DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro DEL ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L.

Tomillo FRENTE A Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 CAUSANTE DE GINGIVITIS Bach. Eduardo Rene Lagos La Rosa Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna Facultad de Ciencias de la Salud Escuela acadmica profesional de Farmacia y Bioqumica edulagoslr86@hotmail.com

RESUMEN Objetivo: Determinacin de la actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de Thymus vulgaris L. Tomillo frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277causante de gingivitis. Metodologa: Mediante el mtodo de difusin en disco (Kirby Bauer), se conoci el grado de sensibilidad en funcin al tamao del halo de inhibicin; por el mtodo de dilucin en medio lquido se encontr la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y por difusin en agar se encontr la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial. Resultados: Se determin que Porphyromonas gingivalis mostr ser muy sensible al aceite esencial. La CMI para Porphyromonas gingivalis es 0,31 mg/ml y CMB es 0,37 mg/ml. Conclusin: El aceite esencial de Thymus vulgaris L. Tomillo presenta actividad antibacteriana sobre Porphyromonas gingivalis causante de gingivitis. Palabras clave: Thymus vulgaris, aceite esencial, Porphyromonas gingivalis, halo de inhibicin, CMI, CMB.

ABSTRACT Objective: Determination of the in vitro antibacterial activity of the essential oil of Thymus vulgaris L. "Thyme" against Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 causante of gingivitis. Methodology: Using the disk diffusion method (Kirby Bauer), it was learned the sensitivity according to the size of the zone of inhibition, by the dilution method in liquid medium was found the minimum inhibitory concentration (MIC) and broadcast agar met the minimum bactericidal concentration (MBC) of the essential oil. Results: It was found that Porphyromonas gingivalis was shown to be very sensitive to the essential oil. The MIC Porphyromonas gingivalis is 0.31 mg / ml and MBC is 0.37 mg / ml. Conclusion: The essential oil of Thymus vulgaris L. "Thyme" exhibits

antibacterial

activity

of

Porphyromonas

gingivalis

causing

gingivitis.

Keywords: Thymus vulgaris, essential oil, Porphyromonas gingivalis, inhibition zone, MIC, MBC

1. INTRODUCCION Las plantas medicinales, como parte del legado de la Medicina Tradicional Peruana, herencia de tiempos precolombinos, sigue siendo la primera instancia de consulta y tratamiento en nuestro pas. Presenta una flora variada calculada aproximadamente en 80, 000 especies, ya que contamos con 28 climas de los 32 existentes en el planeta, y 84 de las 103 zonas de vida reconocidas en la tierra.(1) El uso de las plantas medicinales y la medicina tradicional ha sido reconocido por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) que reconoce su importancia en los sistemas de salud en muchos pases en vas de desarrollo, instando a los estados y miembros a hacer estudios de las plantas medicinales utilizadas por los curanderos tradicionales y la poblacin para determinar aquellos que tengan un efecto satisfactorio, de manera de incluirlas en la (8) Farmacopea Nacional. Una de estas plantas empleada con fines medicinales cuya siembra y cosecha estn en proceso de estudio por parte de la Direccin Regional Sectorial de Agricultura Tacna en la provincia de Tarata es el Tomillo, tradicionalmente utilizado en la medicina popular como astringente, expectorante,digestivo, antihelmntico,

antiespasmdico, antitusgeno, antisptico y antifngico. Propiedades farmacolgicas de los diferentes extractos y aceites esenciales de tomillo fueron estudiados en detalle y trajo importantes contribuciones a la industria (principalmente como aditivo para los alimentos) y los usos medicinales de la planta. (6) De hecho, en el siglo XIX y primera mitad del XX, cuando todava no se conocan los antibiticos, el tomillo era considerado como un eficaz desinfectante. Tiene actividad antibacteriana frente a grmenes gram positivos y gram negativos. Por su actividad antisptica, el tomillo tambin tiene inters como antisptico de la cavidad bucofarngea, as como para el lavado de heridas. (7) Las enfermedades gingivales son una amplia familia de patologas diferentes y complejas, que se encuentran confinadas a la enca y son el resultado de diferentes etiologas. El inters por las alteraciones gingivales se basa no tanto en su gravedad, sino en su enorme prevalencia entre la poblacin. Las enfermedades gingivales forman un grupo heterogneo, en el que se pueden ver problemas de ndole exclusivamente inflamatoria, pero tambin alteraciones de origen gentico, traumtico o asociadas a alteraciones sistmicas. La gingivitis es la primera

