Mtodo Cromognico-Fluorognico para la identificacin y/o recuento de E.

coli y coliformes con el empleo del medio CromoCen CC

BioCen, cdigo 4227

Aplicacin en muestras de alimentos

El mtodo incluye una fase de identificacin y enumeracin con el empleo del medio cromognico y fluorognico CromoCen CC para E. coli y coliformes en muestras de alimentos. Garantiza los resultados en 18-28 h y la confirmacin de E. coli se complementa con la prueba de Indol Rpida y/o de Glutamato Descarboxilasa. Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este mtodo: slidas y lquidas, de materias primas, alimentos crudos o procesados, o cualquier otro tipo de muestra donde se sospeche la presencia de los microorganismos diana. Resumen de la aplicacin El medio basa su funcionamiento en la combinacin de la reaccin cromognica del sustrato 5-bromo-4-cloro3-indolil--D-galactopiransido (X-gal) para la deteccin de actividad -galactosidasa presente tanto en E. coli, como en el resto de los coliformes, conjuntamente con una sal de 4-metil-umbeliferil--D-glucurnido (MUG) para la deteccin de la actividad de -glucuronidasa de E. coli por la aparicin de fluorescencia azul bajo la luz ultravioleta a 366 nm, permitiendo un procedimiento ms sencillo. En la fase confirmativa, se comprueba la presencia de E. coli con la prueba de Indol Rpida y/o de Glutamato descarboxilasa (GAD). La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Grampositivos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de los microorganismos e inters. Procedimiento (Ver el esquema general del mtodo). De estar congeladas las muestras, desconglelas hasta alcanzar la temperatura ambiente. Realice este proceso evitando cambios bruscos de temperatura para evitar mayor estrs celular. Pese 25 g de las muestras slidas en un matraz de Erlenmeyer estril de 500 mL u otro contenedor apropiado. Aada 225 mL de Agua Peptona Buferada y mezcle en la licuadora u otro equipo de igual finalidad. Deje reposar por espacio de aproximadamente 1 h (esta suspensin se considera la dilucin 10-1). Proceda a realizar las diluciones pertinentes teniendo en cuenta el nivel de contaminacin de la muestra. Para el caso de las muestras liquidas, tome 25 mL y dependiendo del nivel de contaminacin inicial que tenga la muestra, realice las diluciones pertinentes, hasta que alcance al menos dos diluciones que sean contables (entre 30 y 300 UFC/ placa). Para aquellos productos en los cuales se espera un bajo nivel de contaminacin, incluya la siembra directa. Algunos tipos de muestras pueden requerir procedimientos especficos para su preparacin previo a la inoculacin en el medio. Por ejemplo, para leche y productos lcteos segn la ISO 8261 IDG 122-2001 (Milk and milk products. General guidance for the preparation of test simples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination). Luego de esperar el tiempo sealado despus de la homogeneizacin, prepare diluciones decimales hasta obtener dos, en las que se puedan obtener recuentos aceptables. Siembre al menos dos diluciones consecutivas en las placas con el medio CromoCen CC. El mtodo de siembra a utilizar ser por inundacin de la superficie, distribuyendo homogneamente la muestra con ayuda de una esptula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule de 0,1 a 0,5 mL de la porcin de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen CC. Si se necesitara analizar volmenes de hasta 1 mL, inocule en alcuotas de la muestra en varias placas, por ejemplo, para 1 mL inocule en cada placa segn varios esquemas (3 placas con 0,2 mL y 1 placa con 0,4 mL; 2 placas con 0,2 mL y 2 placas con 0,3 mL). Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una esptula de Drigalsky estril (embeber en alcohol y flamear), girando esta ltima siempre en posicin totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Para muestras en las que se requiera slo la identificacin de los microorganismos diana, se puede sembrar por agotamiento en la superficie (estriado). Deje la placa en reposo por 510 min para que la muestra penetre en el lecho del agar. Incube la placa en una incubadora bacteriolgica a 35 2 C por 18-24 h. Para la determinacin de coliformes fecales incube a 42 2 C por 18-24 h. En la incubadora, coloque las placas en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Al finalizar la incubacin, observe el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo. Concluida la incubacin, examine las placas para determinar la presencia de colonias tpicas de los microorganismos diana y las atpicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. Se marcan en la tapa de la placa y se cuentan las colonias azul verdosas correspondientes a coliformes totales. Para la identificacin y recuento de E. coli se procede a alumbrar la placa con la lmpara UV y se cuentan las colonias fluorescentes marcadas con anterioridad como pertenecientes a los coliformes. La presencia de E. coli se confirma con la prueba de Indol Rpida y/o de GAD, para lo cual, se toman de 5 a
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10 colonias tpicas (verde azules-fluorescentes) con coloracin azul-verdosa y fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366 nm), se calcula entonces el recuento confirmado como: R confirmado= (colonias picadas y confirmadas como positivas/colonias picadas para confirmar)* recuento presuntivo de colonias. Interpretacin El crecimiento tpico de los coliformes en el medio CromoCen CC se observa como colonias de color azulverdoso en su centro, o en toda la superficie de la colonia, con o sin fluorescencia azul bajo luz ultravioleta a 366 nm (slo E. coli), pudiendo presentar bordes blancos, regulares o irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias. El crecimiento tpico de Escherichia (excepto E. coli O157:H7) en el medio CromoCen CC se observa como colonias azul verdosas que se distinguen del resto de los coliformes por su fluorescencia azul bajo la luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes blancos regulares o irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias. Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas. Presuntivamente se puede detectar Pseudomonas aeruginosa al presentar colonias blancas con fluorescencia azul-verdosa bajo luz ultravioleta (366 nm) y Serratia marcencens por el desarrollo de las colonias rojizas. Cuando se sospeche de la presencia de Aeromonas en la muestra (colonias azul-verdosas) se proceder, adems, a determinar la actividad de citocromo oxidasa. Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio. Ventajas

Identificacin directa. El uso de los medios de cultivo cromognicos y/o fluorognicos en los laboratorios de

microbiologa introduce cambios en los criterios de identificacin de los patgenos (son identificados directamente). Esto debe considerarse en las comparaciones con los estudios previos.

