MICROBIOLOGA

SEGUNDO CURSO

GUIN DE PRCTICAS

Curso 2007-2008

INDICE

Normativa de las prcticas de Microbiologa ............................................................................................................. Pag. 3 Normas y reglas en el laboratorio de Microbiologa .................................................................................................. Pag. 4 Material de laboratorio ............................................................................................................................................... Pag. 5 Objetivo de las prcticas de Microbiologa ................................................................................................................ Pag. 6 Esquema de trabajo .................................................................................................................................................... Pag. 7 Toma de muestra ........................................................................................................................................................ Pag. 8 Preparacin de medios de cultivo ............................................................................................................................... Pag. 9 Mtodos de siembra .................................................................................................................................................. Pag. 10 Mtodos de incubacin ............................................................................................................................................. Pag. 15 Observaciones macroscpicas................................................................................................................................... Pag. 15 Observaciones microscpicas ................................................................................................................................... Pag. 17 Morfologa de las bacterias ....................................................................................................................................... Pag. 21 Identificacin bacteriana ........................................................................................................................................... Pag. 22 Tiras Multisustrato .................................................................................................................................................... Pag. 30 Antibiograma ............................................................................................................................................................ Pag. 31 Prctica de Virologa ................................................................................................................................................. Pag. 36 Prctica de Micologa................................................................................................................................................ Pag. 41 Anlisis de alimentos ................................................................................................................................................ Pag. 56 Medios de cultivo ...................................................................................................................................................... Pag. 59 Pruebas bioqumicas ................................................................................................................................................. Pag. 62 Supuesto prctico ...................................................................................................................................................... Pag. 72

NORMATIVA DE LAS PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA

- Las prcticas de Microbiologa e Inmunologa son obligatorias para todos los alumnos matriculados en la asignatura y deben ser superadas para poder acceder al examen final de la misma. - Se exceptan de esta norma aquellos alumnos que las hayan superado en el curso anterior en esta Facultad. Los alumnos que hayan cursado prcticas de Microbiologa en otras Universidades debern presentar un certificado acreditativo que ser evaluado por el Departamento para juzgar si procede o no a su convalidacin. - Los alumnos sern convocados mediante listas que se expondrn con la debida antelacin en el tabln de anuncios del Departamento (Pabelln de Sanidad Animal) y debern venir provistos de bata de laboratorio y guin de prcticas, as como de dos artculos de divulgacin, extrados de la prensa diaria reciente (peridicos o revistas que se puedan comprar en kioscos, y que no sean especficamente cientficos; tambin puede ser de Internet del mismo tipo de publicaciones on-line). - Las practicas transcurren a lo largo de dos semanas consecutivas. De martes a viernes, en las que se realizarn las enseanzas prcticas de correspondientes a la asignatura de Microbiologa. - Los horarios sern de maana para los alumnos que cursan estudios por la tarde y de tarde para los que cursan estudios por la maana. La duracin de cada una de las sesiones prcticas es variable, estimndose en unas 3 h. - Es obligatoria la asistencia a todas las sesiones prcticas que integran cada grupo. Las faltas debern ser debidamente justificadas y la ausencia en ms de una sesin supondr el paso directo al examen final de prcticas. - Una parte importante de las prcticas corresponder a la realizacin de una identificacin bacteriana de una muestra problema. Al finalizar la misma, el alumno deber entregar al profesor de prcticas un informe sobre el proceso seguido, en el que se incluya la bibliografa consultada, y otros datos que considere de inters. - La calificacin del alumno en lo que respecta a las prcticas de esta asignatura se basar en tres criterios: actitud del alumno a lo largo de las prcticas, conocimientos adquiridos, e informe presentado. - Los alumnos que no superen la evaluacin prctica podrn presentarse al examen final de prcticas que tendr lugar antes del examen final terico de la asignatura. - Tendrn derecho al examen final de prcticas todos los alumnos de la asignatura que por cualquier causa no las hayan superado con anterioridad. - Excepcionalmente podrn repetir las prcticas voluntariamente aquellos alumnos que no habiendo superado la prueba correspondiente a su grupo, as lo soliciten y sean informados favorablemente por el Profesor responsable de su grupo. - Los cambios de grupos de prcticas slo se admiten en las siguientes circunstancias:

* *

Por razn de incompatibilidad con el horario laboral debidamente justificada y siempre que se haga constar con claridad en la ficha de la asignatura. Por acuerdo con otra persona que deba tambin realizarlas pero en un turno diferente, hacindolo constar igualmente muy claramente al rellenar la correspondiente ficha por parte de ambas personas. Por razones de enfermedad debidamente justificadas.

NORMAS Y REGLAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Por escaso que sea el nivel de conocimientos que se posea de esta asignatura, cualquiera puede imaginarse fcilmente que en el trabajo cotidiano en un laboratorio de Microbiologa, uno de los problemas que hay que cuidar es el de las contaminaciones con microorganismos no deseables, ya que su presencia en un cultivo es origen, en el mejor de los casos, de errores en las pautas de identificacin, cuando no atentan contra la seguridad del microbilogo y de su entorno. Por este motivo, se deben respetar y cumplir unas reglas esenciales: A - Evitar la contaminacin del material a estudiar. B - Evitar la contaminacin por el material a estudiar. Las normas bsicas de actuacin se concretan en: 1.- Del microbilogo: 1.1 La prenda adecuada para trabajar en un laboratorio de Microbiologa es la bata blanca, que debe estar siempre limpia y usarse slo en el interior de los laboratorios. 1.2 Normas generales de higiene: * Limpieza de manos antes y despus del trabajo. * Si la longitud de los cabellos es notable, stos debern estar recogidos. 1.3 Normas generales de comportamiento: * El material, mobiliario y dems utensilios deben cuidarse con el mayor esmero. * No se puede fumar, beber o comer en el laboratorio bajo ningn concepto. * Hay que evitar desplazamientos intiles y movimientos bruscos. 2.- Del lugar de trabajo: 2.1 Cada alumno dispone de un puesto de trabajo en el que podr encontrar: * Un papel de filtro que cubre el lugar de trabajo. * Un mechero de gas emplazado en el centro. El mechero debe permanecer encendido durante la realizacin de los experimentos que requieran su utilizacin, apagndose cuando no sea necesario. * Los instrumentos y elementos especficos para la realizacin de cada prctica concreta. 3.- Del trabajo: 3.1 No se debe comenzar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones precisas. 3.2 Se deben preguntar siempre todas las dudas que aparezcan antes de realizar el trabajo.

3.3 La mayor parte de los instrumentos que se utilizan deben ser y permanecer estriles, por lo cual se manejan siempre en una zona aproximada de unos 15 cm alrededor de la llama del mechero encendido. 3.4 La esterilizacin de algunos utensilios (asas de platino, boca de los tubos, etc) se consigue mantenindolos en posicin oblicua sobre la llama. Estas operaciones se realizan siempre antes y despus de utilizar tales instrumentos. 3.5 No se debe dejar nunca el tubo o la placa abiertos ms tiempo del estrictamente necesario, para evitar una posible contaminacin del cultivo. Tampoco se debe depositar el tapn del tubo con el que estamos trabajando sobre la mesa, debindose mantener siempre en la mano hasta el momento de tapar el tubo. 3.6 La organizacin del trabajo vara segn la prctica que se est realizando, pero en general: * Deben evitarse las precipitaciones. * Deben evitarse riesgos de confusin etiquetando o marcando el material. * Deben evitarse riesgos de contaminacin (evitar contacto de la boca con las manos, evitar chupar objetos del laboratorio, etc.). * Deben tomarse todas las precauciones posibles para evitar accidentes (cortaduras, quemaduras, etc.). 3.7 Despus del trabajo, tambin debe seguirse un plan ordenado. * El material utilizado debe transportarse al lugar donde contine su procesamiento. * El material y utensilios utilizados deben ser lavados y esterilizados para su posterior uso o bien eliminarse previa esterilizacin si son de un solo uso. * El puesto de trabajo debe quedar al final ordenado y limpio, tal como se encontr al inicio de la sesin.

MATERIAL DE LABORATORIO
El material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado; evidentemente, no se precisa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con un alto grado de especializacin que en un laboratorio de Bacteriologa Clnica. Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele encontrar en un laboratorio mnimamente dotado. A) Material de uso corriente: * Material de vidrio o plstico que se usa para contener o medir: aqu se incluyen tubos de ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc., todo ello de distintos tamaos y capacidades. Tambin incluimos las placas de Petri, los portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de recuento, cestillos y cubetas para efectuar tinciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc. * Material de siembra: constituido principalmente por asas y filamentos de platino, asas de Drigalski y pipetas estriles. * Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estriles, tubos y frascos estriles, jeringas y agujas, trcares, cnulas, catteres y material de diseccin. B) Aparatos productores de calor:

Se utilizan con diversas finalidades: * Para esterilizacin: autoclave (calor hmedo), horno Pasteur (calor seco) y mechero Bunsen (esterilizacin por calentamiento directo). * Para incubacin: estufas, baos de agua, de aceite o parafina y de arena.

C) Aparatos productores de fro: * Refrigeradores: son indispensables para conservar los medios de cultivo, productos biolgicos y patolgicos, as como mantener la supervivencia de algunos mo. Su temperatura oscila alrededor de los 4C. * Congeladores: alcanzan temperaturas entre -20 y -70 C y son indispensables para conservar determinados productos biolgicos (sueros, clulas, mo). * Neveras porttiles: para trasladar muestras al laboratorio en condiciones de refrigeracin.

D) Material ptico: Es de capital importancia en el laboratorio ya que permite la observacin de los mo.. * Microscopios: en su distintas versiones (campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia). * Lupa estereoscpica: permite observar colonias bajo distintas condiciones de iluminacin.

E) Otro tipo de material y aparatos: * Agitadores y homogeneizadores. * Centrfugas. * Balanzas. * Liofilizadores. * pHmetros. * Espectrofotmetros. * Destiladores, etc.

OBJETIVO DE LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

Las clases prcticas de Microbiologa tienen como objetivos bsicos los siguientes: - Familiarizar al alumno con las normas generales de trabajo en el laboratorio. - Iniciarle en el uso de los elementos y medios propios de la asignatura. - Ensearle las tcnicas bsicas empleadas para el estudio de microorganismos. Aislamiento e identificacin bacteriana. Preparacin e interpretacin de antibiogramas. Anlisis de microorganismos en alimentos. Recuento de bacterias Estudio e identificacin de hongos. Observacin de la patogenicidad celular de virus.

ESQUEMA DE TRABAJO
A) BACTERIOLOGA 1) Anlisis clnico. - Recogida de muestras: * Condiciones de esterilidad * Emisin de informe * Envo rpido al laboratorio - Anlisis - Aislamiento: * Medios de cultivo slido * Siembra por agotamiento * Incubacin: * 37C * 24/48 h * Aerobiosis/anaerobiosis - Identificacin: * Anlisis macroscpico de colonias * Anlisis microscpico: - Formas y dimensiones - Tincin de Gram - Estructuras especiales * Pruebas bioqumicas * Pruebas serolgicas * Identificacin por comparacin de datos * Identificacin por tiras multisustrato 2) Antibiograma * Preparacin * Interpretacin 3) Anlisis de microorganismos en alimentos

B) MICOLOGIA * Obtencin de cultivos puros * Pautas de identificacin

D) VIROLOGA * Efecto citoptico.

TOMA DE MUESTRA
Bajo la denominacin de muestra se incluye cualquier elemento orgnico, natural o patolgico, procedente del animal vivo, del cadver, o de su entorno, que sea susceptible de contener microorganismos. Son muestras por tanto, lquidos fisiolgicos (sangre, orina, saliva, heces), lquidos patolgicos (exudados, pus, esputos, vmitos) y slidos como biopsias o piezas procedentes del cadver; tambin son muestras los alimentos, camas y el propio ambiente en el que se encuentran situados los animales. Recogida de muestras: Las muestras deben ser recogidas con la mxima asepsia con el fin de no introducir en ellas microorganismos ajenos al proceso. Esta asepsia se refiere: * Al proceso y condiciones de la toma de muestras, que debe evitar las contaminaciones. * A los utensilios empleados, que deben estar estriles. * A los recipientes destinados a la recogida y envo al laboratorio, que igualmente deben estar estriles. Una vez recogidas, las muestras se deben enviar al laboratorio con la mayor rapidez posible. Toda muestra debe ir acompaada de un informe en el cual, de forma ordenada y pormenorizada, se expondrn todos aquellos datos que tengan relacin con la misma y que puedan ser tiles para orientar al laboratorio en su labor analtica. Estos datos suelen ser de tipo clnico (sintomatologa, lesiones, tratamientos efectuados) y epidemiolgicos (n de animales afectados, n de bajas, edad, sexo, tipo de alimentacin, sistema de explotacin, vacunaciones, enfermedades ms frecuentes en la zona, etc.). En el momento de su recepcin en el laboratorio, toda muestra debe ser convenientemente identificada a travs de un nmero de orden y de su inclusin en el libro de anlisis.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Tipos de medios: a) Por su objetivo: - Aislamiento - Enriquecimiento - Identificacin - Conservacin - Recuento b) Por su especificidad para los microorganismos: - Comunes - Selectivos c) Por su composicin: - Naturales o empricos - Sintticos - Semisintticos d) Por su estado fsico: - Slidos: por el empleo de agentes solidificantes. * Agar:1,5-2 % medios slidos 0,2 % medios semislidos * Gelatina. - Lquidos e) Por su forma de almacenamiento y empleo: - En placa - En tubo:* lquido * slido vertical * slido en pico de flauta 2. Material necesario: - Preparacin: balanza, matraz, vaso de precipitados, esptula, probetas, tubos, tapones. - Esterilizacin: autoclave/filtracin. 3. Mtodo de preparacin: - Pesar las cantidades fijadas para cada medio de cultivo. - Hidratar con agua destilada hasta el volumen preciso. - Ajustar el valor del pH. - Homogeneizar por calentamiento para una buena solubilizacin de los componentes. - Esterilizacin. * Por autoclave: material que no se altere por ** Caramelizacin: ciertos azcares. ** Precipitacin: ciertos minerales. ** Desnaturalizacin: ciertas protenas. * Por tyndalizacin: material que se altere a temperaturas de autoclave. * Vapor fluente. * Filtracin: ** Filtros adaptables a jeringuillas. ** Sistemas de filtros Millipore. 4. Medios incompletos: Son aqullos a los que hay que aadir algn otro componente tras la esterilizacin (normalmente es un componente sensible al calor); p.e., yema de huevo, sangre, etc..

