Tesis Myc Unam Vero PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO,
TIPIFICACIN
BIOQUIMICA Y
MOLHCULAR
DE CEPAS
DE Mycoptasma
hovis
AISLADAS DE LECHE DE BOVINO PROCEDENTE
DE
TANQUE DE ALMACENAMIENTO.
TESI S
QUE PARA OBTENER
EL T|TULO DE
MDICA VETERINARIA
ZOOTECNISTA
PRESENTA
VERNICA ROJAS
TREJO
ASERORES:
DRA. ROSA ELENA IVIIRANDA MORALES
DR. FRANCISCO JOSH TRIGO TAVERA
mxrco o.
p.
2008
Neevia docConverter 5.1
CONTENI DO
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
CONTENIDO
ABREVIATURAS
RESUMEN
I . O I NTRODUCCI N
1.1 Si tuaci n Naci onal del ganado l echero en Mxi co
1. 2 Mast i t i s
1.3 Prdi das econmi cas a causa de masti ti s
1.4 Mastitis
por
Mycoplasma bovis
1.5 Prdidas econmicas a causa de mastitis
por
Mycoplasma bovis
1. 6 Leche de t anque
1 .7 Antecedentes histricos
1 .8 Clasificacin taxonmica
1.9 Generalidades de Mycoplasma spp.
1 . 1 0 Caractersticas estructurales
1. 10. 1 Membr ana
1.10.2 Protenas de superfi ci e de membrana
1. 10. 3 L pi dos de super f i ci e de membr ana
1.1 1 Requeri mi entos nutri ci onal es
1 1 "12 Acti vi dad metabl i ca
Pgi na
t l
t l t l
V
I X
1
3
3
4
4
5
5
6
7
1 1
1 5
1 5
1 5
1 6
1 8
1 B
1 9
1.13 Factores de vi rul enci a
1 . 13. 1 Toxi ci dad
1.13.2 Adherenci a
1 .1 4 Caractersticas moleculares
1 .15 Transmisin de Mycoplasma bovis
1 .16 Di agnsti co
1.17 Prevencin y
control
para Mycoplasma bovis
1.18 Tratamientos utilizados
para Mycoplasma bovis
JUSTIFICACN
2.0 HIPTESIS
3.0 OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
3.2 Objetivos especficos
4 MATERIAL Y MTODOS
4.0 Zona de muestreo
4.1 Col ecci n de muestras
4.2 Aislamiento de Mycoplasma spp
4.2.1 Medi o de cul ti vo
4.2-2 Control del medi o de cul ti vo
4.?.3 Procesami ento de l as muestras
4.3 l denti fi caci n de gnero
4.3.1 Morfol oga de col oni a
25
25
27
29
30
Pgi na
20
22
22
23
32
32
32
33
31
30
30
30
31
31
34
34
4.3.2 Fi l trabi l i dad
4.4.3.3Reversi n de formas Li ster
4.3.4 Requeri mi ento de esterol es
4.4. l denti fi caci n bi oqumi ca de especi es de mi copl asmas
4.4.1 Fermentaci n de l a gl ucosa
4.4.2 Fermentaci n de l a manosa
4.4.3 Hi drl i si s de l a argi ni na
4.4.4 Hi drl i si s de l a casena
4.4.5 Reduccin del tetrazolio
4.4.6 Producci n de
pel cul as y
manchas
4.5 Obtencin de concentrado de cepas de micoplasmas
y
Mycoplasma bovis
cepa Donneta.
4.6 Lavado de antgeno
4.7 .0 f dentificacin molecular de Mycoplasma bovis
por la PCR
4.7.1 Extracci n de ADN
4.7 .2 Reactivos
para las reacciones de PCR
4.7.3 Opti mi zaci n de l a Tcni ca de l a PCR
4.7.4 Vi sual i zaci n del gel
4.8 Anl i si s estadsti cos
5.0 RESULTADOS
5.1 Resul tados
gl obal es en l os hatos muestreados de l eche de tanque de
al macenami ento
Pgi na
34
34
35
35
36
37
37
3B
38
39
41
41
42
42
44
46
48
50
51
51
5.2 Resul tados
gl obal es de l as muestras de l eche de tanque
5.2.1 l denti fi caci n bi oqumi ca de l as especi es de mi copl asmas ai sl adas en
l as muestras de l eche de tanque de al macenami ento
5. 2. 1. 1 l dent i f i caci n de gner o
5.2.1.2 l denti fi caci n bi oqumi ca de especi e
5.2.2 Especi es de mi copl asmas ai sl adas en muestreo 1 y 2 de l eche de
tanque de al macenami ento
5.2.3 Resultados de hatos
positivos
al aislamiento de Mycoplasma bovis
5.3 Resul tados
gl obal es en l os hatos muestreados de l eche de tanque de
almacenamiento
por reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR)
5.3.1 Resultados de hatos positivos a Mycoplasma bovis por PCR
5.4 fdentificacin bioqumica
y molecular de Mycoplasma bovis en leche de
tanque de al macenami ento
5.5 Anl i si s estadsti co
6.0 DtscustN
7. 0 CONCLUSI ONES
8.0 REFERENC IAS
9. 0 APNDI CES
Pgl na
52
53
53
53
56
58
58
61
62
62
63
68
69
ABREVIATURAS
(
-
)
Negativo
( +
)
Positivo
pc Micrmetro
pg Mi crogramo
(' s)
rl
Microlitro
(' s)
Adeni na
ARN Aci do Ri bonucl ei co
ATP Adenosin trifosfato
C Ci tosi na
c.b.p. Cuanto baste
para
MgCl 2 Cl oruro de Magnesi o
DNA Desoxyribonucleic acrd: cido desoxirribonuclico
DNTP Di nucletido-trifosfato
ELISA Enzyme-linked
immunosorbent assay: Ensayo inmuno
enzimtico
FMVZ Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
G Guani na
' kb
Ki l o base
LC Large colony' . colonia
grande
LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclatura
M Mol ar
(sol uci ones mol ares)
NAD Di nucl eoti do de Ni coti nami da
y Adeni na
NMC Nati onal Masti ti s Counci l
oC
Grados centgrados
OPP Ol i goppti do
Permeasa
P Protenas
PBS Solucin Buffer Fosfatos
PCR Reacci n en Cadena de l a Pol i merasa
PG Fosfatilglicerol
pH Potenci al de Hi drogeno
PPLO Organi smos Asoci ados a Pl euroneumona
Ps Protenas Superficie
RCS Recuento Cel ul ar Somti co
SAGARPA Secretaria de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural Pesca
y
Al i mentaci n
SC Small colony Colonia
Pequea
SIAP Seruicio de Informacin Agroalimentaria
y Pesquera
Ti mi na
Taq
Termus aquaticus
TNF Factor de necrosis tumoral
UNAM Uni versi dad Naci onal Autnoma de Mxi co
VSP Protenas Vari abl es de Superfi ci e
IOM Organization of Mycoplasmology
I a l .
lJeclrcatorta
Dedico este trabajo a:
-Mi s
padres: Enri que y Eva con todo mi corazn, por darme l a vi da,
por
ayudarme a cumpl i r todos mi s sueos,
por
darme l a opoftuni dad de concl ui r una
carrera hermosa como lo es la medicina veterinaria, por
todo el amor y cario
que me di eron. Muchas graci as l os amo.
-A
mi s Hermanas: Mi reya y Kari na
por ser mi s mej ores ami gas, por sopoftarme,
por apoyarme i ncondi ci onal mente
y confi ar si empre en m, estoy muy orgul l osa
de tenerl as a mi l ado como hermanas
ya que son mi mayor apoyo.
-A
mi s sobri nos: Al exi s
y Fri da por ser l a l uz en m vi da desde el momento
que
l l egaron a este mundo,
por ser mi i nspi raci n
y mi fuerca de cada da l os amo
muchsi mo y
si empre estar a su l ado, graci as por l l enar mi vi da de esperanza.
-
A Rol ando, Por tener si empre fe en m, por ser m apoyo i ncondi ci onal , por
estar si empre a mi l ado en l os momentos buenos y mal os. Adems,
por
haberme demostrado l o hermoso
que
es amar. Una vez ms graci as. Te amo.
-A
Mayra y Toito, Con mucho cario, son
parte
de mi vida.
Todo o que hago siempre es por usfedes mi familia, lo ms
impoftante para m en esfe mundo.
Agradecimientos
A la Doctora Rosa Elena Miranda Morales, por guiarme y ensearme tanto
en este cami no de l a i nvesti gaci n, es una gran muj er que admi ro, respeto y tengo
gran cari o graci as l a
qui ero mucho.
Al Doctor Francisco Trigo Tavera
por
apoyarme en este proyecto.
A l os mi embros de mi
j urado,
Dr. Mi guel ngel Bl anco, Dr. Mi guel ngel
Qui roz, Dr. Al fredo Sahagn,
y
en especi al al Dr. Ri gobefto Hernndez por ser
una
persona
excelente, su enseanza y su apoyo eres parte fundamental en este
trabajo.
A mis compaeros de laboratorio de Micoplasmas fue lindo trabajar con
ustedes, Martha Jurez, Alejandro Jimnez, Jos Luis Corona, Cnidia (eres parte
de mi copl asmas)Al ej andra, Carl os, Eri ka y Sra. Georgi na.
A Martita por que eres una persona muy especial me diste una mano
si empre
que l a necesi te. Graci as Mar.
Al todos l os i ntegrantes del departamento de Mi crobi ol oga e Inmunol ogi a
que
si empre me ofreci eron una mano y una sonri sa, Lab. de Serol oga; Dra.
Myrna, Gri sel , Juan Carl os Ci ndy, Lab. de Practi cas; Mary Toa, Jul i o, Fabi ol a R,
Lab. Mi col oga; Andi ra, Chucho, Ceci , Lab. Leptospi ra; Dr. Al ej andro de l a Pea,
Ol i , Carl os, Rodri , Preparaci n de medi os; MVZ. El i , MVZ. Fabi ol a, Ral Segura y
todos l os compaeros de l os l aboratori os de Inmunol oga mol ecul ar, Vi rol oga,
Brucella
y Tuberculosis Dr. Francisco Surez, Dr. Pabello, Lucy, Juliette, Rosala.
A Lupi ta y Rosy, etc. Somos una
gran Fami l i a.
A Vctor
por
su colaboracin en este trabajo.
Al Doctor, Rafael Soto Castor,
y
al apoyo otorgado
por la Asociacin de
ganaderos de l a cuenca de Ti zayuca. Hi dal go.
A todos mi s ami gos de l a FMVZ, por cada
pal abra de al i ento y esos
momentos
que
compafti mos durante 5 aos maravi l l osos. Graci as: Adri ana,
Andi ra, Mony, Bren, l tzel , Sony, Mi ri am, Arl en, Al e, Mauri ci o, Al ej andro, Oscar,
Humberto, Adri n, Mi chel l e, Fel i pe.
A mi s ami gos de l a preparatori a Chri sti an, Edgar, l srael , Adhai r,
Quetzal coatl , Jul i o, Jeny, Mony, Bren, Laura, Li by, Li z, etc. Que l os extrao mucho
y son
parte
de mi vi da l os qui ero.
Al
proyecto PAPITT lN-215506-3 DGAPA-UNAM
por
el financiamiento de
este
proyecto.
Resumen
RESUMEN
ROJAS TREJO VHRNl CA. Ai sl ami ento, ti pi fi caci n bi oqumi ca y mol ecul ar
de cepas de Mycoplasma bovis aisladas de leche de bovino
procedente de tanque
de al macenami ento.
Baj o l a di recci n de: Dra. Rosa El ena Mi randa Moral es y Dr.
Francisco J Trigo Tavera.
La masti ti s en el ganado bovi no es una de l as pri nci pal es causas en
prdi das econmi cas a ni vel mundi al , el control de |os mi croorgani smos asoci ados
a este
probl ema si gue si endo
parte fundamental de estudi os
para real i zar un
diagnstico eficaz
y
tener un control de la mastitis bovina. El muestreo en tanques
de almacenamiento
facilita el monitoreo a nivel de hato en cuanto a patgenos
involucrados a la mastitis bovina
y permitir mejorar el
peffil sanitario del hato.
Mycoplasma bovis es un microorganismo asociado a mastitis aguda y crnica
rei nci dente con al ta di semi naci n, tambi n se consi dera como
patgeno
involucrado a problemas respiratorios, infertilidad, aftritis, abortos orquitis
y
conjuntivitis.
Es importante mencionar Mycoplaslna spp, Staphylococcus aureus, y
Streptococcus
agalacfiae estn considerados como microorganismos contagiosos
y patgenos pri mari os causantes de masti ti s bovi na. Con el fi n establ ecer l a
presencia de Mycoplasma bovls en leche de tanque de almacenamiento de hatos
ubi cados en el Estado de Hi dal go, se anal i zaron 224 muestras
proveni entes de
112 tanques, de l os cual es se real i zaron dos muestreos con un i nterval o de 15
das. Cada muestra fue procesada para su ai sl ami ento e i denti fi caci n bi oqumi ca
y mol ecul ar
por l a tcni ca de l a PCR (Reacci n en Cadena de l a Pol i merasa).
Para el ai sl ami ento se uti l i z el medi o de Hayfl i ck y l os ai sl ados fueron
Resumen
i denti fi cados bi oqumi camente si gui endo l as recomendaci ones del IOM
(Organi zati on of Mycopl asmol ogy),
l a i denti fi caci n mol ecul ar se real i z uti l i zando
la secuencia
que codifica al
gen de la permeasa OppD y OppF de Mycoplasma
bovis. Los resultados muestran
que el 62
alo
de los hatos analizados fueron
positivos al aislamiento de Mollicutes, de las ?24 muestras
procesadas se
obtuvieron 87 aislados, de los cuales 15
pertenecan al gnero Acholeplasfla spp
y 7? cepas fueron identificadas como Mycoplasma spp., las cuales se identificaron
bioqumicamente como Mycoplasma bovis 43 (60%), Mycoplasma californicum 5
(7o/o), Mycoplasma a/lralescens 3 (4%), Mycoplasma canadense 2(3o/o) y
Mycoplasma spp19
(26%). Y con la PCR se identificaron 33 cepas como
Mycoplasma bovis. Se estableci una concordancia buena con un valor de Kappa
de 0,63 entre l as dos tcni cas real i zadas,
por l o que se determi no
que el 26 % de
fos hatos fueron
positivos a Mycoplasma bovis
por la tcnica de la PCR. Este es el
pri mer estudi o real i zado en l eche de tanque de al macenami ento de expl otaci ones
de bovinos,
para establecer la presencia de Mycoplasma bovis por tcnicas
mol ecul ares en Mxi co.
t _ . a
t
rnocruccron
I. INTRODUCGION
1. 0 SI TUACI N NACI ONAL DEL GANADO LECHERO EN MKCO.
La ganadera naci onal ao con ao ha mostrado un l i gero creci mi ento, en el
caso de bovi nos especi al i zados en producci n l ctea, el ul ti mo i nforme que
proporci ona el SIAP
(Servi ci o de Informaci n Agroal i mentari a y Pesquera 2007) de
l a SAGARPA
(Secretari a de Agri cul tura, Ganadera, Desarrol l o Rural Pesca y
Al i mentaci n) i ndi ca que en l a l ti ma dcada l a pobl aci n de bovi nos present un
consi derabl e creci mi ento graci as a programas de mej ora genti ca, manej o,
desarrollo del hato, tcnicas en produccin lctea y programas de control sanitario,
i ncl uyendo i mpodaci ones de ganado de Norte-Amri ca.
