DISCUSIN

En este estudio, se compar una seleccin de cyclotides aislados de O. affinis,

V. odorata, y V. tricolorcon respecto a su afinidad por membranas modelo y su toxicidad
contra eritrocitos de mamferos, bacterias y partculas de VIH. Todos los cyclotides
probadas eran especficos para las membranas que contienen PE-fosfolpidos en los otros
lpidos probados y causaron perturbaciones que eventualmente condujeron a la
membrana interrupciones. Su afinidad por membranas modelo correlacionados con
toxicidades de clulas enteras. Adems de proporcionar una comprensin fundamental de
las interacciones-cyclotide membrana, los resultados tienen el potencial de ayudar en el
diseo de cyclotides farmacuticamente activos para dirigirse a tipos celulares especficos
y por lo tanto mejorar las aplicaciones mdicas de cyclotides.
Todo Probado cyclotides selectivamente Target, INSERT INTO y permeabilizar las
membranas que contienen fosfolpidos PE-
La fluorescencia y estudios de SPR con membranas modelo revelaron que cyclotides son
capaces de unirse, insertar en, y romper las membranas de lpidos modelo por un
mecanismo dependiente del reconocimiento pptido-lpido inicial y subsiguientes
interacciones hidrofbicas. Especficamente, todos los cyclotides obligado a y se
permeabilizaron las membranas que contienen PE-fosfolpidos pero slo mostr muy dbil
unin a, o la permeabilizacin de las membranas carecen de PE. Fluidez de la membrana
se encontr para modular an ms la afinidad de unin; cyclotides tenan mayor afinidad
por las membranas que exhiben fases lquido-desordenadas o lquidos-ordenada que
para las fases slidas-ordenada, incluso cuando la misma proporcin de PE estaba
presente. Proponemos que la afinidad mejorada para las membranas de fluido refleja una
mayor capacidad de cyclotides para insertar en estas membranas en comparacin con las
membranas slidas.
La potencia hemoltica se correlaciona con cyclotide-unin a la membrana, de insercin, y
permeabilizacin
Ensayos hemolticos a 37 C mostraron que cyclotides interactan y se interrumpen los
glbulos rojos, con la eficiencia hemoltica con la siguiente orden: cyO2> KB2 ~ KB6> KB5
~ KB1> KB9> KB7> KB8>TCA.Esta tendencia est de acuerdo con estudios anteriores en
los que se examinaron unos cyclotides para otras actividades biolgicas ( 52 - 54 ). La
actividad hemoltica relativa se correlaciona con la tendencia de fugas relativa eficiencia
en POPC / POPE / membranas modelo Chol / SM ( . Fig. 10 ), consistente con la
capacidad de cyclotides para insertar en el ncleo hidrofbico y romper la membrana de
RBC, que incluye fosfolpidos de fosfatidilcolina, Chol, SM, y una pequea cantidad de
PE-fosfolpidos en el exterior prospecto ( 41 , 55 ).
Correlacin entre la actividad hemoltica y la eficiencia de fuga de vesculas. Se
muestra la correlacin entre la eficiencia relativa de fuga de POPC / POPE / Chol / SM
(17:10:33:40) y la actividad hemoltica de los cyclotides probados. LC y HC
50 50
se
normalizaron ...
Aunque los glbulos rojos slo tienen una pequea cantidad de fosfolpidos que contiene
PE-(~ 5%) expuestos en la cara externa ( 55 ), se encontr que esta cantidad fue
suficiente para facilitar la unin de KB1 modelar membranas, especialmente cuando Chol
est presente (vase . Fig. 5 A). Adems, parece que KB1 es capaz de inducir el
movimiento hacia el exterior de PE-fosfolpidos, exponiendo de esta manera ms de PE y
auto-promocin de su unin ( 21 ).
La desviacin de la linealidad para KB2 y cyO2 en la correlacin entre la fuga de la
membrana y la eficiencia hemoltica se muestra en la figura. 10 sugiere que, as como la
orientacin PE-fosfolpidos en los glbulos rojos, otros componentes de la membrana /
propiedades (por ejemplo, la asimetra de la membrana) no representados en el modelo
de POPC / POPE / Col / SM puede mejorar an ms la eficiencia hemoltica del
cyclotides.
