INSTITUTO TECNOLGICO DE

CELAYA
DEPARTAMENTO DE INGENIERA
BIOQUMICA


Manual de
Prcticas de laboratorio
de
Bioqumica
(COMPETENCIAS)










PRCTICA 1
OBTENCIN DE CIDOS NUCLICOS

OBJETIVO
Demostrar la presencia de cidos nucleicos en la levadura.

INTRODUCCIN
Los cidos nucleicos son polmeros de elevado peso molecular formados
por nucletidos. Los nucletidos son esteres que se forman por accin del
cido fosfrico sobre un nuclesido, que a su vez, est constituido por la unin
de una pentosa con una base aminada.
Se consideran dos clases de cidos nuclicos: los ADN y los ARN, los cuales
tienen a su cargo la transmisin de la informacin gentica y la sntesis de
protenas, respectivamente.
Una de las diferencias entre los nucletidos que forman uno y otro tipo de
cidos, radica en la pentosa que sirve de soporte a las bases y al cido
fosfrico. Los ADN tienen como azcar a la D-2-desoxirribosa y los ARN a la D-
ribosa.
Los ARN pueden ser hidrolizados por los lcalis y esta labilidad es til para su
deteccin en los procesos analticos. La identificacin de la presencia de una
pentosa, confirma el diagnstico.
En esta prctica se efectuarn ambas experiencias.

MATERIALES

REACTIVOS
1 Agitador
1 Embudo
1 Embudo Buchner
2 Matraces Erlenmeyer de 125 ml
1 Matraz Kitazato
1 placa de calentamiento
1 Pipeta de 5 ml
1 Pipeta de 10 ml
4 Tubos Falcon
2 Vasos de precipitado de 250 ml
1 Tubo de ensaye
Algodn
HCl conc. 4-5 ml
Cloruro frrico al 10% 5 ml
Etanol 10 ml
NaOH al 30% 7 ml
Papel filtro
Reactivo de Bial
Tierra de diatomeas
Barra de levadura (alumno)
Gasa




METODOLOGA
1. EXTRACCIN DE CIDOS NUCLICOS
Pese 5g de levadura seca. Colquela en un vaso de precipitado,
agregue 7 ml de NaOH al 30% y agite con una varilla hasta obtener una
mezcla homognea.
Agregue 5 ml de agua y homogenice la mezcla.
Aada 5 ml de solucin de cloruro frrico y mezcle.
Filtre la mezcla empleando gasa como medio de filtracin y reciba el
lquido en un vaso de precipitado. Lave el residuo que queda retenido en
la gasa con 15 ml de agua. El residuo se desecha.
El lquido se seca por succin en un embudo Buchner previamente
acondicionado con ayudante de filtracin. Inmediatamente lave el
residuo con 5 ml de agua.

NOTA: El ayudante de filtracin es un material polvoriento que se esparce
sobre el papel filtro que se aplica al embudo Buchner.

Aada al filtrado 10 ml de etanol y despus agregue HCl concentrado
gota a gota. Cada vez que agregue una gota de HCl, mezcle
perfectamente con el agitador, tome una gota y colquelo sobre un
pedazo de papel indicador. Suspenda la adicin de HCl cuando el pH
sea cido. La acidificacin del lquido filtrado hace que se precipite el
cido nuiclico.
Pese cuatro tubos de ensaye, limpios y secos. Anote el peso.
Para concentrar el precipitado formado, distribuya el contenido del
matraz en los 4 tubos Falcon y centrifugue por 5 minutos.
Decante perfectamente el lquido sobrenadante y pese los tubos.
Obtenga el rendimiento por diferencia de pesadas y reprtelo.


2. REACCIN DE BIAL (IDENTIFICACIN DE PENTOSAS)
Ponga 15 gotas del reactivo de Bial a uno de los tubos y agregue 4 o 5
ml de HCl concentrado, mezcle por agitacin pendular.
Tape el tubo de ensaye con un algodn e introdzcalo en agua hirviendo
por 3 minutos. Una coloracin verde azulada o verde olivo indica que la
reaccin es positiva. Reporte el resultado.


CUESTIONARIO
1. Cules son las partes que constituyen un nucletido simple?
2. Qu diferencia hay entre nuclesido y nucletido? Ejemplifique.
3. Mencione las funciones ms importantes del DNA y RNA.
4. Todo tipo de organismo contiene ambos tipos de cidos nuclicos.
Explique su respuesta.


