INTRODUCCIN AL ANLISIS DE LOS COMPUESTOS ORGNICOS- Parte I Anlisis Cuantitativo

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ANLISIS DE COMPUESTOS ORGNICOS

EL ANLISIS DE COMPUESTOS ORGNICOS
Una de las actividades ms apasionantes que realiza el qumico, es cuando se encuentra con una sustancia desconocida; inmediatamente surge la interrogante qu es? tratando de conocer su identidad o estructura qumica. Si se trata de una sustancia conocida, trata de determinar su estado de pureza; y si se trata de una mezcla, cules son sus componentes y cunto hay de cada uno de ellos. Las teoras y tcnicas que forman parte de esta actividad es lo que se conoce como QUMICA ANALTICA, y cuando las muestras son sustancias orgnicas, le denominamos ANLISIS DE COMPUESTOS ORGNICOS. Entonces, el Anlisis de Compuestos Orgnicos lo podemos definir como la aplicacin sistemtica de teoras y tcnicas que permiten identificar y cuantificar a las sustancias orgnicas; determinando sus estructuras, grado de pureza o composicin porcentual. De acuerdo al problema analtico a resolver, podemos considerar dos aspectos : El Anlisis Orgnico Cualitativo, que permite establecer la identidad de la especie qumica; y el Anlisis Orgnico cuantitativo, mediante el cual se determina la pureza de una sustancia conocida, la composicin porcentual de una mezcla o el nmero de grupos funcionales presentes en la molcula de una sustancia desconocida. Los mtodos analticos podemos clasificarlos como qumicos y espectroscpicos. Hasta la dcada de los 5O los mtodos analticos en qumica orgnica eran estrictamente qumicos; con el posterior desarrollo de las tcnicas espectroscpicas en la investigacin qumica, se ha logrado un gran impulso en el avance del Anlisis Orgnico Cualitativo, y en la actualidad la identificacin de compuestos orgnicos se realiza por la elucidacin espectroscpica de las estructuras . En el anlisis cualitativo por mtodos qumicos, se empleaban reacciones especficas de los grupos funcionales que involucran formacin de productos coloreados, precipitados, desprendimiento de gases y otras formas de ser percibidas sensorialmente. En el anlisis cuantitativo, la espectroscopia an no ha logrado el mismo impacto, a excepcin de la espectroscopa Ultravioleta-visible; aunque se han desarrollado tcnicas instrumentales como por ejemplo HPLC (Cromatografa lquida de alta presin), an son frecuentes los mtodos qumicos, en los cuales se emplean reacciones de

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estequiometra definida que involucran consumo o produccin de cidos, bases, etc. y que pueden ser medidos en una determinacin visual por uso de indicadores o potenciomtricamente. Los mtodos espectroscpicos permiten elucidar estructuras orgnicas utilizando pequeas cantidades de muestra, y con una rapidez mucho mayor que los mtodos qumicos, la desventaja es el elevado costo en la adquisicin de equipos, en el manejo de las muestras y en su mantenimiento. Los principales mtodos espectroscpicos, para el anlisis orgnico, son: Espectroscopia Ultravioleta-Visible, Espectroscopia Infrarroja, Espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear y Espectrometra de Masa

IMPORTANCIA DEL ANLISIS DE COMPUESTOS ORGNICOS

Una de las fases ms importantes de la investigacin en qumica, lo constituye el anlisis de compuestos orgnicos, que comprende la organizacin del conocimiento acumulado sobre las propiedades fsicas y espectroscpicas, las estructuras y las reacciones de miles de sustancias orgnicas; dentro de un procedimiento sistemtico de identificacin lgica. Las investigaciones que realiza el Qumico Farmacutico, se orientan principalmente a la bsqueda de sustancias con nuevas o mejores acciones farmacolgicas y que por lo general son compuestos orgnicos, adems resulta evidente que existe una estrecha relacin entre la estructura qumica y la accin biolgica; de all la necesidad de conocer la identidad o estructura de una sustancia. Estas nuevas sustancias que luego se convierten en medicamentos, se obtienen de la naturaleza o por sntesis qumica. En la actualidad tiene gran vigencia la separacin e identificacin de principios activos en plantas medicinales; la riqueza de nuestra flora de uso en la medicina tradicional nos obliga a una sistemtica investigacin de estos recursos naturales, cuya utilizacin con el aporte cientfico y tecnolgico coadyuven a la solucin de nuestra problemtica sanitaria. En dicha investigacin es de suma utilidad la identificacin y cuantificacin de los principios activos, que permita un uso adecuado de ellos. Esta informacin la proporciona el anlisis orgnico. Es tambin de gran importancia la aplicacin del anlisis orgnico en la Bromatologa, Anlisis Clnicos y Bioqumicos, Toxicologa y en el Control de Calidad de sustancias orgnicas. En suma el anlisis de compuestos orgnicos, es base fundamental para introducirnos en el campo de la investigacin qumica y de la especializacin en el rea analtica.