La SAGARPA en l a dcada de 1994-2004 mostr el i ncremento en l a pobl aci n
bovina lo que se reflej en el aumento en la produccin lctea y seala que en
ms de una dcada
(1994
al 2006) el aumento en l a producci n l ctea fue de 7
320, 213 l i tros a
g
996, 137 l i tros
(Fi g. t
).
Figura 1 Poblacin y produccin del ganado bovino productor de leche de 1994 a 2006, SIAP, SAGARPA2OOT.
12,0m,000
l o, om, om,
' r i
a,ffi,00) I
4,mo,m0
z . om. oooi
eom zoo 2F 2006
-+*
Pbloln do gqngdo bwino
+
Ptoduccln ff m|s de lilros
---;,,;;;|-*-l
9. 47?. 293 9, 658, 282
9, 871, 441
lntroduccin
1. 1 MASTI TI S
La mastitis es el
problema
ms frecuente y serio en los bovinos
productores
de l eche, ocasi onando
prdi das
econmi cas debi do a l a baj a producci n l ctea, l a
necesi dad de desechar l a l eche de l os ani mal es con l esi ones de masti ti s
(i nfl amaci n del tej i do de l a gl ndul a mamari a que
muestra dao epi tel i al ), del
diagnstico bacteriolgico, del tratamiento, el desecho y reemplazos de los
ani mal es. Se puede cl asi fi car por su forma de
presentaci n
en dos ti pos
pri nci pal es masti ti s cl ni ca o subcl i ni ca (vi l a et a1.,2004, Ki rk and Mel l engerber
1995). El Nati onal Masti ti s Counci l (NMC) a parti r del ao 1999 consi der a
Staphylococcus aureus, Mycoplasma spp y Sfrepfococcus agalactiae como los
microorganismos contagiosos
y patgenos primarios
causantes de mastitis bovina
(Ki rk
and Mel l engerber 1995, NMC 1999, Bri tten 2006).
1.2 PERDIDAS ECONOMICAS A CAUSA DE MASTITIS
A nivel mundial se ha estimado
que la mastitis representa el 30% del costo
total de l as enfermedades
que afectan al ganado l echero (Ni chol as et a1.,2003).
En Estados Uni dos
y Canad l as
prdi das
econmi cas
por masti ti s en bovi nos en
1996, ascendi eron a dos mi l mi l l ones de dl ares
que
equi val en a 200 dl ares
por
vaca
(Cri st ef a/., 1997 NMC).
En Mxico, las
prdidas
econmicas
por concepto de valor al desecho
por
vaca asoci adas con masti ti s en 1984, fue de 2.17 mi l l ones de
pesos (Val despi no
1984) .
Introduccin
Tabl a 1..Pdi das econmi cas
por masti ti s bovi na en di ferentes zonas geogrfi cas del mundo.
-F.Enolo-eE-';--
l---
:-'
eEilififlH16,: l,
REFF.RENctAri,r,ii
- " t " 1
i UNI ON
EUROPEA
dlares ao
i
2003 NMC
i
' "' "
i l
2 mi l mi l l ones
i
Soca Prez et al .,
I
+ , I Masti ti s
dl ares ao i 2003 NMC
I
576 mi l l ones de l
I Ni chol as 2004 i Masti ti s
euros
MXI CO
2. 17 mi l l ones de
pesos
Val despi no 1999
Vlilti"desecffi
vacas por mastitis
1.3 MASTITI$ POR lllvcoplasma bovrs
La mastitis bovina es causada por varias especies de micoplasmas
principalmente por Mycoplasma bovis
que
se considera como el ms patgeno,
sin embargo se mencionan otras especies involucradas como, Mycoplasma
alkalescens, M. californicum, M. canadense y M. arginini (Jasper 1981, Miranda-
Moral es et al ., 1999, vi l a ef a/., 2005).
Mycoplasma bovis esta asociado
principalmente a problemas de mastitis,
si n embargo se encuentra tambi n ocasi onando
probl emas
de neumona, aftri ti s,
abortos
y queratoconjuntivitis. La mastitis
por
Mycoplasma bovis se caracteriza por
la presentacin de cuadros clnicos severos
que generalmente afecta a ms de un
cuarto de l a gl ndul a mamari a, con
perdi da
en l a producci n de l eche ori gi nando
altos costos por tratamientos a los que la mastitis se muestra reincidente. La
produccin lctea muestra una baja sbita, algunas veces se pueden presentar
depsitos con aspecto arenoso lo que afecta negativamente la calidad lctea
(Ni chol as 2004, Farshi d, et al .,2003).
Introduccin
1.4
pnol oAs
ecoruml cRs R cRusR oe ml sl rl s
poR
En l a i ndustri a l echera, l as
prdi das econmi cas ori gi nadas
por l os
probl emas de masti ti s
por mi copl asmas se deben
pri nci pal mente a l a di smi nuci n
sbita en la baja de
produccin lctea
y
al desecho de animales con alto registro
(Ni chol as et a1.,2003). En l a Uni n Europea l as prdi das anual es
por masti ti s son
de alrededor de 576 millones de euros
y
se ha responsabilizado a Mycoplasma
bovi s de al rededor de 144 mi l l ones de euros de
prdi das anual es
y en l os Estados
Uni dos en el 2003 Ni chol as, repoi l 32 mi l l ones de dl ares como
perdi das
econmicas a causa de Mycoplasma bovis (Tabla 2). En los hatos infectados el
microorganismo
persiste durante un
perodo prolongado, lo que ocasiona la
el i mi naci n de l os ani mal es
por secuel as de l a enfermedad. En muchas ocasi ones
l a severi dad de l as l esi ones es tan
grave que muchos ani mal es
pi erden su val or
producti vo y econmi co
provocando su el i mi naci n
(Jasper 1981).
Tabla 2. Prdidas econmicas a causa de Mastitis
por Mycoplasma bovis.
EUROPA
144 mi l l ones euros
Ni chol as ef al ., 2003
1. 5 LECHE DE TANQUE
En l a i ndustri a l echera l a l eche se acopi a despus del ordeo en tanques de
almacenamiento
que
deben estar en condiciones de refrigeracin
y agitacin hasta
Introduccin
su transpofte a las
plantas procesadoras. La leche almacenada en los tanques
permite al
ganadero y al mdico veterinario realizar diferentes
pruebas para
obtener
informacin del
perfil
sanitario del hato. Datos como, el recuento celular
somti co
(RCS), l a detecci n de mi croorgani smos
patgenos i nvol ucrados en l a
mastitis,
presencia de antibiticos, hormonas en leche, deteccin de anticuerpos
y
la
presencia de otros
patgenos como Brucella, Mycobacterium, virus de lBR, etc.,
el estudio de todos estos factores en la leche permite un mejor control sanitario de
l os hatos
(Farnsworth 1993, Agger 1994, Ol l i s 1995).
El NMC
(Nati onal Masti ti s Counci l ) 1997 i ndi ca gue para
tener un control del
hato en cuanto a sanidad, se deben realizar dos muestreos de leche de forma
asptica directamente de la ubre cada trimestre
y en el caso de leche de tanque
menci ona
que el muestreo debe ser semanal ,
qui ncenal o mensual segn el pl an
de control sani tari o de l os hatos, el NMC 1999 seal a
que el tanque de
almacenamiento debe
permanecer en refrigeracin
y agitacin, la coleccin de
una muestra de tanque se toma de l a
parte
superi or del tanque y no de l as l l aves
de sal i da, se debe col ectar como mni mo 30 ml en un reci pi ente estri l y ser
transportadas en refri geraci n haci a el l aboratori o de di agnsti co
(NMC 1999).
1 . 6 ANTECEDENTES HI STHCOS
El pri mer i nforme de ai sl ami ento de mi copl asma fue descri to
por Nocard y
Roux en el ao de 1898, de un caso de
pl europneumona bovi na en donde
identificaron a Mycoplasma mycoides subsp mycoides. El primer nombre
que
recibi Mycoplasma bovis fue el de Mycoplasma bovimastitidis,
posteriormente se
le asign el nombre de Mycoplasma agalactiae subespecie bovr,s
por su similitud
Introduccin
con Mycoplasma agalactiae hasta
que el anlisis de la secuencia del
gen para
el
RNAr 16s l a evi denci como una especi e di ferente
y
se l e di o el nombre de
Mycoplasma bovis (Tenk 2005).
Para el ao 1962 Hal e et al ., en l os Estados Uni dos repoftaron el
pri mer
ai sl ami ento M. bovi s de muestras de l eche de 25 bovi nos con probl emas de
masti ti s subcl ni ca, Carmi cheael et al ., en el ao de 1964 detectaron
serolgicamente a M. bovisde 16 hatos en New York, USA. Desde entonces, se
han reportado ai sl ami entos
por
Bar-Morshe en l srael 1964,
por
Marcos Barrado y
Sanz-Perex en Espaa 1967, Cottew en Austral i a 1970, Franci a 1974, Gran
Bretaa 1975, Ruhnke et al ., en 1976 Canad, Al emani a 1977, Di namarca 1981,
Marruecos 1988, Corea del Sur 1989, Brasi l 1989, l rl anda 1993, Shane C. et al .,
1999 en Cal i f or ni a USA y Chi l e 2000
( Shane et al . , 1999 Ni chol as et a1. , 2003
Farshi d et a1.,2003 Jasper 1981). Hotzel 1996 estandari z l a tcni ca de l a PCR
con una cepa tipo de Mycoplasma bovis con la secuencia de la oligopptido
permeasa Opp, metodol oga que ms tarde uti l i zo Bashi ruddi n ef a/., en l ngl aterra
j unto
con otras tcni cas de l a PCR de autores como Dedi u et al ", 1995, Johansson
ef al ., 1996, Subramani am ef a/., 1998, Hotzel and Shane 1998 (cl ase Mol l i cutes)
asimismo utilizaron 10 cepas de referencia de Mycoplasma bovis
y 15 cepas de
referencia de Mycoplasma agalactiae,
para un estudio comparativo donde se
report
que los iniciadores
que codifican
para la permeasa Opp que utilizo Hotzel,
fue 100 % especifico de M. bovis sin falsos positivos a diferencia de otras
metodologas
y
otros iniciadores (Tabla 3).
Introduccin
Tabl a 3. Antecedentes hi stri cos del ai sl ami ento e i denti fi caci n de mi copl asmas de ani mal es con
probl emas
de masti ti s
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Bashi ruddi n et al .,
*Ai sl omi ento
de Mycopl osmo bovrs de oni mol es con
probl emos
de mosl i l i s.
Despus de una revisin bibliogrfica exhaustiva, no se encontraron
estudi os rel aci onados actual mente con el anl i si s bacteri ol gi co en l eche de
tanque para
establecer la
presencia
de micoplasmas y
otras bacterias
involucrados como
patgenos primarios
de mastitis. Los estudios realizados en
Mxi co al rededor de l a masti ti s bovi na por mi copl asmas son de l eche di recta de
los cuartos de bovino con mastitis. vila et al., en 1983 aislaron a Mycoplasma
T .
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tnffoclucclon
spp., de un hato l echero del Hstado de Mxi co. Mi randa-Moral es ef a/., en 1995
aislaron a Mycoplasrna spp de un brote en un hato lechero del estado de Hidalgo,
Mi randa-Moral es et al ., 1999 reportaron l a patogeni ci dad de mi copl asmas en
cul ti vo cel ul ar pri mari o de gl ndul a mamari a i nvol ucrados en l a masti ti s bovi na.
Asi mi smo, se han real i zado estudi os serol gi cos como Hernndez et al ., 1995,
f nfante et al., 2004
que
detectaron anticuerpos contra M. bovis, as como Nez ef
at.,l}Ql,report
positividad con la tcnica de ELISA contra M. bovis(Tabla 4).
Tabl a 4. Antecedentes hi stri cos del ai sl ami ento e i denti fi caci n de mi copl asmas en ani mal es con
probl emas de masti ti s en Mxi co.
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2004 I Mxico
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serologia M. bovis i Nez et a/.,
Jasper en 1980, en Cal i forni a U.S.A. repoft un brote de mi copl asmosi s
clnica en 104 hatos, en 59 de ellos
presentaron Mycoplasma bovis y
el resto M.
a/kalescens, M. arginini, M. bovigenitalium, M. bovirhinis y M. canadense.
Asi mi smo, Jasper 1980, anal i z muestras de l eche de tanque y ai sl a
Mycoplasma bovis en un 4
o/o
y Acholeplas/na como agente contaminante (Jasper
1981). Shane et al., 1999, en California USA identificaron a Mycoplasma bovrs en
l eche de tanque con l a PCR l ograron i denti fi car el 88 % de 25 muestras. El
si stema naci onal de moni toreo de sal ud ani mal del centro de epi demi ol oga y
safud ani mal , del Departamento de Agri cul tura de U.S.A, en el ao 2002
estudi aron l a preval enci a
de mi copl asmas en l eche de tanque de al gunas regi ones
l 0
Introduccin
:
de 21 estados del pas
donde se muestrearon 871 hatos en total , donde el T.g %
de los hatos resultaron positivos
a Mycoplaslna spp. De los aislados obtuvieron
una prevalencia
de Mycoplasma bovis del 86% siendo el patgeno
con mayor
porcentaje y en menor cantidad a M. californicLtm, M. alkalescens,
M. canadense y
M. bovigenitaluim, y
se observ que
en 16 de los 21 estados fueron positivos
al
aislamiento de lrrlycoplasma
spp. Filioussis, ef a/., 2005 en Grecia identificaron
a
Mycoplasma bovis por
medio de la PCR en 37 leches
de tanque de
almacenamiento, donde obtuvieron un 5.4 Vo de hatos positivos.
Fox ef al., Z00E
repofiaron en USA la identificacin de M. bovis por
medio de PCR en
g3
leches de
tanque de al macenami ento,
donde obtuvi eron un 70 % de hatos posi ti vos y
Richard G et al., 2006 observaron que
en 773 muestras de leche de tanque de
bovi no anal i zadas se ai sl Mycopl asma spp. en 1.g %
(Rchard
et a|.,2006).
Tabla 5. Antecedentes histricos del aislamiento e identificacin de micoplasmas en leche de
t anque.
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Introduccin
1 .7 CLASIFICACIN TAXONOMICA
Los microorganismos de la clase Mollicutes estn considerados como los
ms pequeos dentro del rei no procari ote, mi den aproxi madamente 300 a 500 nm,
son
pleomdicos,
carecen de
pared
celular por ello se nombran como Mollicutes
termino que proviene
de mollis (suave) y cufrs
(piel) (Razin et al, 1998).
Dentro de la clase Mollicutes se encuentran dos grupos:
Los helicoidales y
l os no hel i coi dal es. En l os no hel i coi dal es dependi entes de esterol es se ubi can l os
gneros Mycoplasma y Ureaplasma microorganismos, descritos como
patgenos
en humanos
y
ani mal es
y
l os no hel i coi dal es no dependi entes de esterol es, l os
Acholeplas,nas microorganismos considerados comensales en diferentes especies
animafes y finalmente los Spiroplasmas microorganismos helicoidales que
se
encuentran i denti fi cados en pl antas y arpodos pri nci pal mente (Rosendal ,
1993;
Razin et al, 1998).
Los micoplasmas son rnicroorganismos que se localizan en diferentes
especi es ani mal es: bovi nos, capri nos, ovi nos, cerdos, aves,
perros, gatos y el
humano, adems se han identificado en reptiles, artrpodos
y peces.
Se
consideran de alta especificidad de especie y se relacionan a problemas del tracto
respiratorio, tracto genital, glndula mamaria, articulaciones y conjuntiva (Dybvig
1ee6).
La LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclatura)
reconoce 122 especi es (LPSN 2005), aproxi madamente 85 de el l as afectan al
hombre y a l os ani mal es (Smi th 1971, Howard et al ., 1994). En l os bovi nos l as
t2
Introduccin
especies de micoplasmas responsables de ocasionar problemas
son [trlycoplasma
bovis, M. mycoides subsp. mycoides SC (small
colony), M. dispar, M. bovirhinis,
M. canadense M. bovigenitalium, M. californicum, M. alkalescens, M. arginini, M.
coniuntivae, y Ureaplasma diversum. Mycoplasma bovis es causante de mastitis,
artritis,
problemas
respiratorios, problemas
oculares e infecciones vaginales en
bovi nos (Howard
WW 1994, Ni chol as ef a/., 2003, Farshi d et at.,2008).
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Introduccin
1. 9 GENERALI DADE$
DE MI COPLASMA
Una caractersti ca pri mordi al
del gnero
mi copl asma es l a ausenci a de
pared
celular, propiedad que los hace resistentes a los antibiticos
B-lactmicos,
sensi bl es a detergentes, general mente
son i nmvi l es, al gunas especi es muestran
movi mi ento de desl i zami ento y al gunas especi es son i ntracel ul ares.
Los mi copl asmas' estn
cl asi fi cados como bacteri as
Gram negati vas, se
desarrollan en una atmsfera de aerobiosis y microaerobiosis
en medio lquido y
slido respectivamente, en medio slido al 0.8
o/o
de agar las colonias se aprecian
con l a morfol oga tpi ca de
"huevo
fri to" (Tul l y- Razi n 1970), mi den de 10 a 500
pm
de di metro, muestran una forma umbi l i cada, apari enci a que se da
por
l a al ta
densidad en la
parte
central del medio slido y menor densidad en la periferia
de
l a col oni a (Smi th 1971), al gunas especi es de mi copl asmas uti l zan carbohi dratos
como l a gl ucosa,
manosa, mal tosa y l a argi ni na como fuentes energti cas. Por su
del i mi tado potenci al genti co,
l os mi copl asmas requi eren de una asoci aci n con l a
clula husped por lo tanto
para
su cultivo in vitro requieren de medos
enri queci dos que deben contener
protenas,
esterol es y ci dos grasos, l os cual es
se adicionan con el suero de equino y/o
cerdo los cuales proveen
lpidos no
txicos y proteccin
al unirse con iones metlicos txicos.
1.1 O CARACTERSTICAS ESTRUCTURALES:
1. 10. 1 MEMBRANA:
La membrana de l os mi copl asmas es tri l ami nar, ri ca en l pi dos, por l o que
se desarrollan ln vitro en medios enriquecidos con alto contenido de esteroles,
fosfol i pi dos, gl i col pi dos, protenas etc. (Ei chwal d
ef al ., 1973, Razi n 1978). La
l 5
Introduccin
membrana de micoplasma esta compuesta
por un 50-59 % de
protenas, 35-40 Vo
de lpidos y un 2 To de carbohidratos
(Maniloff ef al., 1972). Las
protenas y lpidos
son de
gran impoftancia
por interactar directamente con las clulas del husped
y con l a respuesta i nmune. En el caso de l os mi copl asmas una funci n de l as
protenas es l a ci toadherenci a
y l os l pi dos cumpl en con funci ones de transporte
y
est r uct ur a
( Razi n et a1. , 1998,
Dybvi g et al - , 1996) '
1. 10. 2 PROTEI NAS DE SUPERFI CI E DE MEMBRANA:
Los Mi copl asmas ti enen
protenas de superfi ci e l l amadas P, Ps (protenas
superfi ci al es de membrana) o VSP
(protenas vari abl es de superfi ci e)
que han si do
estudiadas
para
conocer sus funciones
y/o respuesta inmunolgica
(Razin et al.,
1998, Dybvi g et a1. , 1996, Rosengar t en et al ' , 1994) '
La i denti fi caci n
con anti cuerpos de eptopos de mol cul as de l a fami l i a
VSP de cepas
patgenas de Mycoplasma bovis involucradas al la adherencia en
el epi tel i o i ndi ca a P26 como una
protena de adherenci a. As, se ha demostrado
que en cul ti vos de cl ul as embri onari as de
pul mn de bovi no anti cuerpos
i nhi ben
parcialmente citoadherencia
por la P26
(Sacase ef a/, 2000). Otra funcin de las
VSP de Mycoplasma
bovis es la posible evasin de la opsonizacion
por
anticuerpos
especficos
(Sachse ef a/., 2000, Razin et al., 1998). Adems de
presentar VSP y protenas estructural es
(P) l as
que ti enen l a
pri nci pal funci n de
adhesi nas, ubi cadas en el ci toesquel eto de l os mi copl asmas como M.
pneumoni ae
que tienen la p30, p57, etc. Mycoplasma bovis
posee la P48 que es una
protena
conservada de cuyo
gen a sido utilizado
para su identificacin
por la tcnica de
reacci n en cadena de l a
pol i merasa (PCR) y se ha encontrado
una homol oga
t 6
Introduccin
con la P48 de Mycoplasma agalactiae (Behrens et al., 1994, Robino et a1.,2005).
Los micoplasmas tambin cuentan con
protenas
transportadoras en la membrana,
en ef caso de M. bovis se
presentan
tres sistemas ABC, PTS y difusin faclitada.
En el si stema ABC trabaj a con una o dos protenas
de membranas con domi ni os
conservados denomi nado cassette de uni n de ATP en i ngl es ATP Bi ndi ng
-
Cassette y su sistema consiste en el paso del substrato pegado
a una protena
transpoftadora con consumo de ATP, este sistema solo se ha descrito en
bacterias, el segundo sistema de fosfotransferasa de azcares consiste en el
transporte de carbohidratos modificando la composicin qumica
del carbohidrato y
el tercero difusin facilitada de substratos a travs de la bicapa lipidica sin que
estos substratos se alteren bioqumicamente (Razin
et al., 1998, Zhao et al.,
2004). El si stema ABC, se encuentran en vari as especi es de mi copl asmas. Este
transporte consta de protenas
acarreadoras de ATP y pptidos, llamadas Opp
(Ol i gopepti do permeasa) l as cual es i mportan ol ogopepti dos uti l i zados para l a
sntesi s de ci dos nucl ecos (Razi n et al ., 1998, Behrens et al ., 1994, Zhao et al .,
2004).
Las permeasas son protenas que facilitan el transporte de molculas como
Oligopeptidos de un lado a otro de la membrana mediante transporte activo, estas
permeasas
necesitan consumo de ATP para
llevar acabo su trabajo. Las
secuenci as de l os genes de l as permeasas OppD y OppF han si do uti l i zadas
para
diferenciar a Mycoplasma bovis de otras especies de este debido a
que
Mycoplasma bovis
presenta la secuencia conservada, a diferencia de las
permeasas en Sfrepfococcos spp., Sfaphylococcos spp, E. coli incluyendo varios
t 7
T I I
. f
lniloouccl0n
mi copl asmas (Dybvi g et al ., 1996, Razi n et al ., 1998, Hopfe et al .,2003, Asi ya ef
a/., 2003).
110. 3 L PI DOS DE SUPERFI CI E DE MEMBRANA:
La membrana conti ene fosfol pi dos, gl ucol pi dos,
l pi dos neutros
(almacenamiento
energtico) o lpidos estructurales, esteroles
y
lipoprotenas,
tambin cuenta con lpidos membranales como el fosfatilglicerol o PG la cual es
i mportante en l a estabi l i dad de l a membrana (Behrens et al ., 1994, Razi n et al .,
1998, Sachese et a| . , 1999) .
Los esterol es son l os
pri nci pal es
l pi dos que conti enen l as cl ul as eucari otas en
micoplasma por su ausencia de
pared
celular los esteroles son parte fundamental
de su estabi l i dad osmti ca (Razi n
et al ., 1998).
1. 1 1 REQUERI MI ENTOS NUTRI GI ONALES
Los micoplasmas requieren para su cultivo in vitro caractersticas y
condiciones atmosfricas especficos, por su complejidad se considera un
mi croorgani smo fasti di oso, requi eren para
su creci mi ento una canti dad abundante
de esteroles proporcionados por el suero de equino o cerdo, son
quimioorganotrofos, que
utilizan a los azcares
ylo
a la arginina como fuente de
energa. El medio comnmente utilizado para su cultivo es el medio Hayflick
basado en el medi o Edwars 1956, que conti ene una base de
peptona
con i nfusi n
de cerebro-corazn PPLO
(organi smos
asoci ados a
pl euroneumona)
enri queci do
con glucosa, extracto de levadura y un pH de 7.5, ms la fuente de esteroles que
se adi ci onan en el suero equi no. Para al gunas especi es de mi copl asmas de
crecimiento ms fastidioso, se tienen medios de cultivo ms enriquecidos como lo
l 8
Introduccin
es el medi o Fri i s,
que
se uti l i za
para
mi copl asmas en cerdo, al cual se l e adi ci ona
una sol uci n de sal es,
para
una mej or estabi l i dad de osmol ari dad, suero de cerdo
y suero de equi no. El medi o Frey se uti l i za para mi copl asmas en aves al que
se l e
adi ci ona Di nucl eoti do de ni coti nami da y adeni na (NAD), ci stei na y suero de cerdo
( Howar d
et a| . , 1994) .
1.12
ACTIVIDAD
METABOLIGA
Muchos de l os mi copl asmas degradan l os carbohi dratos con l a producci n
de cido lctico y acido actico, similar a las dems bacterias. Otras especies
utilizan la
B-oxidacin
para
la oxidacin de cidos
y
utilizan el ciclo del cido
tricarboxlico
para generar acetatos.'Otras especies ms convierten la arginina en
ornitina
por la arginina desaminasa y el gnero Ureaplasma
que
hidroliza la Urea
(Smi th 1971, Howard et al ., 1994). Al gunos mi copl asmas uti l i zan l os ci dos grasos
exgenos
para sintetizar los fosfolpidos
y glicolpidos de su membrana y otros
micoplasmas incorporan a su membrana cidos grasos preformados por
el
husped (Smi t h 1971).
La i denti fi caci n de l os mi copl asmas
por pruebas bi oqumi cas requi ere
mucho tiempo
y en ocasiones los resultados son difciles de interpretar es
necesario consultar las pruebas establecidas
por el Subcomit sobre la taxonoma
de Mycopl asmas
(Howard ef al ., 1994) con el fi n de uti l i zar l as pruebas
bioqumicas recomendadas y lograr una adecuada interpretacin de estas, ya que
algunas veces solo una prueba nos diferencia alguna especie como lo muestra la
t abl a 6.
l 9
Introduccin
Tabl a 6. Caractersti cas bi oqumi cas y tamao del genoma del gnero Mycoptasma.
- - - -
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G: Glucosa
M: Manosa
A: Arginina
T: Tetrazolio aerbio / anaerobio
C: Casena
H: Hemoadsorcin
F: Fosfatasa alcalina
P/M: Pelculas y Manchas
X: No Aolica
1.13 FACTORES DE VIRULENCIA Y PATOGENICIDAD
DE
Mvcoplasma bovis.
La infeccin por micoplasma
se caracteriza por
3 aspectos importantes.
1. Enfermedad septi cmi ca, z. Di semi naci n por
sangre segui da por
inflamacin de cavidades y
afticulaciones,
3. Hnfermedad local del aparato
respi ratori o, geni tal , gl ndul a
mamari a y conj unti va (Gyl esl gg3).
20
T
- l
. l
lnffoclucclon
Mycoplasma bovis
puede tener una interaccin en un largo
periodo con las clulas
de hospedero causando efectos ci topti cos,
Farshi d et a1.,2003 menci onan
gue
Mycoplasma bovis induce la produccin del Factor de Necrosis Tumoral alfa
(TNF-
p) que sugiere la respuesta inflamatoria en
procesos de micoplasmosis
por
Mycoplasma bovis adems de mencionar la evidente evasin de la respuesta
i nmune del husped. As como l as abundantes
l i poprotenas anti gni cas
que
se
expresan en esta especi e
(Farshi d et a1.,2003)-
Mycoptasma bovis es capaz de ocasionar la disfuncin celular en el tejido
de l a gl ndul a mamari a
por l a l i beraci n de metabol i tos como l os i ones perxi do,
super-xi do
fosfol i pasas, ureasas,
proteasas, hemol i si nas
y nucl easas
que daan
de forma l ocal i zada l a i ntegri dad de l a membrana cel ul ar del husped
(Tenk 2005)-
La mastitis
por Mycoplasma bovis tiene una
presentacin clnica crnica
que se
caracteriza
por fibrosis, necrosis, exudados con infiltracin de macrfagos
y
neutrofi l os.
En l a
presentaci n aguda l a
gl ndul a mamari a muestra un exudado
seropurulento
persistente que no responde al tratamiento, lo
que
condiciona a una
masti ti s rei nci dente
(Jasper 1981, Farshi d et a1.,2003). Cuando l a i nfecci n se
torna crnica despus de 2 a 3 semanas
post-infeccin se obserua una atrofia
alveolar con infiltracin
intersticial de linfocitos
y macrfagos
(Miranda-Morales
1999, Dybvi g et al . , 1996, Jasper 1981, Far shi d et a1. , 2003) . En el caso de l a
masti ti s subcl ni ca, l a gl ndul a mamari a no
presenta cambi os aparentes, sol o l a
baja sbita en la produccin de leche
por Mycoplasma
bovls se vuelve crnica
y
reincidente,
por
esto es necesario el monitoreo
general del hato antes
que
i ndi vi dual
( Ki r k 1995) .
2 l
Introduccin
Se han obseruado explotaciones de bovinos infectados con M. bovrs,
que
presentaron
una mortal i dad del 10%
V
una morbi l i dad hasta del B0%, cuando el
cuadro respiratorio esta asociado a la mastitis
(Nicholas,
ef a/., 2003 Farshid et al.,
2003, Mi randa-Moral es et al ., 1994).
1. 13. 1 TOX| C| DAD
M. bovis
produce potentes toxinas que
ocasionan alteraciones en la
i ntegri dad de l as cl ul as del husped, as como
perxi dos,
superxi dos, enzi mas
hidrolticas como fosfolipasas, ureasas, proteasas, hemolisinas y nucleasas, as
mismo, los micoplasmas compiten por aminocidos, cidos grasos, cofactores y
vi tami nas, al terando l a i ntegri dad y funci onami ento de l as cl ul as del husped
(Razi n
et a| . , 1998).
1. 13. 2 ADHERENCI A:
La adherenci a es el pri nci pal mecani smo de
patogeni ci dad que uti l i zan l os
mi copl asmas
para
col oni zar al husped
y
es consi derado el pri mer paso
en l a
i nfecci n. La adherenci a esta dada por l as adhesi nas
que
son
protenas
l ocal i zadas en l a superfi ci e de l a membrana de mi copl asma (Thomas
et a| .,2002),
como las que presenta M. genitalium, M. pneumoniae y
M. gallisepticum P1, MgPa
y P30 respectivamente.
Las adhesi nas responsabl es de l a ci toadherenci a, son un
proceso que
involucra protenas accesorias de membrana que incluso facilitan el movimiento
l ateral (Razi n 1998). Los receptores sobre l a membrana de l a cl ul a husped son
l os responsabl es de
que
l os mi copl asmas se puedan
adheri r
y
estn i denti fi cados
como sialoglicoconjugados y glucolpidos conjugados. El contacto de micoplasma
Introduccin
con la membrana de la clula husped crea un micro-ambiente que facilita la
acumul aci n de l os productos
del metabol i smo de mi copl asma como radi cal es
superxi do
y perxi dos
l os
que
causan l a oxi daci n de l as membranas cel ul ares
del husped (Razi n 1998 y
Jacob 1992).
