Mlcroblologla AmblenLal

Curso 8lC131L
Dra. 8eatr|z D|ez
LaboraLorlo de Lcologla Mlcroblana de
SlsLemas LxLremos
bdlez[blo.puc.cl
. unlversldad CaLllca de Chlle
laculLad de Clenclas 8lolglcas
LsLudla la relacln de los mlcroorganlsmos enLre ellos y con su hblLaL
Reciclaje
Evolucin
M|crob|o|og|a amb|enta|
Biodiversidad Ecologa
Biorremediacin
Microb.
alimentos
Biotecnologa
AgrlculLura
SlsLemas naLurales
SlsLemas exLremos: 8loLecnologla
CunLos mlcroorganlsmos hay?
Cue mlcroorganlsmos hay?
Cue hacen? (nlcho)
Cmo se relaclonan enLre ellos y con oLros
organlsmos?
Cul es su efecLo en los clclos blogeoqulmlcos?
D|snntos npos de metabo||smo m|crob|ano:
1. uependlendo de donde obuene el carbono para la consLruccln de la masa
celular:

AuLLrofo. ulxldo de carbono (CC
2
).
PeLerLrofo. CompuesLos orgnlcos (e[. glucosa).
MlxLrofo. 1anLo usando compuesLos orgnlcos como [ando CC
2.

2. uependlendo de donde obuenen los equlvalenLes reducLores para la
conservacln de la energla o en las reacclones bloslnLeucas:
LlLoLrofo. CompuesLos lnorgnlcos.
CrganoLrofo. CompuesLos orgnlcos.
3. uependlendo de como obuene la energla para vlvlr y crecer:
CulmloLrofo. CompuesLos qulmlcos exLernos.
loLoLrofo. ue la luz.
CulmlollLoauLLrofos: energla de la oxldacln de compuesLos lnorgnlcos y el carbono de la [acln
del dlxldo de carbono.
L[emplos: bacLerlas nlLrlcanLes, bacLerlas oxldanLes del azufre, bacLerlas oxldanLes del
hlerro, bacLerlas oxldanLes del hldrgeno.
loLollLoauLLrofos: energla de la luz y el carbono de la [acln del dlxldo de carbono, usando
compuesLos lnorgnlcos como equlvalenLes reducLores.
L[emplos: CyanobacLerla (agua como equlvalenLe reducLor), Chloroblaceae,
Chromaucaceae (sulfuro de hldrgeno), Chloroexus (hldrgeno).
CulmlollLoheLerLrofos: energla de la oxldacln de compuesLos lnorgnlcos, pero no pueden [ar el
dlxldo de carbono.
L[emplos: algunos !"#$%&'(#)$ +,,-. /%0"1)00' (hldrgeno equlvalenLe reducLor).
CulmloorganoheLerLrofos: energla, carbono y equlvalenLes reducLores para las reacclones
bloslnLeucas de compuesLos orgnlcos.
L[emplos: la mayorla de las bacLerlas, como 2+(3)$"(3"' (%0". 4'("005+ +,,-. AcunobacLerla.
loLoorganoLrofos: energla de la luz y el carbono y los equlvalenLes reducLores para las reacclones
bloslnLeucas de compuesLos orgnlcos. Algunas especles son LermlnanLemenLe heLerLrofas, pero
muchas oLras pueden Lamblen [ar el dlxldo de carbono y son mlxLrofas.
L[emplos: 63%7%&'(#)$. 63%7%,+)57%8%1'+. 63%7%+,"$"0058. 63%7%8"($%&"58.
63%7%(9(05+. :)0"%&'(#)$"58. ;30%$%<)=5+ (alLerna con foLollLoauLoLrona con hldrgeno).
2 foLoslsLemas
1 foLoslsLema
1ransporLe e- clcllco
uonador y acepLor Lermlnal
de e- es la mlsma 8Chl
Cran depslLo en la corLeza LerresLre y en los sedlmenLos en la forma de sulfaLos
solubles (rocas sulfurosas, depslLo de elemenLos sulfurosos y combusubles fslles) y
menor en la aLmsfera.
La colaboracln enLre meLangenos y bacLerlas
fermenLanLes permlLe la obLencln del hldrgeno para
los prlmeros y evlLa la lnhlblcln de los segundos por
acumulacln del mlsmo.
8educcln CC2 a CP4 uullzando elecLrones del
hldrgeno qulmlollLoauLoLrcamenLe.
Cmo allar e ldenucar los mlcroorganlsmos de una muesLra
amblenLal?
AlslamlenLo, ldenucacln y cuanucacln de
M.C. en dlferenLes hblLaLs
MeLodos culuvo dependlenLe
MeLodos no culuvo dependlenLe
La acuvldad mlcroblana, lo que los M.C. hacen
en su hblLaL
Mtodos cu|nvo depend|ente
Se requlere un lnculo adecuado
uar condlclones adecuadas y/o selecuvas
LxlsLen numerosos meLodos desarrollados para los
dlferenLes upos de M.C.
AISLAMIENTO por medio selectivo
Ej. Azotobacter
un enrlqueclmlenLo o muesLra
naLural de agua, suelo, eLc, se
agrega a un medlo de culuvo
selecuvo, y se hacen dlluclones
serladas de los mlsmos.
Ll ulumo Lubo que muesLra
creclmlenLo (en el e[emplo es la
dllucln 10-3) se ha desarrollado a
parur de 10 o menos celulas.
NM: la dllucln mayor que mosLr creclmlenLo. Sl el medlo uullzado en esLe caso es selecuvo
para bacLerlas reducLoras de sulfaLo, por e[emplo, se podrla conclulr que 103 celulas recuperables
de esLos organlsmos esLuvleron presenLes por gramo de muesLra.
obtencin de cultivos puros
AISLAMILN1C por d||uc|n ser|ada
ueLermlnacln del numero ms probable de celulas
(8ecuenLo dlrecLo vlA8LLS)
Sln embargo.
Se ha demosLrado que no Lodos los M.C. de un
ecoslsLema son culuvables (aprox.1)
La gran anoma||a de| recuento en p|aca

