ANLISIS DE LOS PARMETROS CINTICOS PARA LA PRODUCCIN DE -

D-GALACTOSIDASA A PARTIR DE LACTOSUERO USANDO LA CEPA

KLUYVEROMYCES





DIXON ANDRS BALLESTEROS PARRA
JORGE LUIS GUTIRREZ NIO
JOSE ROBERTO RODRGUEZ PORTILLA
FAUSTO ENRIQUE RUEDA CORREA
CRISTIAN CAMILO VALDS OSMA




UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULDAD DE INGENIERAS FISICOQUMICAS
INGENIERA QUMICA
BUCARAMANGA
2014


ANLISIS DE LOS PARMETROS CINTICOS PARA LA PRODUCCIN DE -
D-GALACTOSIDASA A PARTIR DE LACTOSUERO USANDO LA CEPA
KLUYVEROMYCES


DIXON ANDRS BALLESTEROS PARRA
JORGE LUIS GUTIRREZ NIO
JOSE ROBERTO RODRGUEZ PORTILLA
FAUSTO ENRIQUE RUEDA CORREA
CRISTIAN CAMILO VALDS OSMA


Asignacin 3

Liliana del Pilar Castro Molano


UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULDAD DE INGENIERAS FISICOQUMICAS
INGENIERA QUMICA
BUCARAMANGA
2014
3

CONTENIDO

Pgina.


INTRODUCCIN ..................................................................................................... 7


1. MARCO TERICO ....................................................................................... 8

1.1. LACTOSUERO DEFINICIN Y COMPOSICIN .................................... 8

1.2. CEPA KLUYVEROMYCES ..................................................................... 9


2. EJERCICIO PROPUESTO .......................................................................... 10


3. DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS Y EFICIENCIA . 12




4. ANLISIS Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS ................................... 15



5. CONCLUSIONES ....................................................................................... 15


6. BIBLIOGRAFA .......................................................................................... 16

4

7. ANEXOS .................................................................................................... 17

7.1 CDIGO EN MATLAB 7.12.0 PARA EL AJUSTE POLINMICO PARA LOS
DATOS DE SUSTRATO, BIOMASA Y PRODUCTO ....................................... 17

7.2 COMPARACIN GRFICA DE LA DISTRIBUCIN DE DATOS
EXPERIMENTALES Y EL AJUSTE POLINMICO ......................................... 18



5

LISTA DE GRFICAS

Pgina.

Grfica 1. Ajuste polinmico y datos experimentales para la Biomasa .................. 18

Grfica 2. Ajuste polinmico y datos experimentales para el sustrato ................... 18

Grfica 3. Ajuste polinmico y datos experimentales para el producto .................. 19

Grfica 4. Ajuste polinmico y datos experimentales para para biomasa, sustrato y
producto ................................................................................................................. 19

6

LISTA DE FIGURAS

Pgina.

Figura 1. Cintica de crecimiento de Kluyveromyces en cultivo por lote alimentado
............................................................................................................................... 10

Figura 2. Cintica de consumo de lactosa por Kluyveromyces en cultivo por lote
alimentado ............................................................................................................. 11

Figura 3. Cintica de produccin de la enzima -D-galactosidasa por
Kluyveromyces en cultivo por lote alimentado ....................................................... 11
















7

INTRODUCCION

Los desechos de los procesos industriales son actualmente objeto de estudio para
investigadores de todo el mundo, ya que los problemas de contaminacin que
generan estos afectan la calidad de vida de la humanidad; por esta razn en la
actualidad se busca aprovechar al mximo cualquier subproducto.
A continuacin trataremos un subproducto muy abundante en la industria lctea,
analizndolo desde sus parmetros cinticos para vislumbrar una posible solucin
a la hora de tratarlo.
El lactosuero es un subproducto que representa aproximadamente el 85% del
volumen total de la leche procesada, este es generado en la fabricacin de quesos
y otros derivados lcteos. Tiene un alto contenido de nutrientes, lo cual hace que
sea de inters el posible aprovechamiento de estos, sin embargo, hasta el da de
hoy no se han desarrollado procesos a nivel industrial en el cual se trate de
manera adecuada este subproducto.
Actualmente un porcentaje bajo del lactosuero es usado para alimentar animales,
y el otro se desecha en caos o campos, generando as un problema ambiental
debido a su nivel de acidez, pues su pH se encuentra entre 5,1 y 5,6. Adems, el
vertimiento del lactosuero a las fuentes hdricas ocasiona una disminucin en la
cantidad de oxgeno disuelto, afectando los ecosistemas acuticos. Por otra parte
en los suelos producen una alteracin fsica y qumica debido al grado de acides,
lo que conlleva a la disminucin en la productividad agrcola.
Por lo anterior, es de suma importancia darle un tratamiento adecuado de tal
forma que se pueda aprovechar para obtener productos tiles y evitar la
contaminacin ambiental que genera ste.