Mycoplasma bovis y M. canadense tienen la capacidad de citoadherirse rn
vi tro a cl ul as epi tel i al es de l a gl ndul a mamari a de bovi no, despus de 30
minutos de incubacin a 37oC, reconociendo receptores de la clula husped
(Mi randa-Moral es 1999). Al gunas especi es de Mi copl asmas l l evan acabo un
proceso de adherencia en los eritroctos del husped llamada hemoadsorcin que
es un claro ejemplo del trabajo de las adhesinas, Howard et al., 1994, menciona
que
algunos micoplasmas hemoadsorben eritrocitos de cuye
y
bovino, capacidad
trascendente
para la identificacin de algunas especies.
1 .1 4 CARACTERSfl CAS MOLECU LARHS
El
genoma
de los Mycoplasmatales es de 600-2.200 kb, correspondiente a
600-800
genes, que
se l e consi dera el mni mo necesari o para tener vi da
i ndependi ente
(Smi th 1971
,
Dybvi g et al ., 1996).
El ADN de l os mi copl asmas es
pobre en guani na (G) y ci tosi na (C) (18-
40o/,)
y ri co en adeni na (A) y ti mi na (T) (60-80%). Adems, este gnero produce
un al to ni vel de enzi mas degradati vas como l as nucl easas y l as
proteasas,
caractersticas importantes en la realizacin de pruebas moleculares. Otra
diferencia significativa con algunas bacterias es
que
los micoplasmas leen el
codn UGA como triptofano
y
E. co/i lo lee como codn de trmino. La secuencia
de los
genes del RNAr 165 muestran alta relacin con el gnero Clostridium
y
se
j
r .
' a
. t
Inoclucclon
sugi ere
que l os mi copl asmas
podran ser rel aci onados como una forma evol uti va
de este
gnero (Dybvi g et al ., 1996). Por ej empl o l a secuenci a del ARNr
subuni dad 165 muestra una pequea di ferenci a de I nucl eti dos entre al gunas
especies del
grupo Mycoplasma mycoides
(Razin, 1998, Tenk M 2005). En 1987
Cottew et al., demostraron
que algunas especies de micoplasmas estn
rel aci onadas fi l ogenti camente, si endo cl asi fi cadas dentro del mi smo grupo por
sus caractersticas, un ejemplo de esto es el
"grupo
mycoides", esta relacin la
establecieron con
pruebas bioqumicas convencionales, reacciones
i nmunol gi cas, hi bri daci n del ADN, anl i si s de l a secuenci a de genes del ARNr
165
por medi o de l a tcni ca de PCR
(Thi aucourl et a|.,2000; Ni chol as, 2002). Es
as,
que la identificacin de estas especies se dificulta
ya que no pueden ser
diferenciados bioqumicamente, adems de
presentar reaccin cruzada con
antisueros
policlonales dirigidos contra los diferentes miembros del grupo (Taylor
et at.,1992),
ya que al gunas de l as protenas i nmunodomi nantes son compafti das
por los miembros del
grupo mycoides,
por ejemplo la protena hsp60 y la
l i poprotena
p62 (March et al ., 2002). Las especi es que conforman el
"grupo
mycoides" Son: M. mycoides subsp. mycoides
LQ, M. mycoides subsp. mycoides
colonia
pequea (SC), M. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp'
capripneumoniae,
M. caprico/um subsp. capricolum
y Mycoplasma Spp. Serogrupo
7 bovino
(Blske et al., 1996); recientemente
M. putrefaciens tambin ha sido
clasificada dentro del
grupo mycoides
por su estudio del ARN ribosomal de la
subuni dad 165
(Peyraud ef a/ . , 2003).
24
1.15 TRANSMISIN DE Mvcoplasma bovrs.
Una incorrecta higiene al ordeo puede contagiar al resto del hato ya sea
por
las maquinas de ordeo o
por
el manejo de los ordeadores Mycoplasma
bovis
puede
encontrarse en el tracto respiratorio de animales enfermos o
poftadores sanos, por lo que puede ser transmitido por
descargas nasales, o
aerosol es, tambi n l o encontraremos en l eche de ani mal es poftadores
con l a
que
se alimenta a los becerros lo que puede ocasionar problemas respiratorios (Tenk
2005).
1. 16 DI AGNSTI CO
El diagnstico de la micoplasmosis se realiza con tcnicas bacteriolgicas,
serolgicas y recientemente las tcnicas moleculares.
Las tcnicas bacteriolgicas se basan en el aislamiento del microorganismo
en medi os enri queci dos y en l a i denti fi caci n bi oqumi ca en l aboratori os
especi al i zados, el ti empo de creci mi ento puede vari ar desde 1 a semanas
que
requieren por lo menos de 30 das para lograr la tipificacin, se utilizan diferentes
pruebas para la identificacin de gnero
como la morfologa de la colonia,
reversi n de formas Li ster (L), fi l trabi l i dad en 0.45 pm,
requeri mi entos de
esteroles. Para la determinacin de las especies se realizan pruebas bioqumicas
como gl ucosa, manosa, fructosa, i nosi tol , dul ci tol , hi drl i si s de l a argi ni na,
hi drl i si s de l a urea, acti vi dad de l a fosfatasa, pel cul as y
manchas,
producci n
del
tetrazol i o (aerobi o y anaerobi o), hi drl i si s de l a gel ati na, di gesti n del suero
coagul ado, casena
y l a hemoadsorci n. Hstas tcni cas requi eren de ti empo hacen
del diagnstico un proceso lento y
costoso.
25
Introduccin
Las tcnicas serolgicas, se basan en la deteccin indirecta de anticuerpos
especficos en el suero
por medio de una reaccin antgeno-anticuerpo,
permi ti endo eval uar el
grado de exposi ci n de una
pobl aci n a un antgeno. La
inmunofluorescencia
es una tcnica
para detectar la presencia del antgeno,
que
requiere de anticuerpos monoclonales
especficos
y de conjugados, lo cual hace a
esta tcni ca muy compl i cada
(Jasper 1981). Otra
prueba uti l i zada es
agl uti naci n di recta o i ndi recta,
ya que di versas especi es ani mal es ti enen
capacidad de crear anticuerpos
aglutinantes
que evidencian la infeccin
por
mi copl asmas
(Freundt y Edward 1979).
Las tcnicas moleculares utilizadas en el diagnstico de micoplasmosis
son
basadas en ampl i fi caci n de segmentos de ARNr de l a 165,
patrones
electroforticos
de protenas y secuencias de nucletidos. Existen hasta ahora
diferentes trabajos a nivel molecular como el estudio
patrones electrofortico de
las
protenas de cada especie de micoplasmas. Por otra
parte la tcnica de
reacci n en cadena de l a pol i merasa (PCR) es consi derada
l a tcni ca ms
sensible
para la deteccin
de diferentes agentes como bacterias,
virus y parsitos,
la PCR es una tcnica
que genera in vitro numerosas copas de un fragmento de
ADN a
partir de un bajo nmero de microorganismos.
En esta tcnica se requiere
de dos i ni ci adores
de ol i gonucl eti dos
(Pri mers) compl ementari os
a l as
secuencias situadas en los extremos del fragmento de ADN
que se va amplificar,
para ello se extrae el ADN de la muestra
y se desnaturaliza la doble hlice de ADN
aplicando ciclos repetidos de elevadas temperaturas
y se realiza la hibridacin de
l os dos i ni ci adores de l as secuenci as
compl ementari as
para l a sntesi s de ADN
l a
l a
26
Introduccin
por
l a enzi ma
ADN
pol i mer asa
( R f f on
et a1. , 2001, Mc Aul i f f e et a1. , 2003,
Fi l i oussi s et al ., 2005, Ghadersohi et at., 2005). Se han real i zado di ferentes
protocolos para realizar la tcnica de la PCR para la identificacin
de Alycoplasma
bovi s, a parti r
de cepas ai sl adas y
di rectamente
de l eche, l os cual es han
demostrado diferente sensibilidad y especificidad (Subramaniam
et al., lggg
Hotzel et al ., 1999, shane, et al ., 1ggg, Pi nnow et a1.,2001, Bashi ruddi n et al ..
2005, Ghadersohi ef a/., 2005).
Es necesario
establecer tcnicas diagnsticas rpidas, sensibles y
especficas como la PCR para
la identificacin de micoplasmas y llevar acabo un
control y prevencin
de este tipo de enfermedades (Bashiruddin
et al., 2005,
Hot zel et a\ . , 1999, Hi r ose et a\ . , 2001) .
1.17 PREVENCIN
Y coNTRoL PARA MvcoF,^c' i l a boy,s
Probabl emente el ori gen ms comn del probl ema
de l a mi copl asmosi s
bovi na, es debi do por l a i ntroducci n de ani mal es nuevos ya i nfectados
en el hato,
las medidas de cuarentena y los monitoreos frecuentes en leche de tanque
al macenami ento o de recol ecci n pueden
ser di sposi ci ones que
evi tarn una
infeccin de todo el hato.
A nivel de produccin
la prueba que
se realiza en Mxico para
el control de
masti ti s subcl i ni ca es l a prueba
de Cal i forni a l a cual , uti l i za el detergente al i l l auri l
sulfonato de sodio y el colorante bromo cresol. Los antispticos recomendados
para
el control no solo de micoplasma pero
efectivo para
este microorganismo,
son l os agentes que
afectan l a osmoral i dad de su membrana al gunos
j abones
que
contienen 2
o/o
de hexaclorofeno
ejercen efectos letales. Como desinfectantes se
27
T . a
. l
Introoucclon
uti l i za el fenol
(5
%), formal i na (2o/o),.l ej i a de sosa (4%), agua de cal di l ui da, 2o/o de
cl oro acti vo, cresol es, metal es
pesados
etc
(Jasper 1981
).
La temprana detecci n de mi copl asmosi s en un hato
puede ser por medi o
de un
programa de moni toreo de l os tanques de al macenami ento
y
del cul ti vo de
las muestras de leches mamitosas con la finalidad de evitar la infeccin de los
animales,
ya que los tratamientos no han sido tan efectivos hasta ahora (Howard
et a1. , 1994) .
1.18 TRATAMIENTOS PARA ltlvcoplasma bovis
Debido a
que los micoplasmas carecen de pared celular son resistentes a
los
B-lactmicos
y son sensibles a los antibiticos
que actan inhibiendo la sntesis
de
protenas y los
que afectan la sntesis de cidos nuclecos. Los ms
recomendados
para su uso son, enrofloxacina,
(quinolona) ciprofloxacina,
ofl oxaci na, l evofl oxaci na
(fl uroqui nol onas) cl i ndami ci na, oxi tetraci cl i na
(tetraci cl i na), eri tromi ci na, di ri thromi ci na, ti l osi na
(macrl i dos), estreptomi ci na
(ami nogl ucsi do) y l i ncomi ci na
(l i ncosami da). Si n embargo estos
quimioterapeuticos tienen un efecto bacteriosttico
para Micoplasma, establecer
un tratamiento ayuda a controlar la enfermedad, en ocasiones se eliminan los
si gnos cl ni cos,
pero l os ani mal es
quedan como
portadores sanos, l o que di fi cul ta
l a erradi caci n
de l a enfermedad
(Dybvi g
et al ., 1996, Fox ef a\.,2O05l l l ner et al .,
1e73) .
28
Introduccin
JUSTI FI CACI ON
La frecuencia con la que Mycoplasma bovis se encuentra relacionado con
probl emas
crni cos de masti ti s y ocasi onando
prdi das
econmi cas, es comn
encontrarl o como agente causal
pri mari o,
en EEUU Jasper 1980 y Shane C. et al .,
1999 reportaron un 4
o/o
y 88%, respectivamente a Mycoplasma bovis, el
Departamento de agricultura de USA 2002 identific 86% de prevalencia
en hatos
con
probl emas
de masti ti s ai sl adas en l eche de tanque.
El muestreo en leche de tanque permite conocer la situacin sanitaria del
hato en general , l a cal i dad de l a l eche y que l a metodol oga para l a toma de
muestra es muy senclla
y rpida. Esto conlleva a
procesar
un menor nmero de
muestras
y reduce los costos por monitoreo del hato.
El anlisis
que
se realiz en este trabajo se orient hacia los tanques de
almacenamiento
para identificar a los hatos
positivos
al aislamiento de
mi copl asmas
y ti pi fi car medi ante
pruebas bi oqumi cas y mol ecul ares por medi o de
la PCR para identificar a Mycoplasma bovis de los aislados de Mycoplasma spp,
ya que
este microorganismo esta identificado como patgeno primario en
probl emas de masti ti s haci endo su i denti fi caci n di agnsti ca ms efi ci ente. Por l o
que en este estudio,
para las cepas aisladas la identificacin de Mycoplasma bovis
se real i z por medi o de l a PCR con l os i ni ci adores PpMB920-1 y
PpMB920-2
que
ampl i fi can l os genes que
codi fi can
para l as protenas de membrana
permeasa
(oppD) y (oppF), que han presentado un 100
o/o
de especi fi ci dad
para l a
identificacin de M. bovrs
(Hotzel 1999). El monitoreo favorecer el control
hi gi ni co de l os hatos
por
medi o de l a revi si n en tanques de al macenami ento.
29
Introduccin
il. HI PTESI S
-La
identificacin molecular de cepas de Mycoplasma bovis mediante la tcnica de
PCR detectar un
porcentaje alrededor del 50
o/o
en muestras de leche de bovino
col ectadas en tanque de al macenami ento.
III. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO
GENERAL
-Detectar
fas especies de Mycoplasma spp. en muestras de leche de tanque de
al macenami ento
por medi o de ai sl ami ento e i denti fi caci n bi oqumi ca
y establ ecer
la presencia de Mycoplasma bovis mediante la PCR como
patgeno primario de la
masti ti s bovi na.
3.2 OBJETIVOS PARTICULARES
-Aislar
Mycoplasma spp. de muestras de leche de tanque de almacenamiento.
-Tipificacin
bioqumica de los aislados de Mycoplasma spp.,
para identificar las
especi es i nvol ucradas en masti ti s.
-ldentificacin
molecular de las cepas de Mycoplasma bovis aisladas de leche de
tanque medi ante l a tcni ca de l a Reacci n en Cadena de l a Pol i merasa
(PCR).
Materi al y
mtodos
IV. MATERIAL Y METODOS
4.0 ZONA DE MUESTREO
El muestreo fue real i zado en el Muni ci pi o de Ti zayuca Estado de Hi dal go,
l ocal i zado a 52 ki l metros de l a ci udad de Mxi co. Est si tuado a l os 19' 50
'
de
l ati tud Noreste
y
98' 59' , de l ongi tud Oeste del Meri di ano de Greenwi ch, a una
altura de 2, 260 metros sobre el nivel del mar, colinda al Norte con Tolcayuca y
Estado de Mxico y al Sur y Oeste con el Estado de Mxico, cuenta con una
extensin territorial de 9?. 5 kilmetros cuadrados.
La pobl aci n bovi na aproxi mada en l a cuenca es de 17, 991 ani mal es
di stri bui dos en 132 hatos con una pobl aci n promedi o
de 300 ani mal es cada hato,
l os ani mal es especi al i zados en
producci n
de de l eche y
al gunos en l a cra de
becerras de la raza Holstein. Cada hato cuanta con tanques de almacenamiento
con una capacidad de 5 000 y/o 10 000 litros, los cuales se mantienen en
refrigeracin y agitacin la leche de uno a dos das antes de su recoleccin.