PRCTICA 2
PROTENAS

OBJETIVO
Identificar mediante la realizacin de reacciones qumicas, algunos
componentes de la manera viva.

INTRODUCCIN
La constitucin qumica de los seres vivos es muy compleja, pero
bsicamente en su composicin entran compuestos orgnicos pertenecientes a
los hidratos de carbono, lpidos y protenas. Los tres tipos de compuestos
desempean funciones de energticos, constitutivos de sustancias ms
complejas y son componentes de las diversas estructuras que conforman a las
clulas.
En la presente prctica, se harn pruebas de identificacin como manera de
corroborar la presencia de protenas en los seres vivos y sus productos.

MATERIALES

REACTIVOS
1 Gradilla
1 Placa de calentamiento
1 Pinzas para tubo
3 Tubos de ensaye
1 Vaso de precipitado de 250 ml.
Hidrxido de sodio al 10% y 30%
1mlc/u
Sulfato de cobre (II) al 1%
Reactivo de Hopkins 1ml
cido ntrico concentrado 0.5ml
cido sulfrico concentrado 3ml
Solucin problema


METODOLOGA

1. DETERMINACIN DE ENLACES PEPTDICOS
a) En un tubo de ensaye mezcle 1ml de solucin problema con 1 ml
NaOH al 10%. Agite con movimiento pendular y aada gota a gota
sulfato cprico (mximo 20 gotas).
La aparicin de una coloracin rosa violeta, indica que la prueba es
positiva.



2. IDENTIFICACIN DE MATERIA PROTEICA (REACCIN
XANOPROTEICA)
a) A un ml de solucin problema adale lentamente 0.5 ml de cido
ntrico concentrado.
b) Calienta y deja enfriar la solucin. Una vez fra, aada gota a gota
una solucin de hidrxido de sodio al 30% (mximo 20 gotas).

Las protenas producen con el cido ntrico un marcado color amarillo
que pasa a anaranjado con el hidrxido de sodio, esta reaccin acusa la
presencia de los aminocidos fenilalanina, tirosina y triptfano.



3. IDENTIFICACIN DE PROTENAS EN GENERAL
a) Ponga un ml de reactivo de Hopkins en un tubo de ensaye, aada 1
ml de solucin problema y mezcle por movimiento pendular. Incline el
tubo ligeramente y aada 3 ml de cido sulfrico concentrado,
hacindolo resbalar por las paredes lentamente. Vuelva a agitar para
que las sustancias se mezclen y deje reposar por 1 minuto.

La aparicin de una coloracin violeta (reaccin de triptfano) indica
que la reaccin es positiva.






CUESTIONARIO


1. Por qu es importante conocer la secuencia de los aminocidos de una
protena?

2. Qu es una protena simple y una conjugada?

3. De qu est formado un enlace peptdico?









PRCTICA 3
COFACTORES E INHIBIDORES

OBJETIVO
Preparacin y actividad de deshidrogenasas, as como de cofactores y
presencia de inhibidores, a partir de fuentes naturales.

INTRODUCCIN
Todas las manifestaciones requieren energa la cual se obtiene por la oxidacin
gradual de los alimentos, ya que los diferentes procesos de oxidorreduccin se
dan en una transferencia de energa por diferencias en el potencial elctrico. El
sistema de un potencial elevado oxida al de ms bajo potencial con la
consiguiente liberacin de energa para las necesidades vitales.
En todas las reacciones de oxidorreduccin hay transferencia de electrones.
Por tanto la oxidacin y reduccin son fenmenos que se realizan en forma
simultnea. En muchas reacciones de oxidoreduccin de la clula tambin hay
transferencia de hidrgenos.
La oxidacin biolgica implica la transferencia de hidrgenos y de electrones a
travs de una serie de transportadores de electrones de la cadena respiratoria
que actan como intermediarios para llegar al aceptor final de electrones que
es el oxgeno molecular. El proceso oxidativo se inicia por la accin de
deshidrogenasas especficas que no reacciona directamente con el oxgeno,
sino que requieren de intermediarios como NAO, flavoprotenas y familia de
citocromos. En la presente prctica se realizar el estudio de las
deshidrogenasas y de dos oxidasas que actan como intermediarios en el
transporte de electrones.