8

1. MARCO TERICO

1.1. LACTOSUERO DEFINICIN Y COMPOSICIN
El suero de leche (lactosuero) es considerado como una gran fuente de lactosa y
otros nutrientes esenciales el cual puede ser utilizado como sustrato, adems que
es econmico y de gran disponibilidad. El lactosuero est definido como la
sustancia lquida obtenida por la separacin del cogulo de leche en la
elaboracin del queso (Foegeding y Lucky, 2002). Es un lquido translcido verde
obtenido de la leche despus de la precipitacin de la casena (Jelen, 2003).
Dependiendo de mtodo que se utilice para la coagulacin de la casena se puede
obtener dos tipos de lactosuero:
Si el mtodo se basa en la coagulacin por medio de la renina se dice que
el lactosuero obtenido por este procedimiento es dulce.
Su mtodo consiste en agregar cidos orgnicos o minerales para la
respectiva coagulacin se dice que el lactosuero obtenido por este
procedimiento es acido.
En la tabla 1 se puede detallar la composicin nutricional del lactosuero.
COMPONENTES LACTOSUERO DULCE
(g/L)
LACTOSUERO ACIDO
(g/L)
Slidos totales 63,0-70,0 63,0-70,0
Lactosa 46,0-52,0 44,0-46,0
Protenas 6,0-10,0 6,0-8,0
Calcio 0,4-0,6 1,2-1,6
Fosfatos 1,0-3,0 2,0-4,5
Lactato 2,0 6,4
Cloruros 1,1 1,1
Tabla 1. Composicin del Lactosuero dulce y cido. (Panesar et al., 2007)


9


1.2. CEPA KLUYVEROMYCES
Kluyveromyces es una levadura respiro-fermentativa, debido a que puede generar
energa a travs del ciclo del cido tricarboxlico, por fosforilacin oxidativa o por
fermentacin a etanol. Su principal caracterstica es la capacidad de asimilar
lactosa y el empleo de este azcar como fuente de carbono. Por esta razn, es
frecuentemente aislada de productos lcteos como leche, queso, yogurt y suero.
Posee estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) y QPS (Qualified
Presumption of Safety), es decir, se considera segura para su uso en la industria
de alimentos. Esta levadura presenta altas velocidades de crecimiento, capacidad
de producir enzimas intra y extracelulares y habilidad de crecer a temperaturas de
hasta 52 C.
Comercialmente la aplicacin ms importante es la produccin de enzimas
nativas: inulasa, pectinasa y -D-galactosidasa, enzima utilizada en las industrias
de alimentos y del sector farmacutico. Es capaz de hidrolizar la molcula de
lactosa en glucosa y galactosa, obtenindose un producto de mayor dulzor,
utilizado como edulcorante en repostera y panadera, entre otros. Su
incorporacin a la leche y otros productos lcteos incrementa la calidad de los
mismos al mejorar el sabor, previene los problemas por cristalizacin de la lactosa
y permite el consumo de stos por individuos intolerantes a la misma. Sin
embargo, los altos costos para la obtencin de esta enzima han limitado su
produccin. Adicionalmente, altas concentraciones de lactosa en el medio de
cultivo producen inhibicin del crecimiento y disminucin de la cantidad de enzima
producida en procesos por carga. El cultivo por lote alimentado ha sido utilizado
con xito para obtener cultivos de una alta densidad celular, con el propsito de
mejorar la productividad de las enzimas y otros metabolitos; permite obtener un
alto rendimiento en biomasa, previniendo la inhibicin por sustrato, ya que el
medio concentrado se puede agregar continuamente al biorreactor que contiene el
medio parcialmente fermentado, favoreciendo de este modo la dilucin del mismo.
10

2. EJERCICIO PROPUESTO

Debido a la gran cantidad de suero de leche que se produce en la elaboracin del
queso prensado, el cual contiene grandes cantidades de carbohidratos, protenas
y lpidos con una demanda biolgica de oxigeno (30000-40000) ppm, se considera
un subproducto potencialmente contaminante, por esta razn, se decide estudiar
la produccin de la -D-galactosidasa a partir de suero de leche usando como
cepa Kluyveromyces, el Cultivo por lote alimentado se utiliz un Bioflo de 5L,Se
comenz con una operacin por carga con (1.200 ml de lactosuero y 300 ml de
inculo) durante 7 horas, luego se inici la alimentacin de medio de cultivo fresco
durante 7 horas, hasta completar 3L. La alimentacin se adicion al reactor con un
flujo de 0,21 L/h utilizando una bomba peristltica, se tomaron muestras cada hora
y se analizaron determinando su contenido de biomasa, lactosa y actividad
enzimtica, para una concentracin de 4.7 % y 2.35 % de lactosuero se obtuvieron
los siguientes resultados:










Figura 1. Cintica de crecimiento de Kluyveromyces en cultivo por lote alimentado.