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METODOS DE SIEMBRA
El primer paso a seguir en la identificacin de un microorganismo es proceder a su obtencin en cultivo puro, pues es obvio que las reacciones de cultivos mixtos no podrn ser usadas en la identificacin. El mtodo ms comn de obtencin de un cultivo puro consiste en tomar una sola colonia del medio de aislamiento y proceder a su siembra por agotamiento. Pauta general: 1. Coger el asa de platino como se indica en la figura 1. 2. Flamear el asa de platino hasta que tome color rojo. Flamear tambin el resto del vstago (figura 2). 3. Toma de muestra 3.I Si se parte de una muestra lquida (o cultivo lquido): 3.I.a. Agitar el tubo (figura 3). 3.I.b. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4). 3.I.c. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5). 3.I.d. Introducir el asa en el tubo de forma que el extremo quede justo por debajo de la superficie (figura 6). 3.I.e. Esperar a que deje de burbujear y extraer el asa. La pelcula formada estar cargada de microorganismos. 3.I.f. Volver a flamear el tubo. 3.I.g. Poner el tapn. 3.II. Si se parte de un cultivo slido: 3.II.a. Enfriar el extremo del asa en una zona del medio de cultivo donde no haya crecimiento. 3.II.b. Tomar una colonia bien aislada. 4. Siembra en el medio de cultivo. 4.I. Siembra en medio lquido: 4.I.a. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4). 4.I.b. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5). 4.I.c. Introducir el extremo del asa, previamente cargada en el tubo con medio lquido y se agita con energa para desprender los microorganismos. 4.I.d. Volver a flamear el tubo. 4.I.e. Poner el tapn. 4.II. Siembra en medio slido: 4.II.a. Tomar una placa de medio slido no utilizada y por tanto estril. 4.II.b. Colocarla sobre la mesa de trabajo de forma invertida de tal forma que se encuentre el medio de cultivo en la parte superior. De esta forma se puede destapar la placa con una sola mano. 4.II.c. Una vez destapada, se apoya el extremo del asa cargada con microorganismos sobre la superficie y se efecta la siembra. 5. Flamear el asa hasta que se ponga incandescente. 6. Rotular las placas o los tubos de forma que se puedan identificar. - Tipos de siembras: a) Siembra por agotamiento: La finalidad de esta siembra es obtener colonias aisladas del microorganismo o microorganismos sobre el medio de cultivo slido. Consiste en

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desplazar el asa de platino sobre la superficie del medio slido siguiendo cualquiera de los siguientes procedimientos: * En zig-zag: consiste en desplazar el asa por el medio haciendo un movimiento en forma de zeta desde un borde de la placa hacia el opuesto. Cuando se llega al centro de la placa, se levanta el asa y se repite el movimiento empezando por el otro extremo de la misma (figura 7). Este tipo de siembra tambin se puede hacer en tubo con medio slido en pico de flauta. * En estras: con el asa cargada se trazan dos o tres lineas tangenciales en un borde de la placa; se flamea el asa, se enfra en una zona no sembrada y de nuevo se trazan dos o tres estras que crucen a las anteriores; este procedimiento se repite hasta que se completa la superficie de la placa (Figura 7). b) Siembra en masa: primero se aade un volumen conocido de suspensin de microorganismos en una placa estril; despus se aaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido a 45C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos circulares y se deja solidificar. c) Siembra en superficie: sobre una placa con medio solidificado se deposita una cantidad medida de suspensin de microorganismos y se extiende de forma uniforme con un asa de Drigalski (figura 8). d) Siembra por picadura: se utiliza el filamento de platino que se introduce de forma vertical en un tubo con medio slido (figura 9). e) Siembra por inundacin: sobre una placa con medio solidificado se vierte una suspensin densa de microorganismos de forma que "se inunde" toda la placa. Se espera unos 15 minutos para que se adsorban los microorganismos y se elimina el lquido restante guardando condiciones de esterilidad.

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TCNICAS DE AISLAMIENTO: TOMA DE MUESTRAS

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Figura 7.- Tcnicas de aislamiento: agotamiento de asa en placa

A.- PASOS SUCESIVOS DEL AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

1. Estras

3. Estras

5. Estras

7. Estras

2. Flameado Enfriar

4. Flameado Enfriar

6. Flameado Enfriar

B.- OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS TRAS LA INCUBACIN

Obtencin de colonias aisladas

OTROS SISTEMAS DIFERENTES DE AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

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METODOS DE INCUBACION
1. Temperatura: * Bacterias patgenas: 37C; excepcionalmente otras Tas. * Hongos: ver prctica correspondiente. 2. Atmsfera de incubacin: * Aerobiosis: trasladar las placas a la estufa e incubarlas de forma invertida (tapa abajo; medio inoculado arriba). Los tubos se incuban siempre en posicin vertical. * Microaerofilia: ** Mtodo de la vela: en la jarra se introduce una vela encendida que va consumiendo el oxgeno acumulado tras cerrar la jarra. ** Estufa de CO2: permite regular la cantidad de CO2 en la atmsfera de incubacin. * Anaerobiosis (Mtodo de GasPak): en una jarra de anaerobiosis junto a las placas o tubos se introduce un preparado comercial que produce H2, el cual se combina con el O2 y produce agua.

OBSERVACIONES MACROSCOPICAS
A) Crecimiento en medio slido: las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18 - 24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre medios slidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un nico tipo de microorganismo. Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista o con la ayuda de una lupa. Los caracteres ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters en la caracterizacin son los siguientes:

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1. Forma: Puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada 2. Tamao: Se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm. 3. Elevacin: Vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa, pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresin central). 4. Forma del borde: Puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso, y rizado. 5. Superficie: * Lisa * Rugosa * Mate * Brillante * Transparente * Opaca 6. Color: Presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio. 7. Capacidad de emulsin en agua: * Forma una suspensin uniforme * Forma una suspensin grumosa * No se emulsiona

B) Crecimiento en medio lquido: tiene inters los siguientes aspectos: 1. Cantidad de crecimiento: * Ninguna * Escasa * Moderada * Abundante. 2. Crecimiento en la superficie: * Positivo * Negativo * Formacin de un anillo * Pelcula superficial que se desintegra o no al agitar 3. Turbidez: * Uniforme * Floculante * Negativa 4. Depsito en el fondo del tubo: * Ausente * Granular * Floculante * Viscoso * Se desintegra o no al agitar

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OBSERVACIONES MICROSCOPICAS
El ndice de refraccin de las bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto son difciles de ver al microscopio. En cambio son qumicamente muy diferentes; estas diferencias son las que permiten distinguir las bacterias por medio de TINCIONES. Las tinciones son de dos tipos: a) Tinciones simples: Son aqullas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma, el tamao y la ordenacin de las bacterias. b) Tinciones diferenciales: Son aqullas que utilizan dos o ms reactivos. Con ellas se pueden observar diferencias entre clulas o partes de clulas. Las ms importantes son: 1. Tincin de Gram. 2. Tincin de microorganismos cido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen). 3. Tincin de estructuras. - Tincin de esporos. - Tincin de flagelos. - Tincin de cpsulas. Los principales pasos para realizar una tincin para su posterior examen microscpico son: 1. Extensin: * A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en el portaobjetos y se extiende con movimientos circulares (figura 10). * A partir de una colonia en medio slido. Con el asa de platino se toma una gota de agua que se deposita en el portaobjetos; despus se toma una colonia, se mezcla y se extiende como antes (figura 11). 2. Secar: dejando la preparacin al aire hasta la evaporacin 3. Fijacin: Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la llama hasta que se seque, sin calentar demasiado (figura 12). El calor excesivo alterara la forma normal y la estructura de los microorganismos que se van a teir. El portaobjetos debe notarse caliente, pero no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano. 4. Tincin: En funcin del objetivo existen distintos procedimientos de tincin.

Tincin de Gram
Cuando se emplea este mtodo de tincin, debido a diferencias en la pared celular, las bacterias se dividen por lo general en dos grandes grupos, segn retengan o no el colorante primario ("GRAMPOSITIVAS" o "GRAMNEGATIVAS" respectivamente) tras sufrir la accin de un decolorante. En esta tcnica se emplean cuatro reactivos diferentes: METODO: * Un colorante primario (violeta de genciana) durante tres minutos. * Lavar con agua. * Un mordiente (lugol) durante dos minutos.

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* Lavar con agua. * Un agente decolorante (alcohol-acetona) durante diez segundos. * Lavar con agua. * Un colorante de contraste (safranina) durante treinta segundos. * Lavar con agua y secar sobre un papel de filtro. (figuras 13, 14 y 15) Las clulas que retienen el colorante primario se denominan "GRAMPOSITIVAS" (color violeta) y las que se decoloran con el alcohol-acetona y se tien posteriormente con la safranina reciben el nombre de "GRAMNEGATIVAS" (color rojizo). * Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (punto 4).

Tincin de esporos
Las bacterias de algunos gneros forman endosporos que son estructuras muy resistentes a las altas temperaturas, a la falta de humedad y a la accin de productos qumicos. Los endosporos son tambin resistentes a la penetracin de colorantes utilizados en Bacteriologa y por tanto en una extensin teida segn el mtodo de Gram se pueden distinguir como zonas incoloras en el interior de las formas vegetativas de las bacterias Gram positivas. Sin embargo, una vez teidas su decoloracin suele ser difcil. METODO (Bartolomew y Mittwer) * Se prepara una extensin en la forma habitual y se fija intensamente al calor para lo cual se pasa unas veinte veces por la llama. * Se cubre la extensin durante 10 minutos con solucin acuosa saturada de verde malaquita, calentando hasta la emisin de vapores. * Se lava con agua y se aade safranina durante 30 segundos, se lava con agua y se seca con papel de filtro. * Observar al microscopio con el objetivo de inmersin Segn este mtodo de tincin, los endosporos se tien en verde, pero el resto de la clula (o la clula que no posee endosporos) se tie de rojo dbil.

Tincin de cpsulas
Los mtodos ordinarios de tincin no colorean la cpsula, aunque a veces se puede observar una zona clara rodeando al organismo teido. Para demostrar la presencia de cpsulas se emplea generalmente la tincin negativa con tinta china o nigrosina. METODO * Depositar una gota de tinta china o nigrosina sobre un portaobjetos. * Mezclar con ella una colonia procedente de un medio slido, con ayuda del asa de platino. * Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas de aire. Presionar con fuerza entre papel de filtro para eliminar los restos de tinta china que puedan enturbiar la observacin. * Examinar al microscopio con el objetivo de inmersin

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Las bacterias con cpsula aparecen rodeadas de una zona clara destacando del fondo gris oscuro. Las bacterias no capsuladas no presentan esta zona clara.

5. Observacin al microscopio con el objetivo de inmersin METODO * Depositar en la preparacin una pequea gota de aceite de inmersin. De esta forma se reduce la refraccin de los rayos de luz al pasar del portaobjetos al aire, consiguindose que un mayor nmero de ellos penetren en el objetivo (figura 16). * Colocar el portaobjetos en la platina. * Elevar el condensador del microscopio al nivel de la platina para lograr el mximo de luz. * Bajar el objetivo de inmersin hasta que contacte con la gota de aceite y enfocar hasta observar la morfologa del microorganismo.

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Rayos no refractados Aceite de inmersin

Rayos de luz refractados Aire Preparacin

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MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

Las bacterias presentan una amplia diversidad de tamaos y de forma muy general pueden aparecer bajo la luz del microscopio ptico o electrnico con morfologa esfrica (cocos), alargada (bacilos), y espiral (espiroquetas). Los cocos libres aparecen como clulas esfricas aisladas, en pares como DIPLOCOCOS, en cadenas como ESTREPTOCOCOS, o dependiendo de los planos de divisin, en tetradas o en grupos arracimados. Los bacilos pueden variar considerablemente en longitud desde los que son muy cortos, a veces denominados COCOBACILOS, hasta los bacilos largos que varan en longitud de dos a diez veces su dimetro. Los extremos de los bacilos pueden ser suavemente redondeados, o cuadrados. Las largas hileras aisladas se conocen como FILAMENTOS. Los bacilos bacterianos fusiformes, que aparecen en la cavidad bucal e intestinal, son aguzados en ambos extremos. Los bastones curvos, o ESPIRILOS, varan desde microorganismos pequeos, en forma de coma, o levemente helicoidales con una sola curvatura, o en forma de espiroquetas ms largas y sinuosas. FIGURA 17: MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS a: cocos arracimados b-c: diplococos d: cocos en cadena e: cocos en ttradas

a-e: cocos

f: cocobacilos g-i: bacilos g: bacilos aislados h: bacilos en cadenas i: bacilos aislados, en empalizada y formando ngulos j-k: espirilos

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IDENTIFICACION BACTERIANA
Los procedimientos para llevar a cabo la identificacin bacteriana van desde los simplemente descriptivos (morfologa y tincin), pasando por las pruebas bioqumicas simples para deteccin de productos metablicos o de una determinada reaccin enzimtica, llegando hasta tcnicas muy sofisticadas como puede ser el clculo del porcentaje G+C en bacterias o el empleo de sondas de ADN. Un proceso exhaustivo de identificacin bacteriana incluira los siguientes pasos: 1 Caractersticas macroscpicas. 2 Caractersticas microscpicas. 3 Condiciones de crecimiento. 4 Propiedades bioqumicas. 5 Susceptibilidad a los antibiticos. 6 Estructura antignica (serotipia) y fagotipia. 7 Composicin qumica. 8 Produccin de bacteriocinas. 9 Patogenicidad. 10 Composicin del ADN. Las pruebas bioqumicas nos indican una serie de caractersticas metablicas que, en conjunto, nos permitirn diferenciar unas bacterias de otras). Existe un gran nmero de estas pruebas, por lo que en un problema concreto nos decantaremos por la realizacin de una u otra prueba bioqumica basndonos en: * Origen de la cepa: de dnde la hemos aislado. * Condiciones bajo las que ha sido aislada. * Morfologa. * Tincin, especialmente la de Gram. * Posibilidad de formacin de esporos. * Posibilidad de formacin de cpsula. Segn los resultados obtenidos de la observacin de estos parmetros, una vez consultada la bibliografa sobre taxonoma bacteriana, el amplio espectro bacteriano, va a quedar restringido a unos pocos gneros, por lo que el siguiente paso ser realizar las pruebas bioqumicas que nos ayuden a quedarnos con uno solo de ellos, y posteriormente llegar a la determinacin de especie. Es muy importante comprender que estas pruebas no han sido elegidas al azar, sino siguiendo una pauta detallada con objeto de escoger aquellas que nos van a llevar a la identificacin de especie lo ms rpidamente posible. Son muchas las pruebas bioqumicas descritas, y es evidente que en cada caso intentaremos realizar las menos posibles, siempre y cuando stas nos lleven a una completa y segura identificacin. En la realizacin de pruebas bioqumicas hay que tener en cuenta que no todos los miembros de una determinada especie bacteriana reaccionarn de la misma manera: Se producen variaciones, y esto habr que recordarlo cuando se interpreten los cuadros para identificacin de bacterias. Al comparar los resultados obtenidos con un grupo tabulado de resultados patrn, se debe utilizar el criterio de "aproximacin mxima": si un microorganismo se desva de lo normal en uno o dos resultados de una batera de pruebas segn la tabla patrn, ello no supone que necesariamente haya que descartarlo de esa especie.