LsLn muerLos
Son vlables no culuvables (v8nC)*
No crecen en |os med|os de cu|nvo trad|c|ona|es
(jpor qu?)
*lmporLancla en salud publlca
or cada 1000 bacter|as que vemos a|
m|croscop|o de| agua de mar, s|o crece
una co|on|a.
Se recuperan ms de med|os con ms
nutr|entes.
8lomarcadores
8ecuenLo dlrecLo
MICkCSCCIA
Celulas LoLales (uAl, anaran[ado de acrldlna, eLc...)
- ll[acln 1-6 formaldehldo, eLanol, oLros....
- lllLrar un volumen conocldo
- 1enlr con el uorocromo
- ConLar al mlcroscoplo
Cuannhcac|n por DAI
(4',6-dlamldlno-2-phenyllndole)
- 1lncln uorescenLe que se
une fuerLemenLe a las
reglones rlcas en A1 del Aun
- Se uullza en mlcroscopla de
uorescencla
- asa a Lraves de una
membrana celular lnLacLa por
lo LanLo puede ser uullzado
para Lenlr celulas vlvas o
[adas
Se une al 8nA
Cuanuca numero LoLal de M.C.
vlvos.

Naran[a de acr|d|na
L[. naran[a de acrldlna
L[. >50?%0%&5+ '("7%('07'$"5+ (arquea hlperLermla)
(lsouoclanaLo de uorescelna)
ColoranLes uorescenLes se unen
qulmlcamenLe a la sonda, haclendo vlslbles
las celulas cuando hlbrldan con ellas.
Se observan medlanLe mlcroscoplo de
uorescencla.
uullzando sondas unldas a dlsunLos coloranLes es poslble
ldenucar y cuanucar dlsunLos upos de celulas en una
mlsma muesLra.
8ecuenLo dlrecLo
uso de cronmeLros moleculares
cidos nucleicos o protenas usadas como relojes para medir cambios
evolutivos en el tiempo
Asumen:
Secuencias cambian gradualmente con el tiempo
Los cambios son selectivamente neutrales y al azar
La cantidad de cambios aumenta linealmente con el tiempo
Problemas:
- Que la taxa de cambio en una secuencia puede variar con el
tiempo
- Que diferentes molculas (relojes) y diferentes partes en una
misma molcula pueden tener diferente taxa de cambio
kequer|m|entos para ser un buen cronmetro mo|ecu|ar:

- unlversal en Lodos los seres vlvos
- LsLrucLuralmenLe y funclonalmenLe conservada (homlogos en organlsmos dlsunLos)
- Secuenclas fcllmenLe allneables y con Lamano adecuado para enconLrar camblos
- Su secuencla uene que camblar con una Lasa adecuada a la dlsLancla evoluuva a medlr.
- ModeradamenLe blen conservada pero con suclenLe varlacln en secuencla para
dlsungulr enLre Laxones logeneucos
Genes kNAs r|bosm|cos |os mas ex|tosos
r8nA:
8acLerla Archaea LucarloLa
Uso de| re|o[ mo|ecu|ar rkNA 16]18S
Ctros cronmetros:A1ases, 1U-e|onganon factor, gyrases...