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ANLISIS ORGNICO CUALITATIVO

En la actualidad la identificacin de compuestos orgnicos se realiza muy rpidamente, utilizando mtodos espectroscpicos tales como la espectroscopa Infrarroja que nos permite determinar el grupo funcional en el caso de la identificacin de una nueva sustancia, o como huella digital para verificar la identidad de una sustancia conocida. La espectroscopa Ultravioleta-visible nos da informacin de la estructura de compuestos que presentan grupos cromforos, si bien se trata de una tcnica que no es aplicable a todos los compuestos orgnicos, lo cierto es que una gran cantidad de medicamentos y sustancias naturales con potencial de bioactividad, incluyen cromforos en su estructura qumica, por lo tanto son susceptibles de ser analizadas con esta tcnica espectroscpica. En la dcada de los 70, la espectrometra de masas se convirti en la tcnica ms importante para la elucidacin de las estructuras de las nuevas sustancias orgnicas; en esa misma poca se desarrollan los equipos de Resonancia Magntica Nuclear y en la cual, los avances tecnolgicos de los ltimos aos han sido espectaculares, de tal manera que una gran cantidad de nuevas sustancias, obtenidas de la naturaleza (principalmente del reino vegetal) o por sntesis qumica son identificadas, es decir se elucida su estructura, utilizando nicamente la RMN.

ANLISIS ORGNICO CUANTITATIVO

Los problemas analticos cuantitativos que debemos resolver con mayor frecuencia son:
1. Determinar la cantidad o porcentaje de pureza de una sustancia conocida. 2. Determinar la composicin porcentual de una mezcla. 3. Determinar el peso equivalente o el nmero de grupos funcionales de una muestra

desconocida. En este caso, el anlisis cuantitativo es un auxiliar en la identificacin de dicha muestra. En el anlisis cuantitativo, los mtodos instrumentales van desplazando a los mtodos qumicos; sin embargo, estos ltimos an se utilizan con frecuencia por la rapidez, precisin y bajo costo de los procedimientos. En el presente curso, trataremos de las determinaciones cuantitativas por mtodos qumicos y por espectroscopa UV-visible.

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Los mtodos qumicos se fundamentan en el uso de reacciones que consumen o producen cidos, bases, precipitados, etc., que puedan ser medidos con exactitud; adems, la reaccin analtica debe ser estequiomtrica, es decir el equilibrio desplazado hacia los productos; especfica para una especie qumica o para un grupo funcional y tener una velocidad de reaccin adecuada, que permita la medida cuantitativa. Las medidas cuantitativas se basan en el hecho que en el punto final de la reaccin analtica se cumple: meq de muestra = meq de valorante En el caso de los mtodos gravimtricos, los meq de muestra = meq del producto insoluble. En el caso de la produccin de gases, meq de muestra = meq de gas producido. Los tipos de reaccin analtica ms frecuentes son las siguientes: 1.- Consumo de cido: RNH2 + HClO4 RNH3 ClO4
+ -

El cido perclrico es el valorante (solucin estndar) y el punto final se detecta con un indicador visual o potenciomtricamente. 2.- Produccin de cido: R2CO + NH2OH.HCl R2C=NOH + HCl + H2O

El cido producido se mide con un lcali estndar. 3.- Consumo de base: RCOOR + NaOH RCOONa + ROH El lcali es el valorante, el punto final se detecta visual o potenciomtricamente. 4.- Produccin de base: RCONH2 + NaOH RCOONa + NH3

El amonaco se mide con un cido estndar. 5.- Consumo de oxidante: R-CHOH-CHOH-R + HIO4 RCHO + RCHO + HIO3 + H2O

La cantidad de oxidante consumido se determina por la produccin de yodo en una reaccin adicional. El yodo se mide con tiosulfato de sodio estndar.

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6.- Consumo de reductor: RCCH + AgNO3 RCCAg + HNO3 El reductor (AgNO3) es el valorante. 7.- Gas producido: R-OH + CH3MgI RO.MgI + CH4

El gas desprendido se mide en una bureta de gas.