Ms rpido. La identificacin y/o recuento confirmado de E. coli y coliformes se realiza en un perodo mximo de 28 h. La deteccin directa y simultnea de varias actividades enzimticas en un mismo medio eleva la exactitud del anlisis. Esto permite la identificacin directa (o con un mnimo de pruebas adicionales), cuyos resultados no presentan diferencia con la identificacin realizada por los mtodos bioqumicos tradicionales que consumen ms de 48 h.

Ms fcil de utilizar. No necesita esterilizacin durante su preparacin. Disminucin de la carga de trabajo

asociada al procesamiento de las muestras.

Ms preciso. Sus Sensibilidad y Especificidad diagnsticas son superiores a las de los medios convencionales
destinados al mismo propsito para todos los microorganismos de inters.

Ms confiable. El contraste de colores y la fluorescencia para E. coli no permiten confusin.

Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos 1. Medio CromoCen CC Composicin: Bases nutritivas-11,0 g; Cloruro de sodio- 5,0 g; Mezcla cromognica-flourognica- 1,4; Agar13,0 g. 1.1 Preparacin De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporcin de 30,4 g/L de agua destilada o desionizada. Hierva hasta disolucin completa. Ajuste el pH, de ser necesario, el cual despus de fundir deber mostrar un valor de 7,1 0,2. No esterilizar en autoclave. 1.2 Preparacin de las placas del medio CromoCen CC. Transfiera inmediatamente a un bao con temperatura de 44 a 47 C. Dispense el medio en placas y deje solidificar. Inmediatamente ante de su uso, seque las placas en posicin invertida en el horno a temperatura entre 35-55 C, por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio est seca. 2. Prueba Rpida de GAD Composicin del reactivo de la prueba rpida de glutamato descarboxilasa (GAD): Acido L-glutmico- 0,1 g; Cloruro de sodio- 9 g; Verde de bromocresol- 0,005 g; Tritn X-100- 0,3 mL; Agua destilada- 100 mL. 2.1 Preparacin: El reactivo debe tener el pH 3,5; tener color amarillo y estar transparente. Esterilice el reactivo por filtracin y envselo aspticamente en un frasco de vidrio de color mbar para su posterior almacenamiento en refrigeracin. Se ha comprobado una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un perodo de 5 meses de almacenamiento. 2.2 Procedimiento: Pique una colonia de inters y prepare una suspensin concentrada en 0,5 mL de solucin salina estril. A esta suspensin adale 0,2 mL del reactivo de GAD e incube a 35 C durante
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10-13 h, observando cada 30 min. Cualquier cambio de color amarillo a verde o azul considrelo como reaccin positiva. Existen algunas cepas de E. coli que responden de manera ms rpida y por tanto su respuesta se observa en menor tiempo. 3. Prueba Rpida de indol Prueba de Arnold Weaver Medios de cultivo: Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptfano. Composicin: Hidrolizado enzimtico de casena- 10,0 g; cloruro de sodio- 5,0 g. 3.1 Preparacin: Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada, mezclar bien, distribuir y esterilizar a 121 C por 15 min. 3.2 Procedimiento: Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4 mL de caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptfano. Incube a 37 C durante 2 h. Agregue reactivo de Kovac y agite suavemente. Interpretacin: El color rojo en la capa reactiva indica formacin de indol. 4. Prueba de Citocromo oxidasa La prueba debe realizarse con un asa de platino para evitar los resultados falsos positivos. Existen 3 mtodos para su deteccin: en placa directa, indirecto de Kovacs y el mtodo de tiras o discos impregnados con el reactivo tetrametil (o dimetil)pfenilendiamina; este ltimo tiene la ventaja de ser ms rpido, ms econmico, y que el reactivo permanece estable por lo menos hasta 6 meses despus de preparado. Procedimiento: Tomar con un asa de platino, previamente esterilizada a la llama, la colonia de inters y frotarla sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo. Interpretacin: La presencia de una coloracin azul o marrn (en dependencia del reactivo que se use) indica una prueba positiva y por consiguiente la presencia de la enzima citocromo oxidasa en el microorganismo. Almacenamiento del medio CromoCen CC Mantenga el frasco con el medio deshidratado hermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la luz, a temperatura de 15 a 30 C Se podr almacenar las placas listas para el uso por un perodo de 30 das a temperatura de 2 a 8 C. Para mayor informacin dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia tcnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu Anexo A. Diagrama de flujo para la determinacin de E. coli y coliformes en muestras de alimentos Muestra 25 g + 225 mL de agua fosfato buferada o agua peptona 0,1 %. (Homogeneice por un minuto en una licuadora a alta velocidad) Prepare diluciones seriadas segn los niveles de coliformes y/o E. coli previstos Transfiera 0,2 0,5 mL de las suspensiones anteriores a placas de Petri utilizando el mtodo de inundacin de la superficie Incube las placas por 18-24 h a 35 2 C Cuente las colonias verde azules para el recuento de coliformes totales y las verde azules con o sin bordes blancos y con fluorescencia azul para detectar presuntivamente E. coli Determine el nmero de UFC por gramos de muestra estimados Confirme la identidad de las colonias realizando la pruebas GAD o rpida de indol