forma de enfermedad periodontal y se define como una condicin inflamatoria de los tejidos gingivales que estn alrededor del diente.(4) La finalidad en la presente investigacin es conocer y demostrar cientficamente el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Thymus vulgaris L. frente a la bacteria patgena Porphyromonas gingivalis, contribuyendo a que se tenga referencia para proyectos en el campo farmacutico para el uso adecuado de plantas medicinales. 2. MATERIAL Y METODOS El trabajo se realiz en los ambientes del Laboratorio de Microbiologa General de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann entre los meses de agosto a noviembre del 2012. 2.1. Recoleccin La recoleccin de la planta fue en la provincia de Tarata, sector de Iscacahua, en la chacra perteneciente al Ing. Hiplito Limache Yufra del departamento de Tacna (Per) en los meses de agosto y setiembre del 2012. La recoleccin se realiz de la planta entera (tallos, hojas y flores), obtenindose 3500 gr. de muestra de planta fresca verificando que no presenten sntomas de envejecimiento, ni se encuentren deterioradas por plagas. 2.2. Extraccin del Aceite Esencial de Thymus vulgaris L. Tomillo Tcnica: Arrastre de vapor(5)

Luego de 5 das, de secado la muestra fue cortada y pesada en bolsas, la muestra fue transportada en bolsas de papel de primer uso, se peso 3000 gramos de muestra. Para la extraccin del aceite esencial de Thymus vulgaris L., se colocaron 500 gramos de muestra en un baln, de capacidad volumtrica de un 1 litro (baln de extraccin) mientras se agregaba agua (volumen aproximado de 850 ml) en otro baln de extraccin, de la misma capacidad del anterior, el cual fue someti a calor directo (cocina elctrica), mientras que en el segundo baln se recibirn los vapores de agua, para luego liberar el vapor mixto (agua aceite esencial) hacia el condensador. El aceite esencial destilado se recibi en un depsito estril y cerrado, aqu se pudo observar un estado difsico entre agua y aceite esencial, debido a las diferencias de densidad. Esto permiti separar el aceite esencial mediante el uso de pipetas Pasteur a un tubo de vidrio con tapa rosca cerrado hermticamente envolvindolo en papel aluminio y almacenado a temperatura ambiente y en oscuridad hasta su utilizacin. 2.3. Microorganismos Se trabaj con Porphyromonas gingivalis ATCC 33277. 2.4. Evaluacin de la actividad antibacterial Para evaluar la actividad biolgica del aceite esencial de Thymus vulgaris L. se llev a cabo 3 procesos: la activacin de la cepa bacteriana, la preparacin del inoculo y las pruebas de efecto antibacteriano (Difusin en

agar, Concentracin Mnima Inhibitoria y la Concentracin Mnima Bactericida). Preparacin del inoculo Se tom con un asa de kolle, varias colonias de apariencia similar desarrolladas en el medio de cultivo, que se transfirieron a un tubo que contena 10 ml de caldo Mueller Hinton se homogenizaron con uso de un vortex, dicho tubo se incubo a 37C y en anaerobiosis. La incubacin se mantuvo hasta que la turbidez coincidi con el estndar N 0.5 de la escala de Mc Farland. Esto se logr, generalmente en 2 a 6 horas. Se emple el mtodo de difusin en disco, basado en el mtodo de KirbyBauer. Se impregnaron los discos previamente esterilizados de 6 mm de dimetro con una cantidad determinada de aceite esencial puro. Se realizaron 8 repeticiones por cada tratamiento.
TABLA 1.- Concentraciones del aceite esencial de Thymus vulgaris L. en los discos.
N de tratamiento Volumen (ul) 0,5 ul 1,0 ul 1,5 ul 2,0 ul 2,5 ul 3,0 ul 3,5 ul 4,0 ul Concentracin (mg/ml) 0,459625 0,91925 1,378875 1,8385 2,298125 2,75775 3,217375 3,677

