi Ia mitad de la luz visible
que
se uti l i za habi tual mente en el mi croso-
pio ptico, en principio es posible dupli-
car el poder de resolucin (disminuir
d a
la mitad). El microscopio de luz ultravio-
leta, cuyo sistema ptico suele estar cons-
truido en cuarzo, permite el paso de la luz
ultravioleta, que es invisible. En conse-
cuencia, Ia formacin de la imagen se re-
gistra en una pelcula fotogrfica.
Aunque se logra tn )igero aumento
del poder de resolucin mediante esta
tcni ca, l a pri nci pal i mportanci a del mi -
croscopi o de l uz ul travi ol eta es que l os
dcidos nucleicos absorben la luz ultra-
violeta de determinada longitud de onda
(260
nm), por l o que se pueden detectar
con faci l i dad.
Microscopio electrnico
La construcci n del mi croscopi o el ec-
trni co representa un verdadero-l ogro en
cuanto a incrementos del aumento y
del
poder de resol uci n. En pri nci pi o se debe
a que se reemplaza la luz visible, de lon-
gitud de onda de alrededor de 500 nm,
por un haz de electrones de longitud de
onda del orden de 0,005 nm. Dado
que
d
(poder
de resol uci n) es di rectamente
proporcional a l" (vase pg.20), en teora
la aplicacin de un haz de electrones per-
mite obtener un poder de resolucin muy
elevado. Como los electrones no Dueden
atravesar las lentes de vidrio, es necesario
reemplazarlas por bobinas electromagn-
ticas (denominadas
lentes electromagnti-
cas). en cuyos campos el ectromagnti cot
o electrostticos se modifica el trayecto
del haz de el ectrones, de modo si mi l ar a
como se refracta el haz de la luz visible en
una lente de cristal.
El esquema de construccin del mi-
croscopio electrnico de transmisin
(MET)
se presenta en la figura 2-6
(la
pa-
Iabra transmisin se refiere a
que
los elec-
trones ofrayiesan elobjeto). Se calienta un
ctodo filamentoso del metal tungsteno
(denominado
filamento) en una atmsfera
de vaco, por Io que emite electrones que
son acelerados hacia el nodo debido a
una diferencia de
potencial
de alrededor
de 50-100 kV. Et nodo tiene Ia forma de
una placa metlica con un orificio (deno-
minado apertura) en el centro, a travs del
cual pasan algunos de los electrones, para
formar un flujo constante o haz de electro-
nes. El haz de electrones se enfoca me-
diante Ia lente del condensador en el
pla-
no del obj eto, y l a Iente del obj eti vo foi ma
la imagen del objeto. La imagen obtenida
24 MTODOSHISTOLGICOS
Ctodo
nodo
Lente condensadora
Objeto
Lente objetivo
Lente proyectora
l magen
se aumenta por una lente proyectora, que
corresponde al ocular del microscopio p-
tico. Dado que el haz de electrones es in-
visible, la imagen formada se registra por
proyeccin sobre una pantalla fluorescen-
te o una pelcula fotogrfica. Debido a la
escasa movilidad de los electrones en el
aire, todo el sistema debe estar en una at-
msfera de vaco.
La
formacin
de Ia imagen en el mi-
croscopi o el ectrni co se debe, pri nci pal -
mente, a la dispersin de los electrones.
As se dispersan los electrones que coli-
sionan con los ncleos atmicos y con sus
electrones en el objeto, a menudo de ma-
nera tal que inciden por fuera de la lente
objetivo. En consecuencia, la imagen so-
bre la pantalla se forma por la ausencio de
estos electrones, como "imagen en som-
bra". La dispersin de los electrones de-
pende del espesor del objeto y de su den-
sidad molecular. En especial depende del
nmero atmi co de l oi tomos
presentes
en el objeto, dado que Ia dispersin obte-
nida es mayor, cuanto ms elevado sea el
nmero atmico. La mayora de los to-
mos de las estructuras biolgicas tienen
nmero atmico bastante baio v contribu-
yen muy poco a l a formaci n
-de
l a i ma-
gen, por lo que se adicionan tomos pesa-
dos al preparar los materiales (vase
ms
adelante).
Como se vio antes, el valor del microsco-
pio electrnico radica en el gran poder de
resolucin que se puede obtener, de unos
0,2 nm. No obstante, es importante diferen-
ciar entre el denominado poder de resolu-
cin del instrumento, que
es del orden
mencionado y se puede iograr al analiza,
por ejemplo, polvo metlico, y el denomi-
nado poder de resolucin del objeto. Este
ltimo es el poder de rcsolucin que se
Fi g. 2-6. Di bt
mtico de un
pio electrnil
CAPi TL
Fig.2-7. Dibujo esque-
mtico de un microsco-
pio electrnico de barri-
do. (De Hearle, Sparrow y
Cross.)
Valor del poder de resolucin
Ntese que el poder de resolucin a
simple vista, a distancia normal de lec-
tura, es de alrededor de 0,2 mm, para
los mejores microscopios pticos, de
aproximadamente 0,2 pm, y para los
mejores microscopios electrnicos, de
unos 0.2 nm.
puede lograr en la investigacin de prepa-
rados biolgicos y es del orden de 2 nm, da-
do que depende en gran parte de los proce-
dimientos de preparacin
(vase ms ade-
lante). Con el poder de resolucin prctico
que se puede obtener es posibie lograr ou-
mentos tiles superiores a 500.000 veces.
El microscopio electrnico esI limita-
do por el escaso poder de penetracin del
haz de el ectrones. Esto i mpl i ca l a necesi -
dad de uti l i zar cortes de tei i do muy del ga-
dos
(de
al rededor de 50 nm). Esta l i mi ta-
cin se puede superar en pa-rte mediante
el uso del denominado microscopio elec-
trnico de alto voltaje, cuyo haz de elec-
trones es alrededor de 10 veces ms rico
en energa que el que se utiliza en los mi-
croscooios electrnicos comunes. El mi'
c.or"opio estereoelectrnico permite cor-
tes de tej i do ms gruesos, ya que el mi smo
preparado es fotografiado desde dos ngu-
los algo diferentes. Si despus se analizan
Ias fotografas mediante un estereoscopio
se obtiene un notable efecto tridimensio-
nal, en el cual la profundidad es mayor,
cuanto ms grueso es el corte de tejido.
Otra limitacin es el requerimiento de
utilizor alto vacio, lo cual descarta inves-
tigaciones en clulas vivas.
Microscopio electrnico de barrido
Hasta aqu se analiz el microscopio
electrnico estndar que, como se men-
ci on, se denomi na mi croscopi o el ectr-
Fig. 2-8. lmagen de cilias de la trquea cap-
tada con microscopio electrnico de barri-
do (Cedi da por B. Hol ma.)
nico de transmisin
(MET). Su contrapar-
tida es el microscopio electrnico de ba-
rrido
(MEB) que, en principio y utilidad,
es totalmente diferente de los microsco-
pi os pti co y el ectrni co de transmi si n,
pero que representa un importante suple-
mento del MET. En el microscopio de ba-
rrido los electrones no atraviesan el obie-
fo, la imagen se forma indirectamente, a
travs de Ia captacin puntual de detalles
en l a superfi ci e del preparado. El prepara-
do se recubre de una del gada capa de un
metal pesado y se bombardea con un haz
de el ectrones muy estrecho
(de al rededor
de 10 nm de di metro), que "barre" sobre
el objeto en un patrn lineal y lo copia
(fi g. z-z). Desde cada punto se emi ten
electrones secundarios, de modo tal que
la intensidad de Ia emisin secundaria va-
ra segn el ngulo con que incide el haz
de electrones sobre la superficie. Este n-
gul o depende de l as i rrgul ari dades del
contorno de la superficie. La emisin se-
cundaria se mide con un detector ubicado
cerca del preparado y adaptado a una pan-
talla de televisin, cuyos rayos catdicos
barren en forma coordinada con el haz de
electrones
"que iluminan". La imagen ob-
tenida se visualiza directamente sobre la
pantalla y se puede registrar en una foto-
grafa o en forma digital.
El MEB forma la imagen de la superfi-
cie y no es necesario utilizar cortes ultra-
finos,
dado que el haz de electrones no
atraviesa el preparado . El poder de rcsolu-
cin con la microscopia electrnica de ba-
rrido s1o es de alrededor de 1.0 nm pero,
en contrapartida, la nitidez de la imagen
en profundidad es de hasta 10 veces la
Fuente de
electrones
Sistema de
lentes
"Scanner"
(barredor)
Objeto
cAPi r ut o
Pantalla de TV
MToDosHIjT)LGICOS 25
que se obtiene con el microscopio ptico.
En consecuencia, se puede lograr una
imagen tridimensional definida de la su-
perficie (fig.
2-B).
Microscopio de tnel de barrido
(MTB)
Con este instrumento es posible captar
la estructura de la superficie de un pre-
parado hasta el ni vel atmi co. El pri nci -
pi o se basa en col ocar una sonda del gada
a una di stanci a de hasta 1 nm, por deba-
jo
de la superficie del preparado. Se apli-
ca l uego un contacto el ctri co en el ex-
tremo de la sonda, que al mismo tiempo
barre por sobre la superficie del prepara-
do. De este modo se crea un "tnel " de
electrones a travs de la hendidura for-
mada entre el preparado y Ia sonda.
Mi entras que sta se despl aza por sobre
el preparado, se manti ene constante l a
corriente debido al movimiento autom-
ti co de l a sonda haci a arri ba y haci a aba-
j o
por l as i rregul ari dades de l a superfi ci e
del preparado. La i nformaci n obteni da
durante estos movimientos se registra en
una computadora, Ia cual produce una
"i magen" de l a superfi ci e del preparado.
La mi croscopi a de tnel de barri do per-
mite, entre otros adelantos, obtener una
i magen de l as dos hebras de Ia mol cul a
de DNA.
La microscopia de tnel de barrido est
limitada por la necesidad de que el prepa-
rado sea un conductor elctrico.
Difraccin de rayos X
La difraccin de rayos X es un paso adi-
cional en direccin a Ia resolucin de de-
talles cada vez ms pequeos mediante la
aplicacin de rayos de longitud de onda
ms corta. Los rayos X pareceran ser es-
pecialmente adecuados para el anlisis
mi croscpi co, dado que se puede aumen-
tar el poder de resolucin, pero no existen
lentes capaces de enfocar y sacar prove-
cho de estas longitudes de onda tan cor-
tas. En lugar de lentes se debe aplicar el
anlisis matemtico,lo cual limita la uti-
l i dad.
El principio se basa en enviar un estre-
cho haz de rayos X a travs de Ia muestra
que se desea analizar (fig. 2-9). El haz se
separa y se dispersa en un patrn de di-
fraccin (Iat.
fractum,
rotura) que se regis-
tra en una pelcula fotogrfica ubicada por
debajo de la muestra. En la prctica slo
es posible utilizar la difraccin de rayos X
en la investigacin de estructuras muy or-
denadas de naturaleza cristalina o semi-
cristalina (de
all que, en ocasiones, se de-
nomina cristalografa de rayos X) dado
que, en los dems casos, el patrn de di-
26 MTODOSHISTOLGICOS
fraccin obtenido es casi imposible de
desci frar. Incl uso en l as estruci uras orde-
nadas la falta de imagen formada hace que
se pierda informacin referida a las rela-
ciones entre las fases y los rayos secunda-
rios, por lo que el patrn de difraccin no
se corresponde con exactitud con el obje-
to investigado. En consecuencia se debe
trabajar con aproximaciones e interpreta-
ciones, que slo presentan la estructura
ms probable.
Sin embargo, la difraccin de rayos X
ha tenido importancia
fundamental
en eI
desarrollo de la biologa molecular y ha
permitido obtener informacin esencial
respecto a ms de 300 macromol cul as,
entre ellas la mioglobina, Ia hemoglobina
y el DNA.
Mtodos de observacin directa
de clulas y tejidos vivos
Si bien el objetivo de la histologa es la
descripcin y la comprensin de Ia es-
tructura de las clulas v de los teiidos vi-
vos, l ament abl ement e, por mot i vs t cni -
cos, a menudo ha sido necesario seguir el
camino de la investigacin de tejidos
muertos y preservados. Los procedimien-
tos utilizados implican muchas posibili-
dades de modificacin del aspecto de las
estructuras debi das a causas tcni cas
V
dej an si n respuesta numerosas i ncgni l as
referidas a los
procesos
celulares vitales.