4.1 GOLECCIN DE MUESTRAS
Se tomaron 224 muestras de leche de bovino de tanque de
almacenamiento en agitacin y refrigeracin de un total de 1 12 hatos. Se realiz
un muestreo dobl e con un i nterual o de 15 das, en l os meses de
j ul i o y
agosto del
ao 2006. Las muestras se col ectaron en condi ci ones pti mas de asepsi a,
para
evitar la contaminacin externa, se tomaron en recipientes estriles, de la pafte
superi or del tanque como l o i ndi ca el Naci onal Masti ti s Counci l (2002), se
transpoftaron a 4"C y se al macenaron a
-20
"C.
3 l
Materiat y mtodos
de recol ecci n de l eche.
Fi gura l . Ta
4.2 AISLAT\,IIENTO
4.2.1 MEDIO DE CULTIVO
Para el ai sl ami ento de l os mi copl asmas se uti l i z el medi o de cul ti vo de
Hayfl i ck modi fi cado (Hayfl i ck,
1965)(Apndi ce 1). El cual se basa en el medi o
bsi co de Edward (1947) hecho a base de peptonas pri nci pal mente
usando como
base el medi o de cul ti vo PPLO1 (organi smos asoci ados a pl euroneumona), al cual
se le adcion, suero de equino, extracto de levadural, glucosa2,
antibitico
(peni ci l i na) y como i ndi cador de pH el roj o de fenol s.
4.2.2 CONTHOL DE MEDIO DE CULTIVO
Para veri fi car que
el medi o de cul tvo de Hayfl i ck permi te
el desarrol l o de
mi copl asmas bovi nos que pueden
ser ai sl ados en muestras de l eche de tanque,
se probaron las siguientes cepas como controles.
1. Cepas ti po de mi copl asmas:
a. Mycoplasma bovis cepa donnetaa
b. Mycoplasma del grupo mycoides
'
Lab. DIFCO
t
t,ab. Gl gco
' Lab.
MERCK
a
Donada por la Univcrsidad de Arhus Dinamarca
32
Materi al
v
mtodos
4.2.3 PROCESAMIENTO
DE LAS MUESTRAS
Las muestras de leche se descongelaron y posteriormente
se incubaron
durante t hora a 37' C para permitir que
se liberen las bacterias englobadas
en
grasa y
se si gui l a metodol ogi a establ eci da por Tul l y et al ., 1993.
Se tom un vol umen de 200
Ul
de l eche y se deposi taron en 1.8 ml de medi o
Hayfl i ck l qui do, se real i zaron di l uci ones
deci mal es de l a 10-1 hasta 10-a y se
i ncubarons en aerobi osi s a 37' C de 24 a 48 horas. Al mi smo ti empo se i nocul aron
30
Ul
de muestra de l eche en medi o Hayfl i ck sl i do (Apndi ce
1) y se i ncub
de 4g
horas hasta 7 das en microaerobiosis6 a 37" C con el 80-85 % de humedad. Las
diluciones se revisaron cada 24 horas hasta observar cambio de pH y/o
turbidez,
las diluciones que presentaron
cualquiera de las dos reacciones,
se sembraron en
placas
de medio slido Hayflick y
se incubaron en microaerobiosiso a 37" C con el
80-85
o/o
de humedad. Las diluciones que
no mostraron cambio de
pH y/o
turbidez
se subcultivaron a los 7 das en medio Hayflick liquido, este
procedimiento
se
realiz hasta por 4 veces
para
considerar una muestra como negativa (Ruhnken y
Rosendal, 1994). Las cajas de medio slido fueron observadas cada 24 horas
durante 7 das con la ayuda de un microscopio estereoscpico7 para
distinguir
col oni as con modol oga tpi ca de Mi copl asmas (Tul l y
et al .,1gSB).
Puri fi caci n de l a cepa: A
parti r
de una pl aca
de medi o sl i do con col oni as
de micoplasmas desarrolladas, se tomaron tres colonias perfectamente
aisladas
con una
pi peta
Pasteur estri l , cada col oni a se sembr en 2 ml de medi o l qui do
t
"
Incubadora FORMA SCIENTIFIC
6
-
Jarra de anaerobi osi s BBL e l ncubadora FORMA SCIENTIFIC
7
Microscopio 7.E|ZZ
1 a
J J
Materi al y mtodos
de Hayflick y se incub en aerobiosis a 37" C de 24 a 48 horas hasta observar
cambi o de turbi dez yl o pH, consecuti vamente se subcul ti v en medi o sl i do y se
incub en microaerobiosiss con la temperatura
y
humedad
ya
mencionada. Este
procedimiento
fue repetido
por
tres ocasiones con el fin de obtener un cultivo puro
proveni ente
de una col oni a cl onada
(Tul l y 1983).
4.3 IDENTIFICAGIN DE GNERO
A parti r
de un cul ti vo de cada cepa con 24 horas de i ncubaci n se
realizaron las pruebas para determinar el gnero bacteriano.
4.3.1 MORFOLOGA DE COLONIA
La modologa de colonia tpica de Mycoplasma se obseru como un halo
externo y un punto central en el medio de cultivo slido de Hayflick.
4.3.2 FILTRABILIDAD
La fi l trabi l i dad se real i z con una membrana de
poro
de 0.45 pm de
dimetro colocada en un portafiltro8 estril, se
pas
a travs del filtro 2 ml de
cultivo liquido. Hl filtrado posteriormente se sembr en medio slido Hayflick
para
comprobar el creci mi ento de l as col oni as de mi copl asmas que pasaron por este
poro (Tul l y 1983).
4. 3. 3 REVERSI I * OE FORMAS
"LI STER' '
Esta
prueba
se realiz,
para
confirmar la morfologa tpica de huevo frito y
no l a
presenci a
de una forma L que por
al gn i nhi bi dor evi tara el desarrol l o de l a
pared cel ul ar. Se real i z qui tando i nhi bi dores del medi o de cul ti vo en medi o l qui do
8
Millipo.e
34
Material y mtodos
y sl i do para observar el desarrol l o de col oni as con moffol oga de mi copl asmas
(Howard et a| . , 1994).
4. 3. 4 REQUERI MI ENTOS DE ESTEROLES
La
prueba
de l a di gi toni na se real i z
para
demostrar l a dependenci a de
esteroles de los micoplasmas, lo que diferencia a los gneros Mycoplaslna
y
Acholeplasma. Se utiliz una
placa de medio slido y discos de
papel filtro
saturados con una sol uci n de di gi toni na al 1,5o/o con etanol absol uto, se
cultivaron cepas de 24 horas de incubacin, se les realizaron 3 diluciones
deci mal es 10-1, 10-t y 10-3 de cada una de el l as se tomo 30
pl y
se deposi to en el
medio slido haciendo una lnea de en la superficie,
posteriormente se colocaron
l os di scos de
papel fi l tro i mpregnados con 0.025 ml de di gi toni na en el centro de l a
l nea
por donde corri el i nocul o
y se i ncubo en mi croaerobi osi s a 37" C con el 80-
85 % de humedad, el resultado se obseru cuando el gnero Mycoplasma
que es
dependiente de esteroles
y se observ un halo de inhibicin del crecimiento
que
evidencia la diferencia del
gnero Acholeplasma
que no es dependiente de
esterol es
y creci al rededor del
papel fi l tro i mpregnado con di gi toni na
(Tul l y, 1983,
Howard et a| .,1994).
4.4 IDENTIFICACIN
BIOQUMICA DE ESPECIES DE
MI COPLASMAS
4,4.1 PRUEBA$ BIOQU|TVUCRS
A las cepas identificadas como
gnero
pruebas
bi oqumi cas
para determi nar
se les realizaron las
son l a si gui entes:
Mycoplasma spp.
l a especi e
que
35
Materi al y mtodos
Fermentaci n de carbohi dratos como l a gl ucosa, manosa, hi drl i si s de argi ni na y
casena, producci n de pel cul as y manchas, reducci n de tetrazol i o.
Tabla 5. Pruebas bioqumicas
para la identificacin de especies de Micoplasmas.
l M. bovi s I i i I
+/ +
!
+
i
f-
-:--i- -;-
l-
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M. bovisenitatium
I
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i lM.bovisenitatium I i i |
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|
x
,
],M-!y.:!.' r!...!E*i I;;;;l -_"-' _-.--]"--:-"l ---:"-.i
G: Gl ucosa
M; Manosa
A: Argi ni na
T: Tetrazolio aerobio/anaerobio
P y M: Pelculas y Cristales
C: Casefna
4. 4. 1 FERMENTACI N DE GLUCOSA
Para la fermentacin de la glucosa,
se realiz la metodologa como lo indica
Howard 1994, en el medi o de cul ti vo Hayfl i ckcon gl ucosa
al 50%. Se
prepararon
al cuotas en tubos con 1 ml de medi o Hayfl i ck con gl ucosa al 50 %
y se i nocul aron
con 1 ml . del cul ti vo de mi copl asma de 24 horas de i ncubaci n, se uti l i zaron dos
control es negati vos un tubo con
gl ucosa
al 50% y un tubo =i n gl u"o*a para
control
del medio todos los tubos se incubaron en aerobiosis a 37" C de 24 horas hasta
15 das, verificando previamente el crecimiento de las cepas.
En una reacci n posi ti va se observ un cambi o de pH
en el medi o de cul ti vo
vi rando el medi o a un col or amari l l o. Una reacci n negati va se observ si n cambi o
de pH en un t i empo de 15 d as de i ncubaci n.
3
Materi al y
mtodos
4.4.2 FERMENTACIN
DE MANOSA
Para la fermentacin de la manosa, se utiliz medio de cultivo Hayflick con
manosa al 50Vo, como control negativo su usaron dos tubos, uno con manosa al
50 % si n i nocul ar y uno si n manosa como control del medo de cul ti vo (Howard
1994). Se i nocul 1 ml del cul ti vo de mi copl asmas de 24 horas de creci mi ento en 1
ml de medio Hayflick con manosa al 50% y junto
con los controles se incubaron en
aerobi osi s a37" C de24 horas hasta 15 das mxi mo.
Se veri fi c previ amente
el
crecimiento de las cepas, una reaccin positiva
se consider cuando se observ
un cambi o de pH, vi rando a col or amari l l o. Una reacci n
se consi der como
negati va cuando no se observ un cambi o de pH
mxi mo en un ti empo de 15 das
de i ncubaci n.
4.4.3 HIDRLISIS DE ARGININA
Para l a prueba
de l a hi drl i si s de argi ni na, se agreg argi ni na (O,Zo/o)
en el
medi o de Hayfl i ck y se i nocul con 0.05 ml de un cul ti vo de mi copl asmas de 24
horas de i ncubaci n en tubos con 1.8 ml de medi o de cul ti vo Hayfl i ck con argi ni na
adems de i ncubar l os control es negati vos, uno con argi ni na y
el otro si n argi ni na
como control del medio de cultivo y
se incubaron en aerobiosis a 37oC de 24 horas
hasta 15 das mximo. Se verific previamente
el crecimiento de las cepas. Una
reaccin positiva
se consider cuando se produjo
un cambio de pH
observando
una coloracin alcalina (rolo) y se consider una reaccin negativa cuando no se
observ cambi o de pH
o cambi o de col oraci n en un ti empo mxi mo de 1F das.
a -
_1 I
Materi al y
mtodos
4.4.4 HIDRLISIS DE LA CASENA
Al gunas cepas de mi copl asmas l l evan acabo l a protel i si s
de l a casena,
prueba que
es ti l para l a i denti fi caci n
de mi copl asmas l a cual se real i z
agregando 32 gramos
de l eche descremada por
cada 100 ml de agua desti l ada
estr1, de la cual se agreg 1 de 7 partes
de medio de cultivo. Se inocularon 30 pl
del cul ti vo de mi copl asmas de 24 horas de i ncubaci n y
se i ncub en
microaerobiosis a 37
o
C con 80 a 85 % de humedad, en una reaccin positiva
se
observ l a hi drl i si s de l a casena como una zona cl ara en el l ugar donde creci l a
colonia y una reaccin negativa se observ sin cambio alrededor de la colonia" En
ef caso de Mycoplasma bovis es negativo a la protelisis
de la casena, y
la
especie M. mycoides subsp mycoides LC, reacciona positivamente (Ruhnke y
Rosendal , 1994).
4.4.5 REDUCCIN DEL TETRAZOLIO
Esta prueba se realiz para
demostrar la actividad del metabolismo de
algunos micoplasmas cuando el medio contiene el reactivo de tetrazolio que
acta
como receptor de electrones, se reduce y toma una coloracin roja el medio de
cultivo. Se realiz agregando 0,2o/o de 2, 3, S-trifenil-tetrazolio tanto en el medio
l qui do como en el sl i do. Se deposi taron 200
rl
de cul ti vo en 1.8 de medi o
Hayflick lquido con tetrazolio y se incub a 37oC de 24 horas hasta dos semanas.
Un resultado positivo se observ con la aparicin de un halo rojizo en el medio
l qui do. l gual mente se i ncubaron l os control es negati vos un tubo con tetrazol i o y
un tubo si n el reacti vo y se i ncubo en l as mi smas condi ci ones. Para el medi o
slido se utilizaron placas de medio Hayflick con 0,2o/o de 2, 3, 5-trifeniltetrazolio y
38
Materi al
y mtodos
se incub en microaerobiosis a 37.
o
C con 80 a 85 7o, un resultado positivo se
observ con la aparicin de una coloracin rosa a rojo
prpura intenso alrededor
de l as col oni as de mi copl asmas. La mayora de l as especi es del
grupo mycoi des
presentan reaccin
positiva a esta
prueba incluyendo M. bovis. Una reaccin
negati va se consi der mxi mo a l os 15 das si n cambi os de col oraci n.
4.4.6 PRODUCCIN DE PELCULAS Y CRISTALES.
La
produccin de
pelculas y cristales es una caracterstica de algunas
especes de mi copl asmas
que se obserua ms fci l mente al rededor de col oni as
desarrolladas en el medio slido
que contiene 20o/o de suero (Freundt and Edward
1976). La pel cul a produci da en l a superfi ci e del medi o est compuesta de
colesterol
y fosfolpidos. Los cristales son depsitos de sales de calcio y de
magnesio
procedentes de los cidos
grasos que
son liberados
por la actividad
l i pol ti ca de l os mi copl asmas
(Freundt and Edward 1976).
39
Materi al y
mtodos
METODOLOGI A DEL AI SLAMI ENTO E I DENTI FI CACI N BI OQU MI CA DE
MYCOPLASMA
MUESTRA DE LECHE DE
TANQUE
Incubar 37o C
200 pl '
1800
rl
medi o l qui do
30
rl
Pl aca sl i do
Aerobi osi s 37" C
I
I
Mi croaerobi osi s 37" C
H 8 5 %
2-7 das
Sin cambio de pH y/o
turbidez
Morfologa tpica de micoplasmas
I
Purificacin de cepa
I
I
+
ldentificacin de gnero:
Morfologa de colonia
Fi l t rabi l i dad 0. 45
pm
Reversin formas L
Dependencia de esteroles
I
Resiembra a los 5 das en
Cambio de pH y/o
medi o l qui do
turbi dez
|
'71
I
+ t
Se real i zan 4
pases,
en 30 das
aproximadamente
para
constatar
una muestra como negativa
ldentificacin de especie:
Glucosa
Manosa
Argi ni na
Casena
Tetrazolio
" / \
l r v r \ I
r
40
Material y mtodos
4.5 OBTENGION DEL CONCENTRADO DE CEPAS DE Mvcop/asma
spp. Y Mvcoplasrna bovis GEPA donneta.
