FACULTAD DE OCEANOGRAFIA, PESQUERA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA ALIMENTARIA

ASIGNATURA: TEMA: DOCENTE: AO: ALUMNO:

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO DRA. FLORES TERCERO B

SOTO ZAMORA, Jean Carlos

MIRAFLORES 09 DE MAYO DEL 2013

MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS Aprender a preparar correctamente los medios de cultivo ms comunes como: el caldo nutritivo. Aprender correctamente el uso del autoclave. II. MARCO TEORICO MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecolgicos. Entre los requerimientos ms importantes para su desarrollo estn el carbono, el oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Clasificacin de los medios de cultivo Segn su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. Segn su consistencia a) LQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solucin acuosa. b) SLIDOS: se preparan aadiendo un agar a un medio lquido (caldo) a razn de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacrida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningn elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio lquido".

c) SEMISLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar. Segn su composicin: A causa de los requerimientos qumicos del mundo microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar componentes qumicos del medio. a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio ms frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemlo: agar comn o caldo comn. b) ENRIQUECIDOS: estn compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, lquido asctico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. c) SELECTIVOS: son slidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones fsicas del medio o aadiendo o suprimiendo componentes qumicos especficos con el fin de inhibir el crecimiento de especies qumicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio slo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar saladomanitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos). Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos: Cambio de pH: por ejemplo agregando cido actico para favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil par la mayora de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6. Cambio de temperatura: la mayora de las bacterias crece ptimamente entre 20 C y 40 C. Los cultivos tpicos de S. Faecalis requieren 60 C de temperatura y los de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4 C. Alteraciones osmticas: se acrecientan las propiedades osmticas un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la seleccin de bacterias halfilas como Staphylococcus spp. (7,5%). Ajuste en la tensin de oxgeno: es importante en la seleccin de aerobios y anaerobios. Ajuste en la tensin de anhdrido carbnico: muchos patgenos importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensin ms all de la atmosfrica. d) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios gneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha aadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificacin del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH. El citrato de Simmons es un medio cuya nica fuente de carbono es el citrato sdico, entonces en

l solo crecern las bacterias capaces de desarrollarse utilizando como nica fuente de carbono ese componente. A menudo la separacin se basa en la diferencia de color de las colonias aisladas, como en el agar con azul de metileno - eosina que permite diferenciar E. coli (colonias oscuras y de brillo metlico) de Enterobacter aerogenes (colonias rosadas de centro azul sin brillo). Estos dos microorganismos en agar nutritivo producen colonias de color gris blancuzco. Suelen ser a la vez selectivos, por lo tanto solo crecern determinadas bacterias (pueden ser dos o ms tipos) que al actuar sobre alguno de los componentes especficos del medio, demuestran algunas de sus propiedades o caractersticas y nos permite diferenciar entre ambos tipos. e)DE ENRIQUECIMIENTO: son medios lquidos que contienen un agente que inhibe las especies no deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente infeccioso. El medio de Muller - Kauffman, permite el crecimiento de Salmonella inhibiendo a su vez el de numerosos coliformes. Esto es de gran importancia ya que en ciertas muestras, por ejemplo fecales, el agente infeccioso (Salmonella) es frgil y puede ser superado en nmero por agente bacterianos indgenas como E. coli; por lo tanto antes de realizar las pruebas de laboratorio es necesario aumentar su nmero con respecto a sta en un caldo de enriquecimiento. Ejemplo de este tipo son los caldo de tetrationato y selenito. El agua de peptona alcalina se utiliza para Vibrio cholerae. El enriquecimiento es una tcnica que utiliza un medio selectivo lquido para permitir el desarrollo de un microorganismo a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. As, aquellos microorganismos para los que el ambiente sea ms favorable crecern ms que los otros y finalmente sern predominantes f)DE TRANSPORTE: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin multiplicacin significativa de los microorganismos desde el momento de su extraccin hasta su posterior estudio. Se utilizan generalmente cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se recomienda un lmite de dos horas desde la recoleccin de las muestras y su estudio en el laboratorio, pero este lmite de tiempo es superado (frecuentemente cuando se trata de muestras tomadas en un consultorio). Esta demora hace necesario el uso de medios de transporte adecuados. Los medios de transporte ms frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies y Carey - Blair. Existe una unidad descartable de cultivo de transporte llamada Culterette que consiste en un tapn estril de poliestireno y un ampolla en la parte inferior que se rompe cuando se ejerce presin liberando el medio de transporte de Stuart alrededor del extremo del tapn impregnado en la muestra. Hasta hace algunos aos los componentes orgnicos mencionados deban ser obtenidos por el microbilogo y el medio de cultivo se preparaba en el laboratorio. Actualmente se dispone comercialmente de la mayor parte de los medios e incluso de sus componentes adicionales.