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Los resultados definidamente positivos (+) o negativos (-) son aquellos en que como mnimo el 90% de las cepas de esa especie reaccionan de esa manera, mientras que los Variables (V) se refieren al hecho de que un 11 a 89% pueden hacerlo en uno u otro sentido, por lo que no debe confiarse en stos para los fines de identificacin. Las tablas siguientes son un resumen de las que se pueden encontrar en cualquier manual de identificacin bacteriana y que nos servirn para identificar los microorganismos utilizados durante la primera semana de prcticas as como los empleados en el supuesto prctico.
Ferm. Gluc. +: G. Staphylococcus (Tabla I) CATALASA + Ferm. Gluc. -: G. Micrococcus (Tabla I)

COCOS BACTERIAS GRAM +

ClNa 6% + : G. Enterococcus (Tabla II) CATALASA ClNa 6% - : G. Streptococcus y Lactococcus (Tabla II)

Regulares/pequeos: G. Listeria (mvil a 22C, inmvil a 37C) (Tabla VII) MVILES CATALASA + Regulares/grandes: G. Bacillus (Tabla V)

BACILOS

INMVILES

G. Corynebacterium (Tabla III)

MVILES CATALASA INMVILES

G. Clostridium (Tabla VI) G. Erysipelothrix (Tabla IV)

COCOS

NO fermentativos, inmviles: G. Neisseria / Brahamella (Tabla VIII) OXIDASA+ No fermentativos Bacilos/cido de glucosa: G. Pseudomonas (Tabla IX) Cocobacilos/no cido de glucosa G. Bordetella (Tabla X)

OXIDASA G. Acinetobacer (Tabla XI)

BACTERIAS GRAM -

OXIDASA + CATALASA+

Mviles/curvados: F. Vibrionaceae (Tabla XII) Inmviles/cocobacilos: G. Pasteurella / Mannheimia (Tabla XIII) G. Escherichia

BACILOS
Fermentativos

G+ L+ Gas+ SH2-

G. Klebsiella G. Enterobacter G. Yersinia

G. Salmonella KLIGLER OXIDASA (CATALASA +) F. Enterobacteriaceae (Tabla XIV) G+ L- GasV SH2G. Shigella G. Enterobacter G. Yersinia

G. Salmonella G+ L- GasV SH2+ G. Proteus G. Edwarsiella

G+ L+ Gas+ SH2V+

G. Citerobacter

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COCOS (cocobacilos)

Crecimiento MacConkey Negativo Positivo Negativo

Metabolismo Oxidativo Cat+/Ox+ Oxidativo o no reactivo Cat.+/OxOxidativo Cat+/Ox+ Fermentativo Cat+/Ox+ No reactivo Cat+/Ox+

Gneros Neisseria spp. Branhamella spp. Acinetobacter spp. Flavobacterium spp. Pasteurella spp. (la mayora) Brucella spp. Haemophilus spp. Pasteurella anatipestifer Taylorella equigenitalis Moraxella spp. Campylobacter spp. Francisella tularensis Pseudomonas spp. (la mayora) Burkholderia cepacia Aeromonas spp.* Pasteurella heamolytica* Plesiomonas spp.* Actinobacillus spp. Enterobacteriaceae* Pasteurella caballi Bordetella spp.* Alcaligenes spp.* Micrococcus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Rhodococcus equi Nocardia asteroides (algunos) Bacillus spp.* (algunos) Actinomyces viscosus Bacillus spp.* (algunos) Corynebacterium spp. Listeria spp.* Actynomyces spp.** (la mayora) Actinomyces pyogenes Erysipelothrix spp. Clostridium spp.**/* Eubacterium spp.** Lactobacillus spp. Rhodococcus equi

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Positivo

No reactivo Cat+/-/Ox+/No reactivo Cat+/OxOxidativo Cat+/Ox+ Fermentativo Cat+/Ox+ Fermentativo Cat+/-/Ox+/Fermentativo Cat+/OxNo reactivo Cat+/Ox+ Oxidativo Cat+/Ox+/Fermentativo Cat+/OxFermentativo Cat-/OxNo reactivo Cat+/OxOxidativo Cat+/OxFermentativo Cat+/Ox-

BACTERIAS GRAS POSITIVAS

BACILOS

COCOS

BACILOS

Fermentativo Cat-/Ox-

No reactivo Cat+/Ox-

Cat=catalasa; Ox=oxidasa; +: reaccin positiva; -: reaccin negativa; V= variable; *=mvil; **=anaerobio

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TABLA I. FAMILIA Micrococcaceae

Gnero Staphylococcus Nitratos Motilidad O/F glucosa Manitol Maltosa Coagulasa V.P. DNAsa Lecitinasa Ureasa
O

Gnero Micrococcus

S. intermedius S. aureus S. simulans S. epidermidis M. luteus M. roseus M. varians + + + V+ + + V + F V + + + +

V+

F + + + + + + V+

F + + dbil +

F + V+ +

O + V

O + -

O + V +

: Oxidativo; F: Fermentativo;

: Mayora de cepas positivas; V: Variable.

TABLA II. Gneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus

Hemlisis CAMP

Hidrlisis Esc. Hipur. Arg. + + + + + + + ND + + + + ND + (+) + + + + + +

ClNa 6,5%

V.P. + + + + ND + + +

Acidificacin Sal. V+ + + + + + + + + Raf. + + D Sorb. + + Lac. V+ + + V+ V+ + + + Man. + V V+ + + (+) Rib. + + + ND + + + + +

S. agalactiae S. dysgalactiae S. uberis S. suis S. bovis L. garvieae L. piscium E. faecalis E. faecium E. hirae

, ,no , no , no no , no No ,no , no No

+ -

+ + +

hemlisis = incompleta; hemlisis = completa; Esc: esculina; Hipur: hipurato; Arg: arginina; V.P. Voges Proskauer; Sal: salicina; Raf: rafinosa; Sorb: sorbitol; Lac: lactosa; Man: manitol; Rib: ribosa; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas;V: Variable.

TABLA III. GENERO Corynebacterium

Fermentacin Nit. C. pseudotuberculosis C. renale C. bovis C. urealyticum V Ureasa + + V+ Esculina Gluc. + + V+ Sac. Manit. Xyl. Malt. + Rib. + + -

Nit. = reduccin nitratos; Glu = glucosa; Sac: sacarosa; Manit: manitol; Xyl: xylosa; Malt: maltosa; Rib: ribosa; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas;V: Variable.

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TABLA IV. GNERO Erysipelothrix

Lactosa Ribosa Trehalosa Arabinosa
V+

E. inopinata V+ + -

E. rhusiopathiae + +

E. tonsillarum + V+

: Mayora de cepas positivas

TABLA V. GNERO Bacillus

B. polimixa B. stearothermophilus B. coagulans

B. licheniformis

B. megaterium

B. anthracis

B. pumilus

B. subtilis

B. cereus

Motilidad Nitratos V.P. O/F Lecitanasa Arabinosa Xilosa Manitol Crecimiento Anaerobiosis
O

+ + F + +

V+ + + F + +
V+

+ V O V V V +

+ + + O + + + -

+ + O + + + -

+ + + F + + + +

+ + + F + + + +

+ V F V V V V

+ V V F V V V +

V+ + F +

: Oxidativo; F: Fermentativo;

: Mayora de cepas positivas; V: Variable.

TABLA VI. GNERO Clostridium

C. tetani Motilidad Indol Lecitinasa Nitratos Esculina Hemlisis Morf.esporos V V+ RT C. perfringens + + V+ V OS C. botulinum tipos I V + + OS II + + OS III V VV + OS C. difficile V+ + OS C. septicum V+ V+ + + OS

RT: Redondos/Terminales; OS: Ovales/Subterminales; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable.

B. brevis
+ V O V +

B. alvei

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TABLA VII. GENERO Listeria

Test de CAMP Hemlisis R. equi S .aureus + +C + ++ +P + +c + Reduccin Nitratos +/Acidificacin de azcares D-Manitol + L-Ramnosa + +/+/-/+ D-Xilosa + + + -

L. monocytogenes L. ivanovii L. seeligeri L. innocua L. welshimeri L. grayi

C

: En forma de cerilla. P: En forma de pala. c: En forma de cerilla, dbil.

TABLA VIII. GNEROS Moraxella, Brahamella y Neisseria

M. phenylpruvica

B. catarrhalis

N. flavescens

Morfologa Hemlisis MacConkey Oxidasa Catalasa Red. Nitratos Ureasa

C

cb V+ + V+ -

cb + + + -

cb V+ + + V+ +

c + + + -

c + + + + -

c + + -

c + + + -

c + + -

c + + -

: Cocos. cb: Cocobacilos. V+: Mayora de cepas positivas.

TABLA IX. GNEROS Pseudomonas y Burkholderia

P. aeruginosa MacConkey Nitratos Citrato Lecitinasa Pigmentacin Acidificacin: Maltosa Glucosa Lactosa Manitol
V-

P. fluorescens crece + + verde + +

P. putida crece V + -

B. cepacia crece V+ No relevante no + + + +

crece + + verde + V

: Mayora de cepas negativas; V: Variable.

N. lactamica

M. lacunata

B. cuniculi

M. bovis

N. canis

B. ovis

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TABLA X. GNERO Bordetella

Movilidad MacConkey Hemlisis Reduccin nitratos Ureasa Oxidasa B. avium + + + B. bronchiseptica + + + + + + B. parapertussis + + -

TABLA XI. GNERO Acinetobacter

Hemlisis Citrato cido de glucosa Crecimiento 41-44 C A. baumanni + + + A. calcoaceticus + + A. lwolffii -

TABLA XII. FAMILIA Vibrionaceae

ClNa 6% Sensibilidad O129 Motilidad Lisina-DC Ornitina-DC Nitratos Indol Arabinosa Sacarosa
V+

Gnero Vibrio + V+ V. fluvialis V. vulnificus + + + V+ + + + V+ V+ -

Gnero Aeromonas resistente A. hydrophila A. salmonicida + V+ + + + + + -

Gnero Plesiomonas sensible P. shigelloides + + + + + -

: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas

29

TABLA XIII. GNEROS Pasteurella y Mannheimia

P. multocida MacConkey Indol Ureasa ONPG Ornitina-DC -hemlisis Acidificacin: Manitol Rafinosa Lactosa
V+

P. pneumotropica No crece + + + + + V+

M. haemolytica Crece + V+ + V+ V+

No crece + VV+ V+ V-

: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas

TABLA XIV. FAMILIA Enterobacteriaceae

Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiella Salmonella Proteus Yersinia

E. agglomerans

K. pneumoniae

E. aerogenes

S. gallinarum

E. sakazakii

C. diversus

C. freundii

K. ozaenae

S. arizonae

E. claocae

Y. enterocolitica V + + + +

P. mirabilis

P. vulgaris

Indol Rojo M V.P. Citrato Urea ADH Lisina-DC Ornitina-DC Movilidad Lactosa ONPG
V+

+ + + V + + + +

+ V+ + V +

- V - V- V+ V+ V + + V+ + + + + - V+ + + + + + + + + + V- + + + + + +

+ + V V+ + +

+ V + + + + +

K.oxytoca

E. coli

+ + +

+ V+ + V+ + + + + + + + + V- ND + + ND

+ V + + + -

+ + + + -

+ VV+ + V

: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable;

:No determinado

Y. ruckeri

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TIRAS MULTISUSTRATO
Dentro de las tiras multisustrato, el sistema API es un mtodo rpido de identificacin microbiana mediante el empleo de pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas. Cada tira API consta de un nmero variable de microtubos que contienen los sustratos deshidratados. Existen varios tipos de sistemas API compuestos por diferentes combinaciones de pruebas bioqumicas, con el objeto de identificar correctamente los diversos grupos microbianos. Los tipos de sistemas API ms utilizados son:
* API 20 E. Identificacin de Enterobactiaceae y otros Gram negativos. * API 20 A. Identificacin de bacterias anaerobias. * API Strep. Identificacin de Streptococcus. * API Staph. Identificacin de Staphylococcus. * API 50 CH. Estudio del metabolismo de hidratos de car-bono. * API Z. Deteccin de Salmonella, Shigella y Yersinia. * API S. Deteccin de enterobacterias. * API 20 EC. Deteccin de enterobacterias coliformes. * API 20 NE. Identificacin de Gram negativos no enterobacterias. * API 20 C AUX. Identificacin de levaduras. * API 20 B. Deteccin de bacterias hetertrofas anaerobias. * API ZYM. Estudio de actividades enzimticas. * API 10 M 5 FC. Deteccin de levaduras.

