Introduccin a la Embriologa Molecular (Jean Brachet)

PROLOGO Las cuestiones fundamentales que la embriologa ha intentado siempre resolver son las siguientes: Cmo puede un huevo fecundado, que ha recibido un ncleo de la madre y otro del padre, dar lugar a todos los rganos presentes en el adulto? , Cmo es posible que, en un determinado momento del desarrollo y en una regin especial del embrin, un nmero limitado de clulas se diferencien en msculo o en glbulos rojos de la sangre? El Propsito de la embriologa molecular es responder a estas cuestiones en funcin de las propiedades de las macromolculas. A pesar de que an estamos muy lejos de obtener una respuesta completa, algunos progresos espectaculares de la biologa rnolecular nos permiten plantear los mismos problemas en trminos ms sencillos. Por ejemplo, la palabra "ncleo" puede ser sustituida por "un conjunto de genes" o, mejor an por "cido desoxirribonucleico (DNA)". El huevo fecundado ha recibido Pues cantidades iguales de DNA paterno y materno, que constituyen la parte ms importante del ncleo, porque contienen en la propia molcula todo el programa para el desarrollo del huevo a adulto. Respecto a la segunda cuestin, la bioqumica nos dice que las clulas musculares seran incapaces de contraerse y no tendran su estructura microscpica caracterstica si no contuvieran cantidades considerables de unas protenas especificas: "contrctiles", actina y miosina. Para las clulas rojas sanguneas, la situacin es similar: no seran rojas si no tuvieran hemoglobina; y sin este pigmento rojo sedan incapaces de cumplir su misin, que es transportar el oxgeno a todos lo dems rganos. Cuando nuestras preguntas iniciales son formuladas en trminos bioqumicos en lugar de morfolgicos, se hacen ms sencillas. El problema fundamental de la diferenciacin embriolgica puede ahora plantearse as: Por qu la capacidad, dirigida por el DNA, de sintetizar hemoglobina, actina, miosina o cualquier otra protena especfica aparece solo en un determinado momento y en una regin especial del embrin? Planteado de esta forma, el problema puede parecer a primera vista ms difcil que en su forma original. En realidad es una simplificacin del problema real, pero lo hace mucho ms fcil de abordar experimentalmente. El inducir a una clula a producir hemoglobina (lo cual, como veremos, puede hacerse) no es suficiente para obtener su diferenciacin en glbulo rojo. Pero si este libro versa sobre embriologa molecular, es porque conocemos suficientemente bien los mecanismos de sntesis proteica y su control gentico (ver captulo 2) como para disear experimentos que puedan arrojar luz sobre el problema, mucho ms remoto y complejo, de la diferenciacin celular. Como veremos, la embriologa molecular no trata solo de la diferenciacin embriolgica. Tambin estudia los fenmenos bsicos de la biologa celular, tales como el crecimiento celular, la divisin de la clula, sus movimientos, las interacciones ncleo-citoplsmicas, etc. De hecho, una buena parte de nuestros conocimientos sobre los aspectos qumicos y moleculares de la vida de la clula provienen de trabajos realizados en estados muy tempranos del desarrollo embrionario; y los huevos de anfibio y de erizo de mar son de gran utilidad para el estudio de la divisin (mitosis) y diferenciacin celular. Este libro seguir el orden perfectamente lgico del desarrollo embrionario, caracterizado por un aumento progresivo de la complejidad. Tras unas notas introductorias sobre la historia de la embriologa molecular y un corto resumen de

nuestros actuales conocimientos sobre la sntesis proteica y su control gentico, examinaremos sucesivamente, desde el punto de vista molecular, los pasos fundamentales del desarrollo: la formacin de vulos y espermatozoos, la fecundacin, la segmentacin (que es un periodo de intensa divisin celular), el desarrollo temprano de los huevos de invertebrados y vertebrados, las interacciones nucleo-citoplsmicas y, finalmente, la diferenciacin celular. El esquema y la filosofa general de este libro son los mismos que en Biochemistry of Development (Pergamon, 1960), que escrib para un pblico mas especializado, hace mas de 12 aos. El presente libro debe mucho a mis alumnos de la Universidad de Bruselas, a los que, ao tras ao, he ido ensenando los progresos- de la embriologa molecular. No hubiera sido escrito sin la amable insistencia del Profesor G. Czihak y del Dr. K. Springer; y sin la eficiente ayuda del Profesor P. Van Gansen (que se encarg de las ilustraciones), Dr. P. Malpoix (que reviso el ingles), Sra. J. Baltus (que mecanografi el manuscrito) y mis colegas H. Chantrenne, R. Thomas, A. Ficq y P. Van Gansen (que leyeron el manuscrito e hicieron numerosas y tiles sugerencias). A todos ellos, mi ms clido agradecimiento. Bruselas, Blgica Jean Brachet 16 de Julio de 1973 CAPITULO I DE LA EMBRIOLOGA EMBRIOLOGA MOLECULAR

DESCRIPTIVA

LA

La Embriologa, la ciencia del desarrollo, tiene, como todas las ciencias, su propia embriologa. Cmo y cuando apareci no se sabe, pero los albores han sido muy Bien descritos por el fundador de la embriologa qumica, Joseph Needham, que adems de bioqumico y embrilogo, era un dotado historiador. Despus de que el hombre descubriera la incubacin artificial, que incluso en las ms antiguas civilizaciones fue utilizada para fines eminentemente prcticos, tuvo la suficiente curiosidad como para romper el cascaron del huevo y echar una mirada al embrin de polio en desarrollo. Sin saberlo, as se convirti en "embrilogo descriptivo" y estudio la morfognesis (aparicin de nuevas formas y funciones); y cuando hizo el mismo tipo de observaciones en el embrin de pato, se convirti en "embrilogo comparativo". La embriologa descriptiva y comparativa an hoy constituye la base de la embriologa moderna. Estas dos ramas de la embriologa, que tan importante desarrollo tuvieron en los siglos XVIII y XIX, ahora pueden parecer viejas, pero en modo alguno han muerto, especialmente a la vista de los continuos progresos que se hacen en los medios pticos de observacin. Gracias al microscopio electrnico se han publicado muchos y valiosos estudios sobre la ultra estructura de los embriones normales de erizo de mar, rana o polio. Esta es la forma moderna de la embriologa descriptiva y comparativa. Sin embargo, despus de que el hombre echara una mirada a los pasos del desarrollo que conducen a la formacin del adulto, su curiosidad no hizo ms que aumentar: Cmo ocurre este desarrollo? Despus de discutir exhaustivamente, como ahora hacemos nosotros, la "preformacin" y la "epignesis", se decidi a examinar los embriones. As, los huevos fueron parcialmente destrudos por funcin, se mataron blastmeros y se centrifugaron embriones. La "embriologa experimental", que culminara en descubrimientos tales como el organizador de Spemann, haba nacido; y con ella