11










Figura 2. Cintica de consumo de lactosa por Kluyveromyces en cultivo por lote
alimentado.














Figura 3. Cintica de produccin de la enzima -D-galactosidasa por
Kluyveromyces en cultivo por lote alimentado.
12

Determinar:

m (1/h), Ks (kgS/m3), Yx/s (kgX/kgS) y Yp/s (mmoles (ONP/L) /kgS); para
una concentracin de 4.7% de lactosuero, usando el modelo de Monod



3. DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS Y EFICIENCIAS


Ecuaciones para el modelado del proceso:





Partiendo de la informacin suministrada por las grficas 1, 2 y 3; y usando la
herramienta Matlab 7.12.0 se pudo efectuar regresin no lineal polinmica a los
datos y as encontrar el polinomio que mejor se ajusta a los datos experimentales
(Los cdigos y bosquejos de los polinomios hallados se encuentran anexos al
final):
() = 1,40666 10
8

9
1,76988 10
6

8
+ 7,63516 10
5

7
1,62124 10
3

6
+ 1,87411 10
2

5
1,15284 10
1

4
+ 3,05551 10
1

3
4,82274
10
2

2
+ 3,70335 10
1
+ 2,83261
() = 4,01738 10
6

8
+ 1,97689 10
4

7
3,57716 10
3

6
+ 2,78366
10
2

5
7,54557 10
2

4
4,5419 10
4

3
+ 1,20168 10
1

2
7,9997 + 4,53077 10
1

13

() = 1,37255 10
4

8
+ 7,76342 10
3

7
1,78555 10
1

6
+ 2,13483
5
1,39091 10
1

4
+ 4,57282 10
1

3
5,62784 10
1

2
+ 54,0401
+ 1,04886 10
2

De esta manera, se puede plantear una ruta analtica para el clculo de los
parmetros:
Clculo de

:
Fijados
1
= 0 y
2
= 5 se plantea el siguiente sistema de ecuaciones:

1
= |

1
|

2
= |

2
|

2

Es decir:
3,70335 10
1
=

42,56445
42,56445 +

2,83261
6,24261 10
1
=

9,10194
9,10194 +

8,15507

Del anterior planteamiento puede proponerse un sistema de ecuaciones
lineales, de dos ecuaciones con dos incgnitas:
42,56445

0,1307398477

= 5,564869711
9,10194

0,07654882178

= 0,6967427829

El anterior sistema de ecuaciones, tiene como solucin:
{

= 0,5719188068 [
1
]

= 71,15080916 [/
3
]


Clculo de los rendimientos
/
y
/
:
Puede obtenerse el parmetro de la siguiente manera:
14

|
=3
= |
=3

Es decir:
90,33445 = 5,94928
= 15,18409

Ahora, puede plantearse el siguiente sistema de ecuaciones:

|
=0
= [
|
=0

/
+
15,18409

/
] |
=0

|
=10
= [
|
=10

/
+
15,18409

/
] |
=10


Lo que es igual a:
1,68632 = [
0,1307398477

/
+
15,18409

/
] 2,83261
4,89576 = [
0,07654882178

/
+
15,18409

/
] 7,88599

Reordenando el anterior sistema de ecuaciones se obtiene:
1,67975829 =

/

/
0,1307398477
/
+ 15,18409
/

1,610779532 =

/

/
0,07654882178
/
+ 15,18409
/


De lo anterior podemos obtener que:

/
=
25,50560105
/
0,219611343
/
=
24,45822138
/

/
0,1233032753


Despejando se obtiene que:
0,068978758
/
2
0,1466257574
/
= 0
15

Obtenindose que:
{

/
= 0,2125665374[/]

/
= 25,96433199[ (/)/]


4. ANLISIS Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS

De los resultados posteriormente hallados puede claramente verse la
concordancia de la prediccin terica con los datos recolectados
experimentalmente. As como el ajuste que estos modelos tericos tienen.
Es preciso aclarar que los rendimientos son en magnitud mayor a 1 por las
unidades que presentan.
Posibles fuentes de error en los clculos presentados pueden estar ligadas a que
para la resolucin de los modelos y por ende encontrar los parmetros cinticos y
las eficiencias se realiz un ajuste polinmico y no con una ecuacin que no
ofreciera un cien por ciento de fiabilidad, aunque como en los anexos puede
observarse, la aproximacin obtenida en cada caso es considerablemente buena.
La herramienta Matlab 7.12.0 fue fundamental para el desarrollo de esta
asignacin.

