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IV.2.2. Estrs oxidativo y Diabetes mellitus El EOx es un proceso caracterizado por un desequilibrio bioqumico entre la

produccin de RL o especies reactivas con respecto a los antioxidantes a favor de los primeros con implicaciones en la homeostasis del organismo por dao a nivel celular, tisular y sistmico. El EOx ha sido asociado con el mecanismo fisiopatolgico de ms de 100 enfermedades crnico-degenerativas, entre las que destacan la ateroesclerosis, el cncer, la artritis reumatoide, la enfermedad de Alzheimer y la DM.27-29 Qumicamente, un RL se define como un tomo o molcula que en su ltimo orbital presenta un electrn no apareado, por lo cual presenta una configuracin espacial que le genera gran inestabilidad, es altamente reactivo, tiene una enorme capacidad para combinarse inespecficamente, ya que precisa de obtener el tomo que le hace falta de las molculas vecinas, y dependiendo de dnde y cuanto se genere puede estabilizarse tomando el electrn que requiere de las biomolculas prximas a l, incluso aquellas integrantes de la estructura celular, s esto sucede se puede afectar la fisiologa de las clulas al oxidar a los lpidos de membrana, a los carbohidratos, a las protenas e incluso al ADN, lo cual es uno de los mecanismos de dao del EOx.30-31 Sin embargo, los RL no son molculas que deban considerarse estrictamente como dainas, ya que se generan de manera natural y continua durante el metabolismo, el proceso de respiracin, en la fagocitosis, en las reacciones donde intervienen enzimas de la familia de las NADPH oxidasas (nicotinamida adenindinucletido fosfato) asociadas al metabolismo del cido araquidnico como la ciclooxigenasa, la lipooxigenasa, el citocromo P450 y como respuesta a la exposicin a agentes exgenos como los rayos UV, radiaciones ionizantes, la contaminacin ambiental, el humo de cigarrillo, el ejercicio excesivo entre otros.
32-34

Los principales RL que se originan son los derivados de la respiracin aerobia y se denominan especies reactivas de oxgeno (EROs), no obstante no son los nicos ya que

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tambin los hay derivados de nitrgeno y azufre aunque en menor proporcin. Las EROs se forman por la reduccin secuencial del oxgeno, lo cual origina primero al in radical superxido, posteriormente al perxido de hidrgeno (que no es un radical como tal pero es una especie muy oxidante) y finalmente al radical hidroxilo que es el ms reactivo de todos.
30,32,33

O2

+1e

O2

+1e+2H

H2O2

+1e

OH-

+1e + 2H

2H2O

El producto final de la cadena de reacciones, puede ser la molcula de agua, en cuyo caso hay menores posibilidades de dao al organismo; sin embargo considerando que ste es un sistema dinmico, es probable que se den otras interacciones bioqumicas que conduzcan a la generacin y acumulacin de RL en lugar de destoxificar a las clulas; condiciones como la presencia de iones metlicos reductores, compuestos derivados de nitrgeno o deficiencia en los donadores de electrones necesarios para remover o estabilizar a los RL puede causar un exceso de stos (Figura IV. 2.2.1).30-31

O2 + L-arginina
NOS

+1e

O2

SOD

H2O2

CAT

2H2O + O2 2GSH 2H2O + O2

Fe+2

NO
H+

OH + OH- + Fe+3 OH + NO2

ONOO-

Figura IV.2.2.1. Interacciones entre los EROs y otras especies, generacin de otros RL.

El medio por el cual el organismo contrarresta la accin potencialmente nociva de las especies oxidantes es el sistema antioxidante y su eficiencia depende de su capacidad de actuacin tanto intra como extracelularmente. As, un antioxidante se define como aquella sustancia que presente en bajas concentraciones en relacin a un sustrato oxidable, previene o retarda la oxidacin de tal sustrato. Los antioxidantes utilizan varios mecanismos de accin y en base a esto han clasificado en primarios y secundarios (Cuadro IV.2.2.1).
35-36

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Cuadro IV.2.2.1 Clasificacin de los diferentes antioxidantes. ANTIOXIDANTES PRIMARIOS Superxidodismutasa (SOD) Glutatin peroxidasa (GPx) Catalasa Transferrina Ceruloplasmina Albmina Metalotionenas ANTIOXIDANTES SECUNDARIOS Vitamina C Vitamina E Vitamina A y carotenos cido rico Bilirrubinas Albmina Melatonina Estrgenos