comenzaron a emerger progresivamente nuevos conceptos tericos tales como los de potencialidades, determinacin, regulacin, campos morfogenticos y gradientes. Como la embriologa qumica no es mas que el anlisis bioqumico del desarrollo embrionario, hubo de seguir el mismo rumbo que la propia embriologa, y su evolucin ha estado siempre obligatoriamente ligada a la de esta ciencia. La embriologa qumica comenz6 como una ciencia descriptiva y comparativa, posteriormente fue profundamente influenciada por los progresos de la embriologa experimental, y ahora esta expuesta a los grandes impactos de la gentica bacteriana y la biologa molecular. El uso de nuevos mtodos y conceptos procedentes de esta ltima ciencia ha transformado la embriologa "qumica" en embriologa "molecular". El primer gran hito en la historia de la embriologa qumica fue el Chemical Embryology (1931) de Needham. Adems de acuar el nombre de la nueva ciencia, Needhan reuni en tres grandes volmenes todo lo que en su tiempo se saba sobre la composicin qumica de los embriones en los sucesivos estados del desarrollo. Este fue el opus magnum de un gran humanista moderno y la biblia de un pequeo grupo de embrilogos qumicos que en este momento comenzaban sus investigaciones. En cientos de tablas se recogan datos, procedentes de mltiples publicaciones, sobre contenido en protenas, glucgeno, lpidos y agua, de todo tipo de embriones. Esta recopilacin, tan valiosa en su da, hoy ha perdido la mayor parte de su utilidad a causa de los cambios que han sufrido tanto los problemas como los mtodos de trabajo. Los progresos de la bioqumica y de la fsica qumica tuvieron, como es natural, mucha influencia en la orientacin de las investigaciones ms modernas de la dcada de los 30. Revisando las observaciones de Warburg sobre el aumento del consumo de oxgeno durante la fecundacin del huevo de erizo de mar, Runnstrom introdujo por primera vez algunos factores bioqumicos realmente importantes: la citocromo-oxidasa, los citocromos, las dehidrogenasas y el adenosin trifosfato. Tambin en la dcada de los 30, Needham, Chambers, Rapkine, Ephrussi, Wurmser y Reiss trataron de medir el pH y el potencial redox de estos huevos. Hoy se sabe que la ultraestructura de los huevos es tan complicada que difcilmente se puede (incluso en una primera aproximacin) considerarlos como una solucin rodeada por una membrana lipdica, y en consecuencia este tipo de investigaciones ha sido abandonado. Sin embargo, Chambers logro demostrar que la vescula germinal de los ovocitos ni reduce ni oxida las tinciones que se le inyectan; y estudios mas recientes han mostrado que el ncleo celular es notablemente pobre en enzimas reductoras y oxidantes. En 1932 ocurri una revolucin: el descubrirniento por Bautmann et al, de que un organizador muerto an es capaz de inducir la formacin de un sistema nervioso. Los bioqumicos descubrieron la existencia de la embriologa experimental, y el rumbo de la embriologa qumica cambia. Este cambio es evidente si se comparan el Chemical Embryology (1931) de Needham con su propio Biochemistry and Morphogenesis (1942) o con la Embiyologie chimique (1944) del autor de estas lneas. En cuanto Holtfreter (1935) y Whemeier (1934) descubrieron que la "sustancia inductora" (o "sustancia evocadora", como prefera llamarla el grupo de Cambridge, siguiendo las sugerencias de Waddington) estaba ampliamente distribuida en la Naturaleza, comenzaron los intentos de identificarla. Dado que tanto el organizador muerto como los fragmentos, de hgado de caballo o de buey tratados con alcohol "inducan" la formacin de estructuras neurales en el ectoblasto por que no tomar todo el hgado y fraccionarlo por los mtodos bioqumicos que permiten aislar y purificar las vitaminas y hormonas? Comenzaron estos trabajos en varios laboratorios, y este campo

se hizo casi tan "candente" como lo era hace algunos aos el campo de la gentica molecular. Pareca que cada laboratorio de vanguardia tenia su propia "sustancia activa", diferente de las halladas en los dems. Pero entonces lleg el primer revs, y el inters decay6. En Cambridge, nosotros (Waddington, Needham y el autor) estbamos estudiando el metabolismo respiratorio del organizador, comparndolo con otras partes de la gstrula. Como el azul de metileno se saba que era capaz de incrementar el ritmo respiratorio de muchas clulas, decidimos implantar pedazos de agar que contenan azul de metileno en gstrulas. As1 se obtuvieron inducciones neurales utilizando un inductor de origen no biolgico. Y lo que es mas, el rojo neutro, que no tenia efecto sobre el consumo de oxigeno, tambin era activo. Todas las sustancias biolgicas probadas eran ms o menos activas; pero como el ectoblasto (igual que el huevo no fecundado tratado con agentes partenogenticos) poda reaccionar de la misma forma (induccin neural) a una amplia gama de sustancias qumicas, fue imposible decidir cual era la correcta. Esto llevo a Waddington et al (1936) a sugerir que el factor de induccin neural estaba previamente presente en el ectoblasto, pero en una forma ligada. Cualquier agente que pudiera "desenmascarar" la sustancia inductora, provocara la transformacin del ectodermo en tejido neural. La "verdadera" sustancia activa seria liberada por las clulas al morirse, y la esperanza de aislarla e identificarla se hizo remota. El golpe final vino cuando Holtfreter (1947) demostr que un pequeo choque acido o alcalino, incapaz de matar las clulas, era suficiente para obtener un alto porcentaje de estructuras nerviosas en estas preparaciones. Pero las cosas nunca son tan malas como parecen. Las discusiones sobre los mecanismos de induccin ceflica (neural) y caudal (mesodrmica) volvieron a llevar el trabajo a un campo que desde las observaciones de Holtfreter pareca muy poco prometedor. Estas diferencias, son debidas a factores cualitativos o cuantitativos? Existen sustancias diferentes de induccin neural y mesodrmica? Hombres de la vala de Toivonen, Yamada y Tiedemann encabezaron la bsqueda de sustancias inductoras ceflicas y caudales especficas. Se utilizaron mtodos refinados de qumica proteica (ultracentrifugacin, electroforesis, cromatografa en columna) que llevaron a aislar de varios tejidos (hgado, medual sea, embrin de pollo) sustancias de induccin neural y mesodrmica activas y purificadas. El aislamiento de protenas inductoras especificas as una parte de la biologa molecular basada en las propiedades fsicas y qumicas de las macromolculas biolgicas. Pero la biologa molecular ha hecho mucho ms que dar nuevos mtodos para estudiar la naturaleza y sntesis de las macromolculas presentes en huevos y embriones. Ha producido una revolucin en nuestros esquemas te6ricos, fruto del tremendo desarrollo de la gentica molecular. Los bilogos moleculares, despus de haber resuelto los enigmas de la herencia, estn entrando en el campo de la embriologa y esperan resolver los problemas de la diferenciacin celular. La irrupcin masiva de eminentes bilogos en este campo sin duda dar lugar a progresos espectaculares. Este nuevo rumbo puede verse en una parcela que ha sido el principal campo de batalla de los bilogos moleculares: el control de la sntesis de protenas especificas por los cidos nucleicos. En el periodo "pre-Needhamiano", alrededor de 1930, no se conocan los cidos desoxirribonucleico (DNA).y ribonucleico (RNA). Se sabia sin embargo, por la reaccin de Feulgen, que el "acido timonucleico" (nuestro DNA) estaba presente en los ncleos de todas las clulas, no mereciendo pues su nombre de acido nucleico "animal". Los cidos pentosa-nucleicos (RNA) se suponan cidos nucleicos "vegetales", a pesar de que uno de estos cidos ya haba sido aislado en el pncreas.