Adems, es imposible lograr un control
ms directo sobre el medio
que
circunda a
l a cl ul a y crear modi fi caCi ones experi -
ment al es del mi smo.
En consecuencia, existen claras venta-
jas
en el estudio de clulas y tejidos vivos;
a continuacin se vern algunos de los
mtodos disponibles.
Fi g. 2-9. Di br
mtico del pri
difraccin de
(Segn Ambe
Smi t h. )
Haz de rayos X
CAPI T (
Fi g. 2- 10. Di bul os de
cultivo de teiido conec-
t i vo embri onari o. En a
se observa el explantado
como una masa cent ral
negra, rodeada del creci-
mi ent o ms cl aro. b
Y
c
muestran el desarrollo a
aumentos crecentes.
(Segn Leonhardt . )
- l
l mm
100 pm
b
Cultivo de tejido
El cultivo de teiido es un importante
mtodo para eI estudio de poblaciones ce-
lulares iivas
fuera
del organismo. El m-
todo se menci ona a menudo como cul ti vo
in vitro. dado
que
se refiere a frascos de
reactivo o de vidrio
(Iat. vitro, vidrio), a
diferencia de in vivo, es decir, en el orga-
ni smo vi vo.
En Ia actualidad, el cultivo de teiido se
clasifica en tres categoras: 1) El cultivo de
clulas comprende el cultivo de clulas
aisladas, ya no organizadas en un teiido.
Las clulas se pueden transportar a otro
frasco con medio de cultivo, a medida que
crece su nmero. z) El cultivo de tejido
por lo general comprende la transferencia
de un trozo de tei i do embri onari o
(gr.
embryon, feto) o explantado a un medio
de cultivo. Durante el cultivo crecen ex-
crecencias celulares, que suelen ser de ti-
po conecti vo
(fi g. 2-10). mi entras que i as
clulas especializadas del rgano perma-
necen en el explantado, donde mantienen
algunas de sus funciones caractersticas'
3) El cul ti vo de rganos comprende ei ex-
plantado de rganos embrionarios o ma-
duros ltotalmente
desarrollados), como
rganos compl etos o partes de el l os. Se i n-
Inicios del cultivo de teiido
El cultivo de clulas eucariotas co-
tnenz a principios de este siglo, como
parte de l investigacin tendiente a de-
terminar si los filamentos nerviosos cre-
can desde el cuerpo de la clula nervio-
sa hacia el exterior o se formaban por fu-
sin de una serie de secciones preforma-
das del filamento. Ross Harrison coloc
partes de mdul a espi nal del si stema
ervioso no desarrollado de una rana en
un cogul o l i nfti co y observ, con el
microscopio, la clara formacin directa
de filamentos netviosos, como prolonga-
ciones del cuerpo celular. Otro pionero
tenta mantener la estructura del rgano y
sus funci ones normal es, adems de su po-
si bl e evol uci n ul teri or
Las
primeras clulas de mamferos que
se observaron en estado vivo fuera del or-
ganismo fueron las clulas sanguneas'
Eran de fcil acceso y se podan analizar
al colocar una gota sobre un portaobieto,
cubierta por un cubreobjeto, y sellar los
bordes para evitar la evaporacin. Si se
calentaba a temperatura del cuerpo la pla-
tina del microscopio se lograban condi-
ciones muy cercanas a las del organismo
vivo. De esta manera se descubrieron los
distintos tipos de glbulos blancos y sus
pr opi edades de movi mi ent o i ndependi en-
i e y-de captaci n de partcul as
(vase cap.
3). En Ia actualidad estos cultivos a corto
pl azo de gtbul os bl ancos ti enen ampl i a
plicacin como e.l mtodo ms simple
oara esl udi ar l os cromosomas humanos
(ms
detal l es en el cap. 4).
Los estudi os ms prol ongados y Ia i n-
vesti gaci n de l as ci ul as en l os tej i dos or-
gani zados u rganos reci n fueron_po_si -
bl es despus de l a i ncorporaci n de l os
cul ti vos de tei i do. Para l os estudi os de
cul ti vo de tei i do se toma l a muestra y se
mantiene estril
(libre de microorganis-
mos vivos), porque los factores de creci-
fue Alexis Carrel, quien demostr, entre
otros descubrimientos,
que los extractos
diante el cultivo de tejidos.
Esta tcnica clsica de explantado in-
cluido en un cogulo ha experimentado
numerosas mejoras tcnicas que incre-
mentaron mucho las posibilidades de
aplicacin.
CAPI T UL O
MTODOSHISTOLGICOS
27
miento tambin favorecen la formacin de
bacterias y hongos. Despus de obtener la
muestra se debe mantener el teiido en una
sol uci n de composi ci n si mi l ar a l a de
los Iquidos tisulires. Mediante el trata-
miento cuidadoso con enzimas digestivas
como tripsina y colagenasa, que degradan
el material extracelular tendiente a man-
tener unidas las clulas, se liberan las
uniones entre ellas. El proceso se facilita
con el agregado de sustancias que captan
cal ci o, dado que l os i ones cal ci o son nece-
sarias para Ia adhesin intercelular. Ade-
ms se efecta una separacin mecnica.
De esta manera, el teiido obtenido se divi-
de en clulas individuales.
Despus del agregado de medio nutriti-
vo se pueden mantener las clulas en un
cultivo en suspensin, en el que flotan, o
se pueden transferir a una superficie de
vi dr i o o de pl st i co, al que s adhi er en.
Sobre esta superficie crecen Ias clulas y
forman una capa ni ca, denomi nada mo-
nocapa.
La composicin del medio nutrivo es
de importancia crtica para el exito del
cultivo de tejido. La meta ideal buscada ha
sido obtener medios sintticos con compo-
sicin qumica totalmente definida y sin el
agregado de sustancias orgnicas naturales
como, por ejemplo, plasma sanguneo. Es-
te tipo de medio representa las mejores
condiciones para Ia investigacin de la in-
fluencia de distintas sustancias sobre el
crecimiento y la funcin de Ias clulas es-
tudiadas, por ejemplo, factores de creci-
miento bien definidos. Hasta el momento,
Ios medios sintticos desarrollados slo
satisfacen Ios requerimientos de creci-
miento de muy pocos tipos celulares, dado
que la mayora de las clulas y tejidos so-
lamente se pueden mantener vivos duran-
te corto tiempo sin el agregado de suero al
medio. En estos ltimos casos se habla de
medios naturales. Un paso importante ha
sido Ia posibilidad de agregar antibiticos
y disminuir as en gran parte el problema
de las infecciones bacterianas en los me-
dios de cultivo. La temperatura ptima pa-
ra el cultivo de clulas es de alrededor de
37,5.C para las clulas de los mamferos
(si
bien vara en parte para distintos teji-
dos). pero para mantener una pobl aci n
celular durante un perodo ms prolonga-
do es necesario recurrir al conqelamenlo.
En condi ci ones normal es. l as c' i ul as mue-
ren debido a la formacin de cristales de
hielo si se las enfra por debajo del punto
de congelacin pero, si se toman algunas
precauciones, es posible controlar la for-
macin de cristales y entonces se pueden
congelar y preservar en nitrgeno lquido
a
-196"C
durante meses o aos. Si despus
se descongel an, estarn en condi ci ons de
continuar su crecimiento.
28 MTODOSHISTOLGICOS
Mediante el cultivo de tejidos es posi-
ble aislar clones celulares. Un clon celu-
lar (gr.
klon, rama, brote) es una poblacin
de clulas idnticas, originadas de Ia mis-
ma clula por mitosis (divisin
celular).
El establecimiento de un clon celular. de-
nominado clonacin, se efecta, en prin-
cipio, a travs del aislamiento de clulas
individuales, que despus generan el clon
por cultivo. A su vez, el clon da origen a
una lnea celular pura, es decir, un culti-
vo compuesto por un nico tipo celular.
Para muchas de Ias investigaciones que se
realizan mediante cultivos de teiido es ne-
::;.".t"
el empleo de lneas celulares pu-
Tambin es posible aislar el tipo celular
que se desea investigar a partir de una
suspensin mixta, que contenga distintos
tipos celulares. Un mtodo especialmente
efectivo para este fin es Ia seleccin celu-
l ar acti vada medi ante fl uorescenci a
(FACS).
Se utilizan anticuerpos que se fi-
jan
exclusivamente al tipo celular que se
desea aislar. A las molculas de anticuer-
po se le adiciona un colorante fluorescen-
te (vanse
ms detalles ms adelante) y
se
agrega l a mezcl a a l a suspensi n mi xt de
clulas. El anticuerpo fluorescente se fija
exclusivamente al tipo celular que se de-
sea aislar. A continuacin se separan las
clulas fluorescentes mediante un cifo-
fluormetro
de
flujo.
En el cultivo de tejido es importante di-
ferenciar ene lneas celulares primarias
v
lneas celulares establecidos.-Una lne
celular primaria aparece en el primer cul-
tivo del tejido, denomnado cultivo prima-
ri o, i nmedi atamente despus de l a-obten-
por lo general, despus de unas 50 divisio-
nes celulares para las clulas humanas, y
l a mayor parte de l as cl ul as mueren.
Por el contrario, las lneas celulares es-
tablecidas pueden crecer en cultivos con
elevada densidad de poblacin. Una lnea
celular establecida puede aparecer espon-
tneamente, es decir, sin causa conocida,
debido a que algunas clulas del cultivo
primario retoma el crecimiento, tras Io
cual suele continuar de esa manera. Si es-
te tipo de lnea celular se transfiere unas
70 veces de un frasco de cultivo a otro, se
considera establecido. Se dice
que
las c-
lulas que dan origen espontnamente a
una lnea celular establecida han sufrido
una modificacin o transformacin es-
pontnea, donde las clulas transformadas
tienen capacidad para formarse casi sin in-
hibiciones. Sin embargo, Ias clulas tam-
bin se pueden transformar si se las expo-
CAP T U
Fi g. 2-11. Di buj o esquemt i co de hi bri daci n
cel ul ar. Se i nduce l a f usi n cel ul ar
por agrega-
do de virus Sendai,
que
favorece la formacin
de un het erocari on y de cl ul as h bri das cuan-
do ste se divide.
ne a acci ones cancer genas como i r r adi a-
ci ones, agent es qu mi cos o i nf eccl ones por
vi rus cancer genos. Se obt ene una l nea
cel ul ar est abl eci da de est e t i po de cl ul as
t ransf ormadas a part i r de un t ej i do t umo-
ral o de un cul t i vo pri mari o, despus que
est e l t i mo ha si do expuest o a una acci n
cancergena. Se puede entonces establecer
un cultivo homogneo de lnea pura por
clonacin del cultivo primario. Las lneas
celulares transformadas de crecimiento r-
pido y supervivencia ilimitada
(ing' rm-
mortal cell )ines) representan un material
especialmente importante para las investi-
gaciones experimentales.
Por ltimo se ver el fenmeno de hibri-
dacin celular, de gran importancia en la
investigacin de clulas cultivadas. Las c-
lulas hbridas se forman por fusin celular,
es decir, la unin de dos o ms clulas. La
fusin celular se puede producir en forma
espontnea, por eiemplo en Ia fecundacin,
cuando se unen las clulas sexuales mascu-
Iinas y femeninas, pero tambin se demos-
Clulas HeLa
En 1954 se exffaio un tumor de endo-
metrio de una mujer llamada Henrietta
Lacks. Una muestra del tejido tumoral se
utiliz para generar una lnea celular es-
tablecida
y se han cultivado estas clulas
t umoi al e desde' ent onces. Henri et t a
Lacks falleci al ao siguiente peio, en su
tr, alrededor del ao 1960, que ocurre en
la formacin de clulas hbridas en cultivos
celulares. Sin embargo, recin cuando poco
despus se descubri que era posible lndu-
crr la fusin celula en los cultivos celula-
res, mediante el agregado de ciertos virus
[el ms usado es e] denominado virus Sen-
doi,
que incrementa la tendencia a Ia fusin
de lai membranas celulares), cobr real im-
oortancia la tcnica de Ia hibridacin. Me-
iutrt" lu fusin de dos clulas diferentes
desde el punto de vista gentico, la clula
formada contiene dos ncleos con distinto
contenido gentico, lo que se denomina he-
terocarion
(fig. 2-11). Algunas de las clu-
las formadas tendrn capacidad para divi-
dirse y los dos ncleos comienzan Ia divi-
sin al mismo tiempo. A su vez, esto a ve-
ces tambin da lugar a la formacin de dos
clulas, cada una de las cuales contiene un
ncleo. Este ncleo
(en cada una de las dos
clulas hbridas neoformadas) contiene una
copia de los cromosomas de ambas clulas;
este tioo celular se denomina sincarion.
