Instituto Politcnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

Informe de Prctica: Separacin e Identificacin de Aminocidos de Jugos de Frutos por Cromatografa Bidimensional en Capa Fina
(Fecha realizada 28 y 31 de Enero 2014)

Alumno: Mandujano Molina Miguel ngel

5QM2 Seccin III

INTRODUCCIN La cromatografa se utiliza para separar mezclas, y tiene como principal objetivo determinar la identidad de los componentes de una mezcla. La ventaja es que se desarrolla ms rpidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre diferentes adsorbenteses, es una tcnica estndar en el laboratorio de qumica. Debido a su simplicidad y velocidad, la CCF se utiliza a menudo para monitorizar las reacciones qumicas y tambin para el anlisis cualitativo de los productos de una reaccin, puesto que permite conocer de manera rpida y sencilla cuntos componentes hay en una mezcla. La cromatografa bidimensional es una variante de la separacin de una mezcla, ya que se emplean dos diferentes solventes, que se aplican secuencialmente para poder desplazar un solo compuesto. La aplicacin de este compuesto se revela como una mancha en el papel y el material ms usado es la ninhidrina.

Figura 1. Cromatografa Bidimensional. Tomada del libro Bioqumica Mdica, Limusa Noriega Editores de Daniel Pacheco Leal, 2004 pg. 120.

Para la CCF utiliza el mismo principio que la cromatografa en papel o cromatografa de adsorcin; el soporte utilizado es slica gel o celulosa colocadas en una hoja de vidrio o aluminio en forma de capas muy finas. La relacin de la distancia recorrida por el compuesto entre la distancia que recorre el frente del solvente desde el sitio de aplicacin se conoce relacin de frentes del compuesto, que es una constante importante para la identificacin. Rf : Relacin de frentes. Es el cociente de la divisin fs/fd (distancia recorrida por el soluto entre distancia recorrida por el disolvente. Se utiliza con fines de identificacin de compuestos cando se tienen patrones de referencia.

Figura 2.- Clculo de Relacin de frentes. No puede ser mayor de 1 ni menor de cero. 0Rf1, esta relacin sirve para conocer el eluyente indicado en un compuesto. El conocimiento de los mtodos de aislamiento y purificacin de un compuesto es fundamental para poder determinar sus estructuras en los procesos de sntesis y en el seguimiento de las reacciones qumicas. OBJETIVOS Separar los aminocidos presentes en el jugo de frutos por cromatografa bidimensional en capa fina. Identificar los aminocidos separados por comparacin de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminocidos. Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con el de la unidimensional. METODOLOGA
De una placa de Aluminio con Slica de 20 cm, cortar 4 regiones de 10 x10cm 20 cm

10 cm

10 cm

20 cm

CROMATOGRAMAS UNIDIMESIONALES

Marcar con lapiz 1cm

Aplicar 1 microlitro de cada sol. tipo de a.

Aplicar sol. problema. Placa I: Fase Mvil clorof ormo-metanol-amonaco 17% (2:2:1) Placa II: Fase Mvil butanol-cido actico-agua (3:1:1) Despes de terminar la aplicacin de las muestras, exponer las placas a los vapores de amoniaco durante 30, para desarrollar las fase mviles segn lo indicado.
CROMATOGRAMAS BIDIMENSIONALES

Marcar con lapiz 1cm

Aplicar sol. a. para placa III. Aplicar sol. problema para placa IV

Placa III: Primer Fase Mvil cloroformo-metanol-amonaco 17% (2:2:1) Placa IV: Segunda Fase Mvil metanol-etanol-agua-urea Despes de terminar la aplicacin de las muestras, exponer las placas a los vapores de amoniaco durante 30, para desarrollar las fase mviles segn lo indicado. Sin neutralizar la cromatografia para la solucin problema.

RESULTADOS Jugo de fruta de estudio: Sanda (Citrullus lanatus)

Figura 3.- Izq. Representacin esquemtica de cromatograma unidimensional I, a la dcha. fotografa de la placa cromatografica revelada en el laboratorio.

Figura 4.- Izq. Representacin esquemtica de cromatograma unidimensional II, a la dcha. fotografa de la placa cromatografica revelada en el laboratorio.

Figura 5.- Izq. Representacin esquemtica de cromatograma Bidimensional III, a la dcha. fotografa de la placa cromatografica revelada en el laboratorio.

Figura 6.- Izq. Representacin esquemtica de cromatograma Bidimensional IV, a la dcha. fotografa de la placa cromatografica revelada en el laboratorio.

Aminocido

Arg Lys Pro Gli Glu His Thr Tyr Met Phe

1 fase mvil (cm) Frente del Frente del soluto disolvente 1.0 7.8 3.1 7.8 5.1 7.8 5.8 7.8 6.3 7.8 6.4 7.8 6.5 7.8 6.7 7.8 6.8 7.8 7.2 7.8

Rf 0.12 0.39 0.65 0.74 0.80 0.82 0.83 0.85 0.87 0.92

2 fase mvil (cm) Frente del Frente del soluto disolvente 1.0 7.5 0.7 7.5 2.0 7.5 2.1 7.5 2.6 7.5 0.8 7.5 2.7 7.5 4.4 7.5 4.1 7.5 4.7 7.5

Rf 0.13 0.09 0.26 0.28 0.34 0.10 0.36 0.58 0.54 0.62

Tabla 1.- Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases mviles.