No haba mtodo fiable para la estimacin de cada uno de estos dos cidos, pues todava se crea que no podan coexistir en una misma clula, siendo uno especifico de las clulas animales y el otro especifico de las clulas vegetales. En el caso de los ovocitos, la presencia del acido timonucleico en los cromosomas an era muy discutida; y los enfrentamientos entre los defensores de la teora de la "migracin" y los de la teora de "sntesis de novo" eran intensos. Segn la primera, el ncleo del ovocito (vescula germinal) contendra una reserva de acido nucleico que durante la maduracin emigrara al citoplasma y para la segmentacin volvera al ncleo. Sus oponentes, por supuesto, negaban la existencia de tal reserva y afirmaban que el acido timonucleico se formaba de novo en el ncleo tras la fecundacin. El que los mtodos bioqumicos para la determinacin de cidos nucleicos, muy poco fiables en esta poca, indicaran que no haba cambios durante el desarrollo, no hada mas que confundir an mas la situacin. El contenido constante de cidos nucleicos durante el desarrollo era, por supuesto, el argumento fundamental en favor de la teora de la migracin; pero el que la reaccin de Feulgen fuera negativa en el ovocito y fuertemente positiva en los ncleos de la blstula y gstrula aparentemente demostraba la correccin de la segunda hiptesis. Como siempre, la situacin fue clarificada por el desarrollo de nuevas y mas especificas tcnicas (el mtodo de la difenilamina para la estimacin de DNA de Dische) y de nuevas hiptesis. En 1933, pudimos demostrar que el vulo no fecundado contenla solo trazas de DNA comparado con el alto contenido de DNA de la gstrula o de la neurula; con ello la teora de la sntesis neta de DNA durante el desarrollo se convirti6 en un hecho establecido. Simultneamente se demostr que los huevos contienen cantidades importantes de RNA; en consecuencia este no era en absoluto un acido nucleico vegetal, pues estaba presente en todas las clulas. Surga una nueva pregunta: Cual es la localizacin intracelular del RNA? En 1940, los estudios de Caspersson con microscopio UV y los trabajos del autor utilizando procedimientos simples de tincin (cornbinados con digestin de los cortes de tejido con ribonucleasa para asegurar la especificidad) trajeron la respuesta anhelada: el RNA es un constituyente ubicuo de todas las clulas; esta localizado en el nuclolo y en el citoplasma, y hay una estrecha correlacin entre el contenido en RNA de una determinada clula y su capacidad de sntesis proteica. En los huevos de los vertebrados (especialmente en los de los anfibios) el RNA esta distribuido a lo largo de un gradiente primario de polaridad (animal-vegetativo) ya presente en el ovocito y en el vulo no fecundado. En la gastrulacin, un nuevo gradiente, ms dinmico, resultante de la sntesis de nuevo RNA, se desarrolla desde el lado dorsal al ventral. Como resultado de su interaccin mutua, los gradientes de RNA dorsoventral y cefalocaudal se hacen mas aparentes en los estados finales de gstrula y tempranos de neurula. Estos gradientes son paralelos o idnticos a los gradientes morfogenticos de los embrilogos experimentales, y su desorganizacin por medios qumicos o fsicos esta directamente relacionada con la aparicin de anomalas en el desarrollo. Sin embargo, la controversia entre las teoras de migracin y de sntesis neta an no se ha extinguido. Se han desarrollado mtodos nuevos, an ms sensibles y especficos, para la estimacin del DNA, que han demostrado que el citoplasma de los vulos no fecundados contiene alguna forma de este acido nucleico. Al mismo tiempo, la autorradiografa ha demostrado que durante la segmentacin existe una sntesis neta de DNA a expensas de precursores simples, tales como la timidina y la uridina. Nuevamente las dos teoras

parecen correctas. Hoy en da se tiende a creer (aunque an no ha sido demostrado) que durante la ' segmentacin, parte del DNA proviene de la emigracin de la reserva citoplsmica, y parte de una sntesis neta a expensas de precursores simples de desoxirribosa y ribosa. El significado de los gradientes de RNA en los huevos de anfibios tambin va aclarndose poco a poco. La autorradiografa ha demostrado que la sntesis de RNA que lleva a la formacin del gradiente dorsoventral en el estado de gstrula comienza en el ncleo. Por otro lado, mediante la microscopia electrnica, se ha podido observar que el gradiente primario (de polaridad) es esencialmente un gradiente ribosmico. Combinando estos dos hallazgos podemos suponer que el gradiente de polaridad de los ribosomas inertes se activa aproximadamente durante la gastrulacin por unos RNAs mensajeros formados en el ncleo, segn un gradiente dorso-ventral. El resultado sera que la sin tesis proteica sera mas activa en la parte anterior (ceflica) del embrin que en la parte posterior (caudal); y disminuira progresivamente de la parte dorsal a la ventral. Ciertos experimentos realizados con inhibidores de la sntesis de RNA (actinomicina D) y de la sntesis proteica (puromicina) confirman estas deducciones. Realmente esto es un progreso; pero el problema de fondo, la morfognesis, sigue sin estar resuelto. La labor para el futuro inmediato es comprender como la produccin de RNAs mensajeros especficos (controlados por la activacin localizada de genes), que llevan a la sntesis de protenas especificas, finalmente conducen a la diferenciacin a tejido nervioso, corda o clulas musculares; y esto es tarea de la embriologa molecular. CAPITULO 2 COMO DIRIGEN LOS GENES LA SNTESIS DE LAS PROTENAS ESPECIFICAS Es imposible presentar aqu ms que una recopilacin de los puntos fundamentales de los grandes descubrirnientos hechos por los bilogos moleculares en los ltimos 30 aos. Este campo es tan amplio y se mueve tan deprisa, que solo pueden ser presentados los hechos bsicos necesarios para la comprensin de la embriologa molecular. Desde hace tiempo se sabe que las protenas y los cidos nucleicos son constituyentes de todas las clulas, independientemente de que sean de animales, plantas o bacterias. Los cidos nucleicos y las protenas son tambin los componentes fundamentales (y frecuentemente los nicos) de los virus. Estas partculas nucleoprotenas, si son introducidas en una clula viva pueden replicarse repetidas veces, conservando todas sus caractersticas genticas. As, si el virus Ax se introduce en una clula adecuada, se formaran muchas copias de la misma partcula viral Ax. Es decir, los virus, como las clulas y los organismos, tienen continuidad gentica, que es la caracterstica fundamental de la vida. La base molecular de la continuidad gentica asienta siempre, como veremos, en los cidos nucleicos. Por ello no se puede imaginar ninguna forma de vida, por muy primitiva que sea, sin cidos nucleicos. Sus funciones esenciales son la replicacin (una molcula de cido nucleico produce dos molculas idnticas del mismo acido) y el control de la sntesis proteica. Las protenas estn formadas por aminocidos (RCCHCOOH), ligados por enlaces peptidicos (NH00) NH2 dando lugar as a cadenas polipeptdicas. Dado que hay veinte aminocidos diferentes y que pueden ocupar cualquier posicin en la cadena polipeptdica, tericamente pueden existir un nmero prcticamente infinito de protenas.