ATENCIN: Cuando se trabaja con soluciones de KCN debern hacerla con
mucho cuidado de no pipetear y evitar el contacto con la piel.

PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIN DEL SISTEMA DESHIDROGENASA LCTICA-NAD

Preparacin de la coenzima.
De la pierna de pollo obtener 10 g del msculo y cortarlo en fragmentos
pequeos y colocarlos en un vaso con agua destilada, en una proporcin de 8
ml de agua por gramo de msculo, dicho vaso estar en un bao Mara a
ebullicin durante 5 minutos. Despus de este tiempo pasar la preparacin a un
mortero con arena y moler perfectamente hasta que las fibras hayan
desaparecido. Esta preparacin se pasar a tubos de centrfuga, la cual se
centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos. Despus de esto el sobrenadante
de todos y cada uno de los tubos se pasar a un matraz etiquetado como
COENZIMA.
Preparacin de la enzima
Pesar 10 g del msculo de la pierna de pollo y agregar 10 ml de NaCl al 0.9%
por gramo de msculo. Colocar lo anterior en un mortero, el cual deber estar
en un bao de hielo. Con ayuda de arena esta preparacin se moler hasta
obtener una muestra casi sin fibras. Despus se dejar reposar 30 minutos en
el mortero sobre el bao de hielo.
Pasado este tiempo la preparacin se pasar a tubos de centrfuga para ser
centrifugados a 3000 rpm durante 15 minutos pasar el sobrenadante a un
matraz marcado como DESHIDROGENASA LCTICA (LDH).

MATERIALES

REACTIVOS
1 mortero con mano NaCl 0.9%
Pipetas de 1, 5 y 10 ml Na2HPO
3
0.06 M
14 tubos de ensaye KCN 0.01%
12 tubos de centrfuga Lactato de sodio 1%
3 vasos de precipitado de 300 ml Azul de metileno 0.002 M
3 matraces Erlenmeyer de 250 ml Ac. Succnico 0.1 M
1 bao Mara Ac. Malnico 0.01 M
1 gradilla 2,6 diclorofenol indofenol 0.1%
1 agitador Nugol (aceite mineral) (alumno)
Cuchillo (alumno) Corazn de pollo (alumno)
Pierna de pollo (alumno)
Hielo (alumno)
B. PREPARACIN DE LAS DESHIDROGENASAS SUCCINA Y
CITOCROMOS
Del corazn de pollo cortarlo en fragmentos pequeos, pesarlo(s) y colocarlo
en un vaso que contenga Na
2
HPO
3
se usarn 8 ml por gramo de corazn.
Dicha mezcla se moler en mortero que contenga arena para que ayude a
moler muy bien el corazn. El mortero deber de estar en un bao de hielo,
cuando se haya terminado el molido la mezcla se deja reposar 30 minutos en
un bao de hielo, con agitacin ocasional, pasado este tiempo la preparacin
deber ser centrifugada a 3000rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se
colocar en un matraz etiquetado como DESHIDROGENASA SUCCNICA
(SDH).

C. DETERMINACIN DE ACTIVIDADES
Mientras se obtienen los sistemas enzimticos preparar los tubos segn se
indica en cada tabla, para as determinar las actividades enzimticas.
Mezclar bien todos los tubos por agitacin y agregar a todos los tubos un ml de
nugol (aceite de cocina).
Incubar en bao Mara a 37C durante 1 hora haciendo observaciones cada 10
minutos.
Anote todos los cambios observados por grados de decoloracin.

DESHIDROGENASA SUCCNICA
TUBO (ml) 1 2 3 4
Ac. Succnico 0.1 M 0.5 0.5 0.5 0.5
Azul de metileno
0.002 M
0.3 0.3 0.3 0.3
Ac. Malnico 0.1 M 0 1 0 1
Agua destilada 1.5 0.5 3.5 1.5
Sobrenadante SDH 2 2 0 1

Mezclar bien los tubos y aadir a todos los tubos 1 ml de nugol. Incubar a 37C
durante 1 hora, haciendo observaciones cada 10 minutos, anote todo cambio
observado como grados de decoloracin.