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ANLISIS CUANTITATIVO DE COMPUESTOS ORGNICOS

EL ANLISIS CUANTITATIVO
Es el anlisis que nos permite determinar la cantidad de una sustancia orgnica. Si la muestra que analizamos es una sustancia conocida, el anlisis cuantitativo nos permite calcular su porcentaje de pureza y si est en una mezcla, podemos determinar la cantidad de cada uno de los componentes de la mezcla. Si la muestra es una sustancia desconocida, el anlisis cuantitativo proporciona informacin complementaria para la elucidacin de la estructura, ya que se puede calcular el peso equivalente, o el nmero de grupos funcionales presentes en la molcula. El anlisis cuantitativo se fundamenta en reacciones qumicas que deben cumplir los siguientes requisitos: Debe ser especfica para un grupo funcional o para una especie qumica (ejm. EtOH en licores) Debe ser estequiomtrica, es decir que la reaccin debe estar desplazada completamente hacia los productos (derecha). Alguno de los reactantes o de los productos debe ser fcilmente medible. La velocidad de reaccin debe ser adecuada, es decir, debe ser ni muy rpida o violenta que no permita la medida cuantitativa, ni muy lenta que prolongue demasiado el tiempo del anlisis. Las reacciones pueden ser representadas: A+B C+D

En un perfecto equilibrio A+B C+D A+B C+D

Equilibrios desplazados parcialmente A+B C+D

Equilibrio desplazado completamente hacia los productos (derecha) = Rx Estequiomtrica

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Si la reaccin no est desplazada completamente hacia los productos, esto se puede lograr mediante el uso de reactivos o catalizadores adecuados. A+B C+D

Para la medida cuantitativa, se requiere que uno de los reactantes o de los productos sea un cido o una base, o capaz de reducirse o de oxidarse; de tal manera que se midan fcilmente por valoraciones de neutralizacin o de xido reduccin, o tambin que uno de los productos precipite y pueda ser medido gravimtricamente. La formacin de un gas como producto tambin permite una medida cuantitativa utilizando una bureta de gases y controlando presin y temperatura. Si uno de los productos es coloreado o absorbe en la regin UV, entonces podemos utilizar la Espectrometra UV-Vis. En conclusin el Anlisis Cuantitativo puede ser: - Volumtrico, cuando se mide el volumen (normalmente se utilizan soluciones) - Gravimtrico, cuando se mide el peso - Espectrofotomtrico, cuando se mide la absorcin (emisin) de la radiacin. En el desarrollo del curso vamos a revisar mtodos y tcnicas principalmente volumtricas y algunas gravimtrica. Para disear o aplicar mtodos o tcnicas espectrofotomtricas, se requiere conocer las teoras y fundamentos de los fenmenos espectroscpicos.

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CLCULOS EN EL ANLISIS ORGNICO CUANTITATIVO

PREPARACIN DE SOLUCIONES

Concentracin:
La concentracin se expresa en una base fsica (peso o volumen) o en una base qumica (frmula o poder de combinacin).

Fsica: % peso: g de soluto en 100 g de solucin % volumen: mL de soluto en 100 mL de solucin % peso/volumen: g de soluto en 100 mL de solucin mg %: mg de soluto en 100 mL de solucin ppm: g de soluto en 106 g de solucin

Qumica: Molaridad (M): moles de soluto en 1 000 mL de solucin Normalidad (N): equivalentes de soluto en 1 000 mL de solucin Molalidad (m): moles de soluto en 1 000 g de solucin Un peso (masa) de una sustancia pura puede expresarse en peso moleculargramo (moles) o peso equivalente-gramo (equivalentes). PM g Pg x mol = Pg PM g 1 mol x mol m mol = mg PM

PE g Pg x Eq = Pg

1 Eq x Eq PE g meq = mg PE

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Preparando soluciones:
Hemos establecido que: m mol = mg PM y meq = mg PE

De las definiciones de normalidad y molaridad se desprende que: meq = V x N y m mol = V x M

En una solucin, independiente de las modificaciones del volumen, el nmero de mmol o de meq siempre se mantiene; es decir: meq = meq mmol = mmol

lo que puede representarse reemplazando por las ecuaciones anteriores, es decir: 1a mg PE mg PM = VxN 1b Vc x Nc = Vd x Nd Vc x Mc = Vd x Md

2a

= VxM

2b

Entonces, para preparar soluciones normales o molares a partir de una sustancia pura, se calcula el peso necesario aplicando las ecuaciones 1 a 2 a y se diluye hasta el volumen apropiado con el solvente. Ejm. Si queremos preparar una solucin acuosa 0,2 N de NaOH en un volumen de 50 mL, El primer paso consiste en calcular el peso en mg, aplicando la ecuacin 1 a, donde : mg = V x N x PE V (volumen en mL) = 50 mL N (normalidad) = 0,2 PE (del NaOH) = 40 mg = 50 x 0,2 x 40 = 400 Entonces tomamos 400 mg de NaOH y diluimos con agua hasta completar un volumen de 50 mL.