Ent i e ot ras apl i caci ones, I a hi bri daci n
cel ul ar ha cont ri bui do a l as i nvest i gaci o-
nes sobre el creci mi ent o de cl ul as t umo-
ral es. donde se han f usi onado cl ul as nor-
mal es con cl ul as cancerosas. La t cni ca
t ambi n se ha ut i l i zado para demost rar
oue l as
prot e nas
de i as membranas cel u-
l res t i enen capaci dad para despl azarse
dent ro de est as l t i mas, como se ver con
mavor det al l e en el cap t ul o 3. Una apl i ca-
ci n muv especi al es el desarrol l o de an-
t i cuerpos mnocl onal es, cuya ut i l i zaci n
t i ene gran i mport anci a en l as i nvest i ga-
ci ones i nmunohi st oqu mi cas
(vase ms
adel ant e en est e cap t ul o).
Para terminar con el tema de cultivo de
t ej i do se puede deci r que, si bi en no es
una alternativa, representa una posibili-
dad para realizar trabajos experimentales
sobre teiidos humanos sin chocar con pro-
blemas ticos.
Manipulacin experimental
de clulas vivas
Adems de las posibilidades experimen-
tales de actuar sobre clulas y teiidos a tra-
vs de las modificaciones del medio circun-
memoria, se denominaron clulas HeLa
Ias clulas cultivadas. En la actualidad
se utilizan en cientos de laboratorios y,
como la Inea celular transformada ms
intensamente estudiada, han contribuido
a dilucidar numerosos interrogantes bio-
lgicos y mdicos importantes.
\.
I
r )
) 1
Vi rus Sendai
Heterocarion
r-"/
i
CAP TUt O
METODOSHISTOLOGICOS
29
&, *
I x
##
" w
b

6 S: 1 C.
i *W
s
Fig.2-12. Tincin supravital de macrfagos
de teiido conectivo, por agregado de carmn
de litio a un preparado
de tejido vivo. Las part-
culas rojas de carmn de litio han sido fagocita-
das por los macrfagos. x440.
dante relacionadas con el cultivo de teiido,
existen vaios mtodos para la manipula-
cin ms o menos directa de clulas vivas.
Tinciones vital y supravital. Algunos
colorantes relativamente inocuos son caD-
tados en forma selectiva por determinads
clulas
yjyas.
En consecuencia, la locali-
zacn del colorante se puede utilizar pa-
ra detectar estas clulas o determinadas
organelas, a las que se une el colorante
despus de ser captado. De esta manera
tambin se pueden identificar algunas
sustancias intercelulares.
Para Ia tincin vital se inyecta el colo-
rante en el animal vivo. Para la tincin su-
pravital se agrega el colorante a las clu-
Ias o el tejido vivo despus de su extrac-
cin del organismo.
El azul tripn y el carmin de litio se
componen de partculas finas y han teni-
do importancia definitiva para el estudio
de la fagocitosis, es decir, la forma en que
determi nadas cl ul as captan partcul as
del medi o (frg.
2-12).
El rojo neutro y el verde
lano
se utilizan
para el estudio de los glbulos blancos. El
verde
fano
tie selectivamente las mitocon-
drias y el rojo neuto para identificar los
distintos subtipos de leucocitos.
La alizarina se une a la matriz sea neo-
formada y le confiere coloracin roja. La
tincin vital con alizarina ha sido muy
30 MTODOS HISTOLGICOS
Macrfagos que contienen carmn de litio
importante en los trabajos sobre el meca-
nismo de crecimiento seo.
Micromanipulacin mecnica. Nume-
rosas tcnicas, agrupadas bajo Ia denomi-
nacin micromanipulacin o microciru-
ga, se han desarroilado sobre la base del
micromanipulador. Este instrumento se
compone de un microscopio, en el que el
preparado a estudiar se encuentra en una
cmara hmeda de operacin, sobre la
pl ati na, En el mi cromani pul ador se mon-
tan agujas finas, ganchos o pipetas de vi-
drio, cuyos extremos aparecen en el cam-
po visual y que se pueden desplazar con
tanta precisin, que se pueden disecar las
clulas individuales con gran aumento.
Este mtodo de diseccin ha incrementa-
do el conocimiento de la naturaleza fsica
de las clulas. Se ha demostrado que el pro-
toplasma es viscoso y se han desplazado las
organelas dentro de la clulas. Tambin se
puede empujar el ncleo celula dentro del
citoplasma y ha demostrado ser una vescu-
la deformable llena de lquido. As, se pue-
den hacer muescas en l al Dresionar con
una aguja. Con la microdiseicin tambin
se demostr muy pronto la existencia de
una membrrna celula-r (fig.
2-13).
Fig.2-13. Fotomicrografas (a campo oscuro)
de clulas huevo de rana vivas,
que
demuestran
cmo se procede en la micromanipulacin
mecnica. En a se observan dos invaginaciones
en la membrana celular producidas por presin
con dos microelectrodos. En b se visualizan los
mcroelectrodos despus de atravesar la mem-
brana celular hacia el interior del citoplasma La
medida incluida representa 100
rm.
(Segn
Kanno y Loewenstein.)
t
{.
' t
#
"
qeh
# .,*
d5;
.u
qi!
F
i
!-
\
" ) -
I t r t
CAPI TU
Fig. 2-1 4. Fotomicrogra-
fa de una neurona de la
retina captada con mi-
croscopio de fluorescen-
cia. Mediante un microin-
yector se inyect el colo-
rante fluorescente amari-
llo Lucifer directamente
en l a neurona vi va. Luego
se sacrific el animal
y se
efectu un preparado his-
tolgico de la retina (Ce-
di da
por
J. Zi mmer. )
Los microelectrodos son pipetas muy
finas que contienen soluciones salinas
concent radas. Medi ant e l a mi cromani pu-
lacin se inyectan stas en las clulas, y
despus se puede medir la diferencia de
Fig,2-15 Fotomicrografa de una clula viva cap-
tada con microscopio de contraste de fase. La c-
lula se encuentra en la etapa denominada metafa-
se de una divisin celulat
por
lo
que se observan
claramente los cromosomas. La lnea clara angos-
ta entre las dos flechas se forma
por
irradiacin
con un haz de luz ultravioleta de 3 pm de an-
cho, que parece haber "desplazado" un corto seg-
mento de una hilera de cromosomas
paralelos.
Esto se confirma al demostrar
que los segmentos
claros de cromosomas
ya no contienen DNA (me-
diante investigacin histoqumica, segn.el mto-
do de Feulgen). x900. (Segn Bloom y Ozarslan.)
potencial elctrico entre el interior de la
clula y el medio
(fig. 2-13). De esta mane-
ra es posible investigar los potenciales de
membrana variables de los teiidos nervio-
so y muscular.
Los microinyectores son una variante
especial de microelectrodos y se pueden
emplear para la inyeccin de cantidades
microscpicas
(picolitros) de sustancias
dentro de las clulas. Una aplicacin es-
pecial es la inyeccin de un colorante que
difunde en las distintas partes del cito-
plasma y que se hace fluorescente con el
microscopio ptico. Con esta tcnica es
posible dibujar el contorno de cada clula
individual en teiidos con estructuras muy
complicadas, por eiemplo, del sistema
nervioso central
(fig. 2-1'a).
Utilizacin de haces de rayos angostos
y de alta energa. Mediante aparatos es-
peciales es posible concentrat protones
n un haz de rayos con un dimetro de
2,5
tm,
y con inadiacin ultravioleta se
pueden lograr dimetros de alrededor de
1
tm.
Este microrrayo es tan angosto que
puede incidir y, en consecuencia, destruir
Ios componentes individuales del ncleo
celular, por ejemplo, parte de un cromoso-
ma
(fi g. 2-15). En el l ti mo ti empo se han
utilizado especialmente los rayos lser
con este propsi to.
Microcinematografia. Si bien esta tc-
nica no implica en s misma una manipu-
l aci n di rel ta de cl ul as vi vas, representa
un mtodo importante para su observa-
cin. La microcinematografa
(gr.
kinema,
movimiento) es una tcnica que registra
en una pelcula
(como imgenes vivas) lo
oue se observa a travs del obietivo de un
microscopio, mediante una cmara de vi-
deo. Tiene especial importancia para el
anlisis de movimienos cuando son de-
masiado rpidos o lentos para poder ser
considerados directamente. Por ejemplo,
con una aceleracin de cien veces es posi-
ble observar Ia divisin celular y, adems,
se ouede observar cmo se desplazan las
mi i ocondri as dentro de Ia cl ul vi va.
Por el proceso inverso
(frenando los
movi mi entos muy rpi dos) es posi bl e
analizar, por ejemplo, Ios movimientos de
las cilias.
Mtodos de fraccionamiento
celular
Mediante los mtodos de fracciona-
miento celular es posible separar los dis-
tintos componentes celulares y mantener,
al mismo tiempo, sus funciones. Por lo
tanto, los mtodos de fraccionamiento ce-
l ul ar han
j ugado un i mportante papel en
la resolucin de la organizacin funcional
de la clula.
CAPI T UL O
MTODOSHISTOLGICOS 31
Centrifugacin diferencial (centrifirga-
cin
dinmica).
Este es el mtodo ms uti-
lizado para la separacin de organelas ce-
lulares. Antes de la centrifugacin se efec-
ta una homogenizacn. Se colocan pe-
queos trozos de tejido en una solucin
adecuada (p.ej.,
de sacarosa) que contri-
buye a mantener intactas las organelas y
se opone a su tendencia a agruparse. Des-
pus se coloca la solucin con los trozos
de tejido en un homogenizador, que pue-
de tener la forma de un cilindro de vidrio,
en el cual rota a gran velocidad una vari-
lla de tefln (fig.
2-16). Los trozos de teji-
do son aplastados por Ia friccin de la va-
rilla contra las paredes del cilindro. As se
rompen las membranas celulares y que-
dan libres en la solucin las organels y
las inclusiones. Se pueden utilizar otros
mtodos para la homogenizacin de las
clulas y los tejidos, por ejemplo ultraso-
nido. Despus de unos minutos de reposo
se centrifuga el sobrenadante (lat.
super-
natant, flotante) con velocidad moderada
y temperatura apenas superior a OoC. Des-
pus de la sedimentacin de las partculas
ms pesadas se puede hacer sedimentar
las partculas con masa menor, mediante
centrifugaciones con velocidades crecien-
tes. La identificacin de una
fraccin
y
la
evaluacin de su grado de purezo, e el
caso de los ncleos celulares, se
puede
efectuar por microscopia de contraite de
fase. Las partculas ms pequeas (es
de-
cir, la mayora) deben ser identificadas
mediante microscopia electrnica de los
cortes ultrafinos del sedimento slido ob-
tenido por centrifugacin, el denominado
"pellet". De esta manera se tiene la seguri-
dad de que las fracciones no contienen
mezclas de distintos tipos de organelas.
Centrifugacin por gradientes de den-
sidad
(centrifugacin
equilibrada). Con
este mtodo es posible obtener mayor
cantidad de
fracciones
ms limpios que
con la centrifugacin diferencial. Se ob-
tiene el homogenizado como en el caso
anterior y se agrega una solucin de, por
ei empl o, sacarosa. que conti ene concen-
traciones crecientes de sacarosa a medida
que se acerca al fondo, es decir, con den-
sidad creciente. La centrifugacin prolon-
gada a gran velocidad hace que las part-
culas sedimenten en el sitio que les per-
mite su densidad (se
detienen cuando al-
car:zan una "profundidad"
equivalente a
su propi a densi dad).
De esta manera se logra obtener fraccio-
nes casi puras de ncleos, elementos nu-
cleares, mitocondrias, lisosomas, riboso-
mas, retculo endoplasmtico y grnulos
de secrecin. Estos homogenados celula-
res fraccionados, en los cuales los compo-
nentes manti enen su funci n bi ol gi ca, se
denominan sistemas libres de clulas. El
32 MTODOS HISTOLGICOS
estudio de estos sistemas libres de clulas
ha contribuido con gran parte del conoci-
miento actual sobre Ia biologa molecular
de la clula, por ejemplo respecto a la re-
plicacin y la transcripcin del DNA y a
la sntesis de protenas.