Las pruebas tambin incluyen un control negativo: - Control negativo: Disco de papel filtro impregnado con agua estril para descartar la actividad antimicrobiana del mismo. Inoculacin Se inocul la placa de agar Mueller Hinton, utilizando la suspensin estandarizada de bacterias a una concentracin de 1,5 x 108 microorganismos/ml (UFC). Se deposit 100 l del inculo bacteriano sobre la superficie del agar de cada placa correspondientemente, se homogenizo con un asa de drigalsky para asegurar una distribucin uniforme del inoculo. Se tap la placa y se dej secar durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente antes de colocar los discos con las respectivas concentraciones. Una vez absorbido el inoculo y con la ayuda de una pinza estril se procedi a colocar 4 discos por cada placa de agar Mueller Hinton. Incubacin Las placas fueron incubadas a 37 C durante 18 - 24 horas en cmara de anaerobiosis para ver los halos de inhibicin. Lectura Se realiz midiendo los halos de inhibicin con el vernier sobre el crecimiento del microorganismo (2) alrededor del disco. 2.5. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8

Fuente: Elaboracin propia

Se prepar una solucin madre de 100 l de aceite esencial en 100 l de DMSO (Dimetilsulfxido), para 9800 l de Caldo Mueller Hinton. La concentracin final en la solucin madre es 9,1925 mg/ml de aceite esencial de Thymus vulgaris L. Se colocaron 13 tubos de 15 X 125 mm a los cuales se les agreg lo siguiente:
N de tubo Volumen de solucin Madre Concentracin en 1000 ul (S.M.) (mg/ml) Vol. Caldo Mueller Hinton Volumen total concentracin Final (mg/ml)

de turbidez (igualando al control negativo), que se designa como la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI). 2.6. Determinacin de la Concentracin Mnima Bactericida Se tomaron a partir del primer tubo que no presento turbidez, tres tubos en total sin turbidez de cada uno de ellos se resembr 100 ul por diseminacin en placas que contenan agar Mueller Hinton. Las placas se dejaron secar por 5 minutos para luego incubarlas a 37C por 24 horas en cmara de anaerobiosis. Transcurrido este tiempo se cont el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC). 2.7. Procesamiento y Anlisis estadstico La presente investigacin estuvo basada en un estudio cuasi experimental, para la determinacin de la sensibilidad de las bacterias patgenas al aceite esencial de Thymus vulgaris L. mediante el mtodo de difusin en disco se emple el diseo Completamente Aleatorio (9). Todos los datos fueron procesados a travs del software estadstico SPSS versin 18.0 para Windows. Se determin el anlisis de varianza (ANDEVA) y la prueba de significacin de Tukey.

30 ul

0,275775

2970 ul

3000 ul

0,091925

40 ul

0,3677

2960 ul

3000 ul

0,122566666

50 ul

0,459625

2950 ul

3000 ul

0,153208333

60 ul

0,55155

2940 ul

3000 ul

0,18385

70 ul

0,643475

2930 ul

3000 ul

0,214491666

80 ul

0,7354

2920 ul

3000 ul

0,245133333

90 ul

0,827325

2910 ul

3000 ul

0,275775

100 ul

0,91925

2900 ul

3000 ul

0,306416666

110 ul

1,011175

2890 ul

3000 ul

0,337058333

10

120 ul

1,1031

2880 ul

3000 ul

0,3677

11

130 ul

1,195025

2870 ul

3000 ul

0,3983341666

12

140 ul

1,28695

2860 ul

3000 ul

0,428983333

13

150 ul

1,378875

2850 ul

3000 ul

0,459625

Los diferentes tratamientos se compar con los siguientes controles: tubo con 2900 ul de medio y 100 ul de DMSO (control negativo) y el otro con 100 ul de solucin de bacterias (control positivo). Se lleva a incubacin en cmara de anaerobiosis por espacio de 24 horas a 37C. Se observa la turbidez de los tubos que indicara desarrollo bacteriano. La concentracin del aceite esencial que presente ausencia de crecimiento, es detectada por falta

