Amplificacin por PCR convencional de un fragmento de 160- 170 pb perteneciente al gen que codifica para el factor de coagulacin v tipo

silvestre en humano

AMPLIFICACION POR PCR CONVENCIONAL DE UN FRAGMENTO DE 160 a 170 pb PERTENECIENTE AL GEN QUE CODIFICA PARA EL FACTOR DE COAGULACIN V TIPO SILVESTRE EN HUMANO
Ayala, Christian. Cueva, Mauricio. Cumbajn, Evelyn. Freire, Viviana. Iturralde, Francisco.
realiza a 65 C y requiere del uso de dos o tres pares de primers para garantizar la especificidad y una polimerasa (la Bst polimerasa), la cual tiene la capacidad de separar las cadenas de ADN sin necesidad de calentamiento (Rojas, 2009). La LCR (ligase chain reaction) utiliza 4 oligonucletidos especficos, dos adyacentes que hibridan en la una cadena y otros dos adyacentes que hibridan en la otra, y una ligasa termoestable, la cual se unir a cada pareja siempre que existe total complementariedad en la unin. Este mtodo sirve tanto para la amplificacin de DNA, como para la discriminacin de mutaciones puntuales (Barany, 1991). En esta prctica se realizo la identificacin del factor de coagulacin V humano (FV), el cual es una glicoprotena plasmtica larga. Es un componente importante en la cascada de coagulacin, tiene un papel muy importante en la hemostasia ya que mantiene en equilibrio los efectos anticoagulantes y procoagulantes de la sangre (Zabalegui, 2000). La sustitucin de una guanina por una adenina 1691, dar lugar al aparecimiento del mutante FV Leiden, el cual causa un aumento en los niveles de trombina y puede causar trombosis (Zabalegui, 2000). Un mtodo de deteccin de la variante mutante de este gen es la amplificacin mediante PCR de una regin especfica, que exhibe una banda de 200 pb, a diferencia del alelo silvestre que muestra una de 163 pb aproximadamente (Lay & Wittwer, 1997).

RESUMEN: La tcnica de PCR (reaccin en

cadena de la polimerasa) es un proceso complejo pero con gran poder y versatilidad para la manipulacin y anlisis de ADN que utiliza varios reactivos moleculares, asi como temperaturas variables para hacer simultaneas copias de fragmentos especficos. Se amplific el gen que codifica el factor de coagulacin V Wild type de 163 pb. Se realizaron 2 sets consistentes en dos controles positivos que contenan la muestra de ADN y un control negativo sin muestra. El programa del termociclador usado fue HUMANA que usa 35 ciclos a diferentes temperaturas. Posteriormente se realiz una corrida electrofortica con gel de agarosa al 2%, la cual revel los patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de ADN amplificados de 160 a 170 pb.

1 INTRODUCCIN
En biologa molecular muchas veces lo que se desea es obtener una gran cantidad de copias de un fragmento o una secuencia especfica de ADN con las cuales se va a trabajar para realizar los anlisis segn requiera el caso (Dorado, S/A). Ya que producto de la extraccin se obtiene el ADN completo del tejido utilizado es necesario el uso de tcnicas de amplificacin que nos permitan separar y multiplicar estos fragmentos especficos (Castro, S/A). Por este motivo se han desarrollado varias tcnicas de amplificacin, siendo la PCR la ms utilizada de todas y sustituyendo a la amplificacin in vivo que se usaba tradicionalmente. (Dorado, S/A). La PCR se basa en el uso de primerssintticos los cuales se unen a regiones especficas de la secuencia molde, mediante diferentes gradientes de temperatura,y debido a la accin de la polimerasa, replican y amplifican la secuencia de inters. Otras tcnicas de amplificacin son la Amplificacin Isotrmica LAMP, y la LCR. La amplificacin isotrmica LAMP (loop-mediate disothermal amplification) que se