TUBO (ml) 1 2 3 4 5
KCN 0.01% 0 0 0 0 1
Lactato de sodio 1% 1 1 0 1 1
Azul de metileno 0.002 M 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Agua destilada 2 1 2 2 0
Sobrenadante coenzima 0 1 1 1 1
Sobrenadante (LDH) 1 1 1 0 1
CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA
TUBO (ml) 1 2 3 4 5
KCN 0.01% 0 1 0 0 1
2,6 diclorofenol
indofenol 1%
1 1 1 1 1
Alfa naftol 0.15% 0 0 0 0.1 0.1
Agua destilada 1.1 0.1 2.1 1 1
Sobrenadante SDH 1 1 0 1 0

Incubar a 37C los tubos con agitacin ocasional durante 30 minutos, anotar
cualquier cambio en coloracin en los tubos.

REPORTE
1. Escriba las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los tubos
indicando por qu si o por qu no se realiza la reaccin.
2. Para reportar el cambio de coloracin en cada uno de los experimentos
haga un cuadro donde indique con O la falta de decoloracin y con X el
grado de coloracin, segn sea el tiempo que se observ cada tubo.

CUESTIONARIO
1. Investigue qu tipo de reaccin realiza cada una de las enzimas que se
utiliza en este experimento.
2. Por qu se utiliza azul de metileno en estos experimentos?
3. Por qu los experimentos en sta prctica se realizan a 37C?
4. Investigue por qu la COENZIMA, el LDH y la SDH se obtienen del
msculo de la pierna de pollo, as como del corazn de pollo.











PRCTICA 4
CATALASA

OBJETIVO
Conocimiento de la actividad de la catalasa sobre el perxido de hidrgeno.

INTODUCCIN
Las catalasas son enzimas que catalizan la descomposicin del perxido de
hidrgeno por accin de las oxigenasas.
Las peroxidasas catalizan la reaccin en la cual el hidrgeno del perxido es el
aceptor de electrones. De ese modo la peroxidasa transfiere el hidrgeno
como se muestra en la reaccin.
AH
2
+ H
2
O A + 2H
2
O
Posee una alta especificidad por su sustrato, ya que, acta solamente sobre el
perxido de hidrgeno.
Dicha enzima se encuentra ampliamente distribuida en casi todas las clulas
vivas, es muy abundante en la sangre y en el hgado.

MATERIALES

2 vasos de precipitado de 250 ml
1 bureta
1 bao Mara
1 pinzas para bureta
1 agitador
1 lanceta estril
6 matraces Erlenmeyer de 125 ml
REACTIVOS

Amortiguadores de fosfatos de 0.02
M y pH 7
H
2
O
2
al 0.05 M en amortiguador de
fosfatos
KCN 0.005

M
KMnO
4
6 N
Hielo (alumno)
Pipetas de 0.5, 1 y 5 ml
1 placa de calentamiento

PROCEDIMIENTO
Se utiliza como fuente de enzima una dilucin de sangre fresca de 1:1000. Se
colocan 10 ml de agua destilada fra en un matraz Erlenmeyer rodeado de hielo
picado.
Se toma una muestra de sangre fresca a travs de la puncin que se hace en la
yema del debo mediante una lanceta estril. Se dejan caer unas 3 o 4 gotas de
sangre sobre el agua fra en el matraz.
Se aspira el agua con la pipeta varias veces para asegurarse que toda el agua
tenga la misma concentracin de sangre. Nuevamente se agita el matraz para
obtener una mezcla homognea.
Dicho matraz con la sangre ya diluida se mantiene en el bao de hielo a baja
temperatura, mientras se preparan los 5 matraces segn se indica en la tabla,
pero antes de ser preparados deber leer las siguientes indicaciones.
El matraz 1 representa la cantidad de H
2
O
2
que se aade a cada matraz, es por
eso que en este matraz se aadir primero con 2 ml de H
2
O
2
al 0.05 M.
En los matraces 2 al 5 la reaccin se detendr 5 minutos, es decir, ya preparados
los matraces como se indica en la tabla incluyendo la enzima, se esperan 5
minutos, y luego se adicionar los 2 ml de cido sulfrico 6 N.
Enseguida se determinar la titulacin del H
2
O
2
con el permanganato de potasio
0.005 M. La primera gota de permanganato en exceso vuelven rosa a la solucin
que se tiene en el matraz, sta ser la que se tome como referencia cuando ya
permanezca constante el color.
El H
2
O
2
que no fue descompuesto por la catalasa permanece estable en la
solucin cida slo media hora aprox., por lo tanto en ese periodo se debern
titular todos y cada uno de los matraces. Ya preparados stos no se debern
pasar el tiempo indicado. Despus de que se termina la titulacin se tira el
contenido de estos.