Para optimizar la tcnica de la PCR se tom como control positivo
a la cepa
de M. bovis cepa donneta y como un control negativo se utiliz una cepa de
Mycoplasma spp. del grupo mycoides. Los micoplasmas se hicieron crecer como
se i ndi ca en el protocol o Tul l y et a\.,1986.,
que
menci ona l o si gui ente:
En 2 ml . de medi o l qui do Hayfl i ck (Jasper, 1981) se sembraron 200 pl de l a
cepa, Mycoplasma bovis cepa donella, Mycoplasma del grupo
mycoides. cepas de
Mycoplasma spp aisladas de muestras de leche de tanque, se incubarone en
aerobiosis a 37"C
por
24 a 72 horas, al observar cambio de pH y/o turbidez se
sembraron 20
rl ,
en pl acas de medi o sl i do Hayfl i ck, y se i ncubaron en
microaerobiosis a 37
oC
con el 80-85 % humedad durante 48 horas para permitir
el
desarrollo de colonias con morfologa tpica de huevo frito, que se obseruaron con
la ayuda del mcroscopio estereoscpico1o. A partir
de una colonia purificada
se
elabor la concentracin de cada uno de los mcoplasmas, metodologa descrita
por Tully et al. 1983; utilizando una solucin buffer de fosfatos (PBS) pH11 7.2.
4.6 LAVADO DE Mvcoplasma spp.
De l a obtenci n del concentrado de mi copl asmas se tomaron 100 ml
y
se
l avaron por
3 ocasi ones de l a si gui ente manera.
Pri mero se centri fug1z a 11,300 xg durante 45 mi nutos y se el i mi n el
sobrenadante que son los restos del medio de cultivo, posteriormente
la
pastilla
"
I ncubadora FORMA SCI ENTI FI C
t0
Microscopio estereoscopico ZEIS$
"
Potencimetro COLE-PARMER
' ?
Ultracentrfuga refrigerada BECKMAN
4 l
Materi al
y mtodos
obtenida fue resuspendida con una solucin buffer de fosfatos (PBS) pH13 7.2,
despus fue
procesada nuevamente en l a centri fugatt a 11,300 xg durante 45
minutos, este
paso se repiti por tres ocasiones ms para lavar la pastilla y al final
fue resuspendida en 1 ml. de PBS
para
ser almacenada a
-20
"C.
Este proceso se
realiz
para obtener 1 ml de Mycoplasma bovis concentrado, al igual
que
las
cepas ai sl adas de l as muestras de l eche de tanque.
4.7 IDENTIFICAGIN
MOLECULAR DE M, bOV,S POR LA TCNICA
DE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA.
4.7.1 EXTRACCIN DE ADN
La extraccin de ADN se realiz de todas las cepas de Mycoplasma spp. se
utiliz
para cada una de las cepas el protocolo de extraccin de ADN con el
mtodo de ti oci anato de guani di na como se i ndi ca a conti nuaci n:
1.- Se tomaron 500
rl
de l a cepa de mi copl asma concentrada
y se centri fug14 12
000 xg
por
10 minutos posteriormente se decant el sobrenadante.
2.- Se l e agreg l a sol uci n de l i si s l . con Ti oci anato de Guani di na,
(Apndi ce l l l ) y
se homogeniz la pastilla en el voftex1s durante 5 minutos al final se incub
durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3.- Se agreg sol uci n l l . Con Acetato de amoni o 7 .4 M, (Apndi ce l l l ) que i nacti v
a l as endonucl easas
que fueron l i beradas al romperse l a membrana de l a cl ul a.
Se Invi rti 5 a 6 veces e i ncubando durante 10 mi nutos en hi el o temperatura a l a
que
acta mej or el acetato de amoni o.
tt
Potencmetro coLE-PARMER
ra
Microcentrifuga BIOFUGE
't
V.rrt** LABNET
42
Material y mtodos
4.- Posteri ormente se agreg l a sol uci n l l l . (Apndi ce l l l ) Que conti ene cl oroformo
alcohol-isoamilico, se homogeniz con el vortex por 5 minutos y
se centrifug
durante 15 mi nutos a 12 000 xg, con l o que se observaron tres zonas
perfectamente
delimitadas, de la
primera
fase de la cual se obtuvieron los cidos
nuclecos
que
se
quedaron
en una fase acuosa ubicada en la parte
superior, la
segunda
que
fueron restos celulares y la tercera donde se encuentran los
materi al es orgni cos de l as sol uci ones antes uti l i zadas.
Se tom con mucho cui dado l a parte acuosa y se deposi t en un tubo de 1.5 ml y
se agreg nuevamente cloroformo alcohol-isoamilico para repetir el paso numero
4, esto se realiz con el fin de eliminar los restos celulares y
de sales residuales.
5.- El sobrenadante se tom
y
se le agreg solucin lV (etanol absoluto)
para
precipitar el ADN, que se homogeniz con el vortex 5 minutos y se centrifug a 12
000 xg
por 15 mi nutos.
6.- Posteriormente se tom el
precipitado
de ADN
y
se agreg solucin V (Etanol
al 7}o/o) para purificar el ADN, se homogeniz con el vortex 5 minutos
y
se
centri fug
por 15 mi nutos 12 000 xg, este paso se repi ti 3 veces para puri fi carel
ADN.
7.- Al concluir se dejo secar a temperatura ambiente por 12 horas
aproxi madamente.
B.-Fi nal mente se resuspendi l a pasti l l a de ADN con 50
Ul
de agua bi desti l ada
estri l
y
se al macen a 4' C hasta su uso.
43
Material
y mtodos
. . . . .
4.7.2 REAGTIVOS
PARA LAS REACCIONES
DE LA PCR
INICIADORES
Se uti l i zaron l os i ni ci adores
de l as secuenci a
del gen que codi fi ca
para l a
protena
Oligo
-peptido
permeasa
que identifica a Mycoplasma bovis, secuencia
homol oga
de l as oppD
y oppF, con acceso en el Gen-Bank AF1301 19.
PpM8920-1
t
I
PpM8920-2
\
\
I
6 1
n r ^ ^ ^ n ^
l , gLI LNUI
TTCGAAGTCA
TAATTTCGCA
ATITA;U\CCGTI
CTGGCAAAAT
GTCCGTTTTA
ATACATGAGC
TATGTACTCG
AAGGAACCCC
TTCCTTGGGG
ACTTTGCCTT
^ l n l n n ^ r F
r f f i sL4u!
TAGAACATAG
ATCTTGTATC
AJ\\UU\GTCA
TTTTTTCAGT
AJ\CruU\GCTG
TTG'ITTCGAC
GGTGAGTCAG
CCACTCAGTC
] m ^ l mnnr m
AAATTACCAA
CGCGAAAAGT
GCGCTTTTCA
Mycoplasma
hovis oppD y oppF 2004 bp.
Fi g. 2. Secuenci a de OPPD
Y
OPPF
TTTAGCTCTT TTTGAACAAA TACGTCAAGA
GTACAATATA
AAATCGAGAA AAACTTGTTT ATGCAGTTCT CATGTTATAT
TAACATTAGT GTTGTCGCTA AGTTTTGTGA
ATATATTTAT
ATTGTAATCA CAACAGCGAT
TCAAAACACA TATATAAATA
TGTTGAAAGA GGAACTAGAA AAGATATTTT
TACTAATCCA
ACAACTTTCT CCTTGATCTT TTCTATAJU\J\
ATGATTAGGT
GCTTATCTCG GCTATACCTG AAATGATGA TGAGAGATTA
CGAATAGAGC CGATATGGAG
TTTTACTACT ACTCTCTAAT
ACCAGATA"IG GCAAACTTAC CTATCGGTGA
CCCTTTTGCA
TGGTCTATAC
CGTTTGAATG GATAGCCACT GGGAAAACGT
AGAAATTGAC TAIIGA,UUU\G
AACCACCATT AATTGAAATT
AACGTGACTA CTTCACCCTG ATGCACCA.AA
AJ\TIAC A;\'\GA
ACTA'U\i\,\GT
TTTAGAAAGG TATTTT'AU\GA CGATGAAGAA
TCATTTTTCA
AAATCTTTCC ATAAATTTCT GCTACTTCTT
TTTTAGAAAT TCAAGATCTT Ai\i\i\\GTACT
TTTTAAATAA
AJUU\TCTTTA
AGI'TCTAGAA TTTTTCATGA AAAATTTATT
TTGATGGTGT GTCATTTAAA
TTACATGAAG GTGAAATAGT
AACTACCACA CAGTA'U\TTIT AATGTACTTC
CACTTTATCA
GAAGTGGAAA AACCACTGTT GGACGTTCAA
TTCTAAGGCT
CTTCACCTTT TTGGTGACAA CCTGCAAGTT
AAGATTCCGA
TTGTTACTT'T AGATGATCAA ATCATTAGCG
GAGAAAGCAT
AACAATGAAA
TCTU,CTAGTT TAGTAATCGC CTCTTTCGTA
TTTTGCGTAA AAGAGTGCAA ATGATCTTTC AAGATCCACA
AJUU\CGCATT TTCTCACGT'I TACTAGAAAG
TTCTAGGTGT
TCAATAATTT
AGTTATTAAA
U I I N f U f l I U
CAATACATAC
GCTCACCCTT
^ ^ ^ - ^ ^ h l
LNUI USUl . s
TTCTCAATTC
AAGAGTTAAG
CCTIAGNU\TIG
GGATCTTTAC
AATAGTCATC
CCruUU\GAJ\T
1 1 n n l ^ ^ l m
ATTGCTGTTA
n ^ ^ mn l ^ ^ f r ^
GCCATTCCAG
CGGTCTAATT
^ ^ n ^ i i
ULLUNf l l . u
TTATGACGAT
AATACTGCTA
'I'TTCTIzuUUUU\
AAGATTTTTT
CGCGTCTTI'A
^ ^ ^ d n n ^ n m
LLNUf f i I
1 2 1
1 8 1
24r
3 0 1
3 6 1
42L
4 B l
5 4 1
6 0 1
6 6 1
' 12r
44
Material y
mtodos
781 AACGGCCAA
TTGCCGGTTT
841 A,\GC4JUUU{'\
TTCGTTTTTT
901 ACATTTTTGC
TIGTIA;\UU\CG
961 TCTAGCACAT
l n l mr f , mn ml
1021 AACTTATCTA
mm^ l l ml l m
1OB1 ATGGAAAGCT
mn r ^ h mm^ l
1141 TACGNUU\GC
ATGCTTTTCG
1201 AATGCTACAA
mml n n l mn mm
1261 GATGCATTAA
CTACGTAATT
].321 AATGATTATT
mml n m^ ^ ml l
1.381 GAGATCAAAA
CTCTAGTTTT
1441 AACTATIAJUU\
TTGATATTTT
1501 AAGTTAAGTT
TTCAATTCAA
1561. ACTAATAGTT
TGATTATCAA
1621 GTTGCTAAGT
n ^ ^ n n l m m n ^
1681 AACCATTCTA
TTGGTAAGAT
1741 GCTCAAAAGG
CGAGTTTTCC
1BO1 GAAGCTGCTG
n mmr n l n r ^ n
1861 TATAACAJUU\
ATATTGTTTT
1921 CTTTTATATA
^ l x ^ h m ^ ^ d
1981 AATGAAGCGT
TTACTTCGCA
AAACTATCTA
mmm^ l ml n l m
CTGATGATCT
(l A(-TA(.T' AIIA
m m1 n A l l
AAATACGATT
TTTTTCCTAA
NUUU\GGATT
TITGATGAJUUq
AACTACTTTT
CAATTATTAA
GTTru\Tzu\TT
l ^ n n ^ ^ i n mm
TTCGCGTCAA
AGGAACTAGA
TCCTTGATCT
ACAAATTAAG
TGTTTAATTC
,T|ATFTAA(-T' AA
l m^ l mmn ^ mm
TTTGCCGTTA
l ^ ^ n n l l m
AAGAGCTAAC
TTCTCGATTG
ATTTATCAAT
TAAATAGTTA
mmm^ n l mm^ l
l l ^ m n m l l ^ m
TAATAATTGA
ATTATTAACT
ATGAATTAGA
TACTTAATCT
AAATTATTCA
TTTAATAAGT
AGCA'UUU\TT
TCGTTTTTAA
AT\4l\TCAJUU\
TATAAGTTTT
A,U\ATTITAJU\
TTTTAAATTT
TTTTTGAAAA
AAAAA( - TTT1T
fAGCATTCTT
ATCGTAAGAA
1 r n l ^ mn l n
TIA;\i\TICACTG
I AA( I FTI AAAA
TT'ICAATTTT
ATGATCAGAT
n ^ ^ ^ n i
TTTTGTTTCT
ruUu\qA'\'\GA
m^ l n l m ml n
ACTCTACATG
m l ^ l ^ x m ^ l m
ATCT'ITATTA
ATTAJ\CTA,U\
TAATTGATTT
TGLATTAGAC
ACTTAATCTG
CNUUU\CGCT
- mmmmmr r n^
TGCAAGATTA
ACGTTCTAAT
CAACAAAATA
GTTCTTTTAT
AGATCAAATT
TCTAGTTTAA
ACACTTAGAA
TGTGAATCTT
^ m^h^ ^ r n^ m
TAGACTAATA
ATTTAATTCA
TIAiL\TfItN\GT
TTCAAAAGAT
AAGTTTTCTA
GGCTAATGCT
CCGATTACGA
TCAAATTAAG
AGTTTAATTC
AACTCAGCAA
TTGAGTCGTT
GCTT
CGAA
AAAGAACCTT
hh^hm^^^ ^
i r r L r r u u M
TGAJUUUUU\G
ACTTTTTTTC
ATTASAAACC
m^ l mmmmm^n
^ n l n i ^ f r mn
TCTGATTAAC
TATTTTAACT
ATAAAATTGA
T'CN\,\CAC4G
AGTTTGTGTC
n l mn mn l n mm
n m^ n ^ A f n 1 l
AAATTATGTA
TTTAATACAT
l i l n ^ i m m ^ l
TTTCTTAACT
TTTAATAATT
AU\TTATTIA'\
l l ml n mm^ ^ n
TTATGAATGC
l n n mm^ n l mn
TCCAATCTAC
CGTAAATTTA
GCATTTAAAT
JLf l L I LLLf f i
l r mn l f , r n mm
i l ^ mmmn l n
TTGAAACTAC
GCACTTAGGA
CGTGAATCCT
GA,UUU\CCAG
CTTTTTGGTC
GAGAAAGTTT
CTCTTTCAAA
n l l m m ^ n l n l
GTTAATCTGT
n n ml mm^ l mn
n n ^ m n i i n
TAGTTGTCAA
ATCAACAGTT
TTACTGAGAA
^ l mn ^ m^ mm
mmt l n ^ ^ l l
AATTCCGTTA
ACTTTAAGTT
TGAAATTCAA
^ n mml ^ ^ l ^
TGAATCTTCT
ATCAATTAAT
TAGTTAATTA
mm^ l n n l l
AACTCGTTAA
AGTATTCACA
m l ml ^ ^ mn m
AAGAGTTAAA
TTCTCAATTT
TTCTTTCGGA
l.gUffiULL 1
ACATAGATTT
TGTATCTAAA
TAATCAAAAA
ATTAGTTTTT
mr r n mn l ^ mm
AACGACTTAA
mmmn ml l ^ n ^
^ ^ l n l mmmn m
TTAATGAATA
AATTACTTAT
l m l ^ l ^ ^ ^
TATAACTTCT
CTTTTGGCAA
n n l l l n n ^ mm
TCAAAGCTGA
l ^ mmmn n ^ n m
AAGACATTCT
TTCTGTAAGA
l mn mn l x n mm
TAGACTTCAA
Tfu\CATA'\TT
Ammn ml mmh l
CTTTCAATTT
(l A
AAGTFTFAAA
m i i n l ^ ^ n i
ATTACTCGGT
^ ^ ^ m^ ^ ^ ^ ^
I U N U I U U U M
^ F m^ l ^ n mm
^ l l l n l l h n l
TTTTGTTTGT
GGCTTTCTAT
CCGAAAGATA
AGACTATATA
TCTGATATAT
A'\i\GCAi\TIATI
TTTCGTTATA
A'\GTA'\TICA;\
TTCATTAGTT
ATATAAGAAC
TATATTCTTG
TTACTTTTTT
AJ\TIGAJUUUU\
ATATAAGTCT
TATATTCAGA
AAACAAATAT
TTTGTTTATA
CTTTAAAGCA
n l l l mmn ^ m
TCTAAAGTTA
AGATTTCAAT
TTCAATCAAG
1 mml n mm^
GAAAGAATTA
CTTTCTTAAT
A,U\CGATI'A,\,\
TTTGCTATTT
TAATGAGAGC
ATTACTCTCG
rII\UUU\GATT
ATTTTTCTAA
45
Material
y mtodos
MobOPPD-FORWAR
Posicin
(1 0-21)
MobOPPD-REVERSE
Posi ci n
(1 921
-1
903)
Fig. 2 Secuencia
del
gen que corresponde a Ia permeasa OppD/F.