El peso molecular de las protenas suele variar entre algunos miles a varios cientos de miles de daltons,(generalmente entre 10.000 y 500.000). Las protenas mas grandes estn frecuentemente formadas por la asociacin de un cierto nmero (generalmente 2 6 4) de subunidades menores, que pueden ser idnticas o diferentes. La secuencia de aminocidos en la cadena polipeptdica define la estructura primaria de la protena. Pero rpidamente la cadena polipeptdica se pliega y toma una estructura tridimensional, analizable por mtodos como la cristalografa de difraccin de rayos X. Nuestros actuales mtodos nos permiten establecer no solo la secuencia de los aminocidos de la cadena (estructura primaria), sino tambin la estructura espacial de una protena tan compleja como la hemoglobina (Figura 1). Esta molcula, que tiene un peso molecular de 68.000, .contiene cuatro cadenas polipeptdicas idnticas dos a dos (2 02). La sustitucin de un solo aminocido de una cadena polipeptdica por otro hace que la molcula de hemoglobina sea anormal y no cumpla correctamente sus funciones. Estas hemoglobinas anormales no son raras en el hombre, y son resultado de una mutacin que da lugar a una enfermedad congnita (un gen mutante da lugar a una protena anormal). Es de notar que las enzimas, catalizadores de las reacciones bioqumicas que ocurren en todas las clulas, son siempre protenas. Investigaciones recientes muestran que las enzimas frecuentemente estn formadas por subunidades diferentes, una de las cuales tiene funcin cataltica, mientras que la otra ejerce una actividad reguladora (controla en forma positiva o negativa la accin cataltica de la primera, actuando como el acelerador o el freno de un coche). Los cidos nucleicos son, a primera vista, molculas mucho ms sencillas. En lugar de veinte aminocidos, varan solo en funcin de cuatro bases nitrogenadas (dos purinas y dos pirimidinas). La unidad fundamental de los cidos nucleicos es el nucletido, formado por cido fosf6rico, un hidrato de carbono del tipo de las pentosas y una base nitrogenada. Hay dos tipos fundamentales de cidos nucleicos, que difieren en la naturaleza del hidrato de carbono empleado: el cido desoxirribonucleico (DNA), que contiene deoxirribosa (C5 H10 04); y el cido ribonucleico (RNA), contiene ribosa (C5 H10 O5). Los dos tipos de cidos nucleicos tienen tres bases en comn: las pricas adenina (A) y guanina (G), y la pirimdica citosina (C), pero difieren en la cuarta base pirimdica. El DNA contiene timina (T), mientras que el RNA contiene uracilo (U), aunque realmente la timina no es otra cosa que metiluracilo. Los cidos nucleicos, como las protenas, forman largas cadenas. Por supuesto, no son cadenas polipeptdicas, sino cadenas polinucleotidicas. La Figura 2 comparada una cadena polipeptdica a una cadena polinucleotidica. Durante muchos arios nadie pens que hubiera algn nexo entre los cidos nucleicos y las protenas. De hecho, incluso en solo estara presente en el ncleo de las clulas animales, y que tendra una funcin de regulacin del pH. El RNA se supona que solo exista en las clulas vegetales, y su funcin biolgica era desconocida. Una nueva era, la de la biologa molecular, comenz con la II Guerra Mundial, at hacerse tres importantes descubrimientos. 1. Los estudios citoquimicos de Feulgen, Caspersson y el autor de estas lineal mostraron que el DNA y el RNA son componentes constantes de todo tipo de clulas. El DNA esti. localizado fundamentalmente en el ncleo de la clula y en los cromosomas de las clulas en divisin, mientras que el RNA esta presente en el nucleolo y en el citoplasma. Adems, se observo una estrecha relacin entre el contenido en RNA de una clula y su

capacidad de sntesis proteica, lo que implicaba que el RNA deba tener una funcin prioritaria en esta sntesis. 2. Avery descubri el fenmeno de la transformacin bacteriana. Hallo que ciertas bacterias (neumococos), incapaces de formar una capsula protectora, podan crearla en cuanto se les administraba DNA extrado de bacterias que si posean tal capsula. Dado que la formacin o ausencia de capsula es una caracterstica gentica hereditaria, el material gentico tenia que ser el DNA. Es decir, los genes, que son las unidades cromosmicas de herencia, deban estar formados de DNA. 3. Los trabajos de Ephrussi, Beadle y Tatum mostraron que genes individuales controlan la sntesis de protenas particulares. Es la teora de "un gen-una enzima". Dado que el gen esta formado por DNA y que la enzima es una protena, la sntesis de la enzima (es decir, el ensamblaje de una cadena polipeptdica especfica) deba estar controlada por una secuencia definida de nucletidos de la macromolcula de DNA correspondiente. Como por otro lado sabamos que el RNA estaba muy directamente relacionado con la sntesis proteica, el "dogma central" de la biologa molecular era evidente: El DNA produce el RNA, y el RNA produce las protenas. La forma en que ocurre todo este proceso esta ms o menos establecida gracias a muchos experimentos realizados sobre todo en bacterias y bacterifagos (virus que infectan bacterias). Hoy sabemos que las molculas de DNA estn formadas por una hlice doble gigante (Watson y Crick) (Figura. 3), donde las bases adenina y timina (A:T) y guanina y citosina (G:C) estn ligadas por puentes de hidrogeno. Esta estructura, como veremos mas tarde, permite una fcil explicacin de la replicacin del DNA que precede a la divisin celular; y tambin explica la mutacin de genes, que no sera ms que la sustitucin de una base por otra, o cualquier otro tipo de irregularidad que interfiriera en el emparejamiento exacto de las bases. (1) La relacin A+ T/G+T vara de unas especies a otras, y puede incluso variar considerablemente en diferentes zonas de la molcula de DNA de un mismo cromosoma. Trabajos recientes han mostrado que en el DNA repetitivo existen ciertas secuencias repetidas muchas veces en tandem. Un ejemplo de niveles muy elevados de redundancia de una misma secuencia es el llamado "DNA satlite" del ratn, en que secuencias iguales o muy parecidas, ricas en A: T, se repiten hasta un milln de veces. Sin embargo, a veces las secuencias del DNA son (micas o existen muy pocas copias. Se supone, segn Crick ha sugerido recientemente, que las secuencias nicas son las encargadas de la sntesis de protenas especficas, mientras que las reiteradas tendran una funcin regulatoria y, de alguna manera, afectaran positiva o negativamente la actividad de las secuencias nicas. La Figura 4 muestra corno los dos tipos de DNAs, repetitivo y nico, podran alternarse en un cromosoma, segn Crick (1971). Tambin sabemos cmo es utilizada para la sntesis de las protenas especificas correspondientes, la informacin contenida en los genes "estructurales" o cistrones (es decir, aquellas secuencias nicas que dirigen la sntesis de una determinada protena, o mas precisamente, de una determinada cadena polipeptdica; por ejemplo, los genes de la hemoglobina). Esta informacin esta codificada en la molcula del DNA en forma de secuencias de tres nucletidos (tripletes o codones). La informacin contenida en la molcula del DNA es inicialmente transcrita a una molcula de RNA prcticamente idntica: el llamado RNA mensajero (mRNA), que es una copia fiel de una de las cadenas del DNA del gen. Esta copia es realizada en el ncleo celular por una enzima llamada RNA polimerasa, que sintetiza RNA solo en presencia de DNA, actuando este ultimo