2 METODOLOGA
DISEO DE LA PCR CONVENCIONAL
Para la amplificacin del gen del factor V humano tipo silvestre se realiz la master mix triplicando los valores especificados en la Tabla 1. El ensayo se realiz por duplicado preparando dos tripletas conformadas de doscontroles positivos y uno negativo. Se prepar la solucin madre sin incluir el ADN, despus se separ 45 uL para el control negativo el que fue

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completado con agua (DDW). A la solucin restante se le adicion el ADN necesario para dos reacciones y se separ en dos tubos. Tabla 1. Protocolo por reaccin de una PCR convencional para la amplificacin de un fragmento del gen del factor V humano tipo silvestre.
Reactivos ADN polimerasa Buffer dNTP`s Primers Concentracin Recomendada 1-5 u/R 5-10X 50-200 uM 1.5-3.5 mM 10-100 pmol/R Concentracin Stock 5 u/R 5X 20 mM 25 mM 100 pmol/uL Concentracin Final 2.5 u/R* 1X 400 uM/mezcla 1.5 mM 20 pmol/R* Volumen Final 0.5 uL 10 uL 1 uL 3 uL Forward 0.2 uL Reverse 0.2 uL 5 uL 30.1 uL 50 uL

3 RESULTADOS
Se presentan a continuacin los resultados de la corrida electrofortica de los productos de PCR en gel de agarosa al 2%, utilizando SYBR safe como fluorforo. En el primer pocillo se observa el marcador molecular 100 pb Trackit de Invitrogen, seguido por los controles positivos designados con pos y posteriormente el control negativo designado con neg en la imagen 1

ADN Agua (DDW) Volumen Final

100-500 ng/R

20ng/uL

100 ng/R*

*R= reaccin

Las condiciones del termociclador se especifican en la Tabla2. Las temperaturas de la PCR fueron programadas para 35 ciclos con duracin de 1 minuto cada uno. Adems se program un ciclo inicial de 95C por 4 minutos para garantizar la denaturacin completa del ADN, as como un ciclo final de extensin a 72C para garantizar la unin de todos los dNTPs. Finalmente se program un ciclo de terminacin a4C para aclimatar la muestra y evitar la formacin de estructuras secundarias por el cambio brusco de temperatura. Tabla 2. Condiciones del termociclador para la PCR convencional Pasos Temperatura Minutos Nmero de Ciclos 1

Denaturacin inicial Denaturacin Hibridacin Extensin Extensin final Terminacin final

95C 95C 58C 72C 72C 4C

4 min 1 min 1 min 1 min 4 min 10 min

Imagen 1: Bandas en gel de agarosa al 2%, se aprecia en el pocillo de la izquierda el marcador 100 pb Trackit de Invitrogen, y a continuacin los dos sets de controles.

35 1 1

4 DISCUSIN
El fragmento de ADN genmico humano, se amplific mediante la tcnica PCR convencional. En la cual la concentracin de reactivos utilizados para establecer el protocolo de la tcnica, y los ciclos de la reaccin en cadena de la polimerasa, se acercan a los enunciados por Vilela y colaboradores (2006), en su documento referente a identificacin del virus del papiloma humano. En los resultados de la electroforesis, Figura 1, se observa que en la columna 1, se encuentran diferentes bandas que van desde 100 pb hasta 2072 pb, comparndola con las columnas 2, 3, 5 y 6, correspondientes a los controles positivos, se identific

ELECTROFORESIS HORIZONTAL
Se prepar un gel de agarosa al 2% para ser corrido en una cmara horizontal. Se utiliz TBE 1X como buffer de electroforesis y como fluorforo SYBR Safe. No se utiliz buffer de carga ya que estaba incluido en el buffer de PCR.La corrida se realiz a 100V y 300 mA por 60 minutos.