No. de Mancha

8 2 1 7 6 5 3 4 9 10 11

1 fase mvil (cm) Frente del Frente del Rf soluto disolvente (orden creciente) 0.5 7.5 0.06 0.7 7.5 0.09 1.0 7.5 0.13 1.5 7.5 0.20 1.8 7.5 0.24 1.9 7.5 0.25 2.2 7.5 0.29 2.4 7.5 0.32 3.7 7.5 0.49 4.2 7.5 0.56 4.8 7.5 0.64

2 fase mvil (cm) Frente Frente del Rf del disolvente (orden soluto creciente) 0.7 7.5 0.09 1.0 7.5 0.13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2.1 7.5 0.28 2.6 7.5 0.34 0 0 0 4.7 7.5 0.62

Aminocido correspondiente

Lys Arg
No identificado No identificado No identificado No identificado No identificado

Gli Glu
No identificado

Phe

Tabla 2.- Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases mviles.

No. De Mancha

Frente del soluto 0.7 1.0 1.2 1.3 1.5 2.0 2.2 2.4 4.2 4.7

1 fase mvil (cm) Frente del disolvente 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5

4 1 3 2 7 5 8 6 9 10

Rf (orden creciente) 0.09 0.13 0.16 0.17 0.20 0.26 0.29 0.32 0.56 0.62

2 fase mvil (cm) Frente del Frente del soluto disolvente 0.7 1.0 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5

Rf

0.09 0.13

2.0 2.2 2.4 4.2 4.0

0.26 0.29 0.32 0.56 0.64

Tabla 3.- Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases mviles.

No. De Mancha 1 4 5 6 8 9 10

Rf creciente en la 1 fase mvil 0.13 0.09 0.26 0.32 0.29 0.56 0.62

Rf creciente en la 2 fase mvil 0.13 0.09 0.26 0.32 0.29 0.56 0.64

Aminocido correspondiente Arg Lys Pro Glu Gli Met Phe

Tabla 4.- Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases mviles.

DISCUSION: Un problema en el desarrollo de la cromatografa unidimensional, consisti en el corrimiento disparejo de la 1 fase mvil (cloroformo-metanol-agua) en la placa fina I, ya que al colocarlo en la cmara cromatografica, quedo muy cercana a la pared de esta, dando un corrimiento de las manchas muy cercanas entre s, dificultando su identificacin (figura 3); sin embargo, al comparar los Rf de la siguiente cromatografa unidimensional se pudo discernir a qu tipo de aminocido corresponda cada mancha en la placa. CONCLUSIONES Por medio de la cromatografa bidimensional y empleando dos diferentes solventes, se logro separar los aminocidos presentes en el jugo de una sanda (Citrullus lanatus), que despus de la aplicacin de este compuesto, se trato la placa con ninhidrina para identificar los compuestos. Comparando los aminocidos separados por comparacin de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminocidos (10 a. diferentes), se identificaron 7 aminocidos presentes en el jugo de fruta de las 10 soluciones tipo, tal como se indica en la tabla 4. Arg-Lys-Pro-Glu-Gli-Met-Phe Comparado el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con el de la unidimensional, la cromatografa bidimensional tiene mejor poder de resolucin; ya que al emplear dos solventes o eluyentes en dos fases mviles, el corrimiento de los solutos es mejor que empleando solo un solvente, por lo que tambin se demostr que la cualidad de este mtodo de separacin consiste en una mayor sensibilidad que otras tcnicas de separacin, por ejemplo, la cromatografa en papel. Aunque en tiempo, algunas fases mviles que se emplean en este mtodo, pueden variar desde unos minutos o hasta ms de una hora, es cuestin de la mezcla de las fases mviles a aplicar en la placa, aun as su efectividad en tiempo es muy rpido. La cromatografa unidimensional es til para cuando la mezcla tiene muchos componentes, sin embargo, en una sola mancha todava puede tener varios componentes. Una fase mvil, no siempre basta para separar todos los solutos en una muestra

problema, por lo que la cromatografa bidimensional presenta mayor versatilidad al tener dos fases mviles diferentes. CUESTIONARIO 1.- Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado como problema. Compare con sus resultados y concluya. En una porcin de 100 gr de Sanda, se localizan los siguientes aminocidos:

Encontrando que la sanda presenta en mayor abundancia la Arginina, pero en forma de L Citrulina. Se identificaron siete de los aminocidos descritos en la literatura del jugo de la sanda, sin embargo, no se pudieron identificar varias manchas de las CCF bidimensionales, esto es debido a que solo se utilizaron 10 de los 20 aminocidos a identificar en la suspensin del problema.

2.- Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminocido.

3.- Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Explique su respuesta. Si es posible cambiar el orden de las fases mviles, ya que utiliza ambos solventes para eluir los componentes de la placa fina. Lo importante es que la primer fase mvil eluya ms fcilmente el soluto, ya que la urea es ms difcil de excluir de la PCF. 4.- Indique las posibles fuentes de error de esta tcnica. Manipular las placas de slica sin guantes. Olvidar exponer las placas a los vapores de amoniaco para neutralizar o exceder el tiempo de exposicin a los vapores. Al marcar las lneas de aplicacin del compuesto con bolgrafo. Exceder el tamao de la aplicacin en la placa. Una mala proporcin de los solventes. El colocar mal la placa en la cmara o colocarla al revs. Desprender la slica de la placa de aluminio al colocar las aplicaciones de los solutos. CONSULTA BIBLIOGRFICA By Daniel Pacheco Leal, 2004. Bioqumica Mdica. Limusa Noriega Editores. Capitulo, Mtodos de Separacin y Anlisis, pg. 119-121. David Freifelder. Editorial Revert, 1991. Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. ISBN: 8429118195. Cap. 8: Cromatografa. Pg. 179. Skoog, Douglas A. y Leary, James J.1994. Anlisis Instrumental, Madrid: McGraw-Hill.