Los componentes del sistema API son: * Tira o galera con pruebas bioqumicas. * Cmara de incubacin. * Medio de suspensin. Unicamente se provee en los casos en que se requiere un medio especial, en el resto la suspensin se realiza en solucin salina estril. * Hoja de resultados. Deben conservarse en refrigeracin (2-8C) y utilizarse antes de la fecha de caducidad indicada en el envase. Modo de empleo Preparacin de la cmara de incubacin. Se aade agua (unos 5 ml) en los alveolos de la base de la cmara, con el fin de proporcionar una atmsfera hmeda. Preparacin del inculo. Tomar colonias del microorganismo a analizar y diluirlas homogneamente en un medio de suspensin mediante agitacin. Inoculacin de la tira. Se utilizarn micropipetas o puntas de pipeta estriles. Deben llenarse los microtubos de cada prueba bioqumica, evitando la formacin de burbujas. En caso de que el nombre abreviado de la prueba aparezca rodeado por tres barras (p.ej. |CIT ), tambin debe llenarse la cpula del microtubo, y si aparece subrayado (p.ej. ADH), la cpula debe completarse con aceite de parafina o de vaselina estril. Incubacin. Introducir la tira en la cmara de incubacin. La temperatura y condiciones de aerobiosis o anaerobiosis dependern del anlisis. El tiempo normal de incubacin es de 18-24 horas, en caso de que las reacciones sean dudosas debe reincubarse durante otras 24 horas. Lectura de resultados. Se aadirn reactivos en las pruebas que necesiten revelado. Se anotarn en la hoja de resultados las pruebas positivas y negativas (en las hojas hay algunas pruebas que deben hacerse aparte, p.ej. catalasa, motilidad, oxidasa, crecimiento en agar McConkey, etc., que tambin deben anotarse). Identificacin. Mediante el empleo del programa de ordenador Apilab Software. Tambin pueden utilizarse tablas y manuales especficos para sistemas API.

1. 2. 3.

4.

5.

6.

31

ANTIBIOGRAMA
Podemos definir en lneas generales como agentes antimicrobianos a aquellas sustancias que inhiben el crecimiento de los microorganismos o producen suinactivacin. Por lo tanto, y dependiendo de la accin que dichos agentes ejercen sobre los microorganismos, podemos dividirlos en: * Agentes microbiostticos: son aquellos en los que la inhibicin del crecimiento que producen desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo. * Agentes microbicidas: son aquellos que producen una accin letal irreversible sobre los microorganismos. Dependiendo de su naturaleza y procedencia, las sustancias antimicrobianas pueden ser productos qumicos de sntesis o bien productos naturales producidos por microorganismos u otros organismos vivos. A estos ltimos se les considera Antibiticos si bien algunos de ellos, que fueron primero descubiertos en la naturaleza, se obtienen en la actualidad sinttica o semisintticamente, de una forma ms sencilla y barata. Entre las sustancias antimicrobianas qumicas de sntesis se ha englobado dentro del concepto de Quimioterpico a aquellas que pueden interferir directamente en la proliferacin de los microorganismos a concentraciones toleradas por el husped. Por lo tanto, al ser sustancias que poseen una toxicidad selectiva, pueden utilizarse teraputicamente (de ah su nombre) para inhibir a un determinado microorganismo sin ocasionar lesiones importantes en el hospedador. Esta serie de propiedades (toxicidad selectiva, especificidad y extremada actividad) justifican la aplicacin de este tipo de sustancias en la clnica cuando las defensas corporales no bastan para que el individuo supere la enfermedad. De esta manera, el individuo puede recuperarse sin consecuencias graves, permitiendo la destruccin o eliminacin del agente etiolgico sin excesivos riesgos (o por lo menos menores que los producidos por la infeccin) en el hospedador. La resistencia bacteriana a quimioterpicos y antibiticos tom su verdadera importancia cuando se comprob la posibilidad de su adquisicin por mecanismos de transformacin, conjugacin y transduccin. De esta manera se obtiene la resistencia a gran cantidad de antibiticos y quimioterpicos al contactar cepas patgenas con cepas saprofitas que, al ser huspedes habituales del hombre y los animales, estn continuamente expuestas a gran cantidad de estas sustancias. El suministro de estos agentes antimicrobianos a los animales y hombre provoca la seleccin (que no el acostumbramiento) de los mutantes resistentes a estas sustancias. Si esta resistencia es extracromosmica, puede ser transferida a otros microorganismos menos frecuentes y ms patgenos. VALORACION DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS: ANTIBIOGRAMA La accin de los agentes antimicrobianos debe estudiarse sobre cultivos "in vitro" del agente en cuestin. Con los datos obtenidos puede planificarse la posible utilidad teraputica del producto ensayado. Entre estos datos puede ser interesante conocer los tipos de microorganismos sobre los que acta un antibacteriano (espectro antimicrobiano), las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento de un microorganismo (sensibilidad), el efecto de las condiciones ambientales sobre la sensibilidad (pH, temperatura, etc.), si posee accin microbicida o microbiosttica, etc.

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Uno de los datos que ms se maneja a nivel clnico y que ms trascendencia tiene es el de la sensibilidad; para calcularla se enfrentan los microorganismos problema a diversas concentraciones de sustancias antibiticas o quimioterpicas. Mediante este sistema definimos la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que es la menor concentracin de una sustancia que es capaz de inhibir el crecimiento visible de un microorganismo. La realizacin de esta tcnica es lo que se conoce como antibiograma, permitiendo el conocimiento de la CMI y la posible aplicacin teraputica, para cada caso clnico en particular, de la sustancia adecuada a la dosis correcta. Para la realizacin del antibiograma se pueden utilizar varias tcnicas, siendo la ms difundida y sencilla el Tcnica de Difusin en Agar, que a continuacin se detalla.

ANTIBIOGRAMA POR TECNICA DE DIFUSION EN AGAR Esta prueba consiste en enfrentar a un microorganismo a diversas sustancias antimicrobianas a una concentracin determinada para establecer la sensibilidad o resistencia de dicho microorganismo a las mismas. Hay que sealar que el antibiograma se debe realizar con un solo tipo de microorganismo cada vez, es decir, con un microorganismo en cultivo puro, no debindose utilizar una poblacin mixta de microorganismos para realizar el antibiograma. Por tanto, debern realizarse tantos antibiogramas como microorganismos significativos encontremos en la muestra clnica. * Medio de cultivo: el medio que se utiliza es el Mueller-Hinton. Las placas se secan 30 minutos a 37C antes de su empleo. * Inculo: la cepa que se estudia se cultiva durante 24 horas en medio de cultivo slido, normalmente a la temperatura de 37C; posteriormente se realiza una suspensin en solucin salina estril, de manera que obtengamos aproximadamente una concentracin de 106 de bacterias/ml. * Discos de antibiticos. Tcnica: 1. Siembra: se realiza una siembra por inundacin, utilizando 3-5 ml de la dilucin preparada. Se deja reposar 5 minutos. Posteriormente se elimina el sobrenadante inclinado la placa en varias direcciones, para dejar secar la placa durante 10 minutos a 37C en posicin invertida. 2. Aplicacin de los discos antibiticos: los discos se ponen a unos 15 mm de la periferia de la placa con ayuda del aplicador, apretando ligeramente los discos que no hayan entrado totalmente en contacto con el medio usando para tal fin el asa de platino esterilizada a la llama. Se pueden colocar aproximadamente 6 discos por placa, teniendo en cuenta que las zonas de inhibicin de los diferentes discos no deben entrecruzarse para que se puedan efectuar la lectura de los dimetros de los halos de inhibicin en varias direcciones. 3. A continuacin se dejan secar las placas de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente para que se sequen por completo. 4. Incubacin de las placas a 37C durante 18-24 horas.

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Tras este periodo se observar el crecimiento bacteriano y los halos de inhibicin, si los hubiera. * Lectura de la zona de inhibicin: se mide el dimetro (en milmetros) de la zona de inhibicin con una regla o comps (Figura 18). Cuando el borde no es neto, la lectura se realiza en la zona que corresponda aproximadamente al 80% de inhibicin. Ciertos antibiticos producen a veces extensas colonias perifricas que no hay que tener en cuenta en la medicin del dimetro si stas son escasas.

* Interpretacin del antibiograma: se comparan los dimetros de los halos de inhibicin producidos por cada uno de los antibiticos utilizados con los que se detallan en la Tabla 1 adjunta. En esta tabla se relacionan las zonas de inhibicin con la potencia de los discos y la sensibilidad bacteriana, por lo que debemos asegurarnos que la potencia de los discos que refleja la tabla coincide con la usada por nosotros. Para el uso clnico se han clasificado las bacterias en tres grandes grupos, segn su sensibilidad antibitica: - Cepa sensible: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento a la dosis habituales por va general. - Cepa intermedia: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento local, mediante un aumento de las dosis por va general, o por una concentracin fisiolgica particular (orina, bilis, etc.). - Cepa resistente: es aquella que probablemente no ser afectada con las dosis habituales, sea cual sea el tipo de tratamiento.

34

CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UN ANTIBIOGRAMA 1. No se debe realizar el antibiograma sobre una poblacin mixta de microorganismos, debindose proceder previamente al aislamiento y cultivo en pureza de los distintos microorganismos encontrados en la muestra clnica, para, posteriormente, realizar un antibiograma para cada uno de los distintos tipos de microorganismos de significacin clnica hallados. 2. No deben incluirse un nmero muy elevado de antibiticos. 3. Hay que realizar las siguientes consideraciones: 3.a. Se debe limitar el estudio de la sensibilidad a los antibiticos a aquellos que presumiblemente sean activos sobre el microorganismo implicado en el proceso infeccioso. Ha de tenerse en cuenta que, a pesar de que el espectro antibacteriano es el mismo para una misma familia de antibiticos, los fenmenos de resistencia no son siempre extrapolables a todos los miembros de dicha familia. 3.b. Se deben tener en cuenta las contraindicaciones de la especie animal a tratar.

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TABLA 1:CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORAS EN ANTIBIOGRAMAS

Antimicrobiano cido Nalidxico cido Oxolinico Ampicilina Disco NA 30g OA 2g AM 10g Dimetro (Interpretacin) S I R 19 14 18 13 11 10 13 17 14 16 29 28 17 16 26 19 25 18 21 14 19 20 18 14 17 13 17 15 16 14 14 13 22 16 21 15 18 15 17 14 21 18 20 17 23 18 21 18 21 15 16 23 21 23 21 15 14 19 19 15 16 18 21 18 18 17 29 15 28 17 19 23 20 14 11 20 16 14 14 15 12 17 < 15 12 16 16 13 15 11 10 14 13 12 13 13 < 17 14 14 12 28 14 19 12 14 18 16 10 10 16 10 Aplicable en: Enterobacterias Enterobacterias Estafilococos Enterococos Estreptococos (salvo S. pneumoniae) Estafilococos Otros organismos Referencia NCCLS 2002(V) NCCLS 2002(V)

Amoxicilina Amoxicilina+cla Amikacina Apramicina Aztreonam Ceftazidima Ceftiofur

AMX 25g AMC 30g AN 30g APR 40g ATM 30g CAZ 30g EFT 30g CTX 30g FOX 30g Cip 5 g C 30g CL 50g D 30g ENR 5g E 15g S 10g SPC 100g FFC 30g AR 30g GM 10g IMP 10g K 30g L 15g MAR 5g MAR 5g N 30g P 10g

SFM 2001 NCCLS 2002(V) NCCLS 2002(V) VAV NCCLS 2002(H) NCCLS 2002(H) NCCLS 2002(V)

Cefotaxima Cefoxitina Ciprofloxacina Cloranfenicol Colistina Doxiciclina Enrofloxacina

15 22 15 17 16 20 13 17 18 20 13 15 17 22 17 20 14 22 16 20 12 14 11 13 15 18 14 18 13 14 14 15 14 17 15 17 15 17 13 16 20 - 27 13 16 15 18 19 22 11 13

Enterobacterias Enterobacterias Actinobacillus pleuropneumoniae Pasteurella multocida Salmonella enterica Enterobacterias Enterobacterias Enterobacterias Salvo Estreptococos Estreptococos (no S. pneumoniae) Estafilococos, Enterobacterias y Pseudomonas P. multocida, E. coli (Aves) Mannheimia haemolytica, P. multocida y H. somnus (bovino) Salvo Estreptococos Estreptococos Enterobacterias M. haemolytica, P. multocida y H. somnus (bovino) M. haemolytica, P. multocida y H. somnus (Bovino)

NCCLS 2002(H) NCCLS 2002(H) NCCLS 2002(H) NCCLS 2002(V) SFM 2001 NCCLS 2000(H) NCCLS 2002(V)

Eritromicina Estreptomicina Espectinomicina Florfenicol Flumequina Gentamicina Imipenem Kanamicina Lincomicina Marbofloxacina Marbofloxacina Neomicina Penicilina

NCCLS 2002(V) NCCLS 2002(H) NCCLS 2002(V) NCCLS 2002(V)

Estafilococos Enterococos Estreptococos (salvo S. pneumoniae)

NCCLS 2002(V) NCCLS 2002(V) NCCLS 2002(V) SFM 2001 ROSCO VTOQUINOL LIOFILCHEM NCCLS 1999(V)

Sulfafurazol (sulfamidas) Tetraciclina Tiamulina Tilmicosina

SF 300g TE 30g T 30g TIL 15g TY 30g TM 30g

NCCLS 2002(V) Otros salvo Estreptococos Estreptococos NCCLS 2002(V)

Tilosina Trimetoprim

11 15

LIOFILCHEM M. haemolytica (Bovino) NCCLS 2002(V) P. multocida, A. Pleuropneumoniae (Porcino) LIOFILCHEM Enterobacterias , Estafilococos NCCLS 2002(H)

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PRCTICA DE VIROLOGA
INTRODUCCIN Los virus son agentes infecciosos extraordinariamente pequeos compuestos por protena y un nico tipo de cido nucleico, ARN o ADN pero no ambos. Aquellos que tienen envoltura, adems poseen lpidos y, en algunas ocasiones, las protenas ms superficiales poseen grupos azcares (glucoprotenas). Dada su extrema simplicidad estructural, los virus son incapaces de llevar una vida independiente y necesitan parasitar clulas que les van a aportar aquellos materiales de los que carecen y van a permitir su replicacin. Por lo tanto, en el ciclo de vida de los virus se puede hablar de dos fases: a) fase extracelular, en la que actan como partculas inertes sin actividad metablica alguna, simplemente para pasar de clula a clula; b) fase intracelular, en la cual desarrollan su ciclo de vida, y de la cual se deriva su efecto patognico. Algunos virus pueden prescindir de la fase extracelular porque son captados por otra clula no infectada segn geman o emergen, o porque aprovechan que la clula se est dividiendo para transmitirse a las clulas hijas. Pero ningn virus puede prescindir de fase intracelular. Por este motivo, el estudio de los virus siempre requiere el uso de clulas vivas. Afortunadamente, en la actualidad se dispone de lneas celulares continuas: clulas que se multiplican en un medio adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio y que cuando hay muchas se prescinde de parte de ellas para que las que permanecen puedan seguirse multiplicando, y as bsicamente de una forma indefinida. Las clulas as mantenidas son muy susceptibles a alteraciones accidentales tales como contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presin de oxgeno, etc. Han de ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo las condiciones lo ms constantes posible. Por este motivo, el acceso a la sala de cultivos debe ser restringido y no es aconsejable incluir en las prcticas el manejo de las clulas, bien infectadas o bien sin infectar por virus. Los virus son demasiado pequeos para ser observados con el microscopio ptico. Sin embargo, al desarrollar su ciclo de replicacin utilizan productos celulares y alteran la vida de la clula, y en muchas ocasiones esto s que se puede observar con el microscopio ptico. Como se indic ms arriba, ste es el llamado efecto citoptico. Los posibles efectos citopticos son numerosos. Entre ellos se cuentan la aparicin de sincitios, la lisis celular, el desarrollo de cordones, la vacuolizacin, la aparicin de clulas gigantes, etc. Al final de la descripcin de esta prctica hay algunas fotos demostrativas. En la WebCT de la Microbiologa, en Laboratorio Virtual de Microbiologa Veterinaria, en la parte destinada a Laboratorio de Virologa hay imgenes de efectos citopticos y cmo se van desarrollando.