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Tambin se pueden preparar soluciones normales o molares a partir de soluciones ms concentradas. En este caso se calcula el volumen necesario de solucin concentrada aplicando las frmulas 1 b 2 b y luego se diluye hasta el volumen deseado. Ejm. Preparar 50 mL de una solucin acuosa 0,2 N de NaOH a partir de una solucin 1 N. Aplicando la ecuacin 1 b calculamos el volumen necesario de solucin 1 N Vd x Nd = Vc x Nc Vd = 50 mL Nd = 0 ,2 Vc = ? Nc = 1 Entonces: Vd x Nd Nc 50 x 0.2 1

Vc =

Vc =

= 10

Es decir, tomamos 10 mL de la solucin 1N de NaOH y diluimos con agua hasta completar un volumen de 50 mL y obtenemos una solucin 0,2 N de NaOH.

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CLCULOS EN EL ANLISIS VOLUMTRICO

En el punto final de una valoracin: meq valorante = meq muestra esta ecuacin es la base para los clculos volumtricos. Podemos reemplazar meq , de la siguiente manera: El valorante siempre es una solucin, por tanto: meq valorante = Vv x Nv Si queremos conocer la cantidad de una muestra, entonces: meq de muestra = mg (muestra) PE (muestra)

Si queremos conocer la concentracin de una muestra, entonces: meq muestra = Vm x Nm De lo cual podemos deducir las ecuaciones: mg (muestra) PE (muestra) = Vv x Nv

mg (m) = Vv x Nv x PE (m) y Vm x Nm = Vv x Nv Nm = Vv x Nv Vm Estas ecuaciones se aplican en las valoraciones directas, es decir, aquellas en las que interviene una sola reaccin analtica. Ejemplos: - Valoracin de NaOH con HCl NaOH + HCl NaCl + H2O

- Valoracin de cido actico con NaOH CH3COOH + NaOH CH3COONa + H2O

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En las valoraciones indirectas (por retroceso), los clculos son ms fciles de comprender mediante el diseo de diagramas de valoracin, que son representaciones lineales del proceso y permite establecer la relacin entre la muestra y el valorante. Ejemplo: En una valoracin de amonaco, se trata la muestra con exceso de HCl y luego se mide el HCl que no ha reaccionado con NaOH

meq de NH3

meq de HCl meq de NaOH

Entonces : meq de NH3 = meq de HCl - meq de NaOH En una valoracin indirecta, puede utilizarse el control para corregir errores e impedir el uso de dos soluciones estandarizadas.

meq de NH3

meq de HCl

MUESTRA

meq de NaOH

meq de HCl

CONTROL
meq de NaOH

Entonces: meq de NH3 = (meq de NaOH)c - (meq de NaOH)m

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TCNICAS PARA EL ANALISIS CUANTITATIVO DE COMPUESTOS ORGANICOS

Revisaremos las siguientes tcnicas analticas:

1. Valoracin cido-base en medio acuoso

2. Valoracin cido-base en medio no acuoso

3. Anlisis cuantitativo por el mtodo de la saponificacin

4. Anlisis de vitamina C por el mtodo iodomtrico.

5. Anlisis de vitamina C por espectrofotometra UV-visible.

6. Anlisis de antocianinas totales por espectrofotometra UV-visible.

7. Anlisis de polifenoles totales por espectrofotometra UV-visible.

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1. Valoracin cido-base en medio acuoso

Fundamento Existen compuestos orgnicos que tienen la suficiente fuerza cida o bsica, para ser medidos cuantitativamente mediante una valoracin cido-base (neutralizacin) en medio acuoso, utilizando un cido fuerte como valorante en el caso de las sustancias bsicas, o una base fuerte como valorante para medir sustancias orgnicas cidas. Los cidos carboxlicos son los suficientemente fuertes (pka entre 3 a 6) para ser valorados con una base fuerte. El mtodo frecuente consiste en una valoracin en solucin acuosa utilizando como valorante NaOH o KOH estndar y deteccin visual del punto final utilizando fenolftaleina como indicador.