En aos recientes, los mtodos de frac-
cionamiento celular han sido suplementa-
dos con varias tcnicas para la investiga-
cin de macromolculas, entre ellas dis-
tintas formas de cromatografa y de elec-
troforesis. Sin embargo, estas tcnicas
pertenecen ms a la parte bioqumica de
la biologa celular y no se las incluir en
esta presentacin general (se
refiere al lec-
tor a textos de biologa molecular y bio-
qumica), si bien es obvio que
se har re-
ferencia a ellas en relacioes relevantes
de los prximos captulos.
Preparacin e investigacin
de t-eiidos muertos
El estudio directo de clulas v teiidos
vi vos sl o ti ene apl i caci ones l i mi i ads. Es
difcil diferenciarlos distintos componen-
tes entre s con l a mi croscopi a de transmi -
sin, dado que tienen igul grado de re-
fraccin de Ia luz. Adems, por lo general
el tejido presenta un espesor tal que Ia pe-
netracin de la luz es demasiado escasa.
En consecuencia, se utiliza con mucha
mayor frecuencia el tejido muerto, que se
mantiene mediante acciones
qumicas
in-
medi atamente despus de exi rado y en-
tonces se corta en secci ones muy del ga-
das, denomi nadas cortes hi stol gi cos.
Despus de l a t i nci n con di st i nt os col o-
rantes se observan l os cortes con el mi -
croscopi o pti co, dado que el mayor con-
traste entre los componentes tisulares per-
mite diferencialos. Es obvio que al prepa-
rar l os cortes hi stol gi cos se debe procu-
rar mantener, en lo posible, el aspecto de
Ias estructuras en el organi smo vi vo.
Preparacin de tejidos
para microscopia ptica
Fiiacin. Las clulas se matan con la fi-
jacin,
pata detener los procesos celulares
dinmicos con la mayor rapidez posible y
mantener la estructura con ias mnimas
modificaciones posibles. Esto se logra con
la insolubilizacin de los comDonentes
est r uct ur al es de I a cl ul a y
l a f or maci n
de enl aces cr uzados. por l a acci n de di s-
tintos agentes qumicos, los fiiadores. En
el proceso de fijacin se estabilizan las
protenas, porque los fijadores favorecen
la formacin de enlaces cruzados entre las
molculas proteicas. De esta manera se
mantienen todas las relaciones entre las
estructuras como en la clula viva. Las
CAPI T UL O
Fig. 2-16. Dbulo esque-
mtico del
procedimiento
de fraccionamento ce-
lular (vase el texto para
los detalles).
orotenas solubles se unen a las estructu-
iales y se transforman as en insolubles.
AI mismo tiempo se alcanza cierta fuerza
mecnica, que posibilita los pasos si-
guientes del proceso de preparacin. Al-
gunos fijadores como, por ejemplo, eI
/or-
maldehdo y, en especial, el glutaraldeh-
Clula intacta
Ribosomas
do son especialmente efectivos en lo refe-
rido a la fbrmacin de enlaces transversa-
les. Estos dos fijadores,
junto
con el tetr-
xido de osmio, que tambin forma enlaces
tansversales, son algunos de los agentes
ms efectivos. Mantienen el aspecto de la
clula en condiciones muv similares a las
Centrifugacin
200.000 g, t hora
cAP r ut o 2
MToDosHtsroLctcos 33
que se observan con el microscopio de
contraste de fase, como control de la es-
t ruct ura de l as cl ul as vi vas.
La fijacin tambin produce la inactiva-
cin de algunas de las enzimas celulares,
las cuales de otro modo iniciaran la auto-
digestin o autlisis y conduciran a la
degeneracin post mortem (lat.
mors,
muerte). Adems, se eliminan bacterias y
muchos ot ros mi croorgani smos. que po-
dr an dest rui r el t ei i do.
En l a prct i ca, l a f i j aci n se l l eva a ca-
bo por i nmersi n de un pequeo t rozo
de tejido en el fiiador, apenas se haya to-
mado l a muest ra. Es conveni ent e real i -
zar la extraccin del teiido mediante
pi nzas y una cuchi l l a af i l ada, y procurar
no daar el t ej i do. Para l os t ej i dos huma-
nos, est o se puede ef ect uar durant e pro-
cedi mi ent os qui rrgi cos o por bi opsi a
(gr.
bi os, vi da; opsi s, si n), es deci r, una
muest ra de t ej i do ext ra da del organi smo
vi vo. De l os t ej i dos accesi bl es di rect os,
como l a pi el , se puede t omar l a muest ra
por cort e con cuchi l l o, pero t ambi n es
posi bl e t omar muest ras de rganos i nt er-
nos como, por ej empl o, el h gado o el ri -
n, medi ant e cnul as especi al es. Las
bi opsi as t ambi n se pueden ext r aer du-
rant e procedi mi ent os como endoscopi as
(gr.
endon, dent ro; skopei n, ver), es deci r
est udi os i nt ernos de cavi dades medi ant e
un i nst rument o muni do de una f uent e
I umi nosa, el endoscopi o. Despus de I a
ext racci n del t ej i do se l o sumerge en el
fijador, en la fiiacin por inmersin, a
diferencia de la fiiacin por perfusin,
que se puede apl i car a ani mal es de expe-
ri ment aci n. En est e caso se i nyect a el
f i j ador en el t orrent e sangu neo del ani -
mal vi vo anest esi ado y el f i l ador l l ega
por v a hemat gena rpi dament e a t odo
el t ej i do. De est a manera se I ogra mat ar
t odas l as cl ul as de un rgano compl et o
en f orma casi i nst ant nea despus de i n-
t er r umpi r I a admi ni st r aci n d' e ox geno.
y se obt i ene una f i j aci n ms rpi da y
uni f orme. El mt odo se apl i ca en t raba-
i os
muy exi gent es, por ej empl o pr epar a-
dos para mi croscopi a el ect rni ca, en I os
que se dest acan con ni t i dez i ncl uso l as
pequeas modi f i caci ones est ruct ural es
post mort em.
Inclusin y corte. EI tejido fijado se cor-
ta en secciones delgadas, que permiten el
paso de la luz. La mayora de los prepara-
dos para microscopia ptica tienen un es-
pesor de al rededor de 5-10
rm,
para l o
que se requiere un micrtomo, instrumen-
to similar, en principio, a una cortadora
de fetas. Para obtener la consistencia ne-
cesaria para poder cortar secciones tan
delgadas es necesario incluir antes el teii-
do en un mat er i al que, al sol i di [ i car se. l e
confiera suficiente dureza. Las sustancias
34 MTODOSHISTOLGICOS
Fig.2-17. La ilustracin muestra el coe de
tejidos incluidos en un micrtomo de parafi-
na Tras el corte se renen los trozos en serie
sobre una pequea "cinta transportadora" y se
colocan en el bao de agua caliente de la dere-
cha
para que
se estiren A continuacin se
montan sobre portaobjetos y se procesan. So-
bre la mesa se ven 7 bloques de parafina, en
l os que se di st i nguen l os t rozos de t ej i do i ncl ui -
dos Cada bl oque est f i j ado a un pequeo cu-
bo de madera que se aj ust a al mi crt omo du-
rante el corte del bloque
adecuadas para este fin, los medios de in-
clusin, son tipos de cera insolubles en
agua, por Io gneral parafina. En conse-
cuenci a, ant es de I a i ncl usi n, es necesa-
rio deshidratar el tejido. Para ello se pasa
el t ej i do por una seri e de sol uci ones acuo-
sas de ef anol en concent raci ones creci en-
t es, hast a l l egar al anhi dro. El t ej i do se su-
merge ent onces en un l qui do mi sci bl e en
etanol y parafina, por ejemplo xileno, pro-
ceso denomi nado "acl arami ent o". Des-
pus del acl arami ent o se col oca el t ej i do
en parafina lquida, que disuelve ei xileno
y penetra as en ei tejido. Al enfriar, se so-
lidifica la parafina y forma, junto
con el
t ej i do i ncl ui do, un bl oque sl i do o
"t aco",
que es l o que se secci ona (f i g. 2-17).
A pesar de l os cui dados, se producen
ciertas modificaciones al
procesar
el taco.
El al cohol y el xi l eno exf raen grasas y el
calentamiento de la inclusin inactiva
muchas enzimas; adems, a menudo el te-
j i do
se cont rae de modo percept i bl e. Para
evitar estos problemas, a veces se efecta
un corte por congelamiento de tejido fija-
do o no. Un t aco de t ej i do congel ado t i ene
consistencia suficiente
para
ser cortado
en un cr i sl at o ( vase
f i g. 2- 33. pg. a3) .
La tcnica de congelacin es tan rpida
que se pueden obt ener secci ones en pocos
mi nut os. Se ut i l i za, por ej empl o, para de-
terminar si el material de una bioosia ex-
t ra da en un act o qui rrgi co es beni gno o
mal i gno. El resul t ado de l a bi opsi a se ob-
t i ene mi ent ras el paci ent e permanece
CAP T U
lslote de
anestesiado, por lo que el cirujano puede
decidir en el momento el alcance del pro-
cedimiento quirrgico.
Mtodo de congel aci n-desecaci n.
Con este mtodo se intenta lograr que la
variacin estructural y la extraccin qu-
mica sean las mnimas posibles, para
conservar la actividad enzimtica. Se
congela rpidamente el trozo de tejido y
se lo coloca en una cmara de vaco a ba-
j a
temperatura, despus se seca
(se
deshi -
drata) por evaporacin lenta
(sublima-
ci n) del agua.
En la congelacin-sustitucin se efec-
ta primero una fijacin moderada y un
tratamiento con sacarosa, despus una
congelacin rpida del tejido y a conti-
nuacin una deshidratacin a
-B5oC
en
metanol puro. Una vez eliminada el agua
se transfiere el tejido a un medio de inclu-
sin plstico adecuado, que se infiltra
mientras se incrementa gradualmente la
temoeratura hasta alrededor de
-20"C.
Por
ltimo se polimeriza por irradiacin con
luz ultravioleta el medio de inclusin,
que se seca, y ya se puede cortar el taco
terminado.
Fig.2-18. Fotomicrografa que muestra las ga-
mas de color del mtodo de tincin histolgica
de uso ms frecuente, la coloracin con he
matoxilina-eosina (HE). El corte de teido es
de pncreas, por lo que se distingue un slote
de Langerhans, con clulas cuyo citoplasma se
tie de color rosa claro con la eosina,
y nume-
rosos cinos, con clulas cuyo citoplasma se ti-
e de azul lilceo con la hematoxilina en la zo-
na basal y de rosa con la eosina, en la porcin
aoi cal . x660.
El mtodo es muy poco agresivo con el
tejido y es apropiado para muchos proce-
dimientos inmunohistoqumicos
(vase
ms adelante).
Coloracin. Los cortes de teiido se sue-
len montar sobre portaobjetos y se colo-
rean. La mayora de los colorantes histol-
gicos se utilizan en solucin acuosa, por
Io que los cortes incluidos en parafina de-
ben ser "desparafinados", mediante un
tratamiento con xileno, y rehidratados por
pasajes por concentraciones decrecientes
de alcohol en agua, antes de ser teidos.
Los cortes por congelacin se pueden tra-
tar con las soluciones acuosas inmediata-
mente despus de seccionados.
La mavr Darte de los mtodos de tin-
cin histblgicos se desarrollaron en fun-
cin de su capacidad para teir selectiva-
mente los distintos componentes tisula-
res. El mtodo de tincin ms utilizado es
Ia combinacin de hematoxilina y eosina
(HE), que tie los componentes nucleares
de azul vi ol ceo, mi entras que casi todas
las estructuras citoplasmticas adquieren
una tonal i dad rosada
(fi g. 2-18). En con-
secuenci a, l a ti nci n con HE muestra con
nitidez la forma y la estructura del n-
cl eo, adems de i a forma y l a extensi n
de l a cl ul a. Cabe destacar, si n embargo,
que l a ti nci n hi stol gi ca es un procedi -
mi ento qumi co y que se ha produci do
un gran desamol l o en l os mtodos que i n-
forman sobre Ia composicin qumica de
l as cl ul as y l os tej i dos. Esto se ver con
mayor detal l e en l a secci n sobre hi sto-
qumi ca.
Despus de la tincin, por Io general se
deshidrata y se aclara nuevamente la
muestra de tejido y entonces se monta, es
decir, se cubre con una gota de medio de
montaje transparente
(Depex,
Eukitt). Por
ltimo se coloca un cubreobjeto para pro-
teger el preparado. Algunos medios de
montaje son miscibles en agua, por Io que
se puede montar inmediatamente, sin ne-
cesidad de deshidratacin
y
aclaramiento.
