Citometría de flujo Renée L.

Crisp
Citometría de Flujo
Jefa TP Turno Noche
 Citometría de flujo
Es la ciencia que permite
clasificar y separar células vivas
determinando propiedades físicas
o biológicas de las diferentes
poblaciones celulares.
 Parámetros celulares que pueden
estudiarse:
• Tamaño celular
• Complejidad celular interna (organelas, gránulos)
• Contenido de ácidos nucleicos (DNA, RNA)
• Proteínas de superficie
• Proteínas citoplasmáticas
• Actividades enzimáticas
• Viabilidad
• etc.
Citometría de flujo
™ Surge a mediados de la década del 70.

™ Resulta de la integración del desarrollo de otras

técnicas fundamentales:
• Microscopía
• Tinciones citoquímicas
– Tinciones fluorescentes (1880)
– Anticuerpos conjugados (1950)
– Anticuerpos monoclonales (1975)
• Electrónica
– Fotomultiplicador (conversión de fotones
en pulsos eléctricos (1945)
• Computación
 Muestra
™ Células suspendidas en un medio líquido
– Sangre
– Cultivos celulares
– Tejidos
– Tumores sólidos
– Alimentos (para estudio de contaminación bacteriana)

™ Las muestras sólidas se disgregan por

digestión mecánica o enzimática
Parámetros a medir
• Tamaño La muestra NO
requiere tratamiento
• Complejidad interna adicional

• Fluorescencia Se marcan las

células con
anticuerpos
específicos
Proteínas de superficie conjugados con
Contenido de DNA fluorocromos
etc. …
 FLUORESCENCIA

Fenómeno en el que un compuesto

absorbe energía luminosa a una
determinada longitud de onda
(espectro de absorción) y luego emite
el exceso de energía en forma de
fotón a una longitud de onda que le
es característica (espectro de
emisión)
 Fluorescein (FITC)
Excitation Emisson
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

495 nm 520 nm
(430-520) (490-630)

Protein
Fluorocromos
„ FITC también llamado FL1 (Isotiocianato de
fluoresceina) de fluoresceína
Isotiocianato

„ PE llamado FL2 ( Ficoeritrina)

„ PerCP llamado FL3 (piridin clorofil proteina)

„ APC llamado FL4 (aloficocianina).

 Espectros de emisión
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

PerCP
APC
FITC PE
 Componentes básicos de un
citómetro
¾ Cámara de flujo
¾ Fuente de luz y óptica de focalización
¾ Fotodetectores y sistema óptico para
direccionar
¾ Sistema electrónico (amplificación y
conversión a señal eléctrica)
¾ Computadora (hardware y software)
 Cámara de flujo: focalización hidrodinámica

Muestra Injector
suspensión Tip
Fluido: flujo
Sheath
laminar envolvente
tridimensional
Fluid
y estable

Luz de emisión
Fluorescence
(dispersión
signalsy
fluorescencia)

Focused laser
Luz de excitación
beam
(láser)
La muestra es inyectada a presión en el centro de un fluido envolvente
que se mueve a alta velocidad que logra ordenar a las células que
circulan una a una frente a la fuente de excitación.
FUENTE DE EXCITACIÓN
Cada célula es expuesta a la luz de excitación durante 1 a 5 useg

Fuente de iluminación pequeña y brillante Láser

Determinan los
fluorocromos que
pueden ser utilizados
para conjugar los
anticuerpos
(1 o más)
Argón: 334-364, 458, 488, 514
Kriptón: 351-356, 407, 568, 647
Helio – Neón: 633
FUENTE DE EXCITACIÓN y FLUOROCROMOS

Common 350 457 488 514 610 632

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Laser
Lines PE-TR Conj.

Texas Red

PI

Ethidium

PE

FITC

cis-Parinaric acid
Desviación de la luz
Depende de las características de la partícula

„ FSC: luz con desviación frontal (Forward Scatter)

Depende del tamaño de la partícula

„ SSC: luz con desviación lateral (Side Scatter)

Depende de la granularidad
Fluorescence Activated
Cell Sorting

488 nm laser FALS Sensor

Fluorescence detector

Charged Plates - +

Single cells sorted

into test tubes
Standard Long Pass Filters
520 nm Long Pass Filter
Light Source Transmitted Light

>520 nm
Light

Standard Short Pass Filters

575 nm Short Pass Filter
Light Source Transmitted Light

<575 nm
Light
 Standard Band Pass Filters
630 nm BandPass Filter
White Light Source Transmitted Light

620 -640 nm Light

 Optical Filters
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg

Light Source Transmitted Light

Reflected light
 Compensación electrónica
™Los espectros de emisión pueden ser muy próximos
™Los filtros no son perfectos

Fluorescencia
detectada en FL2
pero debida a FITC
(FL1)

Los citómetros tienen incorporado un algoritmo matemático

que remueve las fluorescencias superpuestas (compensación)
Adquisición
„ Identificación de las poblaciones a ser
analizadas
„ FSC vs. SSC
„ Gráficos Scatter vs. Fluorescencia
„ Gráficos Fluorescencia vs. Fluorescencia
Presentación de Datos
„ Histogramas

„ Dot Plots

„ Contour Plots

„ 3D Plots
Histogramas
Dot Plot
Contour Plot
Diagrama de densidad

Diagrama de contornos 3D
Selección de poblaciones

Región11
Región
Región22
Región
Región33
Región
 Algunas células sanguíneas
y como identificarlas….
Polimorfonucleares neutrófilos (PMN)
Poseen gránulos Æ Alta complejidad interna

Monocitos (Mo)
Tamaño similar a PMN
Complejidad intermedia

Linfocitos (Ly)
Pequeño tamaño
Baja complejidad interna
 Cluster Linaje Función
CD 45 Leucocitos Transducción
(Glóbulos Blancos)
CD 14 Monocitos Receptor endotoxina
Receptor Fc
CD 64
CD 19 Linfocitos B Transducción
CD 20 Canal de Ca++
Molécula de adhesión
CD 22
CD 3 Linfocitos T Transducción
Receptor CD 4 T helper Correceptor MHC II
HIV
CD 8 T citotóxicos Correceptor MCH I
Molécula de adhesión
CD 56 Natural Killer
MUESTRA REACTIVO

CD 3 anti CD 3
CD 4
Linfocito CD 8 anti CD 4
CD 19
Monocito anti CD 8

PMN
 Recuento de linfocitos T
(pacientes HIV +)

• Selección de la población
CD 3 positiva (linfocitos T)

• % de eventos CD4 y CD8

en la población CD3 +

anti CD 3

anti CD 4

anti CD 8
PLOIDIA
Indice de replicación tumoral
 APLICACIONES
Clínicas
• Evaluación del estado inmunológico
• Tipificación de leucemias y linfomas
• Grado de crecimiento tumoral
• etc…

Industria alimenticia
• Contaminación bacteriana o por levaduras
Ecología

• Evaluación del impacto ambiental por determinación

de autofluorescencia de algas marinas en muestras seriadas
etc…