I NFORME ESPECTROFOTOMETRA Y B UFFER

Alumnos:

Stephanie Glaves Valentina Jarur Melissa Puentes Luis Silva Amara Valencia

Asignatura:

Procedimientos de Laboratorio Clnico Leonardo Rubio 23 de marzo de 2012

Docente : Fecha:

INTRODUCCIN

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La espectrofotometra es un mtodo muy usado en investigaciones qumicas y biolgicas que sirven para medir la luz. Este equipo mide la absorbancia o transmitancia de la muestra, segn la longitud del espectro de radiacin electromagntica. La absorvbancia se define como la transicin desde un nivel de energa bajo a una alta. La cual vemos la relacin que existe entre la concentracin de la solucin y su capacidad de absorber radiacin o luz. Por lo tanto, al analizar una muestra haciendo incidir un rayo de luz a travs de esta, la muestra absorber o guardara un resto de luz dependiendo del espectro relativo de esta, por ende lo que se mide finalmente en el espectrofotmetro es la luz que no es absorbida por la muestra y que es capaz de atravesarla, esta energa en forma de luz alcanza una placa registradora que medir cuanta luz atraves la muestra, luego la lleva un ampermetro la cual se va a transformar y expresar en nmeros. Tambin tenemos el monocromador, que es el filtro que se utilizar para leer los nanmetros de la longitud de onda requerida para cada tcnica. Este tiene que ser de un color opuesto; obtenindose ya sea por el prisma; filtro y la difraccin de la luz. Tenemos a los cromforos, que son aquellos compuestos que poseen dobles enlaces que absorben la luz en el espectro. Es importante saber que lo que estamos midiendo es cuantitativo. Por otra parte, tambin se demostr para que se usan los amortiguadores o buffer; donde en este caso se hizo el buffer Sorensen o fosfato, a un pH de 7,0 la cual se explicar ms adelante si se necesito hacer TITULACIN.

Objetivos generales: Aprender a usar el espectrofotmetro Determinar cuantitativamente la glucosa de nuestro paciente La importancia de los buffer Aprender y aplicar el concepto de Titulacin Interpolacin en curva de calibracin

SOLUCION BUFFER
Materiales
Agitador magntico Papel indicador de pH Peachmetro Pipetas plsticas Vaso precipitado Tubos Gradillas Probetas Agitador magntico

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Procedimientos y clculos
Preparacin de solucin de buffer fosfato (SORENSEN) Hicimos una dilucin con el cual tendremos un pH neutro final de 7,0. A= 0,2 M NaH2PO4 B= 0,2 M Na2HPO4 DONDE A = X, y B = Y La solucin madre sera: X ml de A + Y ml de B; diluyndolo en 200 ml, donde tenemos que tener X= 39ml e Y= 61 ml Para preparar la disolucin debimos hacer el siguiente clculo: A= 0,2 M NaH2PO4 Na=23 H2=1X2 P=31 04=16X4 ---------------------------------------------P.A= 120 gr + 17 gr = 137 g H2= 1X2 O= 15

0,2 MOLES-------------X MOLES 1000ml-----------------100ml X= 0,02 MOLES en 100 ml 1 MOL----------------137gr 0,02--------------------X gr X= 2,7 gr en 100 ml

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Preparacin de HCL 0,2 M HCL Peso atmico del reactivo: 36,5 g/mol 1 MOL ----------------36.5 gr 0,002 MOLES-------X gr X= 0,073 gr en 10 ml 1L = 1,19 Kg 1000 ml = 1,19 X 1000 1000 ml--------1190 gr X ml------------0,073 gr X = 0,06 ml X= 60 l Luego se vaci el buffer en un vaso precipitado poniendo a este el agitador magntico.

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Despus de que la disolucin est homognea, introducimos los electrodos del peachmetro en el vaso precipitado con el buffer Fosfato.

Resultados
Nuestro buffer dio el pH requerido: 7,0 por lo tanto no fue necesario la titulacin.

La titulacin es un proceso qumico cuantitativo, el cual determina la cantidad de cierto constituyente en la mezcla. En este proceso, la solucin titulante se agrega gradualmente al titulado (analito) para determinar la concentracin molar de este en la masa del reactivo. Se utiliza la molaridad conocida del titulante para determinar la cantidad (masa) de este en la solucin. En nuestro caso, este proceso se haba usado para cambiar en pequeas cantidades el pH de la solucin y as determinar la capacidad amortiguadora de nuestros buffer.

TCNICA DE ESPECTROFOTOMETRA
Materiales
Vaso precipitado Pipeta Matraz aforado Espectrofotmetro Balanza Vidrio reloj Esptula Papel milimetrado Tubos plsticos Gradilla Vaso precipitado

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Procedimiento
1. Preparar una solucin estndar madre de 1000mg/dl de glucosa en agua destilada 2. Preparar diluciones sucesivas con calibradores de glucosa que contengan las siguientes concentraciones: a) 500 mg/dl b) 250 mg/dl c) 125 mg/dl d) 62.g mg/dl 3. Realizar determinacin enzimtica de glucosa usando los calibradores, solucin madre, calibrador comercial, suero control y muestras de pacientes segn el siguiente cuadro: solucin Solucin madre Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Suero control Calibrador comercial muestras Blanco con agua destilada concentracin micro litros 1000 500 250 125 62,5 90 100 ? 0 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Reactivo 1 ml 1 ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
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a) Incubar 5 minutos a 37 grados Celsius; leer en espectrofotmetro antes de 60 minutos. b) Pasar a papel milimetrado los resultados de densidad ptica de los tubos madre A, B, C, y D graficar en Y= absorbancia y X= concentracin. c) Calcular factor segn calibrador comercial; realizar absorbancia y clculo de resultado de muestra y control segn: Resultado = absorbancia x factor d) Obtener mismos resultados por interpolacin en papel milimetrado.