Preparacin de los matraces segn la tabla:




CLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECFICA
La actividad de la catalasa puede expresarse como los moles de H
2
O
2
descompuestos por efecto de la enzima en 5 minutos a 0 C por ml de sangre.
Por lo tanto:
a) Si dos moles de KMnO
4
se descomponen en 5 moles de H
2
O
2.
En los moles
de KMnO
4
utilizados, (gastados) cuntos se descompondrn.
b) Si un mol de KMnO
4
se encuentran en 5 moles de H
2
O
2
, cuantos moles de
H
2
O
2
se estarn descomponiendo. Para conocer estas cifras es necesario
usar el resultado del enciso a.
a) Y b) Se calculan por regla de 3
c) Por ltimo como se trabaj con una dilucin de sangre 1:1000 se le restarn
el resultado de b) se multiplicar por 2000 para obtener la actividad
especfica de la catalasa en cada matraz.

INFORME
En un cuadro entregar los siguientes resultados:
ml de KMnO
4
gastados en cada matraz
H
2
O
2
restante en cada matraz
KMnO
4
descompuesto igual para cada uno
Actividad especfica de cada matraz


CUESTIONARIO
1. Investigue si existe alguna diferencia entre la catalasa animal y vegetal.
2. Qu funcin desempea el regulador de fosfatos?
3. Qu se entiende por actividad especfica de la enzima?
4. Explique que sucede en el matraz N3. Existir actividad de la catalasa?
5. Explique otros mtodos que se pueden emplear para desnaturalizar sta
enzima y explica su efecto.
6. Cul es la frmula para calcular la concentracin de los componentes de
cualquier solucin reguladora?
7. Qu tipo de inhibicin presenta el cianuro en la actividad de la catalasa?
8. Por qu se realiza el experimento a cero grados centgrados?
9. Aade los clculos y los resultados obtenidos en la prctica.


















PRACTICA 5
AISLAMIENTO DE LIPIDOS COMPLEJOS


OBJETIVO

Conocer las tcnicas de aislamiento para cada tipo de lpidos.


INTRODUCCIN

Este experimento consta de la reaccin y purificacin de los lpidos del
tejido cerebral, as como tambin de otros tejidos hacindose resaltar que los
productos finales, con excepcin del colesterol representan substancias
purificadas no puras.

Dicha extraccin est basada sobre las siguientes propiedades particulares:

1. Los esteres son solubles en cetona.

2. Algunos glicerofosfolpidos como la lecitina fosfatidil serina, fosfatidil
etanoamina en ter e insoluble en cetona.


3. Los fosftidos y glucsidos de esfingosma se disuelven en alcohol caliente
y son insolubles en acetona y ter.



MATERIALES

1 Licuadora
2 vasos de precipitados de 250 ml
1 probeta de 100 ml
1 embudo Buchner
1 matraz kitazato
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta de 10 ml
2 matraces Erlenmeyer de 125 ml
1 embudo

MATERIAL BIOLGICO (por
equipo)
Sesos de res y hielo (alumno)

REACTIVOS

Acetona 145 ml
ter 80 ml
Cloroformo
Metanol
Etanol 60 ml
PROCEDIMIENTO

COLESTEROL FRACCION 1

1. Colocar 40 g de muestra en la licuadora.
2. Adicionar lentamente y poco a poco 100 ml de acetona y licuar.
3. Transferir lo licuado a un vaso de precipitados.
4. Lavar el vaso de la licuadora con 15 ml de acetona y transferir el lavado al
vaso de precipitados.
5. Reposar de 5 a 10 minutos.
6. Filtrar a vaco.
7. Recoger el filtrado o sobrenadante que constituye la fraccin 1 (colesterol) y
transferirlo a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, evaporar el solvente del
filtrado obtenido en una parrilla de calentamiento, este residuo constituye la
fraccin 1 COLESTEROL.
8. El precipitado que queda en el papel filtro se transfiere a un vaso de
precipitado para proceder con la extraccin de la fraccin II.


