Qumica Biolgica para Farmacia y Medio Ambiente

Curso 2008
TRABA! "R#CT$C!% C&A'T$F$CAC$(' )* "R!T*+'A,
La determinacin de protenas que se realizar en el TP se har por dos mtodos: el
de Lowry.
M-todo de Brad.ord : (Bradord! ". #nal. Biochem.! $%:%&'! ()$*+! el mismo est
,asado en el cam,io de color del colorante -oomassie ,rilliant ,lue ./%01 en
respuesta a dierentes concentraciones de protenas. 2ste compuesto interacciona con
aminocidos ,sicos (especialmente ar3inina+ y aromticos. 2sta unin del colorante
con las protenas pro4oca un cam,io en el m5imo de a,sorcin del colorante desde
&*0 a 0)0 nm. Por lo tanto! este mtodo se ,asa en la propiedad del #zul Brillante de
-oomasie ./%01 de presentarse en dos ormas con colores dierentes! ro6o y azul. La
orma ro6a se con4ierte en azul cuando el colorante se une a la protena.
25perimentalmente se mide la dierencia de #,sor,ancias entre 0)0 y &*0 nm (0)0/
&*0nm+.
2structura qumica del colorante -oomassie ,rilliant ,lue ./%01.
#l3unas 4enta6as y7o des4enta6as del "todo
La intensidad de a,sorcin depende del contenido de aminocidos ,sicos y
aromticos.
2l comple6o colorante/protena tiene un alto coeiciente de e5tincin lo cual es
imprescindi,le para aumentar la sensi,ilidad en la medicin de protenas.
La unin colorante/protena es un proceso muy rpido (%min+ y el comple6o
permanece esta,le durante un tiempo relati4amente lar3o! una hora. 8aciendo
de este un proceso muy rpido! y que no requiere un tiempo crtico para el
ensayo.
9e pueden utilizar un 3ran n:mero de muestras (muy reproduci,le+ y es
adapta,le a la automatizacin.
Las intererencias o no e5isten o son mnimas por cationes tanto sodio como
potasio y car,ohidratos como la sacarosa. ;tras sustancias que interieren en
1
el ensayo son los a3entes uertemente alcalinos (cilmente soluciona,le con la
utilizacin de ,uers+. Los :nicos componentes encontrados que dan una
e5cesi4a intererencia en el color del ensayo! son altas concentraciones de
deter3entes como el 9<9! Triton =/(11! etc.
M-todo de /o0ry: (()0(+ es un mtodo colorimtrico de 4aloracin cuantitati4a de las
protenas.
Ba6o condiciones alcalinas el -u
>>
orma un comple6o con los enlaces peptdicos de las
protenas y se reduce a -u
>
. 2l -u
>
as como los 3rupos ? de Tirosina! Triptoano y
-isteina reaccionan con el reacti4o de @olin. 2ste reacti4o reacciona primero
produciendo un producto inesta,le que se reduce lentamente a azul de
moli,deno7tun3steno esta reaccin ocurre en medio cido.
-omentarios: aquellos a3entes que acidiican las soluciones (por e6emplo: cidos
uertes o ,uers+! los quelantes de -u (por e6. 2<T#+ o los reductores de -u (por e6.:
mercaptoetanol! ditiotreitol! enoles+ sern intererentes de la reaccin. Las protenas
producirn distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido
de Tyr y Trp.
)*,ARR!//! *1"*R$M*'TA/
2n el tra,a6o prctico usted realizar una cur4a de cali,racin con al3uno de los
mtodos anteriores y con el mismo determinar la concentracin proteica de una
muestra pro,lema.
A2 M3T!)! )* /!4R5
Preparacin de reacti4os
?eacti4o # A Ba
%
-;
C
%D P7E en Ba;8 1!(B.
?eacti4o B A -u9;
&
1.0D P7E en tartrato de sodio y potasio (D P7E.
?eacti4o - A 01 ml de # > ( ml de B.
?eacti4o < A @olin diluido al medio con 8
%
; ,idestilada (8-l 1!%B+
9olucin stocF de seroal,umina ,o4ina ( B9#+
2
9e prepara un patrn stocF de B9# pesando la misma y se lle4a a 4olumen con a3ua!
hasta o,tener una concentracin inal de (!1 m37ml.
Cur6a de calibracin: -ompletar la si3uiente ta,la antes de comenzar con el tra,a6o
e5perimental para la cur4a de cali,racin:
Tu,os -antidad de
protena (G3+
l de sol. 9tocF de B9# l de
8
%
;
l de
solucin -
l de
solucin <
(! % 1 011 01
C! & %0 011 01
0! * C1 011 01
$! ' &0 011 01
)!(1 01 011 01
Procedimiento e5perimental
(+ # (11 Gl de muestra a3re3ar 1!0 ml de solucin -.
%+ "ezclar ,ien e incu,ar (1 minutos a temperatura am,iente.
C+ #3re3ar 01 Gl de solucin <. 8omo3eneizar inmediata y 4i3orosamente en
4orte5.
&+ Hncu,ar C1 minutos a Temperatura am,iente! car3ar %01 l de cada tu,o en
microplaca y leer #,sor,acia a $11 nm.
&tili7ar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la
muestra problema8
B2M3T!)! )* BRA)F!R)
Preparacin del colorante
#zul Brillante de -oomasie ./%01 ((11m3+ es disuelto en 01 ml de etanol )0D. # esta
disolucin se le aIade (11ml de cido osrico '0D p74. La solucin resultante se
diluye lle4ndola hasta un litro de 4olumen inal. La concentracin en la disolucin inal
es 1!1(D p74 de azul! &!$D p74 de etanol y '!0 D p74 de cido osrico.
9olucin stocF de B9#
9e utilizar la misma que en el "todo de Lowry.
Cur6a de calibracin
2l ran3o lineal para este mtodo en microplaca es 1.10 m37ml a 1.0 m37ml
#/-alcule el 4olumen a utilizar del 9olucin stocF B9# para o,tener el si3uiente ran3o
de concentraciones: 1.% m37ml! 1.C m37ml! 1.0 m37ml. -omplete la si3uiente ta,la de
reerencia con lo calculado.
Tu,os (! % C! & 0! * $! '
-oncentracin
@inal (m37ml+
1!1 1!% 1!C 1!0
Eolumen de stocF
sol. B9#
Eolumen de 8
%
;
Eolumen inal (Gl+ (1 (1 (1 (1
3
B+ Procedimiento e5perimental
a+ #3re3ar %11 Gl del reacti4o Bradord diluido (70 a cada pocillo.
,+ -olocar (1 Gl de cada patrn (o de muestra+ en cada pocillo de una placa de )*
pocillos. (?ealizar duplicados para cada muestra+.
"ezclar cuidadosamente con la micropipeta e4itando la ormacin de ,ur,u6as.
c+ Hncu,ar a temperatura am,iente por lo menos 0 minutos (no ms de una hora! la
a,sor,ancia aumentar con el tiempo+.
d+ "edir la a,sor,ancia a 0)0/&*0 nm en un lector de microplacas.
&tili7ar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la
muestra problema8
C2,*M$'AR$!
(/.raicar la cur4a de cali,racin de B9#! #,sor,ancia (0)0/&*0 nm o $11 nm se3:n
corresponda+ 4s -oncentracin de B9# para cada mtodo.
%/Jtilizando la recta o,tenida! calcular la concentracin para cada muestra testeada.
C/.raicar adems para cada mtodo: una cur4a de #,sor,ancia a 0)0/&*0 nm 4s m3
de B9#.
&/-omparar los resultados o,tenidos con cada "todo.
4
&so de las pipetas autom9ticas
Las pipetas automticas son instrumentos delicados y
costosos! que de,en cuidarse dado que de ellos depende
3ran parte de nuestro tra,a6o. <ichas pipetas son muy
precisas si se las utiliza correctamente. 25isten 4arios tipos
de pipetas y cada marca pro4ee un 6ue3o para dierentes
ran3os de 4ol:menes. -ada pipeta est rotulada en el
m,olo y posee un color distinti4o! para su uncionamiento
la mayora tiene caractersticas anlo3as. # continuacin se e6empliican dos tipos de
pipetas.