Se muestra la
i dnti fi caci n
de l s ol i gonucl eti dos
MobOppD-F
en amari l l o
y l os
ol i gonucl eti dos
de MobOppF-R en naranj a.
i ccctcrcAfiAAGAATGT
c
i
" " , - - - l
I
I
I
i
El Bufferlo
para las reacciones
se utiliz en una concentracin
de 10 X
El Cl oruro de Magnesi ol s
1MgCl 2),
se uti l i z a una concentraci ,n
de 25 mM, l a
TAe
pol i merasal s se uti l i z en una concentraci n
de 1.9 Ul
(Uni dades
l nternaci onal es),
l os DNTP' S, se uti l i zaron en una concentraci n
de 200 MM de
cada uno. El marcador
de
peso mol ecul ar
que se uti l i z fue el 1 Kb DNA Ladderl T
para verificar el tamao del
producto'
4.2.3 opTtutzAcl N
DE LA TcNl cA DE LA REAcCIN
EN cADENA DH LA
POLIMERASA
(PCR).
Una vez
que se obtuvo el concentrado
de Mycoplasma
bovis cepa donneta
se real i z l a opti mi zaci n
de l as condi ci ones
de PCR, uti l i zando
el protocol o de
Hotzel 1999
y se utiliz como control
negativo a la cepa de Mycoplasma
spp' del
grupo mycoides.
,U
ALTA ENZYMES
't
tNVITROGEN
46
Materi al y mtodos
Debi do a
que
no se obtuvo una ampl i fi caci n se modi fi caron l as canti dades de
reactivos y
las condiciones mostradas
por Hotzel 1999. Las reacciones utilizadas
fueron de un volumen total de 25
pl
cada una,
para
optimizar la reaccin se
utilizaron 3 reacciones una con la cepa de Mycoplasma bovis cepa donneta, otra
Mycoplasma del grupo mycoides
y la otra como control de los reactivos y/o
contaminacin sin templete de ADN en su lugar se agreg agua bidestilada estril.
Tabla 8. Reaccione$ para la PCR
t )t
rj . r
PPMBsto7
i Bi;-rr;'To x
1 p l
d:s"
i 7 5 r
I
i
-[-
- ---__------**
r;'
--'
r
j t ' l
i b
" l i . 7s
pr
f0
i5
Lrt-
---
i
o}5
i
TOTAL
7.s
i
I
32.25 pl
I
I
I 0. 75
ul
r t c p l
41
Material y intodos
Desnaturalizacin
I ni ci al
96' . C
240 s
P C R
Desnaturrlizacin Ext ensi n
72".C
9 0 s
Al i neaci n
50". c
4 5 s
10 L' t(' t
(-)s
94" . C
3 0 s
Extensin Final
72".C
420 s
Tabl a 9. Condi ci ones de temperaturas para l a PCR
ETAPA
Desnatural i zaci n l ni ci al
r Desnatural i zaci n
Al i neaci n
Extensin
Extensin Final
g60c
g40c
500c
72"C
72"C
TI EMPO
240 s
r
30s
4 5 s
9 0 s
i 420s
4.7.4 VISUALIZACION DE GEL
Para vi sual i zar el producto de l a PCR se real i zo un gel de agarosal E al 17o
en 50 ml de TAE 1X con 5 pl de bromuro de eti di o. Se cargaron l as muestras
j unto
con l a sol uci n de carga tei da con 0,? T" de Azul de Bromofenol y 0,2/" de Ci anol
de Xyl eno.
En el pozo 1 se depositaron el 3 prl del marcador de peso molecular 1 Kb
DNA Ladder
(Figura 3) en el pozo 2 se colocaron 5 pl de Mycoplasma bovis cepa
donneta, en el
pozo 3 se colocaron 5
-rl
de Mycoplasma spp. Por ultimo en el pozo
4 se deposit la reaccin sin ADN como control negativo.
' t
t-AB. AcARosA
48
Materi al
y
mtodos
La muestra se corri por el ectroforesi s con un buffer de corri da en una
sol uci n de TAE 1 X a 80V
por 45 mi nutos. Posteri ormente el gel
se observ en el
t r ansi l umi nador , donde se vi sual i z el mar cador de peso mol ecul ar en el
pozo 1 y
en el pozo
dos el ampl i con de 1.9 Kb, en el
pozo
4 y 5 (control es negati vos) no se
obser v ampl i f i caci n al guna ( Fi g a) .
f "i grrrn 4. Product o de P(l R M. l , t opl umu or, H cepa donnet a en t ransi l ul ni nador con l uz t l l t ravi ol ct a.
Banda de arrrpl i con dc procl uct o
dc A,ltr' 17rsmu hovi,t. 1.9 Kb
Despus de observar el transi l umi nador se l l evo el gel
al fotodocumentador
tn
para
t omar l a i magen.
En ambas i mgenes l a cepa de Mycopl asma bovi s cepa donneta ampl i fi c con l os
i ni ci adores
en al reacci n de PCR, l a cepa de Mycopl asma spp. del
grupo
mycoi des no ampl i fi c al i gual que
con el control negati vo si n ADN.
' "
Kol ) AK
4L)
Materi al
y mtodos
4.8 ANLI.SIS ESTADISTICO
Los resultados de las pruebas utilizadas en este trabajo se analizaron con el
programa Anl i si s epi demi ol gi co de datos tabul ados EPIDAT 3.1
20
para
eval uar
los resultados con el ndice de concordancia entre las dos metodologas utilizadas
(pruebas bi oqumi cas
y l a PCR) cal cul ando el val or de Kappa de Cohen segn el
cuadro de Landi s
y Koch. Tabl a 1o
1O.Cuadro Landi s y Koch.
Or"6p,,dFlaclefdo
. 1 ; , :
. , . , . ,
"
sin Cid
r
-; -"-*-,- "'
r;
---;------
I lnsqnlTtcanle
I
i
I
EaJo
rc=;t
I
I
0,2-b,+
I
f
03-0;6
I
I
i
;6-0,s
I
20
Progranra IIPIDAT 3.1 Organizacin panamericana de la salud
50
Resul tados
V. RESULTADOS
5.1 RESULTADOS GLOBALES EN LOS HATOS MUESTRADOS DE LECHE DE
TANQUE DE ALMACENAMI ENTO.
Un hato se consi der como posi ti vo
cuando se detect en uno de l os dos
muestreos l a presenci a
de mi copl asmas. De l os 112 hatos muestreados l a
preval enci a
de Mol l i cutes fue de 84
(75
%) hatos y 28 (25
%) hatos resul taron
negati vos al ai sl ami ento. Los hatos que resul taron posi ti vos al gnero
Achol epl asrna
spp se consi deraron hatos negati vos a mi copl asma con l o
que
se
determi no l a frecuenci a de Mycopl asma spp. en l os hatos en estudi o
que fue del
62 %
(6e).
El porcentaje
observado de Mycoplasma spp para cada uno de los
muestreos fue el si gui ente, en el muestreo 1 (M1) (32
%) hatos posi ti vos y en el
muestreo 2 (M2) (30
%) hatos (Grafi co
3),
Grafi co 3 Porcentaj es de Mycopl asl r?a spp en l os di ferentes muestreos 1 (M1) y 2 (M2)
5 l
Resul tados
De l os 69 hatos consi derados como posi ti vos, 20 (18
%) de el l os resul taron
posi ti vos
en ambos muestreos y l os 49 (44%)
restantes fueron posi ti vos
a uno sol o
de l os muestreos (Tabl a
1 1).
Tabl a
' 1
l Porcentaj es de hatos posi ti vos a mi copl asmas
AI SLAMI ENTOS EN HATOS
DE Mycoplaslna spp
Posi ti vos
a un sol o mLl e$rreo
Posi ti vos en ambos muestreos
Total de hatos posti vos
Negati vos
Hatos total es
HATOS
49 44%
20 18%
69 62%
43 38%
112
5.2 RESULTADOS GLOBALES DE LAS MUESTRAS DE LECHE DE TANQUE
DE ALMACENAMI ENTO.
Las 224 muestras de l eche de tanque anal i zados en l os dos muestreos
arroj aron el si gui ente resul tado: l as muestras de l eche posi ti vas
a Mol l i cutes
fueron 84 (38
%) y 140 (62%)
negativas (Grafico
4).
Grafico 4.- Muestras postvas al aislamiento de Mycoptasma spp.
NECi A IIVAS
6 2 %
-52
Resul tados
Se observ que
en sol o dos muestras
posi ti vas
se present el ai sl ami ento
de ms de una col oni a, l as cual es mostraron morfol oga di ferente, una de el l as
presento
2 ti pos de col oni a
y l a otra
presento
3 ti pos de morfol oga,
por l o que
obtuvi eron un total de 87 ai sl ados de mi copl asmas.
5. 2. 1 I DENTI FI CACI N BI OQU MI CA DE t AS ESPECI ES DE MI COPLASMAS
AI SLADAS EN LECHE DE TANQUE DE ALMACENAMI ENTO
5. ?, 1. 1. l dent i f i caci n de gner o
El 100 % de l os ai sl ados pr esent ar on mor f ol og a t i pi ca de mi copl asmas ( Fi gur a 1) ,
fueron fi l trabl es a 0.45
"rm,
asi mi smo, en l a prueba de sensi bi l i dad a l a di gi toni na
7? (82
Yo) cepas se identificaron como Mycoplasma spp.
y
el resto como
Achol epl as/.na spp. (Fi guras 2 y
3)
Fi gura 1. Morf ol ogi a de Mi copl asma
2. Sensi bi l i dad a l a di gi toni na de Mi copl asma. 3, Gnero Acholeplasma spp.
f -')
Resultados
5.2.1.2 l denti fi caci n bi oqui mi ca de especi e
Para l a i denti fi caci n de especi e de l os ai sl ados se real i zaron l as pruebas
si gui entes, fermentaci n de l a
gl ucosa y manosa, hi drl i si s de l a argi ni na
y
de l a
casena, adems de l a reducci n del tetrazol i o. Como se muestra en l a tabl a 12
los resultados de las pruebas nos dieron a conocer 4 de las especies con mayor
i mpoftanci a a ni vel de mi copl asmas asoci ados a
probl emas
de masti ti s,
Mycoplasma bovis, M. californicum, M. canadense y M. alkalescens,
conj untamente, un
grupo
de cepas de mi copl asmas ai sl adas no fue posi bl e su
identificacin con las pruebas realizadas, ya que
se presentaban resultados
variables, es as que se determin ubicar estas cepas como Mycoplasma spp.
Tabla 12. Resultados de la pruebas bioqumicas realizadas a los aislados
para
la identificacin.
M. bovis
y anaerobi o. i de l a argi ni na, casena
M. caliomicum
i
Fermentacin de la glucosa, hidrlisis de la arginina y
I
I
casena
;
i-FermeniCi
de rtbrucGlio, ir-ioiSiisii ob t
l
;
arginina, casena y reduccin del tetrazolio aerobio y
i
i
anaerobi o
[------___-_
--- -
t'Feimniin de ta manosa,
I, M, canadense
I
i
reduccin del tetrazolio
l
I
I
M. alkalescens
Fermentaci n de l a gl ucosa, manosa, hi drl i si s de l a
casena
y reduccin del tetrazolio aerobio y anaerobio
Vari abl e Myo,s'nd b Viiaue
54
Resul tados
Fi g. 5 Tetrazol i o posi ti vo de Mycopl osms bovi s
Fi g. 4 Morfol oga tpi ca de Mycopl asmo
Mycoplasma bovis
Fi g. 5 Tetrazol i o posi ti vo l i qui do de Mycopl asma bovi s
Mycoplasma canadense
Fi g. 6 Tetrazol i o posi ti vo de Mycopl osms cqnadense
Fi g. 7 Manosa posi ti va Mycopl asma cqnqdense
Mycoplasma spp,
Fi g. B Casena posi ti va Mycopl asma spp.
Con l a i nterpretaci n de l as reacci ones de l as
pruebas bi oqumi cas real i zadas, de
las 72 cepas de Mycoptasma spp, se identificaron, 43
(60 %) especies
identificadas como Mycoplasma bovis 5 (7%), fueron identificadas
como
: l
,\.r
ih
'dil
J H
'd.
.55
Resul tados
Mycoplasma
californicum 3
(4%),
Mycoplasma alhalescens 2(3o/o), Mycoplasma
canadense y por
ul ti mo 19 (26%) Mycopl asma spp.(Grafi co 7),
Grafi co T Esoeci es ai sl adas en l os 87 ai sl ados de muestras de l eche de tanoue.
1
' '
: !
r n
5 -
M canader?se
5
r"-"
*"' .' 4
H f i
q, 'r
M calfoncutn M tovts
5.2,2 ESPEqIES DE MICOPLASMAS AI$LADAS EN MUESTREO 1 Y 2 DE
LECHE DE TANQUE DE ATMACENAMI ENTO
En el grafi co 8 se
puede
observar l os ai sl ados en l os di ferentes muestreos
mostrando un comportami ento si mi l ar entre cada uno.
Grafi co. I Especi es de mi copl asmas i denti fi cadas en Muestreo 1 y 2
ESPEGI ES AI SL ADAS EN MUESTREO MI Y M2
? 5
2(]
1 5
1 ( )
5
o
I
ffiM
M. t l kl est t t s
#rfiM
-."
3 _
[:thr
A l l ol e/ ] l rs t }1a M. (: -i l t t (t (j t t -\ (r M. Gal f onj cLt | 1
56
Resul tados
' l
rbl n 13. l cl ent i f l caci ri n
bi ocui rrri ca con l os resul t acl os <Je l as ccpas i nvol ucrrcl as en cl cst udi o.