CEFALINA Y LECITINA FRACCIN II

9. Al precipitado anterior agregarle 40 ml de ter y disolvente.
10. Reposar 5 minutos, tapando el vaso.
11. Filtrar rpidamente a vaco.
12. El precipitado que queda en el papel guardado para repetir los pasos del 9
al 12 una vez ms.
13. El precipitado que queda en el papel despus de la segunda filtracin se
guarda para la obtencin de la fraccin III.
14. Concentrar el filtrado del paso 12 hasta un volumen aproximado de 10 ml
utilizando bao mara elctrico.
15. Aadir a este filtrado 10 ml de acetona y agitar
16. Filtra a vaco.
17. El filtrado obtenido puede juntarse con el extracto obtenido en el paso 7 o
bien desecharse.
18. Pesar un papel filtro.
19. El precipitado que queda ene l papel filtro constituye la fraccin II se seca a
temperatura ambiente y se pasa obtener rendimiento.


FOSFTIDOS Y GLUCSIDOS DE ESFINGOSINA FRACCIN III

20. El precipitado obtenido en el paso N13 se coloca en un vaso de
precipitados y se le agregan 30 ml de etanol hirviendo y se disuelve.
21. Filtrar la suspensin an caliente. Repetir desde el paso 20 nuevamente.

22. Desechar el precipitado.
23. Enfriar el filtrado obtenido por 10 minutos, para favorecer la formacin de
cristales.
24. Pesar un papel filtro.
25. Filtrar.
26. El precipitado obtenido constituye la fraccin III.


CUESTIONARIO

1.- Escribe las reacciones que se presentan en la hidrolisis de los lpidos tanto
acidas como alcalinas.

2.-Investiga que otros mtodos hidrolticos existen y que ventajas o desventajas
tendran con los empleados en este mtodo.

3.- Explica detalladamente a qu se debe la diferencia en solubilidad de los lpidos
separados.
















Cadena Respiratoria
Aerobio
2NAD + C
6
H
12
O
6
2 (PIRUVATO)
2NADH + H
Piruvato decarboxilasa
TPP MG
Alcohol deshidrogenasa
Anaerobio
2(ETANOL) 2 (ACETALDEHDO + 2CO
2
PRCTICA 6
PRODUCCION DE PIRUVATO DURANTE LA
FERMENTACION DE GLUCOSA POR LEVADURA


OBJETIVO.
Demostrar la formacin de intermediarios glucolticos.


INTRODUCCION.
La primera etapa del metabolismo de glucosa en levadura es la produccin
de PIRUVATO, este proceso se efecta mediante una serie de reacciones
enzimticas que involucran un nmero considerable de intermediarios y se conoce
como GLUCLISIS.

La reaccin total podr considerarse como la transferencia de dos pares de
tomos de hidrogeno de la glucosa al NAO. Puesto que la coenzima se encuentra
solo en cantidades catalticas, es necesario preoxidarla para que el proceso no se
suspenda y as el NAOH+H formado es reconvertido a NAO por oxigeno molecular
a travs de la cadena respiratoria. Esto no es posible en condiciones anaerobias y
en este caso la reoxidacion se efecta cuando el PIRUVATO se convierte en
acetaldehdo y luego en alcohol.

OXIDACIN AEROBIA Y ANAEROBIA DE GLUCOSA EN LEVADURA













Agua
Molecular
de Oxigeno
Gluclisis
Los metabolitos de piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes normalmente
en muy bajas concentraciones, por tanto, para demostrar su existencia como
intermediario en el camino metablico es necesario impedir que sean
transformados en otros compuestos. Este procedimiento se usa mucho cuando se
investigan caminos metablicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la
conversin del compuesto, mediante inhibidores. Tambin se pueden cambiar las
condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por
debajo de su actividad mxima o se pueda usar un agente que atrape al
intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse, estos dos
ltimos procedimiento se demuestran en el siguiente experimento. La piruvato
descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reaccin de
nitroprusiato de sodio o 2,4-dinitrofenilhidrazina.