RCOOH + KOH

RCOOK + H2O

Aplicacin en el anlisis de compuestos orgnicos Los cidos carboxlicos, los cidos sulfnicos, las bases orgnicas fuertes y en general todos los compuestos orgnicos con la suficiente fuerza cida o bsica; pueden medirse por este mtodo. En el presente curso, revisaremos la aplicacin en el caso de los cidos carboxlicos; debemos tener en cuenta que la fuerza cida es mayor en los cidos carboxlicos alifticos de bajo peso molecular, en cidos carboxlicos aromticos mono o disustituidos, tambin se incrementa la acidez en presencia de mayor nmero de grupos COOH. Interferencias.En el caso de los cidos carboxlicos, las interferencias que impiden la medida cuantitativa son impurezas cidas u otros componentes cidos en casos de mezclas, por ejemplo el cido acetilsaliclico (Aspirina) que se obtiene por esterificacin a partir del cido saliclico y cido actico, normalmente contiene como impurezas los cidos que la originan, por tanto el mtodo no es aplicable ya que en la medida cuantitativa, los resultados seran la suma de aspirina + sus impurezas. Tambin debemos tener en cuenta los casos en que solventes o reactivos consumen el valorante, en estos casos el problema se resuelve realizando un blanco.

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Esquema de la valoracin.La medida de un cido carboxlico utilizando una base fuerte estndar (KOH o NaOH) como valorante, es una valoracin directa.
meq de R - COOH

meq de NaOH o KOH

donde:

meq RCOOH = meq KOH o NaOH

El PE (peso equivalente es: PM N de COOH

PEm =

Presentacin de resultados.Al PE (Peso equivalente) de los cidos carboxlicos determinados en una valoracin directa con lcali estndar, tambin se le denomina EQUIVALENTE DE NEUTRALIZACIN. En caso de una muestra de un cido carboxlico nico, se determina la cantidad o porcentaje de pureza de la muestra. En el caso de una mezcla, en caso que dicha mezcla no presente otros componentes cidos, se determina la cantidad o porcentaje del cido en la mezcla. En el caso de una muestra pura, desconocida, se determina el nmero de grupos funcionales (COOH) presentes en la molcula. Cuando se trata de mezclas complejas como las grasas (mezcla de cidos carboxlicos y sus steres), la medida cuantitativa se da como NDICE DE ACIDEZ, que es el nmero de miligramos de KOH necesarios para neutralizar los cidos de un gramo de muestra.

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2. Valoracin cido-base en medio no acuoso

Fundamento.Existen compuestos orgnicos que se comportan como cidos o bases dbiles, estos compuestos pueden ser medidos cuantitativamente mediante una valoracin cido-base en medio no acuoso. Los fenoles son compuestos menos cidos que los cidos carboxlicos. Este comportamiento permite valorar a los fenoles utilizando medios no acuosos. Los solventes deben ser bases ms fuertes que el agua para incrementar la acidez del fenol, es decir, incrementar su disociacin cida; se emplea piridina u otras bases orgnicas como solventes. Se recomienda como valorante el hidrxido de tetrabutil amonio (Bu4 N) OH , el punto final se puede determinar mediante el uso de azul de timol como indicador, aunque resulta impreciso por lo que se recomienda la deteccin potenciomtrica de dicho punto final.
Piridina + -

Ar - OH + (Bu4 N) OH

Ar - O (Bu4 N)

+ H2O

Existen muchas sustancias orgnicas que se comportan como bases dbiles, como las aminas, los alcaloides, etc., que disueltas en un cido, como el cido actico glacial, incrementan su carcter bsico y se pueden valora con cido perclrico estndar y cristal violeta como indicador.
Ac. actico

R- NH2

+ HClO4

RNH3 ClO4

Aplicacin en el anlisis de compuestos orgnicos Las sustancias orgnicas que se comportan como cidos dbiles (por ejemplo fenoles o cidos carboxlicos muy dbiles) y las sustancias orgnicas que se comportan como bases dbiles (por ejemplo aminas, purinas, alcaloides); pueden medirse por este mtodo. Interferencias.La presencia de impurezas u otros componentes en casos de mezclas que reaccionen con el valorante. En el caso de cidos las interferencias son las impurezas o sustancias cidas y en el caso de las muestras bsicas, las impurezas o sustancias bsicas.
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Al igual que en las valoraciones cido-base en medio acuoso, tambin debemos tener en cuenta los casos en que solventes o reactivos consumen el valorante.