Los antioxidantes primarios actan en la prevencin de la formacin de los RL y en la captura de compuestos que propician su transformacin en radicales ms dainos. Entre estos encontramos a los endgenos como las enzimas SOD, catalasa y GPx, la SOD dismuta al radical anin superxido en perxido de hidrgeno (H2O2), el cual a su vez es descompuesto por la catalasa o la GPx hasta agua; entre este tipo de antioxidantes tambin encontramos a las protenas atrapadoras de metales que evitan la interaccin de los radicales ya formados con los cationes metlicos para proteger a las clulas de generacin del radical ms daino que es el hidroxilo. Los antioxidantes secundarios actan una vez formado el radical, evitan su propagacin al cederle electrones y convertir a s mismos en un radical menos reactivo y ms fcil de eliminar, entre estos hay endgenos como los estrgenos, cido rico y bilirrubinas o exgenos como las vitaminas.36-37 Cuando se da un desequilibrio entre los oxidantes y los antioxidantes en favor de los primeros el resultado es EOx, y dado el exceso de especies reactivas, colisionan con las biomolculas y de ellas sustraen el electrn que le hace falta oxidndolas. Si se trata de los lpidos se daan las estructuras ricas en cidos grasos como son las lipoprotenas y las membranas celulares, en el primer caso se da la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad, lo cual se ha reconocido como un paso inicial importante en el desarrollo de los 3

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ateromas, mientras que si la reaccin es en la membrana se descompone su estructura continua, se altera la permeabilidad y osmolaridad lo cual puede conducir a la muerte celular; es un proceso que se conoce como peroxidacin lipdica, es una reaccin de sustraccin de electrones en cadena y genera numerosos subproductos que pueden determinarse en plasma por tcnicas como la del cido tiobarbitrico.
38-41

Si las especies reactivas actan sobre las protenas se oxidan preferentemente aminocidos con estructura cclica y como consecuencia se da entrecruzamiento de cadenas peptdicas, fragmentacin de protenas y formacin de grupos carbonilo, con lo cual se impide el desarrollo normal de las funciones de las diversas protenas, ya sea transportadoras, receptores, mensajeros celulares, enzimas, etc. En el caso de oxidacin de la molcula de ADN se generan bases modificadas, rompimientos de cadena sencilla, lo cual tiene como consecuencia el desarrollo de mutaciones y carcinognesis y puede relacionarse con la prdida de expresin por dao a algn gen especfico.
38-41

Sin embargo, si el organismo se encuentra en condiciones ptimas es capaz de controlar los niveles de especies oxidantes, a travs de los sistemas antioxidantes y lograr la homeostasis, los problemas se generan al perderse el equilibrio que propicia el desarrollo de enfermedades e incluso el envejecimiento. (Figura IV.2.2.2)27

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Figura IV.2.2.2. Estrs oxidativo, homeostasis y enfermedad. Tomado de Finkel y Holdbrok 2000.

El EOx es un proceso dinmico que se ha vinculado de forma notable con la DM2 ya que existen evidencias que muestran alteraciones en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes en los sujetos diabticos. Se ha reportado una disminucin en la actividad de los antioxidantes, e incremento de los productos de oxidacin, el cual en algunos casos es detectable slo con tcnicas finas pero es evidente cuando existe mayor dao e incluso complicaciones. En este sentido, el EOx presente en los sujetos diabticos se asocia con la hiperglucemia crnica que caracteriza a esta enfermedad, ya que ante un exceso de glucosa circulante se activan varias vas metablicas no muy usuales en el organismo, lo que conduce a la generacin de otros metabolitos entre los cuales se encuentran RL de oxgeno.42-47

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Al respecto, se han descrito varias rutas metablicas vinculadas con el EOx e implicadas en las complicaciones de la DM2, entre ellas encontramos la ruta del sorbitol (o de la aldosa-reductasa), la de la glucosilacin no enzimtica de protenas, la autooxidacin de la glucosa, la modificacin de la actividad de la protein-cinasa C(PKC), la pseudohipoxia, el metabolismo alterado de lipoprotenas y la alteracin va citocinas.
48-51