MATERIALES REACTIVOS

8 Tubos de ensaye Fosfato de sodio dibsico 0.5M
2 Pipetas de 5ml Fosfato de potasio monobsico 0.5M
2 Pipetas de 10ml Suspensin en levadura (10g/100ml en Na
2
HPO
4
)
4 Tubos de centrfuga Suspensin en levadura (10g/100ml en KH
2
PO
4
)
1 Gradilla Glucosa 100g/L
2 Matraces Erlenmeyer de
125ml
Nitroprusiato de sodio 2.5g/50ml (preprese al
momento de usar)
2 Vasos de precipitados de
250ml
Hidrxido de amonio
1 Bao Mara Sulfato de amonio
Hidrxido de sodio 100g/L
Hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina (solucin
saturada en HCl 2M)
cido tricloroacetico 100g/L





PROCEDIMIENTO.

Formacin de piruvato a partir de glucosa. En dos tubos de ensaye coloque 5ml de
solucin de glucosa (A y B); al tubo A agregue 5ml de suspensin de levadura en
solucin ligeramente alcalina de Na
2
HPO
4
. Al tubo B aada 5ml de suspensin de
levadura en solucin acida de KH
2
PO4
4
. Coloque los tubos en un bao Mara de
temperatura controlada a 37C durante una hora.


Despus del tiempo indicado aada a cada tubo 2 ml de la solucin de cido
tricloroacetico, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500
rpm. Separe el sobrenadante y selo para la determinacin de piruvato
etiquetando para cada uno de ellos la muestra A y B.


DETERMINACIN DEL PIRUVATO MEDIANTE NITROPRUSIATO DE SODIO

En un tubo de ensaye coloque un gramo de sulfato de amonio slido y luego
agregue 2ml de sobrenadante hervido previamente y agregue 2 gotas de
nitroprusiato de sodio preparado recientemente y mezcle vigorosamente. Deje
deslizar cuidadosamente por las paredes del tubo amoniaco concentrado verde o
azul en la interface de los dos lquidos. Esta prueba se realiza para cada muestra
(A y B).

La formacin de un anillo rosado transitorio en la interface indica la presencia de
grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloracin azul o verdosa,
caracterstica de la reaccin de piruvato.


DETERMINACIN DE PIRUVATO CON 2,4-DINITROFENILHIDRAZINA

A 2 ml de sobrenadante agregue 1 ml de solucin saturada de 2,4-
dinitrofenilhidrazina, mezcle fuertemente y luego coloque de 5 a 8 gotas de esta
mezcla a un tubo de ensaye y agrguele un mililitro de NaOH y diluya con agua
destilada hasta 5 ml en donde la formacin de un color rojo indicara la presencia
de piruvato, esta prueba se realiza para cada muestra de sobrenadante A y B.


CUESTIONARIO

1. Explique que es el metabolismo.
2. A que se le conoce como proceso de fermentacin, explique.
3. Por qu la fermentacin alcohlica solo sucede en levaduras?
4. Qu es un proceso aerobio y anaerobio?
5. Menciona 5 diferentes materias primas que puedan ser utilizadas en la
fermentacin alcohlica.






PRCTICA 7
HIDRLISIS ENZIMTICA DE LPIDOS. LA ACCION
DE LA LIPASA.


OBJETIVO.

En este experimento se usara un extracto pancretico el cual tiene una
lipasa muy potente.


INTRODUCCIN

La lipasa cataliza la hidrolisis de los enlaces de tipo ster de los
triglicridos, que se encuentran en los animales y las plantas. Las lipasas y
estereasas son especialmente importantes en el tracto gastrointestinal porque
intervienen en la digestin y absorcin de grasas. Debido a que las grasas son
insolubles en agua, las enzimas actan en la interface agua lpido.
Consecuentemente, agentes emulsificantes tales como los cidos biliares,
estimulan la hidrolisis enzimtica del lpido debido a que aumentan la interface
agua lpido. En la leche homogenizada los glbulos de grasa estn finamente
divididos, por lo cual sirve bien como sustrato para la lipasa.

La accin de la lipasa sobre grasas neutras produce un desdoblamiento en cidos
grasos y glicerol, lo cual puede poner de manifiesto por el aumento en la acidez
titulable despus de que se ha realizado la accin de la lipasa. Cuando la grasa no
est emulsificada, la superficie que presenta es muy poca, por lo que la accin de
la lipasa es muy baja, pero al emulsionarse, aumenta la superficie y por lo tanto la
accin de la lipasa.

El acontecimiento inicial en la utilizacin de la grasa como una fuente de energa
es la hidrolisis del triacilglicerol por las lipasas.