Esquema de la valoracin.Es una valoracin directa donde la relacin es: meq muestra (fenol, amina, alcaloide, etc,) = meq valorante
meq de muestra

meq de valorante

donde:
El PE (peso equivalente de la muestra) es:

PE m =

PM N de grupo funcional cido o bsico

Presentacin de resultados.En caso de una muestra nica, se determina la cantidad o porcentaje de pureza de la muestra. En el caso de una mezcla, en caso que no presente otros componentes cidos o bases, se determina la cantidad o porcentaje del cido o la base, segn sea el caso, en la mezcla. En el caso de una muestra pura, desconocida, se determina el nmero de grupos funcionales presentes en la molcula.

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3. Anlisis cuantitativo por el mtodo de la saponificacin (Hidrlisis alcalina)

Fundamento Saponificacin = Hidrlisis alcalina de steres Los steres y las amidas pueden ser determinados cuantitativamente mediante la hidrlisis alcalina, empleando un exceso de lcali, se somete a reflujo y luego se mide el exceso con un cido fuerte estndar. El solvente es agua cuando el ster es soluble y alcoholes (metanol, etanol, propanol) cuando son insolubles en agua. Como reactivo alcalino, se emplean soluciones de NaOH (0.1 1 N), HCl como valorante y fenolftalena como indicador. Se realiza un ensayo control. R-CO.OR + N a OH R-CO.NR2 + N a OH NaOH + H C l Esquema de la valoracin
meq de M

R-COONa + RO H R-COONa + R2N NaCl + H2O

meq de NaOH

MUESTRA

meq de HCl

meq de NaOH meq de HCl

CONTROL

donde: meq M = meq HClc meq HClm El PE (peso equivalente es: PEm = PM N de grupos ster o amido

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Aplicacin en el anlisis de compuestos orgnicos.Este mtodo se aplica para la determinacin cuantitativa de steres de cidos carboxlicos y amidas.

Interferencias.Son interferencias los grupos funcionales o sustancias que consumen lcali.

Presentacin de resultados.En caso de una muestra nica, se determina la cantidad o porcentaje de pureza de la muestra. En el caso de una mezcla, se determina la cantidad o porcentaje del compuesto en la mezcla. En este anlisis, al peso equivalente del ster tambin se le conoce como EQUIVALENTE DE SAPONIFICACIN. En el caso de grasas, (mezclas complejas de cido libres y sus steres) los resultados se expresan como ndice de ster o ndice de saponificacin. NDICE DE STER, es el nmero de miligramos de KOH requeridos para saponificar los steres de 1 gramo de muestra. Por lo general, se aplica a mezclas complejas de steres (grasas, que son mezclas de steres glicridos; as tambin como a los aceites cuya composicin es poco definida). NDICE DE SAPONIFICACIN, es el nmero de miligramos de KOH requeridos para neutralizar los cidos libres y saponificar los steres de 1 gramo de muestra. Se aplica a mezclas de steres con grupos cidos libres.

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4. Anlisis de vitamina C por el mtodo iodomtrico.

Fundamento
Valoracin por xido reduccin. La vitamina C o cido ascrbico reacciona rpidamente con el Yodo, oxidndose a cido dehidroascrbico.

Como valorante se utiliza una solucin estandarizada de Yodo, el punto final se detecta con solucin de almidn, por cambio de coloracin a azul intenso por formacin del complejo Iodo-almidn.

Esquema de la valoracin.Es una valoracin directa donde la relacin es: meq de vitamina C = meq Iodo
meq de Vit. C

meq de Iodo

La reaccin entre el yodo y el cido ascrbico presenta una estequiometra 1:1. Es importante tener en cuenta que si la muestra contiene otras sustancias reductoras adems del cido ascrbico, tambin reaccionaran con el Yodo y el volumen del valorante estar aumentado. Adems debemos recordar que la vitamina C es oxidada fcilmente por el aire, por tanto, las disoluciones que contienen vitamina C deben ser preparadas inmediatamente antes de ser tituladas, con el fin de obtener resultados fiables.