3. RESULTADOS

CUADRO 01 Prueba de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Thymus vulgaris L. frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 por el mtodo de difusin del disco (Kirby Bauer ).
Aceite esencial Placa 1 Halo Volumen (ul) Concentracin 1 (mg/ml) (mm) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,459625 0,91925 1,378875 1,8385 2,298125 2,75775 3,217375 3,677 13,5 14,7 20,3 27,3 29,1 30,1 (mm) 12,4 14,9 19,6 27,1 29,3 30,2 (mm) 12,1 17,8 20,7 28,4 29,7 30,4 (mm) 13,8 18,0 19,3 28,4 29,4 30,4 (mm) 13,3 17,6 18,4 26,3 29,7 32,0 (mm) 12,9 17,2 21,3 25,2 29,6 31,3 (mm) 13,0 17,4 20,4 28,9 29,1 29,8 (mm) 12,2 16,9 21,6 24,7 29,4 27,3 12,9 16,81 20,2 27,04 29,41 30,19 2 3 4 5 6 7 8 Halo Halo Halo Halo Placa 2 Halo Halo Halo

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8

En el cuadro 01, se presenta los promedios de halos de inhibicin producidos por las diferentes concentraciones del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, mediante el mtodo de difusin del disco (Kirby Bauer). Los

CUADRO 02 Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277.
N de Tubo Aceite esencial (mg/ml) 1 0,09 Turbidez + 2 0,12 + 3 0,15 + 4 0,18 + 5 0,21 + 6 0,25 + 7 0,28 + 8 0,31 9 0,34 10 0,37 11 0,40 12 0,43 13 0,46 Control (+) --+ (-) ---

(+) Turbidez; (-) No Turbidez

En el Cuadro 02, se observa que la concentracin superior a 0,31 mg/ml del aceite esencial no presentan turbidez (-) inhibe el crecimiento de la bacteria en estudio, se observa que concentraciones inferiores a

Tratamiento

Promedio

Ausencia de crecimiento bacteriano Ausencia de crecimiento bacteriano

resultados obtenidos indican mayor promedio de halo de inhibicin medible a la concentracin de 2,76 mg/ml con 30,19 mm de dimetro entre las distintas concentraciones del aceite esencial, en los tratamientos 7 y 8 hay ausencia de crecimiento bacteriano.

0,28 mg/ml presentan turbidez (+), lo que indica el crecimiento bacteriano. Determinando que para Porphyromonas gingivalis el CMI es de 0,31 mg/ml.

CUADRO 03 Determinacin de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277.
N de tubo T8 T9 T10 Concentracin (mg/ml) 0,31 0,34 0,37 UFC/Placa 3 2 CMB

El germen evaluado fue seleccionado por ser un microorganismo patgeno al ser humano muy comn en las infecciones gingivales y difciles de erradicar. Las pruebas preliminares proporcionaron datos sobre el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo), observndose sensibilidad para Porphyromonas gingivalis. Los resultados que mostraron las pruebas preliminares, increment el inters y la importancia de trabajar con esta especie botnica de Per. Se enfrent el aceite esencial a la bacteria: Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, aplicando seis concentraciones de aceite esencial, cada una con ocho repeticiones y un control, teniendo as 48 unidades experimentales. Los datos fueron procesados mediante el anlisis de varianza (ANDEVA) y la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 0,05% y 0,01%, que permiti establecer mnimas diferencias entre los tratamientos. Se emple el mtodo de difusin en disco por su fcil aplicacin en laboratorio. Donde los resultados obtenidos, pusieron de manifiesto, la actividad presentada por el aceite esencial de Thymus vulgaris L, frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, actividad que en todos los casos fue debida a un dao letal que ocasion el aceite sobre la clula bacteriana. Al efectuar el anlisis de varianza para el promedio en tamao de los halos de inhibicin sobre