como molde. El mRNA (posteriormente liberado al citoplasma, que es el Lugar fundamental de sntesis proteica) contiene en sus codones la misma informacin que el DNA. Por ejemplo, la secuencia AAA (tres adeninas seguidas) corresponde al aminocido lisina. La Figura 5 resume, de forma muy simplificada, el mecanismo de sntesis proteica (traduccin del cdigo gentico). La molcula especfica de mRNA se liga en el citoplasma a unas partculas previamente existentes, los ribosomas, que resultan de la combinacin de tres tipos de RNAs (RNAs ribosmicos o rRNAs) y un mplio nmero de protenas ribosmicas. Los RNAs ribosmicos y las protenas forman respectivamente alrededor del 50 % de la masa de los ribosomas, y se acostumbra a clasificar, tanto a los ribosomas como a los RNAs, por su constante de sedimentacin (S), medible por ultracentrifugacin. Los ribosomas citoplasmicos de animales y plantas tienen una constante de sedimentacin de 80 S, mientras que las bacterias tienen ribosomas ms pequeos (70 S). Los ribosomas citoplasmicos, que son los lugares ms importantes de sntesis proteica, contienen, en las clulas de animales y plantas, tres tipos de rRNAs diferentes, todos ellos ricos en GC: RNA de 28 S, con un peso molecular de aproximadamente 1,3 millones de daltons; RNA de 18 S, con un peso molecular menor, de alrededor de 700.000 daltons; y un RNA muy pequeo de 5 S. En circunstancias adecuadas, los ribosomas de 80 S se disocian en dos subunidades, con constantes de sedimentacin de 60 S y 40 S respectivamente. Es a la pequea subunidad de 40 S a la que se liga el mRNA, de forma tal que va agrupando a los ribosomas para dar Lugar a unos agregados ms grandes, llamados polisomas. Hay razones poderosas para pensar que esta asociacin y disociacin de subunidades es un paso esencial y necesario en la sntesis proteica normal. A la subunidad mayor, en cambio, es a la que se une el tercer tipo de RNA, el RNA de transferencia (t-RNA). Estas pequeas molculas de RNA (constante de sedimentacin 4 S, peso molecular 24.000) ahora son muy Bien conocidas, pues se ha podido llegar a saber la secuencia nucleotidica completa de muchos de ellos. Todos los tRNAs tienen forma de hoja de trbol (Figura 6), y en uno de los extremos tienen una secuencia especfica de tres nucletidos, el anticodon, que se une al correspondiente triplete del mRNA (el codon). Si por ejemplo el codon del mRNA es AAA (que, como vimos, codifica la lisina), el anticodon del tRNA seria UUU, (pues A y U en el RNA se emparejan de la misma forma en que lo hacen A y T en el DNA). Este tRNA en particular seria pues el lisil-tRNA, capaz de aceptar al aminocido lisina en el otro extremo de su molcula, que tiene una secuencia nucleotdica (CCA) igual en todos los tipos de tRNA. Existen enzimas en el citoplasma que tienen la capacidad de poner o guitar esta secuencia terminal CCA, determinando en consecuencia el que el tRNA este o no cargado con su correspondiente aminocido. Gracias a los ribosomas y a los tRNAs, el mensaje gentico, que fue transcrito del DNA al mRNA, puede ser ahora ledo y traducido a protena. Lo cierto es que la realidad resulta mucho ms compleja que este esquema. Por ejemplo, el cdigo gentico es un cdigo degenerado, es decir, hay varios codones para el mismo aminocido. En consecuencia, pueden existir varios tRNAs "iso-aceptores", con diferentes anticodones, pero que aceptaran el mismo aminocido. La proporcin y naturaleza de los diferentes tipos de tRNAs iso-aceptores pueden cambiar de una clula a otra, o incluso en una misma clula, cuando a consecuencia de un estimulo hormonal, por ejemplo, comienza a sintetizarse una nueva protena. Otro factor importante es que para

sintetizar una protena normal, "con sentido", la sntesis debe comenzar con el aminocido correcto y debe acabar una vez colocado el ultimo aminocido previsto en la cadena polipeptdica; es decir, deben existir "seales" precisas que controlen el comienzo y el final de la lectura del mensaje. La detencin del crecimiento de la cadena polipeptdica puede hacerse por la insercin de codones sin sentido, es decir, secuencias nucleotidicas que no corresponden a ningn aminocido; pero el comienzo es un problema mucho ms complejo. Adems de un codon de iniciacin al que se liga por su anticodon un tRNA especfico (forilmetionn-o metionn-tRNA), existen por lo menos tres factores de iniciacin de naturaleza proteica. Dichos factores (que tambin se precisan para la disociacin de los ribosomas a subunidades y para la elongacin de la cadena polipeptdica en crecimiento) pueden ser considerados como enzimas especializadas. Todas las clulas excepto las bacterias contienen mitocondrias, que juegan un papel fundamental en la produccin de energa y en la respiracin celular. Es importante notar que las mitocondrias se comportan en cierta medida como orgnulos celulares aut6nomos, que contienen su propio DNA,' diferente del DNA nuclear. El DNA mitocondrial se replica cuando se divide la mitocondria, y puede ser transcrito por una RNA-polimerasa mitocondrial a todo tipo de RNAs. La mitocondria tambin posee sus propios ribosomas, an menores (55S) que los de las bacterias, y que son capaces de una sntesis proteica independiente; estos ribosomas probablemente estn especializados en la construccin de algunas de las protenas constituyentes de las membranas mitocondriales (protenas estructurales). Uno de los pilares fundamentales del estudio de la sntesis proteica, frecuentemente utilizado en embriologa molecular, es el use de inhibidores especficos de la transcripcin y de la traduccin. El inhibidor de la transcripcin mejor conocido es la actinomicina, que se une al DNA e impide la sntesis de cualquier tipo de RNA (mRNA, rRNA y tRNA), preferentemente del rRNA (que representa el 80% , o incluso mas, del total de RNA contenido en la clula). Mas recientemente se ha observado que la sntesis del RNA tambin puede ser bloqueada por la a -amanitina. Este veneno inhibe la actividad de una de las RNA-polimerasas, que suele localizarse en el ncleo y que juega un papel esencial en la sntesis del mRNA. Los inhibidores de la traduccin actan a nivel de los polisomas, es decir, en el citoplasma. Los ms importantes son la puromicina, que provoca la liberacin de cadenas polipepticlicas incompletas e inactivas; y la cicloheximida, que bloquea el movimiento de los ribosomas a lo largo de la cadena de mRNA, y en consecuencia detiene la "lectura" del mensaje gentico. La sntesis proteica mitocondrial apenas es afectada por estos inhibidores, pero es fuertemente inhibida por los antibiticos bacterianos cloranfenicol y tetraciclina. La RNA-polimerasa mitocondrial, a diferencia de la nuclear, no se ye afectada por la a amanitina, pero es bloqueada por el agente antibacteriano y antiviral rifampicina, que no tiene ningn efecto sobre las RNA-polimerasas nucleares. Como se ve, la utilizacin de los inhibidores adecuados permite discriminar entre la actividad sinttica de la mitocondria y la del resto de la clula. Claramente, las mitocondrias tienen mucho en coman con las bacterias, y frecuentemente se ha sugerido que seran bacterias que en curso de la evolucin se habran adaptado a la vida simbitica en clulas animales y vegetales. Es de notar, sin embargo, que las mitocondrias actuales dependen casi totalmente para su supervivencia y multiplicacin del resto de la clula, pues contienen tan poco DNA comparado con el ncleo, que su