OBJETIVO El objetivo de esta prctica es hallar la cantidad de virus presente en una muestra de origen infeccioso. Para ello, realizaremos una titulacin, a fin de determinar la Dosis Infectiva en Cultivo Tisular 50 (TCID50), o cantidad de muestra que produce efecto citoptico en 50%

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de los cultivos. Los clculos son muy similares a los que se realizan para determinar cualquier otra dosis infectiva, letal, etc 50. DESARROLLO Todo el proceso debe realizarse en condiciones de la mxima esterilidad. Se dispondr de una placa de 96 pocillos en la que se van a hacer dos titulaciones. Las placas son muy parecidas a las de ELISA pero estn tratadas para que las clulas se adhieran a las mismas. A diferencia de las bacterias, los virus no crecen bien en cualquier clula y son muy especficos. En el laboratorio generalmente hay que disponer de una veintena o ms de lneas celulares para garantizar que un virus procedente de un aislamiento concreto puede crecer en alguna de ellas. Sin embargo, en estas prcticas se va a titular un virus que sabemos que crece sobre la lnea celular CRFK, fibroblastos de rin felino. Para la titulacin, haremos diluciones del virus que iremos aadiendo a los pocillos. Transcurridas 24 h veremos el efecto citoptico. Protocolo de la prctica En la placa, en cada uno de los 96 pocillos hay alrededor de 20.000 clulas en 100 l en un medio de cultivo especfico para cultivos titulares. Cada placa ser empleada para dos titulaciones, aadiendo 100 l de cada dilucin del virus a cuatro pocillos diferentes. 1. Realizar diluciones de la muestra de virus en base cinco. Preparar una batera de tubos Eppendorf estriles, hasta un total de 10 tubos. Aadir 800 l de medio de cultivo (RPMI con suero fetal bovino y antibiticos, para evitar en la medida de lo posible el crecimiento de bacterias) a cada uno. Tomar con una micropipeta 200 l de muestra de virus, y transferirlos al primer Eppendorf. En este tubo, el virus habr quedado diluido 1:5. Mezclar concienzudamente, y transferir 200 l del tubo 1:5 al siguiente tubo, quedando el virus diluido 1:25. Repetir el paso 5 hasta el final, partiendo siempre del ltimo tubo en donde se ha realizado la dilucin. 2. Una vez estn todas las diluciones hechas, pasar 100 l de cada dilucin a cuatro pocillos distintos. La dilucin final del virus en cada pocillo ser la mitad que la inicial, ya que en el volumen final, tan slo la mitad corresponde a la dilucin del virus. 3. No aadir dilucin de virus a las dos ltimas columnas, para considerarlas controles. En estos pocillos, las clulas tienen que crecer perfectamente. 4. Incubar a 37C durante 24 horas en atmsfera con 5% de CO2 y humedad. Al da siguiente se procede a observar el resultado. A partir de aqu ya no es necesario mantener las condiciones de esterilidad. 1. Eliminar el medio de cultivo por absorcin con una pipeta multicanal. 2. Fijar las clulas con metanol, aadiendo 100 l a cada pocillo con la pipeta multicanal y dejndolo actuar durante 5-10 minutos. 3. Eliminar el metanol y lavar con el agua del grifo dejndola caer en los pocillo con mucho cuidado para que no se desprendan las clulas. 4. Aadir 100 l de solucin Giemsa, y dejndolo actuar durante 30 minutos. Si el colorante no est preparado, diluir 1 gota de la solucin madre en 1 ml de agua.

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5. Eliminar la solucin de Giemsa y lavar con cuidado con el agua del grifo. 6. Observar al microscopio. 7. Anotar en un papel los pocillos en los que hay efecto citoptico (aquellos en los que las clulas pegadas al pocillo son menos de la mitad que en los controles).

RESULTADOS Para evaluar los resultados y dar un ttulo hay que aplicar una frmula estadstica. Aqu se muestra el mtodo de Karber. TCID50 = - -(S-0.5) = log10 de la ltima dilucin con 100% de cultivos positivos (con efecto citoptico) = log10 del factor de dilucin log10 10 = 1 log10 5 = 0,7 log10 3 = 0,5 log10 2 = 0,3 S = suma de la fraccin de pocillos con efecto citoptico en cada dilucin, desde la dilucin en la que el 100% lo muestra. Este ltimo caso tiene un valor de 1 y todos los dems sern una fraccin de 1.

En el ejemplo de la pgina anterior = -2,4 (log10 de 1:250, ltima dilucin con el 100% de efecto citoptico). = 0,7 (diluciones en base 5) S = la suma de Dilucin 1:250 = 4/4 = 1 Dilucin 1:1250 = 3/4 = 0,75 Dilucin 1:6.250 = 1/4 = 0,25 Dilucin 1:16.250 =0/0= 0 Suma = 2,00 Sustituyendo los valores en la ecuacin: TCID50 = - 2,4 (0,7 x (2-0,5)) = -2,4 (0,7 x 1,5) = - 2,4 1,05 = -3,45

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TuboColumna Dilucin en el Eppendorf

1 1:5

2 1:25

3 1:125

4 1:625

5 1:3125

6 1:15.625

7 1:78.125

10 1:9.765.625

(11) Contr

(12) Contr

1:390.625 1:1.953.125

RPMI Virus Dilucin final en pocillo

800l 200l 1:10

800l 200l 1:50

800l 200l 1:250

800l 200l 1:1250

800l 200l 1:6.250

800l 800l 800l 800l 800l 200l 200l 200l 200l 200l 1:16.250 1:156.250 1:781.250 1:3.906.250 1:19.531.250

Ejemplo

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Algunos ejemplos de efecto citoptico

a) Efecto citoptico inexistente

b) Lisis, calvas o placas

c) Efecto citoptico: leucemia

d) Efecto citoptico: sincitios

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PRACTICA DE MICOLOGIA
Objetivos: En esta prctica el alumno debe cubrir los siguientes objetivos: Conocimiento de las tcnicas bsicas utilizadas en el laboratorio de Micologa. Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se desarrollan sobre medios de cultivo. Conocer las caractersticas morfolgicas (macro y microscpicas) de los distintos grupos taxonmicos de inters veterinario. Aprender a utilizar las claves dicotmicas bsicas de identificacin de hongos. Teora: 1. Medios de cultivo: no difieren en principio de las normas generales expuestas al hablar de bacterias. Los aspectos diferenciales que podemos destacar son los siguientes: Se utilizan medios selectivos con los siguientes objetivos: a) Inhibir el crecimiento de bacterias. Para ello se han empleado dos estrategias bsicas: ** Medios con pH cido (<5). ** Medios a los que se aade antibiticos de amplio espectro: tetraciclina, penicilina/ estreptomicina, cloranfenicol, gentamicina, etc. b) Inhibir el crecimiento de un determinado grupo de hongos: ** Actidione (cicloheximida) que inhibe el crecimiento de la mayora de los hongos saprofitos, se utiliza en los medios de aislamiento de los hongos dermatofitos. c) Restringir el crecimiento de hongos de desarrollo invasivo, como en el caso de los Zygomycetes, agregando Rosa de Bengala, al 03 por mil. 2. Incubacin: * La incubacin se realiza en aerobiosis. * Se utilizan diferentes temperaturas de incubacin dependiendo del tipo de muestra en estudio: ** Temperatura de 22-28C: cuando se quiere aislar hongos que colonizan sustratos no vivos (alimentos, ambientes....). ** Temperatura de 32C: cuando se procesan muestras clnicas para el diagnstico de micosis superficiales. ** Temperatura de 37C: cuando se procesan muestras clnicas de mamferos para diagnstico de micosis profundas. * El periodo de incubacin vara entre 3-5 das y hasta 21 das en dermatofitos.

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3. Mtodos de aislamiento: Obtencin de cultivos puros. Mtodos: - Siembra por agotamiento: utilizado para levaduras (ya descrito en las tcnicas de bacteriologa.

Siembra en tres puntos: utilizado para hongos miceliares.

Siempre que trabajemos con un cultivo de hongos debemos tener en cuenta que estos se reproducen por medio de esporas, y que estas se dispersan muy fcilmente por el ambiente, contaminando el laboratorio. Por tanto, debemos tomar precauciones en la manipulacin de los cultivos, de tal forma que se evite, en lo posible, la contaminacin, para lo cual: Debemos tener las placas abiertas el menor tiempo posible. Las placas con crecimiento fngico siempre se abren boca abajo, dejando la tapa en la mesa y manteniendo el cultivo hacia abajo con el fin de que las esporas no se diseminen.

Mtodo de siembra en tres puntos a. Con el asa de platino estril y fra se raspa ligeramente el centro de la colonia del hongo. b. En una placa con medio de cultivo se toca en tres puntos equidistantes con el asa de platino cargada. c. Se lleva a incubar a temperatura y periodo ptimos dependiendo del tipo de problema en estudio. 4. Mtodo de identificacin de hongos aislados sobre medio de cultivo: La identificacin se realiza siguiendo las pautas: * Anlisis macroscpico de las colonias: por el aspecto de la colonia podemos saber si se trata de una levadura o de un hongo miceliar o filamentoso. Los caracteres macroscpicos de la colonia que presentan inters taxonmico son: Color (anverso y reverso), tonalidad y distribucin. Textura superficial, surcos y/o estras. Exudados y pigmentos. Tamao

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* Anlisis microscpico. a.- Para levaduras: siguiendo procedimiento similares a las tcnicas bacteriolgicas ya descritas. - En fresco, sin fijar. - Fijadas y teidas b.- Para hongos miceliares: las preparaciones para la observacin microscpica se montan normalmente utilizando los siguientes elementos: - Agua o azul de metileno como agente de montaje. - Agujas enmangadas o "celo" para toma del material a examinar. Tcnica de la cinta adhesiva: 1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa. 2. Se corta un trozo de papel celo que se pone en contacto con una colonia del hongo. 3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno. 4. Se presiona el celo sobre el porta, eliminando el exceso de agua o colorante con papel secante (filtro), evitando la formacin de burbujas. 5. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos. Tcnica del cubreobjetos 1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa. 2. Con dos agujas enmangadas se toma una porcin del centro de la colonia. 3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno. 4. Se dislacera, con ayuda de las agujas, la porcin de colonia en estudio. 5. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, eliminando el resto de agua o colorante con papel secante (filtro). 6. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos. El agua para el montaje de la preparacin, se emplea cuando queremos conocer la coloracin que tienen las estructuras de los hongos. Caracteres que presentan valor taxonmico: a) En la identificacin de levaduras. b) En la identificacin de hongos miceliares. a) Criterios de identificacin para levaduras: Caractersticas de cultivo: - Medio lquido: formacin de velo o anillo. - Medio slido: Caractersticas macroscpicas de la colonia (ya descritas) Caractersticas microscpicas de la levadura: - Forma, tamao de las clulas. - Tipo de reproduccin asexual. - Tipo de reproduccin sexual. Caractersticas fisiolgicas: - Utilizacin de los compuestos de carbono: ** Fermentacin ** Oxidacin ** Hidrlisis de la arbutina - Utilizacin de los compuestos de nitrgeno.

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Capacidad de crecimiento en medios libres de vitaminas. Hidrlisis de la urea Produccin de pigmentos. Capacidad de licuar gelatina.

b) Criterios de identificacin para hongos miceliares: Caractersticas de cultivo: a partir de las colonias desarrolladas en medios de cultivo slidos ejem: agar extracto de Malta, agar glucosado de Sabouraud, CzapexDox, etc. - Caractersticas macroscpicas: (ya descritas) - Caractersticas microscpicas: ** Caractersticas de las hifas: Dimetro. Color: (hialino, dematiceo = oscuro, marrn) Presencia o ausencia de septos. Presencia de determinadas formaciones caractersticas: hifas en raqueta, hifas en espiral, hifas peptinadas, formacin de clamidosporas. ** Caractersticas de las estructuras reproductoras asexuales: Hongos cenocticos: Morfologa del esporangio Morfologa de la columela Presencia o ausencia de apfisis, rizoides... Hongos septados Presencia o ausencia de conidiforo. Morfologa del conidiforo. Morfologa y tipo de clula conidigena. Tipo de conidiogenesis: tlica o blstica. Estructura y caractersticas de los conidios. ** Caractersticas de las estructuras reproductoras sexuales (si las hay). Hongos cenociticos Morfologa de la zigospora Hongos septados Presencia de cuerpos fructferos sexuales (cleistotecios, apotecios, peritecios). Presencia y tipos de ascas y ascosporas.

En la mayor parte de los hongos miceliares la informacin obtenida del estudio de sus caractersticas de cultivo (anlisis macro y microscpico) es suficiente para poder identificarlos utilizando las claves dicotmicas. En algunos casos, para poder discernir entre dos gneros prximos o bien dentro de un gnero determinado entre dos especies, se tiene que recurrir a pruebas fisiolgicas, que nos pondrn en evidencia diferencias metablicas entre ellas (presencia o ausencia de un determinado enzima, capacidad de asimilacin de determinados sustratos.......).