@$A5)'+ 9 25('$"%#'+
(%8,'$#)1 '1()+#$%
(%8B1
LecLuras: C8CnCML18CS MCLLCuLA8LS
L. Zuckerkandl y L. aullng, 1963.
Molecules as documenLs of evoluuonary
hlsLory. !. 1heor. 8lol. 8: 337-366.
C. 8. Woese y C. L. lox, 1977.
hylogeneuc sLrucLure of Lhe prokaryoLe
domaln: Lhe prlmare klngdoms.
roc. naLl. Acad. Scl. uSA. 74: 3088-3090.
C. 8. Woese, 1987. 8acLerlal Lvoluuon.
Mlcroblol. 8ev. S1: 221-271.
Tcnicas moleculares
C o m p o s i c i n
d e e s p e c i e s F i n g e r p r i n t i n g
D G G E
A R D R A
T - R F L P
C l o n a c i n y s e c u e n c i a c i n
E x t r a c t o d e c i d o s n u c l e i c o s
B i o m a s a m i c r o b i a n a
Cultivo/muestra natural
R e c o l e c c i n d e b i o m a s a
H i b r i d a c i n
i n s i t u
I d e n t i f i c a c i n
i n d i v i d u a l
d e c l u l a s
E x t r a c c i n d e c i d o s n u c l e i c o s
H i b r i d a c i n D N A - D N A
A m p l i f i c a c i n p o r P C R
P r o d u c t o d e P C R
C o m p a r a c i n
e n t r e
c o m u n i d a d e s
Anlisis filogentico
(relacin evolutiva)
Bibliotecas genticas
Ligacin de productos de
PCR a un vector
Secuenciacin e identificacin de
clones individuales (especies)
Amplificacin de los
genes rRNA 16S
mediante PCR
~1500pb
Transformacin
en E.coli
97 llmlLe" de especle"
jCunto se parece y a qu se parece?

Comparacin de secuencias de DNA alineadas
Relacin filogentica
(distancia evolutiva)
Amplificacin gen rRNA 16S
por PCR
Cola de GC
Cebador F Cebador R
A B C D E
-Urea
+Urea
Gel
poliacrilamida
Identificacin
Bandas (especies)
y anlisis
filogentico
Cortar,
extraer DNA y
secuenciar
Comparacin comunidades
naturales
A
E
B
C
D
Sclence 2006
ueLermlnacln del esLado slolglco de celulas lndlvlduales
- Crado de acuvldad de enzlmas especlflcas (e[. deshldrogenasas, nlLrogenasas,
reducLasas, oxlgenasas, eLc).
- lncorporacln de subsLraLos marcados con lsLopos.
- roducuvldad prlmarla (produccln de maLerla orgnlca)
- Mlnerallzacln (descomposlcln de maLerla orgnlca a CC2)
- uesaparlcln de un subsLraLo o la generacln de producLos lnLermedlarlos o nales.
- Lxpresln de genes funclonales
- r8nA approach" comblnado con oLras Lecnlcas: m8nA-r8nA llSP, MA8-llSP, Sl, eLc.
Caracter|zac|n metab||ca de M.C. para determ|nar
ro| eco|g|co y potenc|a| un||dad
MLDICICNLS DL AC1IVIDAD MICkC8IANA
anubluco del grupo de las qulnolonas acLua
como bacLerlosLuco bloqueando la repllcacln
rop|d|um |od|de
(b) loLoauLoLrfos.
loLoslnLesls medlda en agua de mar
con
14
CC
2
.
(d) CulmloorganoLrofos.
roduccln de
14
CC
2
desde
14
C-glucosa.
Incorporac|n de |stopos
Agente control para asegurarnos que la
reaccin de transformacin es de carcter
biologico.
MA8-llSP
lsLopos radlacuvos se
anaden como susLraLo
Ll marcado de las celulas se
verlca haclendo una
auLoradlograna (exposlcln
de una emulsln
foLosenslble a la
radlacuvldad).
Acuvos
- Selecuvos para oxlgeno,
sulfuro, pP, CC2, ha permludo
esLudlar la acuvldad meLabllca
de comunldades mlcroblanas ln
slLu
(a) Schemauc drawlng of an oxygen
mlcroelecLrode. noLe Lhe scale of Lhe elecLrode.
M|croe|ectrodos
Mlcroblal maLs and Lhe use of mlcroelecLrodes Lo
sLudy Lhem. noLe Lhe mllllmeLer scale on Lhe
ordlnaLe.
oxlda nlLrlLo a nlLraLo
Lxpresln de genes funclonales
LsLudlo de la Lranscrlpcln (deLeccln de m8nAs especlcos)
no proporclona lnformacln sobre fenoupo, pero sl sobre la acuvacln
de deLermlnados genes en el medlo amblenLe
L[. mlcroarrays" y real ume-C8.