5. CONCLUSIONES

El lacto suero es fuente de lactosa y otros nutrientes esenciales; puede ser
utilizado como un sustrato econmico, ya que est fcilmente disponible
para el cultivo de clulas de microorganismos industriales capaces de
producir diferentes metabolitos y protena unicelular.
El cultivo por lotes representa una alternativa biotecnolgica para la
produccin de la -D-galactosidasa a partir de lacto suero.
16

El lacto suero sin diluir (4,7%) arroja una gran cantidad de densidad celular
en comparacin con una concentracin de 2,35% de sustrato.
La concentracin de lactosa en el suero tuvo un efecto significativo sobre la
cantidad de enzima obtenida y el rendimiento, ya que de ste depende en
gran medida la cintica de crecimiento microbiano.
Para modelar sistemas en los cuales haya formacin de producto, se hace
necesaria la utilizacin de herramientas de clculo que permitan solucionar
sistemas simultneos de ecuaciones diferenciales. debido a que no es
posible la linealizacin del modelo matemtico.
Es posible hallar los parmetros cinticos de crecimiento de Monod a partir
de herramientas de clculo y ajuste de datos experimentales como Matlab
7.12.0.


6. BIBLIOGRAFA
[1] PARRA. R. A., Lactosuero: importancia en la industria de los alimentos,
Revista facultad nacional de agronoma Medelln. Abril 2009, Vol. 62. no. 1,
p.4967-4982.
[2] PEZ, Gisela, PREZ, Aracelys, ARAUJO, Karelen, MRMOL, Zulay,
RINCON, Marisela. Efecto de la concentracin de lactosa sobre la produccin de
-D-galactosidasa a partir de Kluyveromyces marxianus ATCC 8554 en cultivo por
[3] lote alimentado. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa, 32 (1),
Junio 2012.





17

7. ANEXOS


7.1 CDIGO EN MATLAB 7.12.0 PARA EL AJUSTE POLINMICO PARA
LOS DATOS DE SUSTRATO, BIOMASA Y PRODUCTO.

clc
x=[0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]
t=linspace(0,14)
BiomasaExp=[17/6,47/14,4.5,83/14,51/7,49/6,8.5,8.62,25/3,97/12,8,53/7,533/7
0,527/70,7.6]
BiomasaAjuste=polyfit(x,BiomasaExp,9)
DatosBiomasaAjuste=polyval(BiomasaAjuste,t)
SustratoExp=[42.5,115/3,355/12,95/4,85/6,119/12,5,25/6,85/12,25/3,55/6,43/4,
119/12,121/12,25/2]
SustratoAjuste=polyfit(x,SustratoExp,8)
DatosSustratoAjuste=polyval(SustratoAjuste,t)
ProductoExp=[105,135,195,262,367,428,465,480,510,509,482,470,465,475,51
1]
ProductoAjuste=polyfit(x,ProductoExp,8)
DatosProductoAjuste=polyval(ProductoAjuste,t)
subplot(2,2,1), plot(x,BiomasaExp,'*b',t,DatosBiomasaAjuste,'r')
title('Ajuste polinmico y datos experimentales para la Biomasa')
xlabel('Tiempo [h]')
ylabel('Biomasa [kg/m^3]')
legend('Datos experimentales','Ajuste polinmico')
subplot(2,2,2), plot(x,SustratoExp,'*b',t,DatosSustratoAjuste,'r')
title('Ajuste polinmico y datos experimentales para el Sustrato')
xlabel('Tiempo [h]')
ylabel('Sustrato [kg/m^3]')
legend('Datos experimentales','Ajuste polinmico')
subplot(2,2,3), plot(x,ProductoExp,'*b',t,DatosProductoAjuste,'r')
title('Ajuste polinmico y datos experimentale para el Producto')
xlabel('Tiempo [h]')
ylabel('Producto [mmol ONP/L]')
legend('Datos experimentales','Ajuste polinmico')
subplot(2,2,4),
plot(t,DatosBiomasaAjuste,t,DatosSustratoAjuste,t,DatosProductoAjuste,x,Biom
asaExp,'*b',x,SustratoExp,'*g',x,ProductoExp,'*r')
title('Ajustes polinmicos para Biomasa,Sustrato y Producto')
xlabel('Tiempo [h]')
legend('Biomasa','Sustrato','Producto')
18

7.2 COMPARACIN GRFICA DE LA DISTRIBUCIN DE DATOS
EXPERIMENTALES Y EL AJUSTE POLINMICO.













Grfica 1. Ajuste polinmico y datos experimentales para la Biomasa












Grfica 2. Ajuste polinmico y datos experimentales para el sustrato
19












Grfica 3. Ajuste polinmico y datos experimentales para el producto












Grfica 4. Ajuste polinmico y datos experimentales para biomasa, sustrato y
producto