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Tcnica
Preparacin del Valorante 1.4 g de Yodo metlico se disuelven en una solucin que contiene 3.6 g de IK, en 10 mL de agua destilada, se agrega 3 gotas de HCl y luego se completa a 100 mL en una fiola. HCl
+

I2 + IK + H2O

I3 + H + KOH

Preparacin del estndar Pesar aproximadamente 50 mg de Vit C USP, agregar 10 mL de agua destilada y 2.5 mL de cido sulfrico o fosfrico 2N. Valoracin del estndar Al estndar preparado se le agregan 0.5 mL de solucin de almidn 5%, y se procede a valorar con el valorante hasta el punto final (aparicin de color azul, permanente). Anotar los mL de valorante consumidos (mLE) Preparacin de la muestra Pesar de 2 a 3 g de la muestra, diluir con 10 mL de agua destilada y 2.5 mL de cido sulfrico o fosfrico 2N Determinacin cuantitativa A la muestra preparada se le agregan 0.5 mL de solucin de almidn 5%, y se procede a valorar con el valorante hasta el punto final (aparicin de color azul, permanente) Clculos Se aplica la siguiente frmula: % de Vitamina C = mLM x mg Vit. C x 100 / mLE x mg M Donde: mL M = mL de valorante consumidos en la muestra mg Vit. C = cantidad de vitamina C estndar en mg. mL E = mL de valorante consumidos en el estndar (Vitamina C) mg M = Cantidad de muestra, en mg.

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5. Anlisis de vitamina C por espectrofotometra UV-visible.

Fundamento
Determinacin cuantitativa por espectroscopa Ultravioleta - visible. Se basa en las
HO HO CH2 CH O O

propiedades espectroscpicas de la vitamina C o cido ascrbico, en la regin ultravioleta visible. Funcionalmente el cido ascrbico es una lactona --insaturada, por lo tanto presenta una conjugacin entre el grupo carbonilo del ster lactnico (C=O) y el doble enlace C=C, originando una banda K en el espectro UV. Normalmente encontramos la vitamina C como una mezcla de cidos ascrbico y dehidroascrbico; este
O O

HO
cido ascrbico

OH

HO HO CH2 CH

ltimo es producto de la oxidacin inicial y reversible del cido ascrbico y mantiene las caractersticas y propiedades de la Vitamina C. Funcionalmente el cido dehidroascrbico es una lactona con dos grupos carbonilos en conjugacin cruzada, el

O
cido dehidroascrbico

C=O del ster lactnico conjugado con un C=O cetnico y los dos C=O cetnicos conjugados entre si. Entonces, la absorcin mxima de la vitamina C (max) va a depender de las concentraciones de cido ascrbico y dehidroascrbico; por tanto del pH. Mximos de absorbancia (max) de la banda K del cido ascrbico segn el pH: A pH 2 A pH 6 a 10 A pH > 10

max = 244 nm max = 266 nm max = 294 nm

Tcnica
Medida del Estndar de vitamina C Diluir la vitamina C estndar en agua destilada y desionizada a una concentracin de 1 mg en 100 mL En el espectrofotmetro UV-vis, leer la Absorbancia a = 244 nm, 266 nm y 294 nm. Realizar 3 ensayos y obtener el promedio. Comparar las lecturas y seleccionar la de mayor Absorbancia promedio, para utilizar dicha en la determinacin de vitamina C en la muestra analtica.

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Preparacin de la muestra.Si la muestra es un vegetal o derivado (fruta, hortaliza, jugos, nectares, pulpa, etc.) se diluye con agua destilada y desionizada a la concentracin de 100 mg por 100 mL . Si la muestra es un producto farmacutico con alta concentracin de vitamina C (mayor de 20%), la concentracin de la solucin debe ser de 1 mg por 100 mL. Si la muestra vegetal contiene pequeas concentraciones de vitamina C, ser necesario duplicar las concentraciones de la muestra y del estandar. Cuando la muestra es lquida se realizan la dilucin directamente, si la muestra es pulpa de fruta o un slido (por ejemplo tabletas de vitamina C), 1 g. de dicha muestra se trituran en un mortero, se agrega 50 mL de agua destilada y desionizada, se agita durante 5 minutos, se filtra, se enrasa a 50 mL y se realiza las dilucin respectiva. La absorbancia de la muestra se lee en el espectrofotmetro UV-vis a la seleccionada en las determinaciones con el estndar de vitamina C.

Clculos Se aplica la siguiente frmula: Para vegetales: % de Vitamina C = ApM / ApE Para productos farmacuticos (u otros con 20% o ms de vitamina C): % de Vitamina C = 100 x ApM / ApE Donde: ApM = Absorbancia promedio de la muestra ApE = Absorbancia promedio del estndar

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6. Anlisis de antocianinas totales por espectrofotometra UV-visible.