Resultados en espectrofotmetro

Soluciones Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Solucin madre Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Suero control Blanco Calibrador comercial Con C = f *A. Siendo: F= factor A= Absorbancia C= concentracin (mg/dl)

Absorbanci a 1 1,102 1,940 1,356 0,905 1,847 1,829 1,952 1,456 0,769 0,099 0,000 0,843

Concentracin (mg/dl) 119 131,1 230,9 161,4 107,7 219,8 217,7 232,3 173,3 91,5 11,78 0 100

Factor 119 119 119 119 119 119 119 119 119 119 119 119

Grfico

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Grfico e interpolacin para clculo de concentracin de las muestras (1, 2, 3, 4 y 5) a partir de la grfica:

MUESTRA

Concentracin obtenida por interpolacin

Concentracin real

M1 M2 M3 M4 M5

~135 mg/dL ~160 mg/dL ~370 mg/dL ~185 mg/dL ~120 mg/dL

93 mg/dl 92 mg/dl 541 mg/dl 133 mg/dl 87 mg/dl

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CONCLUSIN

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Las soluciones buffer son sin duda un componente esencial en el organismo, es por esto que se encuentran estrechamente ligados a los mecanismos de mantencin del equilibrio qumico y la homeostasis sistmica. En este laboratorio pudimos comprobar el efecto amortiguador de una solucin buffer preparada por nosotros y las variaciones del pH e integridad sangunea en ausencia de este. El buffer que elaboramos fuel buffer fosfato, el cual tiene un pH de 7,0, al exponerlo al peachmetro nos dimos cuenta de que la elaboracin fue correcta y nos calzo el pH medido con lo esperado, sin embargo si no lo hubiramos conseguido habramos tenido que utilizar la tcnica de titulacin que consiste bsicamente en agregar ms acido en caso de que el pH fuera muy bsico, o viceversa si el p H hubiera resultado muy acido habramos tenido que agregar ms sal, que acta como el componente bsico en este caso. Hicimos un pool de 6 tubos, cada uno con 1 ml de sangre y a cada uno de ellos lo expusimos a distintas soluciones, y estos fueron los resultados:

pH Sangre Buffer fosfato Buffer acetato Buffer barbital Agua destilada Suero fisiolgico 7,0 7,0 4,8 8,0 7,0 7,0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

Hemlisis

1 1 1 1 1 1 gota gota gota gota gota gota 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

+ + + -

Se puede notar que no ocurri hemlisis cuando se expuso la sangre al buffer fosfato, esto se debe a que el pH al que trabaja este buffer es muy cercano al pH fisiolgico de la sangre, es por esto que no se altero el equilibrio qumico de su medio normal y esto llevo a que no hubiera hemolisis. Con los otros buffer si se presento hemlisis ya que mantenan el pH a niveles muy distintos a la normalidad sanguneas. Sin embargo se present hemlisis en el agua destilada a pesar de que en esta existe un pH 7,0, esto se debi a la variacin osmtica de los medios, ya que se expuso a los glbulos rojos a un medio hipotnico con respecto al plasma, es por esto que ellos experimentaron una lisis. Con respecto a la espectrofotometra cabe destacar que es una de las tcnicas ms usadas en laboratorio clnico, esencial para medir densidades y concentraciones que el ojo humano no es capaz de distinguir.
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En el laboratorio de espectrofotometra preparamos una solucin madre de glucosa, desde la cual practicamos diluciones sucesivas para llegar a cuatro tubos con concentraciones conocidas diferentes, esto con el propsito de exponerlas luego al espectrofotmetro y medir sus absorbancias junto con otras muestras proporcionadas por el profesor y controles. Los resultados de esta tcnica si bien, no fueron lo exactos que esperbamos, nos sirvieron mucho para experimentar y dimensionar de lo que se trata la espectrofotometra, como funciona y en qu consiste. Sin embargo a juzgar por la variacin de los resultados pudimos inferir que el error estuvo bsicamente en haber calibrado el blanco con una cubeta que, lo ms probable, fue que haya estado rayada por el exceso de uso. Como tambin podra deberse a un mal pipeteo, un error de rotulacin, mala agitacin de las muestras o soluciones y como factor principal, el mal estado en que se encontraba el reactivo utilizado, lo cual fue advertido desde un principio por el docente a cargo. Es por esto que coincidimos en que lo ms importante en esta tcnica es escoger correctamente la longitud de onda a la cual se va a exponer la muestra segn el inserto de la tcnica, y por lo tanto ser muy cuidadosos con los instrumentos y materiales que se utilizan, ya que a la menor variacin los resultados pueden ser distintos en un porcentaje muy importante juzgando que se trata con la vida del paciente.

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BIBLIOGRAFA

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Principios de qumica: los caminos del descubrimiento. Escrito por Peter William Atkins, Loretta Jones. Qumica y reactividad qumica. Escrito por John C. Kotz, Paul M. Treichel, Gabriela C. Weave.

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