informacin gentica para la sin tesis proteica se restringe a solo un pequeo nmero de protenas. De hecho, muchas de las enzimas respiratorias presentes en las mitocondrias son sintetizadas en los polisomas citoplasmicos bajo control de los genes nucleares. Ms importante que la forma de accin de los inhibidores especficos de la sntesis proteica es el difcil problema de los mecanismos de control de esta sntesis. Sabemos desde los trabajos de Jacob y Monod como, en las bacterias, la actividad de los genes es regulada por represores citoplasmicos. Una protena, el represor, se une con gran afinidad y especificidad al DNA de un gen operador. Cuando este gen se activa (es decir, cuando el DNA no esta bloqueado por el represor), toda una bateria de genes (el opern) comienza a funcionar, dando lugar a la sntesis de los mRNAs y enzimas correspondientes. Este esquema, vlido para las bacterias, es a todas luces insuficiente para explicar la regulacin de la actividad gentica en clulas u organismos mas complejos_ Por un lado, el ncleo de las bacterias es del tipo "procarionte", es decir, extremadamente sencillo. Esta formado por una cadena circular de DNA, el cromosoma bacteriano, que no esta rodeado por ninguna membrana [Figura 7 (a)] y que probablemente no esta asociado a protenas. Por el contrario, el ncleo de los Eucariontes [Figura 7 (b)] es mucho ms complejo. Esta rodeado por una envoltura o membrana nuclear; contiene nucleolos ricos en RNA; y el DNA, est asociado a muchos tipos diferentes de protenas, dando lugar a la cromatina, que corresponde a los cromosomas de las clulas en divisin, pero de una forma mas laxa e incondensada. Hay dos clases fundamentales de protenas cromosmicas: las histonas que son bsicas, y las protenas acdicas de la cromatina. Las histonas son unas pequeas protenas con un alto contenido en los aminocidos bsicos arginina y lisina; muy similares en todas las especies eucariontes y en todas las clulas de un mismo organismo (aunque algunas clulas, como por ejemplo los espermatozoos y las clulas rojas nucleadas de la sangre de las aves, contienen adems de los tipos clsicos, alguna forma especial de histona). Las histonas se unen con gran fuerza al DNA, reprimiendo la transcripcin, pues las molculas de RNA-polimerasa no pueden acoplarse al DNA y sintetizar el RNA si el lugar de anclaje esta bloqueado por la presencia de estas protenas. Pero dado el pequeo tamao y la inespecificidad de estas molculas, no se cree que sean capaces de ligarse a un segmento especfico (un gen o un cistrn) de la molcula de DNA, y se considera que son unos represores generales e inespecficos de la sntesis de RNA. Se supone que la especificidad requerida, que permitira activarse (es decir, ser transcrito a RNA) solo a un determinado gen viene dada por las protenas acdicas de la cromatina y, posiblemente, por un aun discutido "RNA cromosmico". No hay duda de que existen muchos tipos diferentes de protenas acdicas nucleares, y que algunas de ellas pueden actuar contrarrestando los efectos inhibitorios de las histonas, como desrepresores especficos de la actividad gentica. Pero como se puede ver, el problema del control de la actividad gentica en los Eucariontes (que es un problema de una extraordinaria importancia) est an lejos de ser resuelto. Lo que parece claro es que la activacin o inactivacin de un gen (de lo resultara la sntesis o la detencin de la sntesis de una determinada protena) es el resultado de sutiles interacciones entre el DNA, las histonas, las protenas acidicas (incluyendo la RNA-polimerasa) y, posiblemente, un RNA cromosmico desrepresor. Pero la sntesis proteica no es controlada solo a nivel de la transcripcin. Veremos ejemplos muy claros, en huevos, de controles post-transcripcionales, que pueden ocurrir a muchos niveles: en el propio n6cleo, donde las molculas de mRNA no deseadas pueden

ser destruidas por enzimas hidrolticas (las ribonucleasas); a nivel de la membrana nuclear, donde probablemente se opera una seleccin entre los mRNAs que funcionaran como mensajeros en el citoplasma y los dems, que sern retenidos y degradados en el n6cleo; y finalmente en los polisomas, donde pueden ocurrir todo tipo de mecanismos de control para modificar la traduccin de un determinado mensaje gentico. Tanto la conformacin de los ribosomas como la unin de las protenas a los mRNAs, la oferta de tRNAs, de enzimas activadoras para los varios tipos de aminocidos, de factores de iniciacin, etc., modificaran la cantidad y naturaleza de la sntesis proteica de una determinada clula. Dado que, como se vio en el prlogo, la sntesis de protenas especficas y la diferenciacin celular son dos fenmenos muy relacionados, es claro que cualquier progreso que se haga en el campo de la regulacin gentica de las clulas eucariontes, ser de gran importancia para la embriologa molecular. Pero lo que nosotros queremos saber es ms que eso. Cul es la causa de la aparicin de las tpicas estructuras morfolgicas, como la estriacin de las clulas del msculo y del coraz6n, la produccin de cilios y flagelos que pueden moverse y permiten a las larvas y a los espermatozoos el nadar, etc? . Esto, que puede fcilmente ser visto al microscopio, es la base de la diferenciacin celular. Parece a primera vista que estamos tratando con problemas tan tremendos que incluso los adelantos en el conocimiento de la sntesis proteica, de los mecanismos de control de la actividad gentica, etc., sern de poca utilidad para su solucin. Y sin embargo, hay buenas razones para pensar que la biologa molecular y la embriologa nos harn avanzar mucho en el camino de este, an lejano, fin. Tomemos el ejemplo de los cilios y los flagelos. Estas estructuras estn formadas por un pequeo nmero de protenas con importantes similitudes con las protenas contrctiles del msculo. Como la actomiosina, se contraen en presencia del cido adenosintrifosfrico (ATP), que se sintetiza en las mitocondrias durante la oxidacin celular. Las protenas de los cilios y flagelos (llamadas tubulinas) existen en forma de unidades relativamente simples, pero fcilmente sufren una polimerizacin lineal, es decir, se unen unas a otras para formar unos largos y complicados filamentos, similares a los cilios o a los flagelos (Figura 8), que pueden contraerse en presencia del ATP. En otras palabras, es posible disecar qumicamente los elementos constituyentes de los cilios y despus reasociarlos, dando lugar a estructuras que son morfolgica, fisiolgica y bioqumicamente muy similares a los cilios iniciales. Este fenmeno de autoensamblaje de las unidades proteicas para formar estructuras mas complejas es, naturalmente, de gran importancia para los bilogos moleculares. An ms sorprendente es el caso de los virus, tales como los bacteriofagos, que contienen DNA (Figura 9), y los virus de mosaico del tabaco, que contienen RNA (Figura 10). El material con capacidad infectiva, es decir, el material gentico, es en ambos casos el cido nucleico. Cuando un bacteriofago, que tiene la compleja estructura que se muestra en la Figura 9, entra en contacto con una bacteria de la especie y cepa apropiada, el virus inyecta su DNA dentro de la bacteria. El caparazn proteico no participa en la infeccin, y solo juega un papel similar al de la jeringa utilizada para una inyeccin (Hershey). El DNA del fago inmediatamente comienza a sintetizar su mRNA complementario, y tras una serie de complejos procesos, empiezan a formarse DNA y protenas del fago. Despus, las protenas de la cabeza y la cola, como en un rompecabezas, se ensamblan y dan lugar al complejo caparazn tpico de estos fagos maduros. El caso del virus del mosaico del tabaco, ms sencillo, es mejor comprendido, pues esta formado por un RNA viral y un solo tipo de protenas. Si el RNA viral se introduce en las clulas de las hojas de tabaco, acta como mensajero e induce la sntesis de protenas virales, utilizando para