Preparacin de tejidos
para microscopia electrnica
Debido al poder de resolucin mucho
mayor del microscopio electrnico, en es-
te caso se agudizan las exigencias de man-
tener las estructuras originales del tejido.
Para la fijacin se suele utilizar glutaral-
dehdo. Tambin se puede emplear fer-
xido de osmio que, adems de fijar el teji-
do, se une con las membranas lipoprotei-
cas y as logra mayor contraste en Ia ima-
gen del microscopio electrnico. Esto se
debe al aumento de la dispersin de elec-
tl ones por l a membrana, a causa del el eva-
do nmero atmico del osmio. En conse-
cuencia, se habla de
"tincin"
o contras-
cAP r ut o
MToDoSHISTOLGICOS 35
Fi g. 2- 19. l ma
corte ultrafin(
con microsco
t rni co, aume
13.000 veces.
muestra la par
t bul o renal , y
con claridad ur
del t bul o com
deada de partr
clulas vecinal
gran riqueza d
que facilitan la
cin de organe
srones, por
el e
condrias (A/). (
A B Maunsba<
,,,!;
: r {
a
r.,1,,
tado. EI contrastado con osmio se emolea
a menudo despus de l a f i j aci n con gl u-
taraldehdo, que por s misma no aumen-
ta el contraste.
Despus de la fijacin se deshidrata y
se incluye el teiido. Para la inclusin se
suelen utilizar resinas epoxi v distintos
mot eri al es pl ri sLi cos. que adqui eren gran
dureza despus del secado y permiten la
seccin de cortes ultrafinos.
36 MTODOSHISTOLGICOS
EI haz de electrones se detiene con faci-
lidad, por lo que 1os cortes de tejido utili-
zados no deben exceder de 20-100 nm.
Desde el punt o de vi st a t cni co, el cort e
de estas secciones ultrafinas es muy di-
f ci l y se necesi t a un ul t rami crt mo.
con una cuchi l l a de vi dri o o de di aman-
t e. El cort e se cont rol a con un mi crosco-
pi o y se aument a el cont rast e medi ant e
el pasai e r pi do de l as secci ones por una
CAPI T U
*
:{i}"
- ; e
s " ,
? 1 q
4
qr
Wa
r 4
-.
. . : . e
' t l
: ,
Fig.2-2O. Fotomicrograf a de un corte semif'
no de tejido de rin Tras la fijacin se incluy
el tejido en plstico y se cort en seccones de
' I
rm
de espesor, que se colorearon con azul
de t ol ui di na x660
sol uci n de acet at o de urani l o. Por l o
gener al no es necesar i o el i mi nar el pl s-
t i co de i ncl usi n, dado que es homog-
neo y t ransparent e, y adems est abi l i za
el preparado durant e el anl i si s con el
mi croscoDi o. Los cort es ul t raf i nos se
mont an despus de l a secci n sobre un
pequeo ret i cul ado de cobre, denomi na-
do "gri l l a", que suel e est ar cubi ert o por
una pel cul a pl st i ca de sost n muy del -
gada. En l a observaci n mi croscpi ca
(f i g. 2-19), el haz de el ect rones at ravi esa
el cort e por I os ori f i ci os de l a gri l l a.
La gran cal i dad t cni ca que se obt i ene
con I a preparaci n de t ej i dos para l a mi -
cr oscopi a ei ect r ni ca t ambi n se apl i ca
par a l a mi cr oscopi a pt i ca, con l os cor -
t es semi f i nos, de al rededor de 1
rm
de
espesor , y l a post er i or t i nci n con, por
ej empl o, azul de t ol ui di na
( f i g. 2- 20) . Se
usa azul de t ol ui di na por su capaci dad
para penet rar en l os medi os de i ncl u-
si n de resi nas eDoxi . i o cual no ocurre
con l os col orant es hi st ol gi cos comu-
nes. Los cort es semi f i nos t ambi n se
pueden secci onar despus de ser i ncl ui -
dos en resi nas acr l i cas
(en I ugar de re-
si nas epoxi ), que dan resul t ados de cal i -
dad muy si mi l ar y permi t en I a t i nci n,
por ej empl o, con hemat oxi l i na y eosi na
(f i e. 2-2t ).
Congelacin y fractura
(ing.
freeze-
cleaving o
freeze-fracfue).
Es una tcni-
Fi g. 2-21. Fot omi crograf a de l a crnea Es un
cort e semi f no de t ej i do i ncl ui do en resi na
acr l i ca y t ei do con hemat oxi l i na-eosi na. x440.
ca nueva que se apl i ca a l a i nvest i gaci n
de t ej i dos por mi cr oscopi a el ect r ni ca.
Consi st e en congel ar rpi dament e el t e-
j i do
en ni t rgeno l qui do y l uego col o-
carl o en vac o, para despus f ract urarl o
con un cuchi l l o o navai a
(de
modo si mi -
l ar a como se part e un l adri l l o). Se col o-
ca ent onces vapor de pl at i no sobre l a su-
perf i ci e de f ract ura, en ngul o i ncl i na-
do, l o que f orma una del gada pl ant i l l a
de pl at i no de esa superf i ci e, o rpl i ca,
ore acenta las formas del relieve. Se
r-ef u". ru ent once l a rpl i ca de pl at i no
medi ant e l a apl i caci n de part cul as de
carbn. A cont i nuaci n se el i mi na el t e-
j i do con un ci do f uert e y se mont a I a r-
pl i ca de pl at i no sobre una gri l l a, para l a
observaci n con el mi croscopi o el ect r-
ni co de t r ansmi si n, dado que el hoz de
el ect rones es capaz de at ravesar l a rpl i -
ca del sada.
Las ventajas del mtodo son evitar las
acciones de los
fijadores
qumicos y de los
medios de deshidratacin y de inclusin,
por I o que se han podi do comparar l as es-
tructuras de los tejidos fijados y no fijados
con el mi croscopi o el ect rni co
(f g. 2-22).
El mtodo tiene aplicacin especialmente
importante en la investigacin de las es-
tructuras internas de las membranas
(va-
se con ms det al l e en el cap. 3).
EI ooder de resolucin es de alrededor
de 3 nm.
- 5 _ * * - - i * ' r r
CAPI T UL O
METODOSHTSTOLOGICOS 37
Mtodos histoqumicos
El elemento fundamental de los mto-
dos histolgicos es Ia utilizacin de ac-
ciones
fsicas
y qumicas sobre prepara-
dos histolgicos, paa determinar la lo-
ca]izacin de sustancias
qumicas
en las
cIulas y Ios tejidos. Para ia histoqumica
es esencial la Localizacin, dado oue el
empl eo de cortes de tej i do puede dl r i n-
formaci n sobre l a l ocal i zaci n, i mposi -
bl e de obtener por determi naci onei bi o-
qumicas obtenidas de homogenados de
tei i dos.
Antes de la reaccin histoqumica en s
es necesario efectuar una
lijacin
y una
preparacin adecuadas, que conserven la
sustancia qumica estudiada y las estruc-
turas celular y tisular. Los lpidos son so-
Iubles en solventes orgnicos como el xi-
leno, por lo que se deben evitar cuando se
estudian esos compuestos. Debido a la ac-
cin desnaturalizante de los agentes fija-
dores sobre las protenas, la mayora de
las enzimas se inactivan con la fiiacin
pero. por otra parte. al gunas enzi mas son
38 MTODOSHISTOLGICOS
solubles y se pierden si no se lleva a cabo
una fijacin previa a la determinacin his-
tooumica.
La reacci n hi stoqumi ca debe i nduci r
la formacin de un producto insoluble
vi si bl e. En consecuenci a, debe ser col o-
reado o poder transformarse en fluores-
cente. Para Ia mi croscopi a el ectrni ca es
necesari o que posea
-el ectrondensi dad
suficiente.
Se debe considerar la sensibilidad de Ia
reaccin histoqumica, dado que los re-
sultados negativos no se pueden interpre-
tar de inmediato como ausencia de la pro-
pi edad buscada. Es posi bl e que l a canti -
dad presente sea demasiado pequea para
ser detectada, o que la sustancia se haya
perdido o modificado durante la prepara-
ci n previ a.
Se pasa gradualmente de los mtodos
de tincin morfolgicos a los procedi-
mientos histoqumicos ms especficos.
Por lo tanto, se vern primero algunas
reacciones ms generales antes de anali-
zar los principales mtodos histoqumi-
Fig.2-22. lmi
rplica de un
realizado por
cin y fractur
con mrcroscc
trnco. La im
tra una clula
plexo coroidec
se ooservan c
el nucl eol ema
ros. x22.400. (
B. Van Deurs.)
CAPI T L
Acidofilia y basofilia
Para obtener suficiente contraste de co-
lor en los cortes histolgicos comunes,
por lo general se emplean combinaciones
de colorantes cidos y bsicos. Tradicio-
nalmente se denomina acidofilia
(g..f-
1ern, amar) a la capacidad de tincin de
Ios colorantes cidos y basofilia ala capa-
cidad de tincin de los colorantes bsicos,
pero la designacin de colorantes "ci'
dos" v "bsicos"
proviene
de la era clsi-
ca de la histolog, cuando las definicio-
nes de cidos y bases diferan de las ac-
tuales
(un
cido es una sustancia capaz de
Iiberar un protn y una base es una sus-
tancia capaz de aceptar un protn). En el
lenguaje /risfoqumico, un colorante ci-
do
(aninico) tiene capacidad para formar
un enlace electrosttico
(iongeno) con
un grupo tisular con carga positiva. En
contraste, un colorante bsico
(catinico)
ouede formar un enlace elctrosttico con
n grupo tisular con carga negativa.
As, las uniones entre colorantes cidos
(aninicos) y bsicos
(catinicos) y los
grupos tisularcs tienen, esencialmente,
caractersticas electrost.ticos. En un corte
de tejido, el esqueleto proteico y muchas
otras macromolculas contienen grupos
i oni zabl es, capaces de formar enl aces
electrostticos con los colorantes. Las dis-
tintas
protenas
de un corte de teiido tie-
nen diferentes puntos isoelctricos, dado
que varan las composiciones de amino-
cidos. Para las tinciones histolgicas co-
munes se utiliza un pH del que se conoce
por experiencia su buen contraste de co-
/o. Con el pH elegido, algunos compo-
nentes tisulares son acidfilos, mientras
que otros sern basfilos
(fig. 2-18), pero
siempre en rcIacin con el pH, A pH neu-
tro, el DNA y el RNA presentan fuerte ba-
sofilia, debido a la disociacin de los gru-
pos fosfato de las molculas
(fig. 2-23).
Con ese mismo pH, la mayora de las pro-
tenas citoplasmticas son acidfilas.
Cuando se desea analizar si la basofilia
se debe a los cidos nucleicos de, por ejem-
plo el RNA, antes de la tincin se puede
tratar el corte control con Ia enzima ribonu-
cleasa. De esta manera se elimina el RNA
del corte control, por lo que las zona ricas
en RNA ya no sern basfilas. El DNA se
identifica de modo similar, con Ia aplica-
cin de la enzima desoxirribonucleasa.
Con la fijacin se modifican las propie-
dades de las
protenas,
debido a la desna-
turalizacin, y el resultado es un aumento
de la afinidad por el colorante.
Para algunos mtodos de tincin, por
ejemplo Ia coloracin tricrmica de Ma-
llory, se utilizan varios colorantes, todos
cidos, que tien distintas estructuras tisu-
lares. Se desconoce el fundamento qumico
de Ia unin entre los colorantes y los com-
ponentes
tisulares, debido a
que
estos m-
iodos no son especficos, desde el punto de
vista histoqumico. Por el contrario, se de-
nominan selectivos cuando tien determi-
nados componentes tisulares
(fi9. 2-2a).
Los mtodos de tincin selectivos tienen
Flg.2-24. Fotomicrografa de un preparado de
la cpsula de un rgano, coloreado
por el mto-
do de Mallory. Se observa una tincin selecti.
va, dado
que,
entre otras, las numerosas fibras
colgenas del tejido conectivo se colorean de
azul intenso. x275.
#

q
t , ,
1|
{
f
i r
"
*
Fig. 2-23. Fotomicrograf a
de un corte de la mdula
esoinal teido con tionina.
En el centro de la imagen
se distingue una neurona
(una clula motora del as-
ta anterior, n) con nuclo-
lo basfilo
y cmulos ci-
toplasmticos muy ba-
sfilos. x440.