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IDENTIFICACIN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS

1.a - Crecimiento en Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias ms o menos mucosas, de color blanco, crema, rosa, rojas .......etc., sin formacin de filamentos.................................................................................LEVADURAS

1.b - Crecimiento en medio Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias de apariencia miceliar........................................................................................... 2

2.a - Hifas no septadas (o con septos muy escasos en las proximidades de los rganos, reproductores). Dimetro de la hifa >4. Esporas asexuales se forman en el interior de receptculos cerrados (esporangios) HONGOS CENOCITICOS Div. Zygomycota

2.b - Hifas septadas. Dimetro de la hifa variable normalmente <4u HONGOS TABICADOS Div. Ascomycota Div. Deuteromycota

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HONGOS CENOCITICOS.

Division Zygomycota Crecimiento en medios slidos, generalmente muy expansivo, algodonoso, hifas hialinas, los esporangios se ven como puntos oscuros en la superficie de la colonia

Caractersticas de inters taxonmico

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1.a.- Esporangiosporas formadas en el interior de merosporangios......................... .............................................................................................. Syncephalastrum

1.b.- Esporangiosporas formadas en esporangios globosos con columela......................................................................................................... 2

2.a.- Micelio vegetativo con rizoides. El esporangio presenta apfisis ................. 3

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2.b.- Ausencia de rizoides y de apfisis........................................................... Mucor

3.a.- Rizoides situados en la base del esporangio. Columela de forma globosa ............................................................................................................ Rhizopus

3.b.- Rizoides presentes pero a menudo difciles de observar. Apfisis en forma de embudo.................................................................................................. Absidia

HONGOS TABICADOS. Divisin Ascomycota. Divisin Deuteromycota. 1.a.- Organos reproductores cerrados presentes: sexuales (cleistotecio, peritecio y apotecio) o asexuales (picnidios, acervulos)............................................................2

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1.b- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales cerrados ausentes................................................................... Div. Deuteromycota Clase Hyphomycetes 2.a.-Organos reproductores sexuales presentes. Espora sexual en el interior de una clula en forma de saco (asca)...............................................Div. Ascomycota

2.b.- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales cerrados presentes.................................................................... Div. Deuteromycota Clase Coelomycetes

Divisin Deuteromycota. Clase Hyphomycetes. 1.a.- Conidios ausentes............................................... Micelio estril. 1.b.- Conidios presentes........................................................ 2.

2.a.- Conidios mayoritarios formados por un proceso tlico . .............................. 3.

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2.b.- Conidios mayoritarios formados por un proceso blstico. ............................ 6

3.a.- Conidio formado por fragmentacin de micelio vegetativo (sin diferenciacin previa), formando artroconidias exclusivamente. Micelio hialino............................................................................................. Geotrichum

3.b.- Artroconidia ausente o poco abundante,presencia de otro tipo de conidios tlicos. Micelio hialino.................................................................................... 4. 4.a.- Presencia de dos tipos de conidios tlicos: unicelulares (microconidios) y pluricelulares con tabiques transversales (macroconidios)........................... 5.

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4.b.- Presencia de un solo tipo de conidio pluricelular (tabicado con septos transversales)......................................................................... Epidermophyton

5.a.- Macroconidia de pared gruesa y rugosa. Relativamente ms abundantes que las microconidias.......................................................................... Microsporum

5.b.- Macroconidia de pared delgada y lisa. Microconidia relativamente ms abundante que las macroconidias............................................... Trichophyton

6.a.- Conidios generalmente unicelulares............................................................ 7. 6.b.- Conidios generalmente pluricelulares......................................................... 10. 7.a.- Conidios mayoritarios formados a partir de micelio indiferenciado por gemacin (blstico). Colonias viscosas, aspecto levaduriforme, color variable ini-

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cialmente (blanquecinas, rosas, marrn plido) evolucionando a marrn oscuro........................................................................................Aureobasidium

7.b.- Conidios formados sobre clulas conidigenas diferenciadas y agrupados de forma caracterstica constituyendo conidioforos...................................... 8.

8.a.- Colonias en tonos blancos o marrones claros cuando envejecen. Clulas conidiognas anelidicas, conidios generalmene rugosos de base truncada, agrupados formando cadenas...................................................Scopulariopsis

8.b.- Colonias en tonos blancos, amarillos, azules, verdes, generalmente de crecimiento rpido. Clulas conidiogenas fialidicas....................................... 9.

9.a.- Las fialides insertadas sobre el pice de una hifa diferenciada, ensanchada, que constituye la vescula. Pudiendo tener uno o dos verticilos de clulas conidiogenas................................................................................... Aspergillus

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9.b.- Las fialides constituyen el ltimo verticilo del conidioforo que tiene la forma caracterstica de pincel.................................................................... Penicillium

10.a.- Colonias blancas, amarillas, rosadas.Generalmente los macroconidios tienen Forma de hoz con tabiques transversales.Tambin pude tener microconidios unicelulares........................................................................................ Fusarium

10.b.- Colonias generalmente de coloresoscuros (verde, marron). Micelios oscuros (dematiaceos). Conidios maduros pluricelulares con tabiques de orientacin irregular, transversales, longitudinales y oblicuos (dictioconidio).... Alternaria

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Levaduras

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Glosario de los terminos micolgicos empleados en la clave de identificacin de las prcticas

Anlide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de una manera baspeta, alargandosese con
la produccin de cada conidio, que deja cicatrices en forma de anillo en la superficie externa.

Aplanospora: espora inmvil. Apfisis: dilatacin en el extremo del esporangiforo situado debajo del esporangio de los Zygomicota. Artrospora. Espora resultante de la fragmentacin de la hifa. Cenoctica: no septada. Clamidospora: conidio tlico de pared gruesa, que generalmente funciona como espora de resistencia. Columela: estructura estril existente dentro de un esporangio u otra fructificacin. Conidio: espora asexual no movil, que suele formarse en el pice o en el lado de la clula esporgena (clula conidigena). Conidio blstico: conidio que se forma por un proceso de gemacin a partir de una clula conidigena. Conidio tlico. Conidio formado por transformacin de la totalidad de una clula hifal preexistente. Conidiforo: hifa simple o ramificada que sale de una hifa somtica y se modifica de tal forma que en su pice, o en un lado lleva una o ms clulas conidiogenas. Dictioconidio: espora con tabique transversales , longitudinales y oblicuas. Esporangio: estructura en forma de saco cuyo contenido protoplsmico completo se transforma en un nmero indefinido de esporas. Esporangiolo: esporangio pequeo que contiene pocas esporas. Esporangioforo: hifa portadora de un esporangio. Filide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de unamanera baspeta, sin un aumento detectable de la longitud.

Hifa hialina: hifas transparentes, incoloras. Hifa dematiacea: hifas de color oscuro. Merosporangio: esporangio cilndrico. Rizoide: ramificacin corta y delgada de las hifas semejante a la raiz de una planta. Zoospora: espora movil, producida asexualmente.

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ANALISIS DE ALIMENTOS
La existencia de microorganismos en los alimentos no significa en muchos casos un peligro para el consumidor o una calidad deficiente de los mismos. Slo en aquellos casos en los que los alimentos vehiculan grmenes potencialmente patgenos o en los que la manipulacin y las condiciones de higiene y almacenamiento han sido deficientes pueden constituir un serio peligro para la salud del consumidor. No obstante la legislacin vigente exige la ausencia de determinados microorganismos, y un nmero mximo de otros, con lo que sea por la causa que sea, el anlisis de alimentos microbiolgico de alimentos es obligatorio. Como consecuencia la determinacin en el laboratorio de ciertos grupos de microorganismos cuya presencia en los alimentos en determinado nmero indica que estos alimentos estuvieron expuestos a condiciones tales que permitieron la entrada y multiplicacin de agentes infecciosos o toxignicos. A estos grupos de microorganismos se les denomina "indicadores" y sirven para evaluar la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus toxinas. En otros casos se pueden seleccionar otros grupos de bacterias, aadiendo al agar nutritivo inhibidores selectivos con actividad de superficie o colorantes, modificando la composicin de la atmsfera de incubacin, eliminando por ejemplo el oxgeno. METODO: Objetivo: Determinar el nmero de microorganismos totales o un grupo de ellos en concreto que hay en 1 ml o en 1 g del alimento a analizar. Recuentos en placa de bacterias: Dichos recuentos se basan en la determinacin del nmero de colonias que crecen en placas de agar nutritivo que han sido sembradas con cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en determinadas condiciones ambientales. Como se ha sealado anteriormente, la siembra en la placa de agar nutritivo del alimento se realiza con este diluido. Los diluyentes utilizados, varan dependiendo del tipo de muestra que se deba analizar; en general suelen ser sustancias tales como agua destilada, solucin salina, solucin Ringer, solucin tampn fosfato, y para el recuento bacteriano en alimentos est especialmente recomendada una solucin al 0,1% de peptona en agua destilada o solucin salina. El mtodo para diluir alimentos slidos o lquidos es diferente. 1. Muestras lquidas: 1.a. Homogeneizacin de la muestra usando el agitador excntrico. 1.b. Con una pipeta se toma 1 ml de la muestra y se deposita en el primer tubo de dilucin que contiene 9 ml de diluyente (figura 20). 1.c. Una vez utilizada la pipeta se elimina. 1.d. Este primer tubo se homogeneiza 1.e. De este tubo se toma 1 ml que se deposita en un segundo tubo de dilucin con otros 9 ml de diluyente. 1.f. Se elimina nuevamente la pipeta utilizada. 1.g. Se homogeneiza este segundo tubo. Este procedimiento se repite tantas veces cuantas diluciones sean necesarias. 2. Muestras slidas:

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En el caso de muestras slidas o semislidas, se considera que 1 g de muestra equivale a 1 ml del mismo producto en estado lquido; de este modo 10 g de la muestra y 90 ml de diluyente convenientemente homogeneizados en una batidora, constituirn la primera dilucin. Posteriormente se procede igual que en el caso anterior. El segundo paso sera sembrar en superficie un determinado volumen (0,1-0,2 ml) de cada dilucin en placas de agar nutritivo, para lo que se utiliza el asa de Drigalski tal y como se describe en la pgina 11. INTERPRETACION: Para hacer recuento de microorganismos aerobios mesfilos las placas sembradas de esta forma se incuban a 32-37C durante 24-48 horas. Trascurrido el periodo de incubacin se procede a contar el nmero de colonias que haya en las placas correspondientes a las distintas diluciones, teniendo en cuenta que slo se deben considerar aquellas placas cuyo nmero de colonias sea superior a 30 e inferior a 300. Las colonias se cuentan punteando con rotulador cada una de ellas por el reverso de la placa de Petri, con el fin de no contar una misma colonia dos veces. Tras contarlas se debe utilizar este dato , junto a los de volumen sembrado y dilucin que corresponda , para calcular el nmero de microorganismos por unidad de volumen o peso de muestra. As, por ejemplo, si en la dilucin 10-7, hemos contado 35 colonias, multiplicaremos este nmero por el inverso de dicha dilucin, con lo cual obtendremos 35x107 en el volumen que hemos aadido a la placa (0,1 ml). Como el resultado debe darse por mililitro de muestra original, el resultado final ser 35x108, o, expresado ms sencillamente, 3,5x109

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Batera de tubos conteniendo cada uno NUEVE ml exactos de solucin salina estril

De cada tubo del banco de diluciones se siembran una o varias placas Petri con agar nutritivo o medio selectivo especfico.

Demasiadas colonias

Nmero adecuado para recuento (30 a 300)

Pocas colonias

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MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS GENERALES
AGAR SANGRE Composicin en g/l:
* Peptona de casena............ 12'0 * Peptona de carne............... 11'0 * Almidn............................. 1'5 * Cloruro Sdico.................. 5'0 * Agar................................. 15'0 pH final: 7'3 aproximadamente

Tambin pueden emplearse como medio base para el agar sangre el agar Columbia o el agar de Soja Tripticasena (TSA). El medio base, una vez esterilizado debe enfriarse hasta una temperatura de 45C. En ese momento se aade la sangre desfibrinada de carnero o de caballo hasta una concentracin del 5% . En el caso de que se aadiera la sangre a una temperatura mayor a 45C, sta se hemolizara, con lo que obtendramos el denominado "Agar-chocolate". Se trata de un medio de uso general (no selectivo), que soporta bien el crecimiento de bacterias normales como las enterobactericeas y otros ms exigentes como Pasteurella y Brucella, etc. Este medio contiene una mezcla equilibrada de peptonas de carne y casana, que lo hacen muy adecuado para la preparacin de medios selectivos y diagnsticos con la adicin de sangre y/o inhibidores. Tal como se presenta, es decir sin adiciones y aadiendo sangre, es un excelente medio de cultivo general. Normalmente, las bases de Agar Sangre contienen una peptona de casena que facilita la produccin de colonias de gran tamao y una peptona de carne, que proporciona unos halos de hemlisis muy definidos, propiedad que es muy importante desde el punto de vista taxonmico.

MEDIO DE SOJA TRIPTICASEINA (TSA) Composicin en g/l:

* Peptona de Casena............. 15'0 * Peptona de Soja....... ......... 5'0 * Cloruro de Sodio................. 5'0 * Agar................................... 15'0 pH final: 7'3 aproximadamente.

Se trata de un medio para uso general, que contiene dos peptonas, las cuales favorecen el crecimiento de una amplia variedad de microorganimos. Es idneo para el cultivo tanto de aerobios como anaerobios. Tambin se puede utilizar el medio como base de Agar Sangre; para ello se debe aadir un 7% de sangre. Igualmente, se puede usar para la preparacin de "Agar chocolate".

GAR DE MUELLER HINTON (MH) Composicin en g/l:

* Peptona........................ 17'5 * Infusin de Carne............4'0 * Almidn........................ 1'5 * Agar............................. 15'0

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Este agar fue ideado como medio de cultivo para aislamiento de especies patgenas del gnero Neisseria. Sin embargo, a partir de 1970 la OMS propuso este medio de cultivo para los ensayos de sensibilidad de antibiticos y sulfamidas, en un afn de estandarizar dichos ensayos.