la formacin de polisomas los ribosomas de la clula husped. Una vez formada la protena viral, se produce el autoensamblaje del RNA y las molculas proteicas, dando lugar a partculas completas de virus (Figura 10). Los estudios sobre el autoensamblaje de las protenas y cidos nucleicos de los virus son de gran utilidad para la compresin de los muchos mas complejos procesos morfogenticos que ocurren durante el desarrollo embrionario, e infunden la esperanza de que, en un futuro no muy lejano, se podr sintetizar el RNA y las protenas constitutivas de los virus y obtener in vitro partculas del virus del mosaico del tabaco plenamente infecciosas. CAPITULO 3 COMO SE FORMAN LOS HUEVOS Y LOS EMBRIONES 1. Teoras sobre la diferenciacin ernbrionaria (a) Resumen de las observaciones descriptivas Sera por supuesto imposible reducir a pocas palabras todo lo que se sabe sobre el desarrollo embrionario de las muchas especies animales que han sido estudiadas desde el punto de vista descriptivo y experimental por multitud de embrilogos en los ltimos 200 aos. Pero no hay ms remedio que destacar lo ms brevemente posible los hallazgos ms importantes, para poder posteriormente comprender los mecanismos moleculares que actan durante el desarrollo embrionario. La reproduccin sexual est basada en la formacin de gametos (vulos y espermatozoos) que se funden en el momento de la fecundacin. Todas las clulas del adulto provienen de este huevo fecundado; y como el, contienen n cromosomas procedentes del 6vulo y n cromosomas procedentes del espermatozoo. Es decir, contienen dos series homlogas de cromosomas, por lo que se dice que son diploides (2n). Los gametos, en cambio, contienen solo n cromosomas, y se llaman haploides (n). La reduccin del nmero de cromosomas, que aparece al final de la gamatognesis, ocurre gracias a una forma especial de divisin celular llamada meiosis. Los resultados de las dos divisiones meiticas, que pueden, segn las especies, estar separadas por un periodo ms o menos largo de tiempo, se muestran en la Figura 11. Una clula madre, la espermatogonia o la oogonia, al madurar se convierte en espermatofita u oocito. En el macho, las dos divisiones meiticas conducen a la formacin de cuatro espermatozoos haploides; en la hembra, por el contrario, estas divisiones son desiguales y conducen a la formacin de solo una clula haploide (otide), mientras que los otros tres pequeos cuerpos polares pronto degeneran. La descripcin de la meiosis (Figura 12.) puede hallarse en cualquier libro de texto de citologa o embriologa. Esta caracterizada por una profase complicada, que puede subdividirse en varios periodos. Los cromosomas, que ya haban replicado su DNA, se hacen visibles en el periodo de leptoteno, y durante el periodo de zigoteno los cromosomas homlogos de origen paterno y materno se emparejan. En el periodo siguiente, llamado paquteno, los cromosomas sufren una intensa condensacin; y posteriormente, durante el periodo de diploteno, tienden a separarse, permaneciendo unidos solo por ciertos puntos llamados quiasmas. Finalmente, durante la diacinesis, los cromosomas nuevamente se hacen anchos y cortos. Esta larga profase es seguida por la primera divisin meitica, que es diferente de las divisiones mit6ticas: cada cromosoma no se divide en dos cromosomas hijos y, en consecuencia, las dos clulas resultantes son

haploides (n cromosomas) y no, como es habitual, diploides (2n cromosomas). La importancia de la profase meitica es que el emparejamiento de los cromosomas homlogos permite un intercambio de material gentico entre ellos ("crossing-over"), que hace posible la recombinacin gentica. La gametognesis y la fecundacin se discutirn con mayor detalle en los captulos siguientes. Debe notarse que el vulo y el espermatozoo son de tamaos muy diferentes. El vulo esta lleno de material de reserva (glucgeno, lpidos y viteloprotenas), que es responsable de su gigantesco tamao, mientras que los espermatozoos son muchos mas pequeos y se mueven activamente gracias a su flagelo. Como veremos, los espermatozoos estn adaptados, como los bacteriofagos, para la inyeccin de material gentico (DNA) intacto en el vulo. A pesar de su enorme diferencia de tamao, los vulos y los espermatozoos contienen la misma cantidad de DNA nuclear; aunque, dado que los vulos tienen muchas mas mitocondrias que los espermatozoos, su contenido en DNA citoplsmico es mucho mayor (1000 veces o incluso mas). El tamao de los vulos varia mucho segn las especies, pero por ejemplo, la enorme diferencia que hay entre el tamao del vulo de un avestruz y el del un erizo de mar (que apenas es visible a simple vista) es fundamentalmente debido a la cantidad de vitelo (material de reserva para el embrin) que tiene cada uno. No hay correlacin entre el tamao del vulo y la cantidad de material gentico que contiene su ncleo. Por ejemplo, el huevo de una rana y el huevo de un tritn tienen aproximadamente el mismo tamao, y sin embargo este ultimo tiene por lo menos 6 veces mas DNA nuclear que el primero. Es de notar que los oocitos y los vulos desarrollan prcticamente siempre una neta polaridad. As, hay un polo animal, ligero, y un polo vegetativo, pesado y cargado de materias de reserva. La fecundacin es inmediatamente seguida por la segmentacin, que es un periodo de rpida e intensa replicacin nuclear (divisiones mitticas). La divisin del citoplasma del huevo no suele ser perfectamente equitativa. El surco divisorio generalmente comienza en el polo animal y va avanzando hacia el vegetativo. Hay varios patrones de segmentacin, directamente relacionados con la cantidad y distribucin del vitelo (que constituye un obstculo para el progreso de los surcos). Por ejemplo, la segmentacin es solo parcial y limitada al polo animal en los huevos, muy cargados de vitelo, de los peces y aves; y es superficial en los huevos de los insectos, donde la materia de reserva esta acumulada en el centro del huevo. Las Figuras 13, 14 y 15 muestran la segmentacin en tres especies muy estudiadas por los embrilogos moleculares: la segmentacin desigual (espiral) del molusco Llyanassa, la segmentacin completa e igual del huevo de erizo de mar y de rana_ En estos ltimos, las clulas (Llamadas blastmeros) rodean a una cavidad central llamada blastocele. Una vez acabada la segmentacin, tras el estado de blstula, sobreviene la gastrulacin. Este es un periodo de grandes y complejos movimientos celulares, que no pueden ser descritos aqu. En los vertebrados, estos movimientos son mucho mas activos en la parte dorsal quo en la ventral. La Figura 16 describe de una manera esquemtica la gastrulacin de un huevo de anfibio. El resultado final de la gastrulacin es siempre el mismo en todos los animales tridrmicos: la gstrula queda formada por tres capas diferentes de clulas, el ectoblasto, el mesoblasto y el endoblasto, que rodean a una cavidad interna llamada arqunteron. El desarrollo subsiguiente es demasiado variable para describirlo aqu; lo veremos con ms detalle cuando discutamos algunos casos especiales, como el de los embriones de erizo de mar o anfibio. Como regla general, la formacin de organos (organognesis)