De entre todas las mencionadas, las vas de la autooxidacin de la glucosa, la del sorbitol y la glucosilacin no enzimtica de protenas han sido las ms estudiadas (Figura IV.2.2.3). HIPERGLUCEMIA CRNICA

Autooxidacin de la glucosa

Sorbitol

Glucosilacin no enzimtica de protenas

Cetoaldehdos

NADP reducido

Productos de glucoslacin avanzada (AGE)

Radicales libres

Glutatin reducido

Endurecimiento de tejidos Unin a receptores

Estrs oxidativo

Estrs oxidativo

Radicales libres

Estrs oxidativo
Figura IV.2.2.3 Principales vas metablicas activadas por la hiperglucemia crnica vinculadas con el desarrollo de EOx en sujetos diabticos.

Durante la autooxidacin de la glucosa se generan productos oxidantes a partir de la enolizacin de la glucosa, de entre ellos se ha demostrado que el gliceraldehdo en presencia de metales pesados, como el Fe+2, puede formar el radical anin superxido, y ste, como se 6

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ilustra en la figura IV.2.2 1 puede ser convertido en agua a travs de

las enzimas

antioxidantes o generar otros radicales ms dainos dependiendo de las condiciones.50 Con relacin a la va del sorbitol se propone que dados los niveles altos de glucosa circulantes en la sangre, se sigue la va metablica de la enzima aldosa reductasa, sta es de baja afinidad a concentraciones normales de glucosa, genera sorbitol a partir de la glucosa y utiliza al NADPH como cofactor. Dado que el potencial antioxidante del glutatin depende del suministro de NADPH (pues lo requiere para su regeneracin) el flujo de este cofactor por otra va como la del sorbitol altera el balance oxidantes-antioxidantes hacia el lado de los primeros propiciando EOx (Figura IV.2.2.4).51

Aldosa reductasa

NADPH GLUCOSA

NADP SORBITOL

Glutatin Oxidado

Glutatin Reducido

H2O2

GPx
Glutatin Oxidado H2O

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Figura IV.2.2.4. Va del sorbitol activada por la hiperglucemia crnica, el flujo de los cofactores por la va de la aldosa reductasa propicia EOx al alterar el equilibrio redox del glutatin.

Adems, se ha demostrado que el sorbitol as generado tiene efectos sobre la fisiologa de las clulas, aquellas que toman libremente la glucosa (y que contienen la enzima aldosa reductasa) como son el lente del cristalino, las neuronas, los glbulos rojos y las nefronas sufren cambios osmticos y en la permeabilidad por el incremento de sorbitol, propicindose la opacidad en el cristalino, la disminucin en la velocidad de conduccin nerviosa, alteraciones de las funciones de la nefrona, que son complicaciones tpicas de los pacientes diabticos.51-54 As mismo, la oxidacin del sorbitol a fructosa por la sorbitol deshidrogenasa se acompaa con el incremento del radio NADH/NAD+ lo cual ha sido llamado estrs reductivo o seudohipoxia hiperglucmica puesto que los cambios redox generados son anlogos a los que se presentan en la isquemia y las clulas lo detectan como hipoxia, lo cual propicia generacin de especies reactivas. Adems el incremento del NADH metilglioxal y del promueve la reaccin catalizada por la gliceraldehdo 3- fosfato deshidrogenasa (GADPH) la cual genera gliceraldehdo 3-fosfato, que es un precursor del activador endgeno de la proteincinasa C; a partir del metilglioxal se generan AGEs (del ingls Advanced Glycosylation End Products) y la activacin de la PKC tiene varios efectos. (Figura IV.2.2.5). Esta enzima regula diversas funciones vasculares al modular a su vez la actividad de otras enzimas como la fosofolipasa A2 citoslica y la Na+-K+-ATPasa, o la expresin de genes de los componentes de matriz extracelular y protenas contrctiles. Cuando no hay una adecuada regulacin de la actividad de la PKC el resultado son anormalidades vasculares incluyendo cambios en el flujo renal y retinal, as como en la contractilidad, permeabilidad y proliferacin celular.
51-55

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SORBITOL DESHIDROGENASA

SORBITOL

FRUCTOSA

PKC

NAD+

NADH

DAG

GLY
GLYK

GAPDH 1,3-DPG GA-3P DHAP

GLY-3P

NAD+: Nicotinamidadenin dinucletido. 1,3-DPG: 1,3 difosfoglicerato GAPDH:Gliceraldehdo -3 fosfato deshidrogenasa GA-3P: Gliceraldehdo 3 fosfato MGO: Metilglioxal DHAP: Dihidroxiacetona fosfato GLY-3P: Glicerol-3 fosfato GLYK: Glicerol cinasa GLY: Glicerol DAG: Diacilglicerol PKC: Proteincinasa C.