La influencia de la fluidez de la membrana se demostr mediante ensayos de hemlisis a
4 C, donde la membrana celular es menos fluido que a 37 C ( 56 ), y todos los
cyclotides fueron incapaces de romper las membranas de glbulos rojos. De acuerdo con
estudios en membranas modelo en la fase slida ordenada, cyclotides tienen una baja
afinidad por membranas muy rgidas, incluso cuando PE-fosfolpidos son en la bicapa.
La importancia de la insercin en las membranas de los efectos biolgicos de cyclotides
se demostr adicionalmente mediante la comparacin de los D-ISMEROS L-Y. Aunque D-
KB1 ( 28 ) y D-KB2 estaban activos y tenan afinidad por membranas que contienen PE-,
eran menos hemoltica y tena correspondientemente menor afinidad por membranas
modelo que los cognados L-PPTIDOS. Como no hay diferencias en la carga,
hidrofobicidad, o estructura tridimensional (aparte de simetra de espejo) entre D-KB1 y el
enantimero nativo ( 28 ), la afinidad de membrana inferior para el D-ENANTIMEROS slo
puede explicarse por el quiral membrana medio ambiente. A medida que el grupo de
cabeza de PE no tiene un centro quiral, la preferencia quiral puede ser explicado por la
asimetra en el esqueleto de glicerol inmediatamente adyacente a la cadena de acilo
hidrfobo, el apoyo a la propuesta de que cyclotides insertar en membranas en lugar de
slo asociar libremente con la regin de grupo de cabeza.
Affinity unin a la membrana tambin se correlaciona con otros Bioactividades
Los estudios sobre la actividad hemoltica y modelo de membrana vinculante confirmaron
el papel del PE y la insercin de pptidos, sino que tambin estaban interesados en
determinar si la propuesta de mecanismo dependiente de unin a la membrana podra
explicar otras actividades biolgicas de cyclotides. Se examinaron las actividades
antimicrobianas y anti-VIH de cyclotides seleccionados. Estos pptidos pueden ser
cargadas en general positiva y por lo general tienen una alta afinidad por las membranas
externas de bacterias cargadas negativamente. Aunque a menudo se hace referencia en
la literatura como pptidos antimicrobianos, la mayora de cyclotides naturales no
coinciden con el perfil tpico de los pptidos antimicrobianos. De hecho, de los pptidos
incluidos en este estudio, cyO2 era el nico demostrado tener actividad antimicrobiana
significativa, de acuerdo con un informe anterior ( 26 ). Sin embargo, su actividad se limita
a las bacterias Gram-negativas, y su potencia antimicrobiana es inferior a su actividad
hemoltica, lo que sugiere que cyO2 tiene un valor limitado como agente antimicrobiano.
De E. coli posee una membrana externa con un lipopolisacrido (LPS) capa expuesta en
el prospecto exterior y un prospecto interior rico en fosfolpidos (PE- 57 ), pero este
prospecto interior slo es accesible despus de la superacin de la capa de LPS
aninico. La falta de actividad antimicrobiana potente de cyclotides est de acuerdo con
su falta de capacidad de dirigirse y romper las membranas cargadas negativamente en
ausencia de PE-fosfolpidos y con la incapacidad para apuntar LPS, como se muestra con
KB1 ( 21 ). cyO2 es la cyclotide ms cargado positivamente probado y el de mayor
afinidad por las membranas lipdicas, lo que explicara una mejor capacidad de dirigirse a
la capa de LPS y por lo tanto acceder al prospecto interior rica en PE para matar E. coli.
Bacterias Gram-positivas tienen una capa de peptidoglicano grueso como un caparazn
protector ( 57 ), lo que hace an ms difcil acceder a los PE-fosfolpidos situados en la
membrana citoplasmtica, lo que explica la falta de actividad de todos los cyclotides
probados contra S. aureus.
El efecto anti-VIH de KB1 fue recientemente demostrado que se correlaciona con su
capacidad para atacar y romper la membrana de la partcula del VIH ( 21 ), que es muy
rica en PE, Chol y SM ( 51 ).Cuanto mayor sea la actividad virucida de actividad KB2 e
inferior del TCA contra partculas de VIH, en relacin con KB1, sugieren un mecanismo
virucida del VIH similares, depende de la membrana viral focalizacin.