Un gran nmero de medios de cultivo usados en el laboratorio de microbiologa son mixtos, es decir que tienen como finalidad la de varios grupos de los mencionados, por ejemplo, el agar S- S es selectivo (pues tiene un inhibidor: el verde brillante) y es a la vez un medio diferencial (lleva lactosa y un indicador) que permite diferenciar las bacterias fermentadoras o no de dicho polisacrido. El medio de Thayer y Martin para Neisseria es un medio enriquecido (contiene plasma) y es selectivo (tiene 3 antibiticos inhibidores de la flora bacteriana y fngica: colistina, vancomicina y nistatina). Ramos, M. 2004

Preparacin En un matraz de 1000 ml de capacidad colocar 250ml. De agua destilada y adicionar sobre ella 5 g de peptona, 2.5 g de cloruro de sodio y 1.5g de extracto de carne , agitar hasta disolucin; si fuera necesario, calentar en bao mara. Completar el volumen a 500 ml de capacidad. Quevedo, Fernando 1967

III.

PARTE EXPERIMENTAL Materiales , Equipos y Reactivos Espatula Balanza de torsin Papel Kraft Balones Probetas Autoclave Caldo Nutritivo

Diagrama De Flujo Preparacin De Caldo Nutritivo

Medio de Cultivo (Caldo Nutritivo )

Rehidratar

Homogenizar

Medio Liquido Caldo

Distribuir

Esterilizar Autoclave

Enfriar

 Procedimiento Segn la formula del caldo nutritivo -Extracto de carne -Peptona -Cloruro de sodio -Agua deltilada 3g. 10g. 5g. 1000 cm3 pH = 6,8 +/- 0,2 En el frasco del medio de cultivo estaba indicado su proporcin y no era necesario calcular los respectivos ingredientes ya que mencionaba 20 g para un litro de solucin y en el laboratorio calculamos para 100 ml. Se hidrato el medio de cultivo y se homogenizo mediante la agitacin constante. Una vez homogenizado se distribuy 5 ml del caldo nutritivo hidratado a 20 tubos de ensayos respectivamente esterilizados, luego de su distribucin se procedi a colocarlos un tapn de algodn para evitar la alteracin del medio de cultivo.

Se prepar los 20 tubos para ser llevados al autoclave por un tiempo de 15 min a un temperatura de 121 C Para la utilizacin del autoclave se debe seguir los siguientes pasos para evitar accidentes: - Llenar de agua hasta el rango permitido para luego colocar los medios de cultivo adecuadamente preparados. - Cerrar el autoclave con la llave especifica, ajustar cada llave con el opuesto homologo. - Una vez cerrado correctamente el autoclave, se procede a encender los 2 mecheros correspondiente. - Se enciende con la ayuda de un espejo el mechero principal, con mucho cuidado y luego se habr la llave del mechero secundario.

 Clculos Para 100 ml de caldo nutritivo 20 g ---------------------- 1000 ml X ------------------------ 100 ml X= 2 g. IV. DISCUSIONES Segn QUEVEDO, F. En su libro Microbiologa General- Practicas de Laboratorio. Nos muestra el siguiente cuadro: Formula de los medios de cultivo - Caldo Nutritivo Peptona 10 g Cloruro de sodio 5g Extracto de carne 3g Agua destilada 1000ml pH= 7,2 +- 0,1 En la medicin del pH mediante el papel indicador nos dio un rango aproximadamente de 7,5 , se puede contrastar mediante la tabla que esta en un rango aceptable ya que el pH afecta directamente a los resultados que podramos tener en este preparacin del medio de cultivo. V. CLONCUSIONES Se logr preparar correctamente el medio de cultivo especifico (Caldo Nutritivo). Se aprendi correctamente el uso del autoclave para as poder evitar posibles accidente en un futuro. Los medios del cultivo son sistemas que tienen nutrientes, humedad, oxgeno y un pH adecuado que permiten el crecimiento de un microorganismo. Los tipos de cultivos dependen del tipo de microorganismo que se quiere criar ya que cada tipo de microorganismo requiere un tipo de medio de cultivo particular.

VI.

FUENTES BIBLIOGRAFICAS QUEVEDO, F. (1967). Microbiologa General Practicas de laboratorio. 1 Edicin Lima. RAMOS, M. (2004). Manual de Practica de Microbiologa General. 2 EdicinMxico.