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el mismo fragmento de ADN de aproximadamente 160 a 170 pb, este resultado coincide con lo esperado despus de haber preparado las muestras iniciales siguiendo el mismo protocolo, y bajo las mismas condiciones. En las columnas 4 y 7 correspondientes a los controles negativos, la ausencia de banda, indica que no existi contaminacin ya que en el momento de la preparacin de estos, se aadi agua (DDW) en sustitucin al volumen correspondiente a la muestra de ADN inicial. En las cuatro columnas donde se corrieron los controles positivos, se observaron bandas 200 pb, que segn lo indica Surzycki en su libro Basic Techniques in Molecular Biology (2000) podran ser resultado de una incorrecta concentracin de primers, o a la degradacin de alguno de ellos. Por otro lado el mismo autor expone que la presencia de fragmentos en diferentes sitios al esperado pueden deberse a una alineacin inespecfica del primer, a la falta de especificidad que este tiene con el ADN molde, o a una incorrecta temperatura de annealing. No obstante, este fragmento de 200 pares de bases se describe en otros ensayos como indicador del factor de coagulacin Leiden, por lo que otra posibilidad podra ser que el ADN que se utiliz haya sido de un individuo heterocigtico que posea una copia del alelo silvestre y otra de la variante mutante Leiden (Lay & Wittwer, 1997). produccin de primers dimers y la amplificacin fue especfica.

6 REFERENCIAS
Barany, F. (1991).The ligase chain reaction in a PCR world Genome Research. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tomado de: [http://genome.cshlp.org/content/1/1/5.full.pdf] Castro, A. (S/A). Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction PCR). Universidad Politcnica de Valencia. Tomado de: [http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci% C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pd f] Dorado, G. (S/A). Amplificacin de DNA mediante PCR. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. Universidad de Crdoba. Tomado de: [http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/44%20PCR.pdf] Lay, Marla. Wittwer, Carl.(1997). Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR, Clinical Chemistry. Vol. 43 Rojas, A. (2009). Deteccin molecular de patgenos Mtodo rpido va amplificacin isotrmica. 3M. Tomado de: [http://www.fiiaiafp.com/neo_2012/pdf/presentaciones/Sesio n%20Paralela%208%20Los%20peligros%20en%20aliment acion/Deteccion%20Molecular%20de%20patogenos%20por %20amplificacion%20isotermica20Alejandro%20Rojas.pdf] Surzycki, S. (2000). Basic Techniques In Molecular Biology. Berlin: Springer Verlag. Vilela, C., Rodrguez, L., & Castro, A. (2006). Mosaico Cient. Retrieved from Deteccin del virus delpapiloma humano mediante la reaccin en cadena de la polimerasa y su relacin con los resultados delPap convencional.: http://revistas.concytec.gob.pe/pdf/mc/v3n2/a05v3n2.pdf Zabalegui, N. (2000). Prevalencia del Factor V Leiden y la mutacin G20210A del gen de la protrombina en Navarra, y su papel como factores de riesgo trombtico. Departamento de Hematologa. Universidad de Navarra. Tomado de: [http://dspace.unav.es/dspace/bitstream/10171/18791/1/Tes isDoctoral_NataliaZabalegui_12-06-2000.pdf]

Refirindose nuevamente a la Figura 1, se puede apreciar que la intensidad de las bandas esperadas, de aproximadamente 180 pb, superan a las de los fragmentos obtenidos en la zona de tamaos menores a 50 pb, denominados primers dimers o dimeros de primer (no visibles en la Figura 1), lo cual coincide con la relacin expuesta por Surzycki (2000), la concentracin de primers dimers es inversamente proporcional a la del fragmento esperado, por lo que se obtuvo una buena amplificacin y una minima presencia de primers dimers.

5 CONCLUSIONES
Se logr desarrollar un protocolo de reaccin, mediante una Master Mix para dos sets de controles. La PCR es sensible y especfica para la identificacin del factor de coagulacin V tipo silvestre. La corrida electrofortica mostr fragmentos amplificados en los controles positivos de aproximadamente 160 a 170 pb, que indican la presencia del alelo silvestre del factor V. La electroforesis en gel de agarosa junto con los controles positivos y negativos, confirmaron que el ADN no presenta contaminacin, hubo una mnima