MEDIOS SELECTIVOS
MEDIO DE BAIRD-PARKER (BP) Composicin en g/l:
* Peptona de casena.............10'0 * Extracto de carne.............. 5'0 * Extracto de levadura...........1'0 * Cloruro de Litio................ 5'0 * Agar................................. 17'0 * Glicina............................. 12'0 * Piruvato de Sodio............ 10'0 pH final: 6'8 aproximadamente

Una vez esterilizado el medio, se aaden 10 ml de una solucin de Telurito Potsico al 1% y una Yema de Huevo emulsionada. Se trata de un medio altamente selectivo para el aislamiento y enumeracin de los miembros del gnero Staphylococcus. El medio incorpora Piruvato Sdico como estimulante del crecimiento. As mismo incorpora un fuerte inhibidor de muchos microorganismos como es el Telurito Potsico, actuando tambin como inhibidores, el Cloruro de Litio y la Glicina. La emulsin de Yema de Huevo hace al medio opaco y permite observar si los microorganismos presentes en el medio poseen lecitinasa, una enzima que desdobla la lecitina presente en la Yema de Huevo. La actividad de esta enzima produce zonas de aclaramiento o halos ms claros alrededor de las colonias. Las colonias de Staphylococcus aureus aparecern brillantes y de color negro por la reduccin del Telurito Potsico. Sin embargo, el color de las colonias no es decisivo para la identificacin: miembros del gnero Listeria que presentan el mismo aspecto. En este medio tambin pueden desarrollarse microorganismos de los gneros Bacillus y Micrococcus.

MEDIO DE MacCONKEY (Mck) Composicin en g/l:

* Peptona................... 20'0 * Lactosa................... 10'0 * Sales Biliares............ 2'5 * Cloruro Sdico......... 5'0 * Rojo Neutro............. 0'05 * Cristal Violeta.......... 0'001 * Agar........................ 15'0 pH final: 7'2 aproximadamente.

Se trata de un medio diferencial para la deteccin, aislamiento y enumeracin de coliformes y patgenos intestinales en agua, productos lcteos y muestras biolgicas. Se utiliza fundamentalmente para el aislamiento de miembros de la Familia Enterobacteriaceae y diferenciacin de Escherichia coli de otros patgenos intestinales de la misma familia. Los componentes selectivos lo constituyen el Cristal Violeta (inhibidor de los microorganismos Gram-positivos) y las Sales Biliares. La concentracin de estas dos sustancias permite el crecimiento de todos los miembros de la familia anteriormente citada. Las bacterias del gnero Pseudomonas pueden crecer tambin en este medio, aunque no perte-

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necen a la Familia Enterobacteriaceae; sin embargo, se diferencian bien por ser las Pseudomonas Oxidasa positivas y aerobias estrictas. La incorporacin del rojo neutro (de color rosa en medio cido) permite la diferenciacin de los microorganismos que fermentan la Lactosa de los que no lo hacen. Los primeros, al fermentar la Lactosa acidificarn el medio, dando lugar a que las colonias presenten una coloracin rosada, que no aparecer si no se hidroliza dicho disacrido.

MEDIO DE SABOURAUD (Sb) Composicin en g/l:

* Glucosa............................. 40'0 * Peptona de Casena............. 5'0 * Peptona de Carne............... 5'0 * Agar....................... .......... 15'0 pH final: 5'6 aproximadamente.

Se trata de un medio indicado para el cultivo de hongos. Su selectividad se debe a su bajo pH y a la alta concentracin de glucosa, que junto con una incubacin a temperaturas relativamente bajas (25 a 30C), permiten favorecer el crecimiento de los hongos, al mismo tiempo que dificultan el de las bacterias. Frecuentemente este medio es usado con antibiticos para el aislamiento de hongos patgenos, a partir de material que contenga gran cantidad de otros hongos o bacterias.

OTROS MEDIOS DE USO FRECUENTE * Caldo BHI adaptado para el crecimiento de microorganismos exigentes. * Agar Columbia, medio bsico enriquecido para microorganismos exigentes, tambin usado como base para el agar sangre. * Agar Salmonella-Shigella (SS) diferencial y selectivo para estos gneros. * Agar Malta y Agar Czapek para el aislamiento de hongos.

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PRUEBAS BIOQUMICAS
UTILIZACION DE AZUCARES Los azcares que vamos a utilizar son: - GALACTOSA - GLUCOSA - INOSITOL - LACTOSA - MALTOSA - MANITOL

- RAFINOSA - RAMNOSA - RIBOSA - SALICINA - SORBITOL - XYLOSA

FUNDAMENTO: Estas pruebas bioqumicas se integran dentro del grupo que estudia la determinacin de la capacidad de un microorganismo para utilizar un hidrato de carbono especfico incorporado en un medio de cultivo bsico, originando un pH cido. El medio de cultivo lleva incorporado un indicador de color (rojo fenol), de color rojo a pH alcalino y amarillo a pH cido. TECNICA: Se siembra con un inculo espeso. En el caso de querer apreciar la degradacin en condiciones de anaerobiosis o cuando se desea estimar si se trata de metabolismo oxidativo o fermentativo, se cubre el medio con 1-2 ml de parafina lquida estril. Se incuba a 37C - 24 h. RESULTADO +: color amarillo del medio, que indica acidez. RESULTADO -: color rosa-rojizo del medio, que indica alcalinidad.

PRUEBA CAMP FUNDAMENTO: La actividad hemoltica de la lisina estafiloccica sobre los eritrocitos se ve intensificada por un factor extracelular producido por estreptococos del grupo B, llamado factor CAMP. Por lo tanto, cuando ambos productos se encuentran juntos en una placa de agar sangre ovina, se advierte una intensificacin de la reaccin hemoltica.

TECNICA: La prueba CAMP se realiza trazando una estra de estreptococos (por identificar) en forma perpendicular a otra estra de una cepa de Staphylococcus aureus conocida co-

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mo productora de lisina. Ambas lneas no deben tocarse (figura 22A). Las placas se deben incubar en aerobiosis. INTERPRETACION: Como se ilustra en la figura 22B, la zona de intensificacin de lisis asume la forma de una punta de flecha en la interseccin de ambas estras.

PRUEBA DE LA CATALASA FUNDAMENTO: El perxido de hidrgeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es txico para las bacterias, por lo que deben tener el enzima catalasa, que lo descompone a agua y oxgeno. TECNICA: Seguiremos el mtodo del portaobjetos: Con un asa de platino se recoge una colonia del cultivo puro y se coloca sobre un portaobjetos. Se agrega una gota de Perxido de hidrgeno al 30% con una pipeta Pasteur. RESULTADO +: Inmediata formacin de burbujas por la liberacin de gas. RESULTADO -: No hay formacin de burbujas.

CITRATO FUNDAMENTO: Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo. El medio utilizado incluye citrato como nica fuente de carbono y fosfato amnico como fuente de nitrgeno. Las bacterias que metabolicen el citrato, tambin utilizarn el fosfato amnico, con la consiguiente alcalinizacin del medio. TECNICA: Se emplea el medio slido Citrato de Simmons, con azul de bromotimol como indicador de pH: presenta color amarillo en condiciones cidas (pH=6), azul en medio alcalino (pH=7.6), y verde en el medio no inoculado (pH=6'9). El medio se prepara en pico de flauta largo, con poca profundidad. Se inocula nicamente en zig-zag sobre el medio en pico de flauta. Se incuba a 37C 24 a 48 horas, si bien a veces incluso son necesarios 4 das. RESULTADO +: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta. RESULTADO -: No se observa crecimiento ni cambio de color, apareciendo verde.

COAGULASA EN PORTA ("CLUMPING FACTOR") FUNDAMENTO: Vamos a investigar la capacidad de produccin del enzima coagulasa. No se conoce exactamente su mecanismo de accin, aunque va a actuar de alguna forma sobre el mecanismo de coagulacin del suero provocando la transformacin de fibringeno en fibrina, con la consiguiente formacin del cogulo. TECNICA: Se emplea normalmente plasma de conejo. Se coloca una gota estril de plasma de conejo con anticoagulante (EDTA), y se emulsiona en ella suavemente una suspensin espesa de microorganismos. Se pueden colocar en el mismo porta microorganismos de control positivo y negativo.

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RESULTADO +: Se observa la inmediata formacin de un precipitado macroscpico en forma de aglutinados blancos (grumos). RESULTADO-: Se considera negativo si no se produce la aglutinacin en 3-4 minutos.

DNAsa FUNDAMENTO: Empleamos un medio de cultivo cuya caracterstica principal es la de poseer cido desoxirribonucleico, con objeto de investigar si es hidrolizado por el microorganismo problema, en caso de que posea la enzima desoxirribonucleasa. TECNICA: Se siembra en el medio Agar DNAsa con una estra central. Se incuba a 37C - 24 h. Trs el periodo de incubacin, se inunda la placa con cido clorhdrico 1N. RESULTADO+: Al aadir el ClH, hace que el ADN existente precipite, produciendo con ello un enturbiamiento del medio. Es evidente que donde ya no quedaba ADN por la accin de la DNAsa microbiana, el medio aparecer transparente. Esto suceder en la zona contigua al crecimiento, indicando con ello que el microorganismo ha hidrolizado el cido nucleico. RESULTADO -: El ADN no ha sido despolimerizado, con lo que precipita por el ClH en toda la placa, y no va a haber zona transparente.

HIDROLISIS DE LA ESCULINA FUNDAMENTO: la esculina, un glicsido, es hidrolizada por algunas bacterias, dando como productos de degradacin glucosa y esculetina. La esculetina al reaccionar con el hierro forma un complejo de color castao oscuro o negro. TECNICA: se emplea un medio que lleva esculina, y al que se han incorporado sales de hierro como indicadores de la presencia de esculitina. El microorganismo se siembra por agotamiento. RESULTADO +: presencia de color negro/castao oscuro alrededor de las colonias. RESULTADO -: ausencia de color negro.

DECARBOXILACIN DE AMINOCIDOS (ARGININA, LISINA Y ORNITINA DECARBOXILASAS) FUNDAMENTO: Algunas bacterias (p.e. ciertas enterobacterias) poseen unas enzimas decarboxilasas especficas que son capaces de atacar el grupo carboxilo de determinados aminocidos, produciendo anhdrido carbnico y una amina, o diamina, con la consiguiente alcalinizacin del medio. As: - La lisina decarboxilasa (LDC) produce, a partir de la L-lisina, cadaverina. - La ornitina decarboxilasa (ODC) produce putrescina. - El aminocido L-arginina posee un sistema especial de transformacin: primero por accin de una descarboxilasa se transforma en un producto intermedio, la agmatina, la cual, por una Arginina dehidrolasa (ADH) pasa a putrescina y urea. Si el microorganismo es productor de ureasa transformar a su vez la urea en amoniaco y anhdrido carbnico.

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TECNICA: Se emplea un medio de cultivo con glucosa (medio Moeller), que incorpora el aminocido en cuestin (arginina, lisina u ornitina). Utilizamos como indicador el prpura de bromocresol, amarillo en medio cido y prpura en medio alcalino. Cuando el medio se inocula con una bacteria capaz de fermentar glucosa, se produce cido que baja el pH del medio y cambia el color del medio del prpura al amarillo. La condicin cida estimula la actividad decarboxilasa y si el organismo produce la enzima apropiada (descarboxilasa), el aminocido es degradado a su correspondiente amina. La formacin de estas aminas (cadaverina o putrescina), eleva el pH del medio y hacen que el indicador de pH vuelva a la alcalinidad, cambiando el color del indicador del medio de amarillo a prpura o violeta. Si el organismo no produce la enzima apropiada, el medio permanece cido (amarillo). Se inocula el medio de cultivo, y se cubre con 1-2 ml de parafina estril (para favorecer las condiciones de fermentacin). Se incuba a 37C-24h. RESULTADO +: color prpura turbio a prpura apagado. RESULTADO -: color amarillo claro y brillante.

Arginina

DC

Agmatina

DH

Putrescina + Urea

Arginina Decarboxilasa
PRUEBA DE LA HIDRLISIS DE LA ARGININA La L-arginina, adems de poder ser catabolizada por una decarboxilasa, puede ser directamente transformada por una hidrolasa con el mismo final anterior, la produccin de alcalinidad por formacin de aminas, aunque los compuestos intermedios sean distintos. Esta transformacin la pueden llevar a cabo ciertos microorganismos, como por ejemplo, estreptococos y bacterias relacionadas. As, la L-arginina, por accin de arginina dehidrolasa, produce Lcitrulina y amoniaco. Esta prueba no debe ser confundida con la ADH descrita en la prueba anterior. FUNDAMENTO: Se trata de detectar la hidrlisis de la arginina mediante la enzima que transforma este aminocido en citrulina, con liberacin de amoniaco. TECNICA: Se inocula un tubo de caldo-arginina y se incuba junto a un tubo testigo estril durante 24 h (en ocasiones 2-7 das). Transcurrido este tiempo se deposita una gota del cultivo sobre un portaobjetos y se aade una gota del reactivo de Nessler, que reacciona con el amoniaco. El desarrollo de un color entre anaranjado y marrn, indica la presencia de amoniaco. El tubo estril que sirve de control debe ensayarse al mismo tiempo y debe ponerse de color amarillo plido o no mostrar ninguna reaccin coloreada. RESULTADO +: Color anaranjado-marrn. RESULTADO -: Color amarillo plido o ausencia de color.

Arginina

DH

L-citrulina + Amoniaco

Arginina Dehidrolasa

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GALACTOSIDASA (ONPG) FUNDAMENTO: Existen microorganismos con capacidad para degradar la lactosa en 3-4 das, y no en 24 horas. Estos son los denominados "fermentadores tardos de la lactosa". En este grupo de microorganismos podemos predecir la facultad de fermentar la lactosa demostrando la presencia o ausencia de actividad Galactosidasa mediante el empleo del compuesto orgnico Orto- nitrofenil--D-Galactopiransido (ONPG), con un enlace similar al de glucosa - galactosa existente en la lactosa. Si se encuentran clulas positivas para la metabolizacin activa de la lactosa, el reactivo ONPG incoloro es hidrolizado liberando un compuesto amarillo, el Orto-Nitrofenol. TECNICA: Se siembra en un tubo con aproximadamente 2 ml de solucin Ringer. Se aade el disco reactivo de ONPG. Se incuba a 37C - 24 h. RESULTADO +: se produce el cambio de color a amarillo. RESULTADO -: continua incoloro.