Importancia de la "BioactivePatch" y propiedades hidrofbicas en la superficie de
cyclotides para su unin a la membrana de afinidad y biolgicos Potencias
Desarrollar una interpretacin molecular ms detallada del mecanismo conservado
propuesto para bioactividadescyclotide (hemoltica, el VIH, los antimicrobianos, e
insecticida), nos centramos en las superficies moleculares de cyclotides. La potencia de
KB1 contra los glbulos rojos y clulas de insectos se ha demostrado que depende tanto
de un parche bioactivo y el parche hidrfobo en la superficie de esta molcula, como se
demuestra en una exploracin de Ala ( 58 ) y se confirma con un anlisis Lys ( 25 ).Ms
recientemente, se demostr que tanto la bioactivo y parches hidrfobos en la superficie de
KB1 se requieren para la orientacin de la membrana y la insercin ( 21 ), y cuando estos
parches estn en peligro KB1 carece de capacidad de las membranas objetivo y se
convierte en inactivo. Sobre la base de estudios de RMN ( 21 , 24 ), se determin que el
parche bioactivo est implicada en la orientacin especfica de los grupos de cabeza de
PE, mientras que se requiere el parche hidrfobo para la insercin en el ncleo
hidrofbico de la membrana.
Este mecanismo propuesto de la actividad sugerida para KB1 se extiende aqu y
demuestra que es comn a todos los cyclotides probadas. Debido a la extensa secuencia
de la variabilidad de cyclotides, no se espera que la misma especificidad y mecanismo de
accin, y la especificidad conservada para PE-fosfolpidos fue inicialmente
sorprendente. Sin embargo, . Fig. 11 muestra que el parche bioactivo est bien
conservado a travs de la familia cyclotide, coherente con l que es responsable de la
unin a la PE del grupo de cabeza no slo para KB1, pero tambin a travs de la familia
cyclotide. Aunque no estn directamente involucrados en el reconocimiento del grupo de
cabeza PE, el parche hidrfobo es tambin un requisito para la actividad de la membrana
de KB1 ( 21 ). Eso s, con diferentes tamaos y composiciones, todas las cyclotides en
este estudio tienen un parche hidrofbico.
Representacin superficial de cyclotidesseleccionados.Representaciones
superficiales de los cyclotides incluidos en este estudio se muestran en las dos vistas. La
"cara bioactivo" identificados previamente para KB1 ( 25 , 58 ) se muestra en rojo, es
decir, los residuos en bucle ...
Proponemos que las diferencias sutiles en los parches bioactivos e hidrfobos, as como
la ubicacin de los cargos sobre la superficie de cyclotides, pueden explicar las
tendencias observadas en la afinidad y los efectos inducidos en la estabilidad de la
membrana y potencia biolgica. Por ejemplo, KB1 y KB2 tienen los mismos residuos en el
parche bioactivo, pero la hidrofobicidad global de KB2 es mayor, lo que se correlaciona
con una mayor afinidad de unin de la membrana y la actividad hemoltica. Entre los
cyclotides probados, TCA tiene la afinidad por la membrana ms bajo, el ms dbil
eficiencia de fuga de vesculas, y es la cyclotide menos hemoltica; estas observaciones
se correlacionan con los residuos hidrfobos ser ms dispersa, en lugar de estar situado
en un solo parche, y tambin con la falta de una Arg / Lys en bucle 6, demostrado ser
importante para la actividad de KB1 ( 58 ). En el otro extremo, cyO2 tiene la ms alta
afinidad por la membrana, de alta eficiencia de fuga, e induce ms desestabilizacin de la
membrana de superficie que cualquier otro cyclotide, en correlacin con la actividad
hemoltica ms alto entre los cyclotides probados. CyO2 tiene su bioactivo y parches
hidrofbicos cerca entre s, pero tambin tiene dos residuos de Lys ubicados en una parte
distinta de la molcula que se pueden establecer contactos adicionales (por
ejemplo, puntos de atraccin electrosttica o H-bonos) con grupos de cabeza de
fosfolpidos.