Ante la menor duda: consulte antes de usar8 *s pre.erible preguntar lo mismo
6einte 6eces antes ;ue romper una pipeta8
Kue3o de pipetas tipo #
Jna pipeta rotulada "220 mide entre 2 l y 20 l8
Jna pipeta rotulada "2200 mide entre 20 l y 200 l8
Jna pipeta rotulada "2<000 mide entre 200 l y <8000 l 0:2 y
<:0 ml8
Kue3o de pipetas tipo B
Jna pipeta de botn ro=o mide con precisin entre < l y > l8
Jna pipeta de botn 6erde mide con precisin entre > l y >0 l8
Jna pipeta de botn marrn mide con precisin entre >0 l y 2>0 l8
Jna pipeta de botn a7ul mide con precisin entre 200 l y <8000 l
0:2 y <:0 ml8
Para poder tomar lquido con estas pipetas! de,en tener en su
e5tremos las puntas plsticas descarta,les (tips+! amarillas para P/
%1 y P/%11! y a7ules para P/(111.
#ntes de utilizar la pipeta ase3:rese conocer cmo i6ar el 4ol:men. La "220 mide
hasta la dcima de microlitro. 2n la P/%1 los dos n:meros superiores indican el
4olumen en microlitros! en tanto que el n:mero inerior es la cantidad raccional La "2
200 y "2<000 miden hasta el microlitro por lo tanto! el n:mero superior de la P/%11
nunca de,e superar el %.
Por e6emplo:

5
2n una p%1 equi4alen
a C!'ul
2n una p%11
equi4alen a C'ul
2n una p(111
equi4alen a C'1ul
?ecuerde que las micropipetas tienen dos topes! antes de tomar un 4olumen
solamente de,e ,a6ar hasta el primero! y cuando ,a6e el 4olumen h3alo hasta el
primer tope! en caso de que aun quede solucin en el tips puede ,a6ar hasta el
se3undo tope.
? '&'CA@
(/ 'unca orzar la pipeta por encima del 4olumen indicado por su nom,re. Bo mide
ms de lo esta,lecido y descali,rar o romper la pipeta.
%/ 'unca utilice la pipeta para medir un 4olumen menor a la dcima parte de su
nom,re. Bo es precisa.
C/ 'unca utilice una pipeta sin su punta (tips+ amarilla o azul.
&/ 'unca utilice la pipeta con soluciones cidas concentradas. Los 4apores pueden
o5idar las partes metlicas interiores de la pipeta.
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