HIDROLISIS DEL HIPURATO FUNDAMENTO: La hipuricasa es una enzima que produce la hidrlisis del hipurato de sodio, con la formacin de benzoato de sodio y glicina. TECNICA: Se inocula un caldo hipurato con el organismo por investigar, y se incuba durante 20-24 horas. Posteriormente se traspasan 0,8 ml de la parte superior del cultivo a un tubo vaco y se aaden a ste 0,2 ml del reactivo cloruro frrico y se mezcla bien. El cloruro frrico precipita protenas, hipurato y benzoato; sin embargo, las protenas y el hipurato se disuelven ms fcilmente en exceso de reactivo. Por lo tanto, la persistencia de un precipitado en el caldo hipurato tras aadir un exceso de cloruro frrico indica la presencia de benzoato y, por tanto, una prueba positiva de hidrlisis de hipurato. RESULTADO +: Presencia de un precipitado en el fondo del tubo. RESULTADO -: Ausencia de precipitado.

INDOL FUNDAMENTO: Por la degradacin del triptfano se libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. Ese indol puede ser detectado por el empleo de determinados reactivos que dan una reaccin de color. TECNICA: Se emplea un medio con triptfano. Incubacin a 37C - 24 h. Con objeto de visualizar el indol formado debemos aadir 5 gotas del reactivo de Kovacs, directamente al tubo ya incubado, y se agita suavemente. Cuando existe indol, ste se combina con el aldehido que se encuentra en el reactivo de Kovacs, para dar un color rojo en la capa de alcohol del reactivo de Kovacs. RESULTADO +: Anillo de color rojo en la superficie del medio. RESULTADO -: Anillo del color del Reactivo de Kovacs (ocre oscuro).

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AGAR KLIGLER FUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar los hidratos de carbono glucosa y lactosa incorporados a un medio de crecimiento, con produccin o no de gases, junto con la posible produccin de cido sulfhdrico. Se utiliza un medio de agar inclinado que contiene dos hidratos de carbono: Lactosa en una concentracin al 1% y Glucosa al 0'1%. Algunos microorganismos utilizarn ambos azcares, otros solo la glucosa y otros ni glucosa ni lactosa. La utilizacin puede ser con produccin o no de gases, y se producir aerbicamente (en el pico de flauta) y anaerbicamente (en el fondo del tubo). Por tanto, los resultados que pueden obtenerse sern los siguientes: 1 Utilizacin slo de la glucosa: Aparecer el pico de flauta alcalino y la capa profunda cida. El pico de flauta es alcalino (color rojo), lo que indica que se ha producido la degradacin aerbica de la glucosa. Despus de 18-24 h de incubacin, la baja concentracin de glucosa (0'1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas del medio con objeto de obtener los nutrientes precisos para su crecimiento. Sin embargo, en la capa profunda se observa un color amarillo debido a la degradacin anaerbica de la glucosa, ms lenta que la aerbica, dando lugar a productos cidos ms estables que hacen que el pH permanezca cido a las 24 h. Por tanto, si la lectura se efectuara a las 12 h, aparece color amarillo en todo el tubo. Si la lectura se efectuara a las 48 h, aparecera color rojo en todo el tubo. 2 Utilizacin de glucosa y lactosa: Como hemos mencionado anteriormente, la lactosa se encuentra en el medio en una concentracin del 1%, es decir, 10 veces ms que la glucosa. Esto hace que en 24 h se habr consumido aerbicamente la glucosa, pero no toda la lactosa, momento en que se iniciara el consumo de peptona, existiendo por tanto todava una condicin cida. Si este tubo se leyera a partir de las 48 h, el pico de flauta se habra vuelto alcalino por depleccin de la lactosa y consiguiente utilizacin de las peptonas. 3 No utilizacin ni de glucosa ni de lactosa. Como estas bacterias son incapaces de tomar sus nutrientes de los hidratos de carbono, acuden a la peptona que contiene el medio. Si la utilizan tanto anaerbica como aerbicamente, todo el tubo aparece de color rojo. Si solo la utilizan aerbicamente , el pico de flauta aparece alcalino y el resto sin cambios. En resumen, con respecto a los azcares, el agar Kligler puede interpretarse de 4 maneras, teniendo en cuenta que el primer trmino corresponde al pico de flauta y el segundo al fondo del tubo: 1. Alcalina/Acida (Rojo/Amarillo): Solamente es utilizada la glucosa. 2. Acida/Acida (Amarillo/Amarillo): Son utilizadas la glucosa y la lactosa. 3. Alcalina/Alcalina (Rojo/Rojo): No es utilizada la glucosa ni la lactosa. Se utilizan las peptonas. 4. Alcalina/Sin cambio (Rojo/Granate): No son utilizadas glucosa ni lactosa. Se utilizan las peptonas aerbicamente. Adems de estas reacciones, podemos investigar la aparicin de gas como producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono. Dicho gas aparecer en forma de burbujas en el fondo del tubo, que pueden llegar incluso a desplazar al medio de cultivo. Tambin podemos investigar la produccin de sulfhdrico en el medio. Para ello el medio contiene 2 indicadores: citrato frrico amnico y tiosulfato de sodio. En principio la bacteria reacciona con el tiosulfato para dar lugar a sulfhdrico, que es incoloro. ste despus reacciona con iones frricos, dando lugar a sulfuro ferroso, que da un precipitado negro insoluble.

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TECNICA: La inoculacin se hace a partir de una colonia de cultivo puro, inoculando en zig-zag en el pico de flauta y por picadura en la capa profunda (figura 23). Se incuba a 37C de 18-24 h, ni antes ni despus. RESULTADOS: El orden en que deben ser leidas las pruebas es: 1 Glucosa; 2 Lactosa; 3 Gas; 4 Sulfhdrico. Ejo: G+L-G+SH-. Glucosa +: color amarillo en el fondo del tubo. Glucosa -: color rojo en el fondo del tubo. Lactosa +: color amarillo en el pico de flauta. Lactosa -: color rojo en el pico de flauta. Gas +: aparicin de burbujas en el medio, incluso con desplazamiento del mismo del fondo del tubo. Gas -: no se aprecian burbujas. SH2 +: color negro en la capa profunda. SH2 -: no se aprecia color negro. LECITINASA FUNDAMENTO: Determinar la presencia del enzima lecitinasa. Para ello empleamos un medio rico en lecitina, como pueda ser un medio nutritivo enriquecido con yema de huevo. TECNICA: Se siembra en placa haciendo una doble estra central, como en el caso de la DNAsa. Incubacin a 37C - 24 a 48 h. RESULTADO +: Se formar un halo ms claro alrededor de la zona de crecimiento microbiano debido a la degradacin de la lecitina por el microorganismo. RESULTADO-: No existe halo opaco alrededor de la zona de crecimiento microbiano. MOTILIDAD FUNDAMENTO: Queremos investigar si un microorganismo es mvil o no. Para ello se emplea un medio semislido (con Agar al 0'2%), en el que la bacteria mvil difunda lo ms rpidamente posible. TECNICA: La inoculacin se debe hacer por picadura en el centro del medio de cultivo con el asa de picadura hasta una profundidad de 1,2 a 1,5 cm. Incubacin a 22C a 37C - 24 h. RESULTADO +: Aparece una turbidez que se difunde por todo el tubo. RESULTADO -: Se produce una lnea de crecimiento limitada a seguir la lnea de siembra, mientras que el medio que la rodea se mantiene claro. NITRATOS FUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de reducir el Nitrato a Nitritos o N2 libre. Este proceso de reduccin tiene lugar generalmente en condiciones anaerbicas, en las cuales el microorganismo obtiene el Oxgeno del Nitrato. TECNICA: Empleamos el medio caldo con nitrato, distribuido a razn de 2 ml por tubo. Se inocula y se incuba a 37C - 24 h. Antes de hacer la interpretacin debemos aadir los reactivos al medio: 1 ml de -naftol y 1 ml de acido sulfanlico.

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RESULTADO +: color rosado a rojo intenso, lo que indica la presencia de nitritos en el medio por reduccin de los nitratos. Es decir, estos colorantes detectan la presencia de nitritos en el medio. En caso de que no se desarrolle color, no damos la reaccin negativa, pues nicamente indica que no hay nitritos en el medio, pero pudo haberlos, y haber pasado a nitrgeno libre por la accin del microorganismo. Para ello se utiliza el mtodo de reduccin por el zinc, aadiendo directamente al tubo una pizca (20 mg) de polvo de zinc, que producira el paso de nitratos a nitritos en caso de que el microorganismo no lo hubiera hecho anteriormente. RESULTADO +: Si no se desarrolla color es porque haba ausencia de nitritos en el medio. Es decir, el microorganismo redujo el nitrato a nitrito, y luego redujo nuevamente el nitrito, que por ello ha desaparecido. RESULTADO -: color rosado a rojo intenso: el nitrato presente no ha sido reducido por el organismo, sino que ha sido el zinc el que lo ha reducido.

PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION DE LA GLUCOSA FUNDAMENTO: La fermentacin es un proceso en que el aceptor final de electrones es un compuesto orgnico, que proviene de la propia degradacin del substrato inicial. La respiracin es un proceso en que el oxgeno es el aceptor final de electrones. El hecho de que la fermentacin sea un proceso anaerbico no implica en absoluto que no pueda desarrollarse en presencia de oxgeno: las bacterias disponen de l, pero no lo utilizan para degradar la glucosa. TECNICA: Se inoculan 2 tubos de caldo glucosado con indicador de pH (rojo fenol), que en condiciones bsicas es rojo mientras que a pH cido es amarillo. Uno de ellos se cubre con 1- 2 ml de parafina fundida estril con objeto de conseguir condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 37C durante 24 a 48 h. RESULTADO +: viraje del indicador dando color amarillo del medio que indica acidificacin por degradacin de la glucosa: a) Si es en los 2 tubos: Fermentacin. OXIDASA FUNDAMENTO: La prueba de la oxidasa est basada en la presencia en la bacteria del enzima citocromo oxidasa. TECNICA: Empleamos un bastoncillo estril, uno de cuyos extremos est impregnado con un reactivo (N,N,N',N'-tetrametil -p-phenilenediamina dihydrochloride). Este extremo del bastoncillo se pone en contacto con una colonia del microorganismo y se esperan unos minutos. RESULTADO +: Las colonias que producen citocromo oxidasa hacen que el reactivo pase a un color prpura oscuro. RESULTADO -: No se produce cambio de color del reactivo.

ROJO DE METILO FUNDAMENTO: Se trata de una prueba para detectar la produccin de cidos fuertes (lctico, frmico y actico) a partir de la fermentacin "cido-mixta" de la glucosa. Se consideran rojo de metilo positivos slo aquellos microorganismos que puedan mantener un pH cido

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bajo, tras una incubacin prolongada (24-48 h) contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. Se basa simplemente en el empleo de un indicador de pH (Rojo de Metilo) para determinar la concentracin de iones Hidrgeno (pH) presentes cuando un organismo degrada la glucosa. TECNICA: Tras la inoculacin en caldo glucosafosfato, se incuba a 37C - 24 h. Despus de la incubacin, para llevar a cabo la interpretacin, se aade el reactivo Rojo de metilo: unas 5 gotas. El resultado se interpreta inmediatamente: con un pH inferior a 4'4 el reactivo permanece rojo, y con un pH superior a 6 vira a color amarillo. Con un pH entre 5 y 5'8 se producen diferentes tonalidades de anaranjado. RESULTADO +: color rojo del medio. RESULTADO -: color amarillo o cobrizo en la superficie del medio. UREA FUNDAMENTO: La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. Por su accin desdobla la urea, liberando 2 molculas de amoniaco. Empleamos un indicador de pH, el rojo fenol, con color amarillo en medio cido y rosado en medio alcalino. TECNICA: Se emplea un medio agar base con un 20% de urea. Hay que tener la precaucin de no calentar, pues la urea se descompone con el calor. Por ello, este medio se debe esterilizar por filtracin. Se incuba a 37C - 24h. RESULTADO +: color rojo rosado del medio, que indica alcalinizacin por el amoniaco tras el desdoblamiento de la urea. RESULTADO -: color amarillo anaranjado del medio.

VOGES PROSKAUER (Prueba de la Acetona) FUNDAMENTO: Esta prueba bioqumica permite determinar la presencia de acetil-metil-carbinol en los cultivos. Este compuesto es un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa, concretamente de una fermentacin particular, denominada butilenogliclica, la cual predomina en ciertas bacterias. TECNICA: Inoculacin con un inculo poco denso en caldo glucosa fosfato. Se incuba a 37C durante 24-48 horas. Una vez finalizado el periodo de incubacin y para proceder a la lectura de la prueba bioqumica, se aaden los reactivos: 1 En primer lugar, 0'6 ml de una solucin de -naftol al 5% en alcohol etlico absoluto, que actuar como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reaccin sin prdida de su especificidad. 2 Despus se aaden 0'2 ml de una solucin alcalina (KOH al 40% o NaOH al 40%). Este lcali, en presencia de acetil-metil- carbinol se oxida a diacetilo, dando un color rosado-salmn. A continuacin debe agitarse suavemente el tubo, dejndolo reposar durante 10-15 minutos antes de interpretar la reaccin. RESULTADO +: color rojo-rosado en la superficie del medio (presencia de acetoina). RESULTADO -: no existe cambio de color.

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SUPUESTO PRACTICO
* Durante la segunda semana de prcticas cada equipo de trabajo (2 personas) tendr que aplicar los conocimientos adquiridos en la primera semana para identificar los distintos microorganismos de una muestra clnica. * Los microorganismos presentes en la muestras no tienen que ser necesariamente los mismos de la primera semana de prcticas, pero a cuya identificacin se podr llegar a travs de las tablas del guin de prcticas. * A lo largo de la segunda semana se podr solicitar al profesor de prcticas todos los medios de cultivo, reactivos y pruebas bioqumicas que se consideren necesarias para la identificacin de los microorganismos. * Se elaborar un cuaderno de trabajo en el que se justificar y razonar cada uno de los pasos seguidos, as como la interpretacin que se da a cada uno de ellos y el resultado obtenido. * La calificacin final ser individual para cada alumno.