El parche bioactivo se centra en un residuo Glu conservado en el circuito 1, y proponemos
que la geometra de este parche facilita una interaccin inica entre el grupo de amonio
del PE y el carboxilato del Glu. Adems, la cadena lateral de la Lys / Arg en bucle 6 puede
establecer una interaccin con el grupo PE-fosfato. Las cadenas laterales hidrfobas que
sobresalen de cyclotides son propensos a estabilizar las interacciones pptido-membrana
por interacciones pptido membrana no especficos adicionales con la regin del ncleo
hidrfobo. Un mecanismo de unin a la membrana propuesto se muestra en la figura. 12 ,
destacando las interacciones inicas iniciales con PE seguido de insercin en la
membrana.
Representacin esquemtica del mecanismo propuesto para la interaccin de
cyclotides con bicapas de lpidos. La interaccin de cyclotides con la membrana lipdica
se inicia por la orientacin PE-fosfolpidos, seguido por la insercin en la membrana
lipdica. KB1 es ...
La importancia del parche bioactivo y del residuo Glu en particular, para el reconocimiento
de la PE grupo de cabeza se apoya en estudios sobre origen natural KB12 y un mutante
kB1_E7D sinttica;ambos pptidos tienen un Asp en lugar del Glu y son
sorprendentemente inactivo contra los glbulos rojos ( 59 ). A pesar de que tienen la
misma estructura general y enzimtica y la estabilidad trmica como KB1, KB12 y
kB1_E7D tener actividad insignificante hemoltica ( 59 ), que se correlaciona con la
incapacidad de kB1_E7D para unirse a PE-fosfolpidos en las membranas ( 21 ). Los
estudios realizados por Gransson y compaeros de trabajo ( 60 ), en la que el residuo de
Glu de cyO2 se modific qumicamente por esterificacin, apoyan an ms la importancia
del residuo Glu para el reconocimiento de grupos de cabeza de PE. Modificacin del
residuo Glu caus una disminucin de 48 veces en la potencia citotxica de cyO2
( 60 ). Una correlacin entre la citotoxicidad y la capacidad para reconocer grupos de
cabeza de PE se muestra por una 50 veces ms potentes contra la fuga de las
membranas de PE-rica (es decir, E. coli extracto de lpido polar que tiene una relacin en
peso de PE-fosfolpidos ~ 67%) que en contra de PE- que carecen de membranas (es
decir, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina / 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato mezcla)
( 61 ). Sin embargo, esterificados cyO2 no distingue entre que contiene PE-y las
membranas lipdicas de PE-existen ( 61 ). En general, los cyclotides modificados y KB12
nativos muestran que el residuo Glu es esencial para los efectos biolgicos de cyclotides,
consistentes con un papel propuesto en el PE de orientacin.
Como se ha sealado en la introduccin, cyclotides pertenecientes a la subfamilia de
inhibidor de tripsina se distinguen de los de Mbius y cyclotides pulsera, no slo por su
falta de homologa de secuencia, sino tambin por bioactividades distintas. En particular,
MCoTI-II no es citotxica y no se une a membranas modelo ( 62 ). Estos datos apoyan la
idea de que la subfamilia de inhibidor de tripsina es distinta de las otras dos subfamilias y,
en particular, carece de la parche bioactivo y un parche hidrfobo en su superficie. Por lo
tanto, hacemos hincapi en que los resultados aqu en relacin con un mecanismo de
accin comn slo se aplican al Mbius y subfamilias cyclotide pulsera.
Cinamicina y duramicina son dos pptidos lantibiticos producidos por bacterias Gram-
positivas tambin informado que tienen especificidad para PE-fosfolpidos ( 63 ). Adems
de PE grupo de cabeza de reconocimiento, se requieren interacciones hidrfobas con las
cadenas acilo de fosfolpidos de membrana eficiente focalizacin ( 64 ). Cinamicina y
duramicina poseen un bolsillo de unin que se ajusta a un grupo de cabeza de PE, y la
unin se estabiliza mediante una interaccin de par de iones entre el grupo amonio de PE
y el carboxilato de Asp-15. Una cadena lateral de Phe estabiliza la membrana pptido de
unin por anclaje para el ncleo hidrofbico de la bicapa de la membrana ( 63 ).Los
modos de unin a membranas de estas lantibiticos tienen similitudes con el modo de
unin cyclotide-membrana, como la unin a headgroup PE y las interacciones
hidrofbicas son a la vez necesario.