Fundamento
La determinacin cuantitativa de antocianinas se realiza por espectroscopa visible. Se basa en las propiedades espectroscpicas de las antocianinas, en la regin ultravioleta visible. Funcionalmente las antocianinas corresponden al grupo de los flavonoides; y son glucsidos de las antocianidinas. El trmino antocianina fue propuesto en 1835 por el farmacutico alemn Ludwig Clamor pigmento Marquart azul de para la describir col el lombarda

(Brassica oleracea). Las antocianinas

Estructura general de antocianinas R = OH, H, Azcar

tambin son responsables de los colores rojos y violetas presentes en las flores y frutos de las plantas.

En su estructura presenta el in flavilio, una amplia conjugacin que origina una banda K por encima de 500 nm, por lo tanto, ubicada en la regin visible. En la determinacin de antocianinas totales, los resultados se expresan en funcin a la antocianina principal.

Tcnica
Preparacin de la Muestra La muestra se diluye con agua destilada y desionizada, en la proporcin 1:10 (Factor de dilucin = 10), 1:20 (Factor de dilucin = 20) y 1:30 (Factor de dilucin = 30). Las muestras slidas se trituran en un mortero antes de la dilucin y luego se agitan por 15 minutos, se filtran y se enrasan al volumen correspondiente. La absorbancia de las muestras se lee en el espectrofotmetro UV-vis a la que corresponda a la antocianina principal (cianidina-3-glicsido = 510 nm y pelargonidina = 520 nm) La Absorbancia ser el promedio de las 3 lecturas en cada dilucin.

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Clculos Aplicar la frmula:

A x P.M. x F dil. x 1000

mg/L o Kg antocianinas totales =

max.
Donde: A = = Absorbancia (Promedio de 3 lecturas) Peso molecular de la antocianina principal Factor de dilucin Constante de extincin molar de la antocianina principal

P.M.

F dil. =

max

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7. Anlisis de polifenoles totales por espectrofotometra UV-visible.

Fundamento La determinacin cuantitativa de polifenoles se realiza por espectroscopa visible. Los compuestos fenlicos, llamados Polifenoles ya que presentan ms de un grupo fenol (OH unido al anillo aromtico) se han constituido en el grupo ms importante de antioxidantes naturales. Los Polifenoles se encuentran en los vegetales, el trmino polifenoles comprende un gran nmero de metabolitos secundarios, que se agrupan en: cidos hidroxibenzoicos, cidos hidroxicinmicos, taninos, flavonoides, principalmente: o o o flavonoles, proantocianinas, y antocianinas

El contenido de Polifenoles totales, se determina por el mtodo de Folin Ciocalteu, mtodo espectrofotomtrico que se fundamenta en la reaccin de los polifenoles con fosfotungstatofosfomolibdato, el cual se reduce formando un complejo azul que se mide en el espectrofotmetro a de 765 nm, se utiliza cido glico como estndar de referencia y los resultados se expresan como % de Polifenoles, mg de Polifenoles en 100 g, o en mg de Polifenoles en 1 Kg o en 1 L; expresados como cido glico.

Tcnica
Preparacin de la muestra.Tomar 100 mg (si la muestra es slida, triturar en mortero) y agregar 20 mL de agua destilada y desionizada; agitar durante 15 minutos. Tomar 0.5 mL de la solucin muestra,

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agregar 0.2 mL de Reactivo de Folin Ciocalteu y 1 mL de solucin de carbonato de sodio 7.5%. Dejar reaccionar durante 20 minutos. Filtrar y leer la absorbancia a 765 nm.

Clculos Se prepara una curva de calibracin con cido glico a concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 25 mg/L. Se elige la absorbancia de la curva de cido glico, ms prxima a la absorbancia obtenida de la muestra y se aplica la siguiente frmula: Cest. x Am x Vdm x 0.1 % de Polifenoles expresados como cido glico = Aest. x Pdm Donde: - Cest .- concentracin de cido glico en mg/L, en la Absorbancia elegida - Am .- lectura de la absorbancia de la muestra (promedio de 3 ensayos) - Vdm .- mL de solvente utilizados en la dilucin de la muestra. - Aest.- Absorbancia elegida del cido glico. - Pdm.- mg de muestra, utilizados en la dilucin.

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EJERCICIOS

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