MGO

AGE

Figura IV.2.2.5 Induccin de pseudohipoxia y activacin de la proteincinasa C por la va de la aldosa reductasa ante la hiperglucemia.

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Por otro lado, la glucosilacin no enzimtica de protenas, tambin denominada glicatacin o reaccin de Maillard, es conocida desde hace mucho tiempo por su aplicacin a la industria de los alimentos y tom relevancia fisiolgica cuando se descubrieron las partculas de hemoglobina glucosilada en sangre de sujetos sanos y su incremento en los diabticos.51-52,56 Qumicamente hablando es una reaccin que sucede en tres etapas, la primera se da por la adicin de un grupo amino primario (de una protena o de fosfolpidos) al grupo carbonilo del azcar formndose una base de Schiff el cual es un compuesto poco estable. Si no disminuye la concentracin de glucosa circulante puede avanzar hacia la segunda etapa de la reaccin con la formacin de un compuesto que se ha llamado genricamente como compuesto de Amadori en el cual se da nuevamente un rearreglo interno para mayor estabilidad pero que genera ms carbonilos reactivos; hasta este punto la reaccin es todava reversible y puede regresar hacia la base de Schiff e incluso hasta la parte inicial si disminuye la concentracin de glucosa. Sin embargo, si la reaccin no se revierte, los grupos carbonilos de los productos de Amadori son capaces de reaccionar nuevamente con grupos amino de protenas y originar molculas ms grandes por el entrecruzamiento del azcar con otras protenas (tercer etapa). Los compuestos as generados se han denominado productos finales de glucosilacin no enzimtica o AGE`s que son estructuras fluorescentes, que se forman lentamente en reacciones fuertemente desplazadas hacia la derecha, es decir hacia la formacin de los productos y que se ven propiciadas por la presencia de oxgeno y metales reductores. Figura IV.2.2.6.57-59

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Glucosa

Protena

Base de Schiff

Glucosamina

Enaminol PRODUCTOS DE AMADORI

Cetoaminol

Formas cclicas

PRINCIPALES AGES

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Pentosidina

Pirralina

CML: Carboximetil-lisina, CEL: Carboxietil-lisina, GOLD: Dmero de glioxal-lisina, MOLD: dmero metilglioxallisina

Figura IV.2.2.6. Glucosilacin no enzimtica de protenas.

Esta reaccin puede afectar la funcionalidad de las clulas, ya que la glucosilacin afecta la actividad biolgica de las protenas, por medio de tres mecanismos generales: la modificacin de protenas extracelulares (de bajo recambio), el desencadenamiento de procesos intracelulares por unin a receptores extracelulares y alteraciones de protenas intracelulares.37,40,41 En los sujetos diabticos, donde se renen las condiciones para que se generen los AGEs, se ha descrito la unin de stos a receptores especficos del tipo de las gammaglobulinas, en la superficie celular de macrfagos, monocitos y clulas endoteliales, desencadenando la liberacin de RL de oxgeno y EOx, lo cual se ver ms adelante en detalle.
51,58-61

Es as como la hiperglucemia crnica se ha vinculado con el EOx en los pacientes diabticos, en los cuales se ha descrito niveles elevados de marcadores de oxidacin, adems de asociacin con el control glucmico y los AGE`s. Por otro lado, se ha vinculado al EOx con los niveles bajos de insulina en los pacientes diabticos, ya que se ha demostrado que las clulas beta del pncreas no son inmunes al dao por los RL, as que ya instalada la enfermedad es posible que empeore la situacin del sujeto diabtico dado que disminuye la secrecin de insulina en el pncreas por interferencia de los RL sobre el proceso normal de produccin y secrecin de insulina.
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