Cyclotides, una nueva familia de protenas de unin a lpidos
El hecho de que cyclotides, ya sea aisladas de las mismas especies de plantas y que
pertenecen a la misma subfamilia (por ejemplo, KB1 y KB2 a partir deO. affinis) o de
mltiples especies y pertenecientes a diferentes subfamilias (por ejemplo KB2 a partir
deO. affinis frente cyO2 de V. odorata ), reconocer especficamente un grupo de cabeza
de fosfolpidos, se le solicita la sugerencia de que ahora se pueden clasificar como una
nueva familia de protenas de unin a lpidos. Hay muchos dominios de unin a lpidos
conservadas en el proteoma eucariota, en particular en las protenas implicadas en la
transduccin de seal y en el trfico de membrana ( 65 ). Una comparacin de diferentes
dominios de unin de lpidos-revela que todos ellos tienen un bolsillo para el
reconocimiento de un grupo de cabeza de lpidos nica, para los que las interacciones
electrostticas son importantes, y en algunos casos se requiere la membrana que rodea
los contactos adicionales, que es modulada por un hidrfobo parche que se inserta en el
ncleo de membrana ( 65 ). Estas caractersticas son consistentes con cyclotides que
tiene un parche en su superficie que reconoce grupos de cabeza de PE y la parte
hidrfoba de la molcula de la insercin en y causando la desestabilizacin de la
membrana. Una protena de unin de PE-(PEBP) de la familia, un grupo evolutivamente
conservados de las protenas que se produce en todos los grupos taxonmicos de las
bacterias a las plantas y los animales, se ha identificado ( 66 ); aunque cyclotides no se
parecen a los miembros PEBP (normalmente protenas ~ 25 kDa en tamao), puede ser
que tengan funciones comunales. Curiosamente, las protenas que pertenecen a los
miembros de la familia PEBP expresan en plantas parecen regular la transicin de la
vegetativa a la fase reproductiva y estn implicados en la modulacin de la arquitectura de
la planta y la floracin ( 66 ). Sorprendentemente, se ha demostrado que dos miembros
PEBP con alta homologa que tienen funciones opuestas en Arabidopsisthaliana; uno de
ellos se activa la floracin y el otro reprime, y sus actividades pueden ser intercambiados
por el intercambio de un solo aminocido ( 67 , 68).
Aqu, mostramos que Mbius y cyclotides pulsera, adems de contar con una estructura
tridimensional comunal, tienen otra caracterstica comn, a saber, la unin especfica de
los lpidos. El papel fisiolgico de cyclotides ha sido sugerido para ser como agentes
insecticidas ( 69 ) con un modo de accin que implica disrupcin de la membrana ( 70 ), y
esto es consistente con mltiples cyclotides tener el reconocimiento comn de los
lpidos. La observacin de que una planta produce muchos cyclotides es desconcertante a
la luz de estos resultados si la actividad insecticida es la nica funcin de cyclotides. Por
lo tanto, los resultados respaldan la idea de que cyclotides probablemente tambin tienen
otros, an no descubiertos, funciones.
Cyclotides modificados sintticamente han sido diseados con varias funciones
introducidas relevantes en el diseo de frmacos. Algunas de estas aplicaciones de
cyclotides para el diseo de frmacos podran beneficiarse de los nuevos conocimientos
se inform aqu sobre sus propiedades de unin de PE-. PE-fosfolpidos tienen un papel
fundamental en la estructura de la membrana y la funcin ( 71 ). Aunque se encuentra
principalmente en el prospecto interior en una clula de mamfero tpico, PE-fosfolpidos
estn ms ampliamente exteriorizados y / o sobreexpresa en clulas apoptticas ( 72 ) y
tambin en la superficie del endotelio vascular del tumor ( 73 ). De hecho, el PE ha sido
sugerido como un amplio marcador tumoral comn a muchas enfermedades malignas
( 73 ). Por lo tanto, cyclotides tienen aplicacin potencial como herramientas para formar
imgenes de tumores, como se observa con otros pptidos de unin de PE-tales como
duramicina y cinamicina ( 73 ). Una ventaja de usar cyclotides ms de estas molculas es
que adems de ser herramientas para dirigirse a las clulas de PE-rico, que tambin se
pueden utilizar como andamios para el suministro intracelular ( 62 , 74 ) de eptopos
activos en base a su susceptibilidad a la sntesis qumica.