*
cAP r ut o
" ' *
MToDoSHISTOLGICOS 39
Metacromasia
(rojo)
Ortocromasia
(azul)
Fig.2-25. Dibujo esquemtico de la metacro-
masia, que muestra la agregacin de las mol-
culas de colorante sobre la suoerficie de un oo-
l mero pol i ani ni co de el evado peso
mol ecul ar
(p. ej . , un gl ucosami nogl ucano en un cart l ago)
con viraje del color azul del colorante a violeta
rojizo. (Segn Bradley y Wolf
)
gran valor prctico, dado que el mayor con-
traste de color facilita la identificacin de
los distintos componentes del tejido.
Metacromasia
Cuando se tien ciertos comDonentes
t i sul ares, como por ej empl o, l a mt ri z car-
tilaginosa, con el colorante azul de tolui-
dina, se modifica el color azul a prpura o
roj o vi ol ceo por uni n con el t ej i do. Est a
variacin cromtica se denomina meta-
cromasia (gr. meta, variacin; kroma, co-
lor) y los colorantes capaces de sufrir esta
transformacin se denominan colorantes
metacromticos. Pertenecen a este tipo de
agent es ci ert os col orant es bsi cos, de l os
cuales los ms importantes son los deriva-
dos t i az ni cos azul de t ol ui di nay t i oni na.
Una solucin diluida de un colorante
tiaznico es azul, debido a que se encuen-
tra como monmero. Si la solucin es
concentrada, el colorante se agrega y for-
ma polmeros, por lo que el color vira al
rojo. As, un colorante tiaznico puede
presentar distinto color, de acuerdo con eI
estado de agregacin de las molculas y
es precisamente este estado de agrega-
cin, que puede ser modificado por los
componentes tisulares, el que produce la
metacromasia. Si se tie un corte con una
solucin diluida de azul de toluidina, es-
te colorante catinico forma enlaces elec-
trostticos co.n los sitios aninicos
V,
por
l os component es t i sul arer
"upaces
"' r"t
teidos metacromticamente (hay poli-
aniones de alto peso molecular), se agre-
40 METODOSHISTOLGICOS
gan l as mol cul as del col orante (fi g.2-25).
En consecuencia, el colorante vira a rojo.
Los componentes tisulares que se colo-
rean por metacromasia son, en su mayor
parte, los muy cidos glucosaminogluca-
nos sulfatados de Ia matriz cartilaginosa
(fg. 2-26) y l os mastoci tos del tej i do co-
necti vo, que conti enen l a sustanci a po-
lianinica heparina. Las nucleoprotenas
presentan metacromasia moderada.
Mtodos basados en la reaccin
de Schiffpara grupos aldehdo
EI reactivo de Schiff es la leucofucsina
formada por el tratamiento del colorante
rojo fucsina con bisulfito. La Ieucofucsina
es incolora, pero forma tn producto de
adicin estable rojo con los grupos aldeh
do. Esta reaccin se incluye como paso fi-
nal de dos importantes mtodos de tin-
ci n hi stoqumi cos: l a reacci n del ci do
perydi co-Schi ff para compuestos ri cos
en hidratos de carbono y la reaccin de
Feulgen para DNA.
Mtodo del cido perydico-Schitr (PAS).
La reaccin de PAS se emplea para deter-
minar la presencia de macromolculas ri-
cas en hidratos de carbono como el sluc-
geno y )as glucoprotenas.
El principio del mtodo de PAS se basa
en que el cido perydico (HIO*)
oxida
primero los grupos hidroxilo Iibres de dos
tomos de carbono adyacentes, por lo que
se transforman en grupos aldehdo. Al
mismo tiempo se escinde la unin entre
l os tomos de carbono, por l o que se deti e-
ne la oxidacin. Los grupos aldehdo neo-
formados reacci onan entonces con el
Si t i o de uni n en el
pol i ani n
Mol cul a de
colorante
re
i :.q
.;'"'.
"
'.-..
q':
. ! ". (. ' -
- - - \ . : f
Fi g. 2-26. Fot
fa de un corte
quea t ei do cr
xi l i na-eosi na, r
tra un ejemplr
cromasia. La
nt ensament e
cea de l a mi t a
de l a i magen r
hi al i no (c), cu1
basal se tie
tr
cromasa. x1 1
CAPI T I
Fig, 2-27. Fotomicrogra-
f a de una t i nci n con el
mtodo de PAS de un
preparado de la mucosa
del intestino delgado. En
el epi t el i o se di st i nguen
cl ul as cal i ci f ormes de
t
color rojo intenso, que A
contienen secrecin
(una gl ucoprot e na) que
se tie con la reaccin
de PAS. x275
Fig.2-28. Muestra el
principio del mtodo de
Feul gen, en el que l os
grupos pri cos del DNA
son el i mi nados
por
hi dr-
l i si s ci da dbi l .
ru
&
'
*ff;
w.
@,
!

*r
:lli
*
'&1
,.r,',
*".!.
J
,
{ }
i
p"
&
f.*
d$/
reactivo de Schiff, para dar lugar a la apa-
ri ci n del col or roTo magenta caractersti -
co
(fi g. 2-27).
Vari os componentes ti sul ares reacci o-
nan con el mtodo de PAS, se di ce que
son "PAS-posi ti vos", como se ver en l os
prxi mos captul os.
Para determinar si una sustancia PAS-po-
sitiva est compuesta por glucgeno se tra-
ta un prepa-rado control con la enzima ami-
loso, que escinde el glucgeno especfica-
mente, antes de realizar la tincin de PAS.
Mtodo de Feulgen. Es un mtodo espe-
cfico para la determinacin histoqumica
de DN,4, sobre la base del contenido de
desoxirribosa en el DNA. Se eliminan los
grupos purnicos del DNA por medio de
una hi drl i si s ci da suave. De esta mane-
ra se abre el anillo de Ia desoxirribosa y se
forma un grupo aldehdo
[fig.
2-28), que
I
- o-
P- o:
I
o
I
OH
I
- o
P- O:
I
o
I
-
k--
{
,nr
,
Fig.2-29. Fotomicrografa de un preparado del
ext remo de l a n z de una cebol l a, t ei da con el
mtodo de Feulgen, especfico para DNA S-
l o se t i e de roj o l a cromat i na del ncl eo (que
cont i ene DNA). El col or verde del ci t opl asma se
debe al col oranl e de cont rast e verde cl aro En-
t re ol ras, en el cent ro de l a i magen se di st i ngue
una cl ul a en mi t osi s (di vi si n), donde l os cro-
mosomas est n bi en t edos x440
reacciona con el reactivo de Schiff, con
aparicin del color rqo caracterstico en el
si t i o que corresponde al DNA (f i g. 2-29).
Como confoi se utilizan cortes tratados
con Ia enzima desoxitibonucleoso antes
de l a t i nci n de Feul gen.
Por Io general, Ios materiales positivos
para Feulgen se limitan aIa cromatina nu-
c}eo. Como se ver, en el captulo 3, las
mitocondrias poseen DNA, pero en canti-
dad demasiado pequea para ser detecta-
da con el mtodo de Feulgen.
Determinacin histoqumica de lpidos
Despus de Ia fijacin de los lpidos
con f ormal i na se cort an secci ones conge-
)adas, para evi t ar I a ext racci n de l os l pi -
dos mediante solventes orgnicos. Para la
demost raci n hi st oqu mi case ut i l i zan
muy a menudo los denominados coloran-
tes Sudn. Son casi insolubles en agua,
por lo que se utilizan disueltos en alcohol
diluido, que no disuelve las grasas. La
"tincin" se oroduce cuando Ias molcu-
las del colornte se distribuyen entre \os
lpidos y el solvente, en relacin coiles-
pondiente a Ia solubilidad en los dos me-
dios. Pare evitar la extraccin del coloran-
CAPI T UL O
MToDosHI}T)LGICOS 41
Fig. 2-30. Fotomicrografa de un corte congela-
do de tejido adiposo teido con rojo Sudn
para los lpidos de los adipocitos (se us "Light
Green" como colorante de contraste). x440.
te y l os l pi dos se i ncl uyen l os cortes, des-
pus de l a ti nci n, en un medi o acuoso.
De este modo, Ios colorantes Sudn ti-
en con intensidad los triacilgliceroles,
como por ej empl o, en l a ti nci n de l os
adi poci tos con roi o Sudn (fi g. 2-30). El
negro Sudn tiene gran utilidad en Ia tin-
cin de las voinas de mielina de las fibras
nerviosas, compuestas por lipoprotenas.
Determinacin histoqumica de enzimas
Las enzimas tienen vital imoortancia en
el metabol i smo cel ul ar, dado-
que
actan
como catal i zadores bi ol gi cos de casi to-
das las reacciones qumicas celuiaes. En
consecuencia, es muy importante conocer
con exactitud Ia localizacin histoqumica
de l as enzi mas. Entre l os numerosos mto-
dos enzimohistoqumicos, algunos tam-
bin se pueden utilizar para el microsco-
pio electrnico. En estos casos se requiere
un producto electrondenso, compuesto
por cantidad suficiente de partculas pe-
queas para sacar provecho del gran poder
de resolucin del microscopio electrnico.
Las sustancias
que
son escindidas o
afectadas de algun manera por las enzi-
mas se denominan sustratos. Las enzimas
se caracterizan por la especificidad de sus'
trato. As, en muchos casos una enzima ac-
ta slo sobre un nico sustrato. Es Dreci-
samenle en Ia especificidad de sustraio que
se basa la localizacin histooumica exacta
de fas enzi mas. dado oue de di sl i ntas ma-
neras se obtiene un
producto
de reaccin
visible que se exprcs en eI sitio de Ia reac-
cin y seala Ia localizacin de Ia enzima.
Para muchas enzimas, la reaccin his-
toqumica se puede describir de la si-
guiente manera: A es el susfuoto, que se
escinde a B + C. Se agrega un reactivo R,
42 MTODOSHISTOLGICOS
enztma
A
----------------
R
BR
+ C
capaz de formar un complejo insoluble
c o n Bo c o n C[ f i g . 2 - 3 1 ) .
La reacci n enzi mt i ca se produce
cuando los cortes se incuban, es decir, se
colocan en un lquido que contiene los
reactivos necesarios para determinar la
actividad enzimtica en cuestin.
En el esquema de reaccin de la figura
2-31, por l o general B. R es i ncol oro y des-
pus
de la incubacin suele sufrir una
iransformacin secundaria
para
dar un
preci pi t ado col oreado, que se observa con
el mi croscopi o pt i co (f i g. 2-32).
Dado que casi todas las enzimas son
protenas, Ia mayora de los
fijadores
dis-
minuye la actividad enzimtica, aunque
en grado variable para las distintas enzi-
mas. Se conserva la mayor parte posible
de Ia actividad enzimtica cuando se sec-
cionan en un cristato cortes congelados
de t ej i do no f i j ado, ent re
-10oC
y
-ZO"C
(f i g. 2-33), aunque con el ri esgo de que I a
enzima se extraiga por dilucin, cuando
se descongel e el cort e. La f i j aci n i mpi de
o inhibe esta extraccin.
Mtodos inmunohistoqumicos
EI organismo est en condiciones de
reaccionar ante sustancias extraas o ant-
Benos,
y formar anticuerpos especficos,
que se unen con los antgenos. Por lo gene-
ral actan como antgenos las macromol-
culas proteicas o polisacridas. Los anti-
Fig. 2-32. Fotomicrografa de la determinacin
de fosfatasa cida mediante mtodos histo-
qumicos en un corte de tejido renal. Dentro de
las clulas, la fosfatasa cida est localizada en
organelas redondeadas denominadas lisoso-
mas
que,
en consecuencia, se identifican en la
magen como granos o esferas negras x870.