+l +
ldentificacin Bioqu imica
M. bovis
M. californicum
M. alkalecens
M. canadense
M. spp
M spp
D, Di gi t oni na
G Gl ucosa
Ar Ar gi ni na
M: Manosa
C; Case na
T, Tetrazol i o
V: Vari abl e
5.2.3 RESULTADOS
DE HATO$ POSITIVOS AL
AISLAMIENTO DE 44, OovIs
De l os 112 hatos muestreados con una pobl aci n
aproxi mada de 241
bovi nos en producci n
sol o 38
(34
%) hatos resul taron posi ti vos
al ai sl ami ento e
i denti fi caci n
bi oqui mi ca de Mycoptasma bovi s y 7a (66
%) fueron negati vos.
Grafico 9. Hatos positivos
a Mycoplasma bovis
57
Resul tados
5.3 RESULTADOS
GLOBALES EN LOS HATOS MUESTRADOS DE LECHE DE
TANQUE
DE ALMACENAMI ENTO
POR REACCI N EN CADENA DE LA
POLI MERASA ( PCR)
La tcni ca de l a PCR, arroj l os si gui entes datos. Del total de l as 87 cepas
ai sl adas se obtuvo que 33 fueron i denti fi cadas como M. bovi s, y
l as 54 restantes
fueron negati vas.
De l as especi es i denti fi cadas bi oqumi camente como Achotepl asrna spp,
tambi n resul taron negati vas por medi o de l a PCR. As que del total de72 cepas
de Arl ycopl asma
spp. por medi o de l a PCR se obtuvo una
preval enci a
de 46 %
(33)
de Mycoplasma
bovis.
Grafi co 10 Cepas i denti fi cadas como M bovl s
por
l a
pCR
" J
Para el pri mer
muestreo (M1)
22 hatos resul taron posi ti vos,
al observar el
producto
del ampl i con correspondi ente a 1.9 Kb en l os gel es de agarosa al 1 % de
l a reacci n de PCR, con secuenci a que
codi fi ca para
el gen de l a permeasa
OPPD
y OPPF. De Mycopl asma bovi s, y para
el segundo muestreo (M2)
sol o 11 hatos
resul taron posi ti vos
al ser i denti fi cados al observarse el producto del ampl i con.
58
Resul tados
Reacci ones
de PCR de l os 87 ai sl ados
1 l dent i f i caci n de cepas 1 a 17 pr
pCR
par a M bovi s
2l dent i f i cac n
de cepas 1B a 33 por
pCR
par a
M. bov s
3 l denti fi caci n de cepas 34 a 49 por PCR para M. bvi s
4 l denti fi caci n de cepas 50 a 65 por PCR para M. bovi s
-59
n 1 . 1
l(esuttaoos
Las
pruebas bioqumicas expusieron la identificacin de 43 aislados como M. bovis
mientras
que la tcnica de la PCR, mostr a 33 aislados. 30 cepas fueron identificadas
por
ambas metodologas como M. bovis, las 10 cepas restantes que bioqumicamente
fueron identificadas como M. bovis para la PCR resultaron negativas. Tres de las cepa$
aisladas como M. bovis cuando bioqumicamente fueron identificadas como M.
canadense, M alkalescens y Mycoplasma spp.
5. 5 ANALI SI S ESTADI STI CO.
DETERMI NACI ON DEL I NDI CE DE CONCORDANCI A PRUEBAS REALI ZADAS.
Para exami nar l a concordanci a de l os resul tados de l as metodol ogas
utilizadas se desarroll un cuadro de 2 x 2 para
obtener el valor de Kappa de
Cohen con dos observadores
(Resul tados de ambas metodol ogas) con el
programa de EPIDAT 3.1 (Tabl a 14).
Tabl a 14 .Determi naci n de l os resul tados de pruebasbi oqumi cas
y PCR.
I
I
I
i - "
I
P c R
i
I
(. ; i
" -i "-?f *. i
(*)
BIOQUIMICAS
(-)
TOTAL
Tabla 15 .Determinacin Los resultados arrojados fueron los siguientes
87
Nivel de confianza del ndice de concordancia
Val or de Kappa de Gohen
62
Di scusi On
VI. DISCUSION
6.1 lDENTlFlCAclN DE Mycoptasrna spp.
Se l ogr el ai sl ami ento de bacteri as de l a Cl ase Mol l i cutes en l a l eche de
tanque de al macenami ento en 84/1 12 (75%) hatos l echeros. De l os cual es, con l a
prueba
de la digitonina, se obsery 69 (62%) hatos positivos
a Mycoplasrna spp. y
15 (13%) positivos
a Acholeplasma spp., este ultimo microorganismo est
considerado como apatgeno y
contaminante del medio ambiente, en contraste el
gnero
Mycoplasma spp est considerado como patgeno
de los animales
domsticos, causante de mastitis y problemas respiratorios en los bovinos. Los
resultados son similares al estudio realizado por Jasper 1981 en Norle Amrica
donde obtuvo un 64
o/o
de muestras de leche de tanque positivas
al aislamiento de
Mycoplavna spp. Asimismo, Richard et al., 2006 en Canad obtuvieron un 74
o/o
de aislados positivos a Mycoplasma spp. en leche de tanque. Se encontraron
estudios realizados con leche directa de bovinos con problemas
de mastitis clnica
porJasperen
1981 donde l ogr i denti fi car a Mycopl asma spp en el 52% de l as
muestras de leche analizadas y un 5% a Acholeplasma laidlawii y Miranda-
Morales, report un 75o/o de Mycoplasma spp. en el estado de Hidalgo, Mxico en
el ao de 1999.
6.2 Tl Pl FfcACtN BtoOUMtcA DE ESPEG|ES DE Mycoptasrna spp.
De las cepas de Mycoplasma spp (72) se identificaron bioqumicamente las
siguientes especies, Mycoplasma bovis 43 (60%), Mycoplasma californicum (7Yo),
Mycoplasma alkalescens
(4%),
Mycoplasma canadense (3%), porcentajes que
coi nci den con l os resul tados de Jasper 1981 que de 104 muestras de l eche de
63
Di scusi n
tanque de bovino identific a M. bovis en un 57
a/o,
a M. alkalescens, M canadense
y M. bovigenitalium en un 5 % respectivamente. As mismo Kirk ef a/, 1997 en
EEUU detect una frecuencia del 54% de M. bovis, en un 34 % a M. califomicum y
M. bovigenitalium, en muestras de leche de tanque de bovino. En contraste los
estudi os de Ri chard et a\.,2006 en Canad reportaron el ai sl ami ento de M. bovi s
en 1.6
o/,
y
de M. alkalescens en 1.9o/o de muestras de leche de tanque de
al macenami ento.
En estudios que
muestran el porcentaje
de aislados de Mycoplasma bovis
en muestras de leche directa de animales con problemas
de mastitis encontramos
que Kirk 1996 repo un 5Q % de aislados como Mycoplasma bovis de 600
ani mal es, tambi n Gonzl ez et a1,.1997 en Espaa reportaron una preval enci a
de
Mycoplasma bovis de 3.1 % en muestras directas de leche de bovinos con
problemas de mastitis. Ayling et al., 2004 en Inglaterra identificaron por pruebas
bioqumicas a 4 aislados de Mycoplasma bovis y 13 aislados de Acholeptasma spp
de 251 muestras de leche de bovinos con problemas
de mastitis. Tambin
Fi l i oussi s et a\.,2005 en Greci a con muestras de l eche di recta observaron un S.4
Yo de aislados de M. bovis. Este microorganismo es ms frecuentemente aislado
como lo muestran los estudios realizados en Europa, Amrica y
hacen notar que la
presencia de Mycoplasma bovls en Europa ha sido reportada con una baja
frecuencia.
Frente a los porcentajes
de las diferentes especies aisladas, tanto en este
trabajo y otros ya mencionados evidencian que Myco plasma
bovis es la especie
ms frecuentemente
ai sl ada a parti r
de muestras de l eche de tanque de
64
Di scusi n
al macenami ento, no obstante l VL cal i forni cum y M.canadense y
al gunas otras
especies ms, estn consideradas
tambin como responsables
de mamitis
mi copl smi ca
bovi na, por
l o que
el moni toreo en l eche de tanque conl l eva a tener
un control sanitario como rutina en los establecimientos
lecheros.
6.3 IDENTIFICACIN I,IOLECULAR
POR LA REACCION
EN CADENA
DE LA
POLIMERASA DE CEPAS DE Mycoptasma
bovis
Con la PCR se obtuvo que
33/72 (46c./,)
de las cepas aisladas fueron
identifcadas como Mycoplasma bovis y
el 54o/o restante fueron negativas de
acuerdo al ampl i con de 1.9 Kb de l a secuenci a que
codi fi ca para
l a permeasa
oPPDiF 100 % especifica de Mycoptasma
bovis. Hotzel et al., 1gg9
estandarizaron la tcnica de la PCR para
M. bovis con los iniciadores
ppMBg20-1
y
PPMB920-2, tcni ca que
Bashi ruddi n
et al .,2OO4, uti l i zaron para
demostrar 100
Yo de especificidad,
a diferencia de tcnicas de otros autores como Dediu et al.,
1995, Johansson ef al ., 1996, Subramani am
ef al ., 1ggg, Hotzel
and sachase
1998 con diferentes secuencias
de iniciadores.
En contraste Hirose et at., Z0O1
utilizaron la PCR con iniciadores
diferentes que los de Hotzel donde identifico
7 %
de animafes positivos
a Mycoplasma bovis.
Este trabajo mostr gue por
la PCR 33187 aislados fueron positivos
a
Mycoplasma bovis mientras que
las pruebas
bioqumicas 43187 fueron positivas,
ambas pruebas
real i zadas coi nci den en 30 de l os
g7
ai sl ados.
Estudios realizados
con anterioridad
utilizaron la identificacin
bioqumica y
molecular para
M. bovis fueron los de Shane et al., lggg que
realizaron
aislamiento, identificacin
bioquimica y molecular por
la PCR para
M. boyrs con
65
diferentes secuencias
de iniciadores y
trabajaron con muestras de tanque de leche
adems de leche directa de bovinos con problemas
de mastitis,
ellos trabajaron
445 muestras de leche de tanque, de las cuales 22 fueron positivas
pCR,
bioqumicamente
3 fueron postivas y
445 negativas, de las 1, 863 muestras
de
l eche di recta obtuvi eron por
PCR 101 posi ti vos
con y por
bi oqumi cas
113 estos
resultados muestran
lo complicado de la interpretacin
de las pruebas
bioqumicas
de l as especi es
de Mi copl asmas.
l gual mente Pi nnow
et al ., 2001 uti l i z l a
metodologa
de Hotzel et al 1999, donde localizaron
a M. bovis en 26 de b3
muestras de leche de bovino con problemas
de mastitis y
realizaron el aislamiento
e identificacin bioqumica
obteniendo el mismo resultado
de positividad.
En este trabajo se obtuvo que
29/112 hatos fueron positivos
a Mycoplasma
bovis por
medio de la PCR. Estudios relacionados
como el de Fox ef at., Z00E
reportaron la identificacin
de M. bovis, de muestras de leche de tanque en un 70
o/o
de los hatos muestreados
con la tcnica de
pcR
de Hotzel 1996.
La diferencia que marca la PCR con la identificacin
bioqumica nos
muestra que
la tcnica molecular nos reduce el nmero
de muestras positivas.
La
interpretacin
bioqumica y molecular difirieron en resultados esto se puede
deber
a lo difcil que
es la interpretacin
de algunas reacciones
bioqumicas dentro del
griero
de micoplasmas, lo que
hace la prueba
de PCR fundamental para
la
i denti fi caci n
de especi es de mi copl asmas.
Con el anlisis de concordancia
entre las pruebas
realizadas (identificacin
bi oqumi ca y
mol ecul ar por l a PCR) medi ante
el val or de Kappa, ndi co que
el
grado
de acuerdo entre l as dos pruebas
es bueno con un val or de Kappa de 0,63.
66
Este trabajo permiti
establecer que
la
prueba
de la PCR es indicada para
el diagnstico de M. bovrs de leche de tanque y nos reduce el tiempo de
identificacin. Adems este trabajo conducir a la realizacin
de otro estudio para
establ ecer l a i denti dad de l os ai sl ados que
no fue posi bl e
su ti pi fi caci n por l os dos
mtodos utilizados en esta investigacin por
lo que
es necesario caracterizar las
cepas de Mi copl asmas ai sl adas de l eche de tanque de bovi no. Asi mi smo es
preci so
real i zar un segui mi ento i ndi vi dual de l os ani mal es de cada uno de l os
hatos infectados para promover
medidas de control ms eficaces contra la
micoplasmosis en la zona. En Mxico este es el primer
reporte sobre el
ai sl ami ento e i denti fi caci n
bi oqumi ca y mol ecul ar medi ante l a PCR de especi es
de mi copl asmas ai sl adas en l eche de tanque de al macenami ento.
67
Conclusiones
VI I . CONCLUSI ONES
Primera: El porcentaje
de asilados de Mycoplasma spp. en la leche de
tanque de almacenamiento de los hatos en estudio fue del 62%.
Segunda: Mycoplasma bovis se identific bioqumicamente en el 60 % de
los aislados
y
en menor porcentaje Mycoplasma califomicum 4o/o, Mycoplasma
alkalescens 370, Mycoptasma canadense 3o/o
y
especies no identificadas como
Mycoplasrna spp., 26 Yo.
Tercera; Con la PCR se logr la identificacin del 46 % de los aislados
como Mycoplasma bovis.
Cuarta: El val or obteni do de Kappa fue de 0,63 l o que i ndi ca un grado de
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APNDI GE I .
1.-Medi o de cul ti vo de Hayfl i ck.
*-i:*"-:-*-----
r"-**"*"***-.---*"-"--* I
I
Agua desti l ada
i
Z0 mt
i
Fr.t'.uo*i;'1Eid#;i'1o-"Ti-.i'-'-*----
l-suero
q-uinoT
*
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* -
I
i-c-lu"os"
*-[fo
mi*
--l
lflll*i_g-q,g_o_0y1nt
.
2.-Medi o de cul ti vo de Hayfl i ck sl i do.
Esterilizar 121"C. Por 15 mi n.
Para la preparacin
del medio slido, Se licu el agar previamente
estril y
se agreg el
medio lquido de Hayflick a una temperatura media para
evitar que
el agar se
polimerice
antes.
t-Hayficliiiquoo
-
-l
6o-mf_--
trsaobie' o;B%
-
[omi---_--
'
I-ab. DIFCO
2
Lub. uFCo
r
Lab. MHRCK
a
Previamente estril por liltracin
)
Lab. OXOID
6
Lau. t,
plsR
t
Lab. DIFCO
l-PPt-o{-"
.t.l
APENDI CE I I
Cepa
concentrada
en 10 ml
PRODUCCI N DE MI COPLASMA EN 1OO MI .
Cepa con 24 hrs. De incubacin
2 ml.
I
* * | ' .
Se agreg I ml de medi o l i qui do Hayf l i ck
para
aforar a 10 ml
*
Se agreg 40 ml de medi o l i qui do
Hayflick para
aforar a 50 ml
* l
t/
Se al i cuot l os 50 ml en 5 bot el l as con 10 ml
Cepa
concentrada
en 10 ml
Cepa
concentrada
en 10 ml
I
\7
*
Cepa
concentrada
en 10 ml
Cepa
concentrada
en 10 ml
Se agreg l0 ml de medio liquido
Hayflick a c/u para aforar a 20 ml
* +
Se obtuvo 100 ml de cepa en medio
lquido Hayflick.
Se incub 37" C en
aerobiosis de 24 a 48 horas
78

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