EXPERIMENTO A----- PRIMERA PARTE



MATERIALES REACTIVOS

2 Matraces Erlenmeyer de 125ml Extracto pancretico o solucin de pancreatina
1 Vaso de precipitado de 250ml Bicarbonato de sodio 5%
1 Bureta KOH 0.1N
1 Pinzas para bureta Polvo de Tornasol
1 Agitador Mayonesa (alumno)
1 Pipeta de 1ml
1 Soporte universal
1 Bao mara


PROCEDIMIENTO

En dos matraces Erlenmeyer que sern etiquetados como matraz No.1 y No. 2,
colocar una muestra de 2.5 g de mayonesa y agregarle a cada uno una
pequesima cantidad de polvo de tornasol y enseguida homogenizar las
muestras.

A ambos matraces se les agrega 1 ml de pancreatina, solo que al matraz 2 se le
aade hervida dicha pancreatina para inactivarla, en este mismo matraz se le
ajusta el pH a 8.0 adicionndole bicarbonato de sodio al 5%.

Estos dos matraces se incuban a 37C durante 30 minutos en un bao Mara de
temperatura controlada. Al terminar el tiempo de incubacin se debe observar que
el matraz que contiene la pancreatina inactiva (No. 2) permanece del mismo color
azul en tanto que el que contiene la pancreatina activa (No. 1) presenta una
coloracin ligeramente rojiza. Esta coloracin es producida por la liberacin de
cidos grasos, ya que el indicador se pone rojo en presencia de los cidos grasos.

Para hacer cuantitativa esta prctica se debern neutralizar los cidos grasos
libres con KOH 0.1 N; por lo tanto el matraz No. 1 que contiene la pancreatina
activa se titula con KOH. El punto final de la titulacin se manifiesta al tomar el
matraz el color azul del otro matraz (No. 2).

CUESTIONARIO

1. Investigue la importancia del glicerol en la formacin de los cidos grasos.
2. Cul es la importancia de la presencia de los lpidos en animales y vegetales.
3. Que desventajas existiran si existiera un exceso de grasa en un organismo.
4. Que diferencia se tiene entre la saponificacin de la grasa animal y la hidrolisis
enzimtica de los triacilgliceroles.
5. Cul es la fuente principal de cidos grasos a nivel celular.

EXPERIMENTO B ----- SEGUNDA PARTE



MATERIAL REACTIVOS

1 Vaso de 250ml Extracto neutro pancretico (1% en agua)
1 Pipeta de 5ml Etanol
1 Soporte universal KOH 0.05N
1 Pipeta de 10ml Fenolftalena
7 Matraces Erlenmeyer de 250ml Leche homogeneizada (alumno)
1 Bureta
1 Pinzas para bureta
1 Bao Mara




PROCEDIMIENTO

Se etiquetan siete matraces y se les agrega a cada uno 5 ml de leche
homogeneizada dejando al sptimo matraz como testigo. A cada matraz se le
aade 1.5 ml de extracto pancretico, solo que el extracto pancretico agregado al
sptimo matraz deber hervirse para inactivar la enzima.

Se colocan todos los matraces en un bao de agua controlada a 37 C y pasados
15 minutos se deber sacar el primer matraz y aadirle 12.5 ml de etanol y titular
con KOH 0.05 N utilizando fenolftalena como indicador (agitar fuertemente la
solucin durante la titulacin).


Ir sacando del bao cada matraz a intervalos de 15 minutos y efectuar cada
titulacin. Esto partir del primer matraz que ha sido titulado.



1. REPORTAR.
Nmero de matraz
Adiciones Testigo 1 2 3 4 5 6
Leche
Homogeneizada

Pancreatina
1%

Resultados
Tiempo de
titulacin
Ml de
titulacin

Ml titulacin-ml
del testigo


2. Graficar los resultados, mi de KOH vs Tiempo.

3. Escribir una reaccin, mostrando la accin de la lipasa.




CUESTIONARIO.

1. Qu diferencia existe entre grasa y aceite?, cual es el origen de cada uno?

2. Investiga que tipo de grasa contiene la leche.

3. Investiga tres ejemplos de grasa animal y su fuente, as como grasa vegetal y
tambin su fuente.

4. A que se le conoce como colesterol bueno y colesterol malo.

5. Porqu es importante la presencia de colesterol en el organismo.