(
Fi g. 2- 31. El r
muestra la for
habitualmente
la reaccin h
con una enzi
el texto para lr
a.
t
\
CAPI T I
Fig. 2-33. La ilustracin muestra el corte de
trozos de tejido en un crstato. En principio
se t rat a de una cmara f r a, en l a que se ubi ca
un micrtomo, que se opera a travs de dos ori-
f i ci os en l a part e ant eri or; el cort e se vi gi l a por
una ventana calefaccionada Los cortes de teji-
do se congel an i nst ant neament e al ser ext ra -
dos y se mantienen as a temperatura baja
constante (p ej
-204C),
durante todo el proce-
so de cort e, l o
que revi st e especal mport anca
en enzi mohi st oqu mi ca
cuerpos son prot e nas produci das por l as
denominadas clulas plasmticas y circu-
Ian por Ia linfa y Ia sangre. Las cluias pro-
duct oras de ant i cuerpos pert enecen al si s-
tema inmune del organismo, que protege
al individuo contra las macromolculas
extraas que intentan ingresar, por ejem-
plo, como componentes de bacterias o vi-
rus. As, Ios anticuerpos son un eslabn
importante en la defensa del organismo
contra las enfermedades infecciosas
[vase
con ms det al l e en el cap. 16). La reacci n
ent re un ant geno y su ant i cuerpo es en ex-
tremo esoecfica.
Los mtoios inmunohistoqumicos se
basan sobre la utilizacin de un anticuer-
po especfico, que se marca mediante un
Fig. 2-35. Fotomicrografa de neuronas teidas
medi ant e i nmunohi st oqu mi ca con ant i cuer-
po contra la molcula transmisora serotonna
(5-hi droxi t ri pt ami na), uni do a peroxi dasa. La
det ermi naci n enzi mohi st oqu mi ca de l a peroxi -
dasa permi t e l a i dent i f i caci n del ant i cuerpo
despus de su uni n con el ant geno del cort e
de tejido y da origen a una reaccin de color ro-
io
parduzco x440
enlace qumico en una sustancia que se
puede
transformar en visible, sin afectar Ia
tapacidad el anticuerpo para formar un
complejo con el antgeno. El principio se
ilustra con Ia denominada tcnica de anti-
cuerpo fluorescente. Para localizar Ia pro-
tena muscular miosina se inyecta en un
conejo miosina purificada de msculo de
pollo. Al cabo de cierto tiempo, el suero
del conei o cont endr ant i cuerpos cont ra el
antgeno miosina de pollo. A continuacin
se extrae el anticuerpo del suero del cone-
io v se adosa a fluorescena. Cortes histol-
giios extrados de pollo se baan en una
solucin del anticuerpo fluorescente
(anti-
miosina), que se une especficamente con
la miosina del corte. El anticuerpo en ex-
ceso se elimina por lavado y se analiza el
preparado con el microscopio de fluores-
cenci a
( f i gs. 2- 34, 2- 36 y 2- 37) .
En lugar de marcar el anticuerpo con
f l uoresce na se puede adosar a l a enzi ma
peroxi dasa, por l o que se pueden i dent i -
f i car compl ej os ant geno-ant i cuerpo me-
di ant e l a det ermi naci n enzi mohi st o-
qu mi ca de l a peroxi dasa
(f i g. 2-35). De
est a manera es posi bl e ut i l i zar el mt odo
para la microscopia electrnica. Ade-
ms, se puede acopl ar el ant i cuerpo a l a
prot e na el ect rondensa que cont i ene hi e-
Fig. 2-34. Fotomicrograf a
captada con microscopa
de fluorescencia de un cor-
te de msculo de
pollo.
El
corte se colorea
primero
con anticuerpo fluores-
cente contra miosina de
pollo, y se baa en una
solucin del anticuerpo. La
antimiosina se une a las
bandas A ricas en miosina,
por lo que stas se ven
fluorescentes
(blancas en
la imagen). x750. (Segn
Finck, Holtzer y Marshall.)
CAPI T UL O
MTODOSHISTOLGICOS
43
rro, ferri ti na, o a partcul as de oro, que
tambi n se puede i denti fi car con el mi -
cr oscopi o el ect r ni co ( f i g. 2- 36) .
La especi fi ci dad de l os mtodos i nmu-
nohistoqumicos depende totalmente de
que el antgeno utilizado se asle sin mez-
clas con otras sustancias, para que sea po-
sible producir anticuerpos puros con la
inmunizacin. En consecuencia, la inves-
tigacin del grado de pureza del antgeno
es un importante control del mtodo. Se
obti ene un antgeno total mente puro
cuando se Io si nteti za, por ej empl o un po-
l i ppti do de secuenci a de ami noci dos
conocida. Es esencial sealar que no es
necesario aislar el anticuerpo primario es-
pecfico de la fraccin mezclada de anti-
cuerpos en el conejo inmunizado ni los
anti cuerpos especfi cos anti conej o en l a
cabra
(vase
recuadro).
-+
---+
--+
En l os l ti mos aos ha si do
posi bl e
ob-
t ener gr an cant i dad de mol cui as de ant i -
cuerpo totalmente iguales, los denomina-
dos anticuerpos monoclonales. La tcnica
para formarlos implica una fusin celular
de clulas de mieloma funa lnea celular
tumoral transformada) murinos con los
denominados linfocitos B, productores de
anticuerpo, del timo de ratones previa-
mente inmunizados por Ia inyeccin del
antgeno que se desea demostrar con el
anticuerpo monoclonal. Despus de la fu-
sin celular, las denominadas clulas de
hibridoma
(hbridas
de mieloma) forma-
das han adquirido la capacidad de las c-
lulas del mieloma de desarrollar un creci-
mi ento prol ongado en cul ti vos cel ul ares y
la capacidad de los linfocitos B de produ-
cir determinado anticuerpo. Despus de
Ia cl oni zaci n de l as cl ul as hbri das i ndi -
F9. 2-36. Di l
mtico del pr
inmunohost<
Se presentan
todos ms us
t ermi naci n h
de protenas r
medi ant e ant i
marcaoos.
Inmunohistoqumica indirecta
El mtodo inmunohistoqumico antes
descrito tambin se denomina mtodo di-
recto, hoy reemplazado casi totalmente
por una tcnica ms sensible, Ilamada
mtodo indirecto. En principio es un
procedimiento que consta de dos pasos:
primero se hace reaccionar el preparado
a analizar con un anticuerpo primario no
marcado dirigido contra el componente
que se desea demostrar. Cuando el anti-
cuerpo primario reaccion con el prepa-
rado se elimina el exceso, no fiiado, y
se
hace reaccionar el preparado con un an-
44 MTODOSHISTOLGICOS
ticuerpo secundario marcado (p.
ej.,
fluorescente), dirigido confua el anticuer-
po primario. Por ejemplo, si se obtuvo el
anticuerpo primario contra una protena
X del preparado por inyeccin de X en
un conejo, el anticuerpo secundario po-
dra ser un anticuerpo de cabra dirigido
contra anticuerpos de conejo en general,
obtenido por inyeccin del anticuerpo de
coneio en una cabra. Este mtodo es ms
sensible porque cada molcula del anti-
cuerpo primario reacciona con varias
molculas del anticuerpo secundario
marcado, v Ia reacci n sel efuerza.
CAPI T I
Fig. 2-37. Fotomicrogra-
fa de un microtbulo den-
tro del citoplasma de fi-
broblastos
provenientes
de un cultivo de tejido, de-
mostrado
por inmunohis-
toqumica mediante la
utilizacin de un anti-
cuerpo fuorescente mo-
noclonal contra la prote-
na tubulina
que conforma
el microtbulo. Los micro-
tbulos citoplasmticos se
distinguen de color verde
fluorescente sobre fondo
negro. x400. (Cedida por
H. Hager. )
viduales, cada clon produce grandes cal-
tidades de anticuerpo monoclonal idnti-
co
( f i l . 2- 37) .
Los mtodos inmunohistoqumicos son
uno de los ms importantes utilizados en
las investigaciones histolgica y biolgica
celula. En principio es posible demostrar
la localizacin de cada una de las prote-
nas que se forman en el or8anismo. Por
ejemplo, en muchos casos se ha podido es-
tablecer cules son Ias clulas que forman
determinada hormona, Los anticuerpos
tambin se pueden forma contra otras
molculas, distintas de las protenas, ya
sea antgenos en s mismos o, en los casos
de molculas pequeas, compuestos que
se acoplan a sustancias antignicas como
las protenas, a veces debido a otro trata-
miento. Por ejemplo, se ha podido demos-
trar la existencia de pequeas molculas
transmisoras como la serotonina
(s-hidro-
xitriptamina)
(fig. 2-3s).
Histoqumica con lectinas
Las lectinas son protenas (en su mayor
parte extradas de vegetales, por ejemplo,
porotos rojos) que poseen sitios de unin
especficos para hidratos de carbono.Dis-
tintas lectinas se unen con diferentes mo-
lculas de hidratos de carbono o secuen-
cias de stas con notable especificidad.
As, existen lectinas que se unen a gluco-
protenas y glucolpidos especficos de la
suoerficie externa de las membranas celu-
larts y a determinados proteoglucanos del
tejido conectivo. La utilizacin histoqu-
mica de las lectinas se debe a que, al igual
que a los anticuerpos, se las puede mar-
crr, por ejemplo con un colorante fluores-
cente o con la enzima peroxidasa, que
permiten su localizacin en un corte de
tejido. La histoqumica con lectinas tiene
amplia aplicacin para demostrar la exis-
tencia de determinadas secuencias de hi-
dratos de carbono en las molculas de las
membranas celulares.
Hibridacin in situ
La hibridacin in situ se basa sobre la
capacidad que poseen los cidos nucleicos
para
hibridarse entrs s, es decir, la capa-
Ldod de unirse entre s que prcsentan las
monocadenas de cidos nucleicos que
tienen secuencias de bases complementa-
ios. La hibridacin puede ser de DNA-
DNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a la
caracterstica muy especfica de Ia hibrida-
cin es posible demostrar con gran especi-
ficidad la presencia de determinadas se-
cuencias de DNA o de RNA en su localiza-
cin en Ia clula. Para Ia tcnica de hibri-
dacin in situ se utiliza una sonda
(ing.
sonde, probe), formada por un cido nu-
cleico monocatenario con una secuencia
de bases conocida, complementaria de la
secuencia de bases
que
se desea demos-
trar. Las sondas son ploducidas en labora-
torios
(p. ej., mediante tcnicas de clona-
cin de genes, vase con mayor detalle en
el cap. 4) y se mrcan con un istopo ra-
diactivo
(para ser demostradas por ra-
dioautografa, vase la prxima seccin) o
con una ramificacin adosada, que permi-
te identificar la sonda mediante otras tc-
cAP r ut o
MToDos HtsroLctcos 4s
nicas, por ejemplo la inmunohistoqumi-
ca. Estas sondas varan en longitud, desde
10-15 bases hasta varios miles de bases.
Por ejemplo, si se desea demostrar la
existencia de determinada secuencia de
DNA en un cromosoma de las clulas de
un corte histolgico o en un preparado es-
peci al de cromosomas, pri mero se expone
el preparado a un pH elevado (bsico), que
induce la separacin de la doble cadena de
la molcula de DNA por desnaturaliza-
cin. Despus se agrega Ia sonda, que pue-
de poseer la secuencia complementaria de
DNA o de RNA. Una vez hibridada Ia son-
da con las zonas comolementarias del
DNA de los cromosomas-se transforma en
visible la localizacin en los ncleos celu-
lares, por ejemplo, mediante radioautogra-
fa o inmunohistoqumica.
Si se desea demostrar la oresencia de
mol cul as especfi cas de RNA, no se efec-
ta ningn tratamiento previo de los cor-
tes histolgicos con pH elevado, dado que
precisamente se desea que las cadenas do-
bl es de l as mol cul as de DNA no se seDa-
ren y, en consecuenci a, no se unan a l u
sonda. En este caso es suficiente incubar
Ios cortes de tejido con la sonda (despus
de una fijacin suave del tejido), que pue-
de contener una secuencia complementa-
ria de DNA o de RNA.
As, mediante Ia hibridacin rn sifu es
posible
demostrar las secuencias de ci-
dos nucleicos correspondiente a determi-
nados genes (vase
fi g. 4-36), adems de l a
expresin de determinados genes por la
demostraci n de Ia oresenci a de secuen-
cias especficas de RNA mensajero (mR-
NA).
Radioautograffa
Con esta tcnica es Dosible obtener in-
formacin directa respcto al sitio dentro
de Ia clula donde se sintetiza un produc-
to y los componentes qumicos que lo for-
man, adems de sus eventuales desplaza-
mientos dentro de Ia clula o hacii otras
Iocalizaciones del organismo, despus de
salir de la clula. Adems, es posible seguir
Ios desplazamientos de toda la clula y su
posterior destino en el organismo. Por lo
tanto, la radioautografa provee de infor-
macin referida a los aspectos dinmicos
de Ia morfologa de las clulos y los Lejidos.