En el Cuadro 03, se muestra solo las concentraciones del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) donde no se evidencio turbidez, para determinar la concentracin mnima bactericida (CMB); observando que en la concentracin de 0,37 mg/ml hay inhibicin total del crecimiento de Porphyromonas gingivalis, mientras que a las concentraciones de 0,31 mg/ml y 0,34 mg/ml existe an el crecimiento de UFC. 4. DISCUSIN La actividad biolgica del aceite esencial del tomillo est relacionada con sus principales componentes, denominados timol y carvacrol. El timol tiene efectos antibacterianos, antifngicos y antihelmnticos. En cuanto al carvacrol ha sido estudiado por sus efectos bactericidas. Todos estos efectos del aceite esencial del tomillo fueron demostradas por diversos estudios como Higes e Llorente (1996), Daferera et al. (2000), Bagamboula et al. (2004), Novacosk e Torres (2006), Sokovi et al. (2009) y Centeno et al. (2010).(3)

Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 se observ que existen diferencias estadsticas altamente significativas entre los tratamientos, siendo el coeficiente de variabilidad de 4,907 %. Por lo que al realizar la prueba de Tukey se confirm que el T6 (2,76 mg/ml) tuvo mayor actividad y de mayor significancia para Porphyromonas gingivalis ATCC 33277. En general, los resultados sugieren la realizacin de mayores estudio in vitro considerando las diferencias de especies, para determinar susceptibilidades a cada una de ellas. Es necesario entonces, dar una aplicacin cientfica que justifique el uso emprico en el Per de las plantas medicinales. El conocimiento de su composicin qumica y las propiedades teraputicas que manifiesten, nos permitiran una mayor confiabilidad de sus usos. 5. CONCLUSIONES -El aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) presenta actividad antibacteriana in vitro frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277. -Se obtuvo el aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) en un volumen de 6,5 ml con un porcentaje de rendimiento del aceite esencial de 0,22 % extrados mediante la tcnica por arrastre a vapor. -El grado de sensibilidad bacteriana de Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 por difusin del disco, es sumamente sensible a

concentraciones de 2,76 mg/ml y que las concentraciones mayores a 3,22 mg/ml los halos de inhibicin superaron el dimetro de la placa en la cual se hizo el estudio, concluyendo as que eliminaba en su totalidad a la especie. -La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 fue de 0,31 mg/ml. -La Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) frente a Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 fue de 0,37 mg/ml. -Se encuentra relacin entre el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris frente a la bacteria de prueba con su composicin fitoqumica, ya que se encuentra el Timol en un 36,50% a quien se le atribuye su mayor efecto antibacteriano y carvacrol 1,55%. 6. RECOMENDACIONES -Se debe valorar la actividad antibacteriana del aceite esencial de Thymus vulgaris L. (Tomillo) frente a otras bacterias de importancia patolgica. -Relacionar los resultados obtenidos en el CMI, con las dosis tolerables en futuras pruebas biolgicas, lo que podra permitir formular un producto de uso comercial. -Realizar estudios sobre los principios activos del aceite esencial de plantas de la regin de Tacna.

7. BIBLIOGRAFIA 1. BRACK A, HEINZ P. (2002). PER MARAVILLOSO. Edit. Epenza. Empresa Periodstica Nacional SAC. Lima Per. 2. DURAFFOURD, C y J., LAPRAZ, (1983). Cuaderno de fitoterapia clnica. Editorial Masson. Francia. 3. ESTRADA O., PAOLA S.(2010). Determinacin de la actividad antibacteriana in vitro de los extractos de Romero Rosmarinus officinalis y Tomillo Thymus vulgaris. Escuela Politcnica Superior de Chimborazo. Ecuador 4. KINANE DF.(2001). Causation and patognesis of periodontal disease. Periodontology 2000, Vol 25. 5. LOCK DE UGAZ, O. (1994). Investigacin Fotoqumica. Mtodos en el Estudio de Productos Naturales, 2da edicin de la PUCP. Lima-Per. 6. LORENZI, H. y Col. (2002).Plantas medicinais no Brasil: nativas e exticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum. Brasil. 7. MUOZ, FERNANDO (1996). Plantas medicinales aromticas. Grupo Mundi Prensa. 8. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE SALUD (1998). Situacin de la Medicina Tradicional en America. Bol. Org. Panam. Salud. 9. STELL Y TORRIE (1985). Bioestadstica: Principios y

procedimientos. 2da edicin. Editorial Mac Graw Hill. Mxico