La radioautografa se basa sobre dos
principios fundamentales: 1) la radiacin
ionizante tiene el mismo efecto sobre una
emulsin
fotogrfica
que la luz visible. 2)
Un precursor biolgico con marca radiac-
tiva, por ejemplo, un aminocido, tiene
exactamente iguales propiedades biolgi-
cas y destino metablico en el organismo
que la molcula correspondiente sin mar-
co. Por marca radiactiva se entiende oue
46 MTODOSHISTOLGICOS
un tomo de Ia molcula determinada es
rcemplazada por su istopo radiactivo co-
rcespondiente, por ejemplo el reemplazo
de hidrgeno por tritio
3H.
El proce dimienfo radioautogrfico pue-
de ser el siguiente, por ejemplo: en un ani-
mal de experimentacin se inyecta una
molcula de importancia biolgica marca-
da con un istopo radiactivo, por ejemplo
eH-leucina,
que interviene en la formacin
de varias
protenas.
Las molculas con
marca radctiva son integradas rpida-
mente a las macromolculas, que se pue-
den conservar en los cortes de teiido al ha-
cerlas insolubles por fijacin. Las molcu-
las inyectadas son solubles y se eliminan
por lavado durante Ia preparacin de los
cortes histolgicos, a menos que hayan si-
do incorporadas al producto de sntesis
macromolecular antes de ser sacrificado el
animal. Despus del montaje de los cortes
se les agrega en cmara oscura una capa
muy delgada de emulsin fotogrfica (cris-
tales de bromuro de
plata
en emulsin de
gelatina) (fig.
2-38). burante el posterior
perodo de exposicin, que puede durar
algunos das o semanas, de acuerdo al tra-
bajo experimental, desde los sitios radiac-
tivos del tejido se emiten partculas o ra-
yos gamma. Algunos de ellos atraviesan la
emulsin fotogrfica e inciden en los cris-
Fig. 2-38. Dibujo esquemtico de un preparado
radioautogrfico para uso en el microscopio
efectrnico. Parte superior. el preparado du-
rante la exposicin. Una partcula beta prove-
niente de un compuesto tritiado en el corte de
tejido ha incidido sobre un cristal de bromuro
de plata (grisado) de la emulsin fotogrfica su-
prayacente y generado una transformacin par-
cial de los iones plata del cristal en plata metli-
ca (presentado como una mancha negra arriba
a la izquierda del cristal). Parte inferior. el
pre-
parado tras el revelado y la fijacin. El cristal in-
cidido se ha transformado totalmente en grnu-
lo de plata metlica y se eliminaron los dems
cri st al es (no i nci di dos). (Segn Caro. )
B
t
o, 1t r
I
+
0,0,6F
Y
+
0,09rr

Gel ati n
Cristal
Corte o
Pelcula
-
Gelatin
Corte d
Pel cul
sostn
Grano de plata
CAP T I
F9, 2-39, Fotomicrografa de un preparado ra-
dioautogrfico para microscopia ptica de
tejido renal. En el animal vivo se inyect timidi-
na tritiada, que antes de ser sacrificado el ani-
mal se incoroor al DNA en todos los ncleos
celulares en fase de sntesis como paso previo
a la divisin celular. Los puntos negros repre-
sentan los grnulos de plata metlica y se loca-
l i zan en l os ncl eos de l as cl ul as marcadas
(ntese que, por lo general, las clulas total-
ment e desarrol l adas no se di vi den en l os t bu-
los renales,
pero
en este caso fueron estimula-
das experimentalmente
para la divisin). x870
(Cedi da por R Rasch
)
tales de bromuro de plata, que se transfor-
man entonces, en parte, de iones plata a
plata metlica. Despus de un perodo
prudencial de exposicin se aplica un re-
velador qumico que transforma todos los
cristales incididos por los rayos en plata
metlica. Por ltimo se eliminan todos los
cristales no incididos mediante una solu-
cin de tiosulfato (fiiacin fotogrfica). A
continuacin se nuede tratar el corte de Ia
misma manero- que cualquier otro, por
ejemplo teirlo de manera adecuada, con
oosterior deshidratacin e inclusin.
-
En I a observaci n con el mi croscopi o se
distinguen los granos de plata metlica
como pequeas manchas o puntos negros
en los sitios de Localizacin de la sustan-
cia radiactiva en el corte de teiido subva-
cent e
( f i g. 2- 39) .
El poder de resolucin, entendido como
la exactitud de la locaiizacin del istooo
radi act i vo, es de al rededor de I
l m
con-el
microscopio ptico, pero si se utiliza el mi-
croscopio electrnico
(fig.
2-a0) es posible
obtener un ooder de resolucin de alrede-
dor de 0,1
rm.
En las imgenes obtenidas
por microscopio electrnico a menudo los
grnulos ocultan varias estructuras y el es-
tudio ms exhaustivo de Ias radioautogra-
fas puede requerir un anfisrs estadstico.
EI mtodo slo demuestra sustancias
que se incluyen en los componentes tisu-
lares, mientras que el material marcado
se encuentra dentro del ors.anismo. Preci-
samente por ello es posibl obtener infor-
macin sobre las relaciones dinmicas de
los procesos metablicos. Una importante
Fig.2-40. lmagen de un preparado radioauto-
grfico de eritrocitos y reticulocitos (glbulos ro-
jos
inmaduros), captada con microscopio electr-
nico. Previo a la preparacin para la radioauto-
grafa para el microscopio elecfnico se incuba-
ron las cfulas n vitro con leucina tritiada; se ob-
serva gran cantidad de grnulos de plata por so-
bre un reticulocito (F), pero ninguno sobre los
dos eritrocitos (4. Esto se debe a que el reticu-
locito incorpor la leucina radiactiva durante la
incubacin, puesto que an es capaz de sintet-
zar hemoglobina (protena que requiere leucina),
mientras que los eritrocitos maduros han perdido
la capacidad de sntesis proterca. x80.000.(Cedi-
do en prstamo por A.B. Maunsbach.)
aplicacin de la radiautografa es el mor-
cado de los ncleos celulares
(fig.
2-39J,
tras el cual se puede seguir el desplaza-
miento y el destino de las clulas marca-
das dentro del organismo. Si, por ejemplo,
se inyecta timidina marcada con tritio
(que en el organismo se incluye como la
base timina en el DNA) en un feto, ser in-
cluido en el ncleo de todas las clulas
que sintetizaban DNA en el momento de
la inyeccin, como paso previo para la di-
visin celular. En la actualidad el mtodo
es muy importante para el estudio de la
histognesis
(el
desarrollo de las clulas
embrionarias indiferenciadas a clulas es-
peci al i zadas en un t ej i do).
Problemas en la interpretacin
de cortes de teiido
Por ltimo se vern algunas condicio-
nes que conviene recordar respecto de la
microscopia ptica prctica.
CAP T Ut O MToDosHIST)LGIcoS 47
Artificios. La palabra artificio significa
producto artificial y designa estructuras
del preparado que no existen en el tejido
vivo, pero que aparecen artificialmnte du-
rante el procedimiento de preparacin.
Algunos de los artificios ms comunes
sonla retraccin (fig. 2-41,a), que en mayor
o menor grado son una consecuenci a i nevi -
table de la preparacin habitual de los cor-
tes tisulares. La retraccin se oresenta en
I os t ei i dos como hendi duras u ri f i ci os va-
cos y sin estructuras (p. ej., no presentan,
como los caoilares. una cubierta endotelial
hacia el inteiior del espacio vaco). Los pre-
cipitados de colorante se observan como
cristales coloreados, a menudo ubicados
por encima del corte (fig. z-+tb). Los plega-
mientos se oueden formar en el momento
de la seccin o durante el posterior proce-
samiento de los delgados cortes
(h9.2-a1,c),
mientras que las imperfecciones de la cu-
chilla del micrtomo causan defectos en el
corte oue se visualizan como lneas rectas
que atiaviesan las estructuras biolgicas
(fig.
2-a1d). La rotura del tejido durante Ia
extraccin, por ejemplo debido a la pinza,
puede dar lugar a la formacin de groseras
variaciones dei aspecto de las clulas. Por
ltimo se debe nombrar Ia fiiacin dema-
siado ]enta o insuliciente como causa de
cortes de mala calidad, debido a la degene-
racin post mortem (vase con mayor deta-
lle en Ia seccin de lisosomas, en el cap. 3).
Interpretacin tridimensional de un
corte. Siempre se debe recordar que los
cortes de tejido representan una delgada
y, en principio, bidimensional rodaja de
un objeto tridimensional. En la figura2-42
se muestra cmo un corte seccionado a
travs del mismo objeto puede presentar
asoectos totalmente diferentes de los mis-
ms tipos celulares. Muchas estructuras
histolgicas son tubulares, y Ia figura 2-43
presenta el aspecto muy variable de dis-
tintos cortes transversales de la misma es-
tructura tubular.
Para establecer la forma tridimensional
correcta de un rgano o de una estructura
de gran tamano a menudo se realizan cofes
seriados, en los que se presentan sucesivas
secciones a travs de toda la estructura u r-
sano. Mediante el cuidadoso anlisis de Ias
ielaciones entre los cortes de toda la serie
es posible obtener una representacin ms
cierta de Ia conformacin espacial, en algu-
nos casos desous de construir un modelo
sobre la base e la serie de cortes. La infor-
macin obtenida en el anlisis tambin se
puede transferir a una computadora, capaz
de reconstruir un modelo tridimensional.
Aou termina Ia somera introduccin a
la microscopia prctica, recordando que
para el diagnstico es mrs importante
descubrir la estructura de las clulas y los
tejidos que los colores, dado que estos
oueden vari ar de una t cni ca a ot ra.
*
* f
b
#
o t
* !
s
\ s
_<_
Fi g. 2- 41. Es
crografas (a-r
coloreados cc
lina-eosina mr
ejemplos de
cios histolg
comunes. a r
pacros
como
(
cia de retracc
chas), mientre
b se observa
grande de co
bre el tejido (f
un ejemplo de
miento del cc
montado, mie
d muestra lnr
a muescas el
lla del micrl
(flechas).
48 MTODOSHISTOLGICOS CAPI T
Corte de 5
Um
que atraviesa
una cl ul a
de 15 pm
ffi---.
w
Fig.2-42. Dibulo esquemtico que muestra c-
mo un corte fino entre un grupo de clulas si-
milares puede presentar un aspecto totalmen-
te diferente cuando se observa el corte oor el
mi croscopi o. (Segn Ham. )
Fig.2-43. Este dibujo esquemtico muestra c-
mo cortes en distinta direccin a travs de
la misma estructura tubular oueden Dresentar
aspectos totalmente diferentes.
Cuestionario sobre mtodos histolgicos
1.
Qu
se entiende por poder de reso-
lucin?
2.
Qu
se entiende por aumento?
3.
Cul
es el mximo poder de resolu-
cin para el ojo a distancia normal
de lectura, los mejores microscopios
pticos y los mejores microscopios
electrnicos?
.
Qu
se entiende por in uivo e in vitro?
5.
Qu
es un clon celular, y qu es la
clonacin?
6, Intente explicar en pocas palabras el
mtodo de fraccionamiento celular
que utiliza la centrifugacin diferen-
cl al .
7.
Cul
es el obietivo de la fijacin de
los tejidos cuando se preparan cortes
histolgicos?
B.
Cul
es la importancia clnica de la
tcnica de cortes por congelacin?
9.
Qu
se entiende por cortes semifi-
nos y cul es su espesor?
10.
Cul
es el objetivo de usar mtodos
histolgicos?
11.
Qu
se entiende por acidofilia y ba-
sofilia?
12. Nombre un colorante metacromtico
y algunas sustancias tisulares que
presentan metacromasia.
13.
Cul
es el principio bsico del mto-
do de PAS y qu se demuestra con
l?
14.
Cul
es el principio bsico del mto-
do de Feulgen y qu demuestra espe-
cficamente?
15. Describa brevemente el principio b-
sico de un mtodo enzimohistoqu-
mico.
16. Intente explicar brevemente el prin-
cipio fundamental de un mtodo in-
munohistoqumico directo.
1,7.
Se
puede utilizar la inmunohisto-
qumica a nivel de microscopia elec-
trnica?
18.
Qu
sustancias se pueden demostrar
mediante la histoqumica con lecti-
nas?
19. Intente explicar brevemente el prin-
cipio fundamental de la hibridacin
in situ.
20.
Qu
se entiende por marca radiacti-
va de una molcula?
CAPI T UL O MToDoSHIST)LGIC)S 49
so trooos utsrotarcos cnp r