precede a la diferenciacin celular final. Por ejemplo, el sistema nervioso de un embrin de anfibio esta formado mucho antes de que aparezcan clulas nerviosas (neuronas) bien diferenciadas morfolgica, fisiolgica y bioqumicamente. (b) Algunos hechos experimentales importantes Aunque no es totalmente correcto, se acostumbra a dividir los huevos, segn sus reacciones a ciertas maniobras experimentales (como en la destruccin de una parte de las clulas por puncin, el transplante o explante de un grupo de clulas, la centrifugacin, etc.) en dos grupos: regulativo y mosaico. La regulacin embrionaria fue descubierta por Driesch mucho antes de que la palabra regulacin se pusiera de moda entre los bilogos moleculares. Driesch hallo que en el huevo de erizo de mar, la separacin de los dos primeros blastmeros conduce a la formacin de dos embriones normales (Figura 7.), mientras que si los blastometros no hubieran sido separados, cada uno de ellos habra dado lugar solo a medio embrin. Es decir, el blastmero aislado haba adquirido mayores potencialidades para el desarrollo que el normal. El hecho de que una parte del huevo pudiera dar lugar a un embrin completo result tan sorprendente para Driesch, que bas en este experimento toda una teora filosfica neovitalista. La regulacin sera debida a la intervencin de la entelequia, un principio que por definicin no puede ser estudiado experimentalmente. Hoy en da., los embrilogos estn tratando de comprender las bases moleculares de la regulacin sin tener que apelar a entelequias ni a cualquier otro tipo de fuerzas vitales (Figura 17). En los huevos mosaico, como los del molusco Ilyanassa (Figura 13.), la extirpacin de un pedazo de citoplasma provoca la formacin de un embrin anormal, en que falta alguna parte. Por ejemplo, la extirpacin del lbulo polar (que es puramente citoplsmico, y que nunca contiene al ncleo) en el "estado de trbol" conduce a la formacin de un organismo defectuoso, donde el pie, el ojo y el caparazn estn ausentes o son anormales. Sin embargo, un anlisis cuidadoso de los huevos en mosaico operados muestra que nunca hay una ausencia total de regulacin. Muchos experimentos realizados en huevos de anfibios han confirmado la importancia que, en los primeros estados del desarrollo, tiene el citoplasma para la morfognesis. Por ejemplo, la centrifugacin de huevos de rana recin fecundados conduce a la formacin de embriones microceflicos, que pueden no tener cerebro ni ojos; en cambio, si un huevo de rana fecundado se coloca "al revs" (con el polo animal hacia abajo) y es comprimido ligeramente, se forman dos embriones (gemelos siameses). Poco tiempo despus de la fecundacin, los huevos de rana muestran un rea pigmentada tpica, en forma de media luna (creciente gris), que indica cual va a ser el lado dorsal del embrin y del adulto (Figura 16). Si se destruye por puncin esta zona, se forman embriones muy anormales, prcticamente desprovistos de sistema nervioso. Recientemente, Curtis ha demostrado que la parte realmente importante de este rea es su cortex, es decir, la fina pelcula de material citoplsmico localizada inmediatamente debajo de la membrana celular. Si el cortex es extirpado o lesionado, el huevo nunca llegara al estado de gstrula, y quedar bloqueado en el estado de blstula. Si el cortex dorsal extirpado de un creciente gris es injertado en el lado ventral de otro huevo, este dar lugar a gemelos siameses.

Existe otro tipo de localizacin germinal citoplsmica de extraordinaria importancia biolgica, visible en los huevos de ciertas especies. Se trata de la formacin del plasma germinal, requerido para la gnesis de los rganos y clulas reproductoras (ovarios y testculos, y vulos y espermatozoos, respectivamente). En el polo vegetativo de los vulos no fecundados de anfibio se acumula un material, que contiene grandes grnulos compuestos de protenas y RNA, y que es morfolgicamente idntico al material localizado en el extremo posterior de los huevos de ciertos insectos, incluyendo Drosophila. Si este rea concreta del huevo es irradiada con UV (radiacin ultravioleta), el desarrollo es normal, pero los adultos son estriles. Se ha demostrado que, en el huevo de rana, la inyeccin del polo vegetativo (que es donde se localizan los grandes grnulos ribonucleoproteicos) en huevos irradiados con UV, permite la formacin de ovarios y testculos normales. La naturaleza de este material activo es desconocida, pero su gran sensibilidad a los UV sugiere a los cidos nucleicos como factores esenciales. In otros insectos (Cecidyomidae), los ncleos que durante la segmentacin alcanzan el plasma germinal son capaces de retener sus cromosomas normalmente en la mitosis, mientras que en las dems partes del mismo huevo puede observarse una gran perdida de cromosomas; es decir, solo los ncleos que darn lugar a los gametos retienen su dotacin cromosmica completa, en tanto que las clulas somticas tendrn una dotacin cromosmica reducida. Si el plasma germinal es alterado por centrifugacin, da lugar a islotes aislados en el huevo, y solo los ncleos que accidentalmente estn en estos islotes retendrn todos sus cromosomas. Un proceso similar, descubierto por Boveri a finales del siglo XIX, y que se llama fenmeno de disminucin crornatinica, ocurre en el nematodo Ascaris: slo las clulas de la lnea germinal retienen la dotacin cromosmica completa; en todas las dems clulas, parte de los cromosomas son eliminados al citoplasma, donde son rpidamente degradados. Recientes estudios bioqumicos han mostrado que la cromatina eliminada contiene tanto secuencias nicas como secuencias repetitivas de DNA. Aparentemente, pues, ciertos genes (correspondientes a las secuencias nicas) no son necesarios para las clulas somticas, pero deben ser retenidos en la lima germinal que producir los gametos_ En todos estos casos el comportamiento de los cromosomas esta controlado por la composicin qumica del citoplasma que rodea al ncleo. Las funciones respectivas del ncleo y el citoplasma se hacen mucho ms difciles de analizar en las faces siguientes del desarrollo. Muchos experimentos muestran claramente que el huevo no puede ser considerado como una esfera hornognea, y WIC las interacciones entre clulas tienen un papel esencial en la morfognesis. Hemos visto los resultados de los experimentos de Driesch en el huevo de erizo de mar en estado de dos clulas; pero si se repiten estos experimentos (secciones meridianas) en estados mas avanzados de la segmentacin, se observa que la regulacin an persiste de forma importante. Sin embargo, si la seccin es ecuatorial (Figura 18.), la mitad animal detiene su desarrollo en el estado de blstula o da lugar a una larva anmala, que no posee aparato digestivo, mientras que la mitad vegetativa, por el contrario, da lugar a un exceso tal de aparato digestivo, que no puede posteriormente invaginarse (exogastrulacin). Si se injertan micrmeros (que son las clulas mas vegetativas) a mitades animales aisladas, se induce la formacin del arqunteron y se obtiene una larva perfectamente normal (pluteus). Estos experimentos demuestran la existencia, en el huevo de erizo de mar, de gradientes morfogenticos opuestos (Horstadius). Ciertas sustancias requeridas para el desarrollo tienen una concentracin progresivamente menor desde el polo animal al vegetativo, mientras que otras muestran una distribucin opuesta, con una concentracin mxima en el Polo vegetativo.

La embriologa experimental ha demostrado claramente que tambin existen gradientes morfogenticos en los huevos de anfibio. El transplante de clulas tomadas de una determinada regin de un embrin a otras reas ha mostrado que las potencialidades de desarrollo tienden a decaer gradualmente de la cabeza a la cola y de la parte dorsal a la ventral; es decir, demuestra la existencia de unos gradientes dorsovental y cefalocaudal, que son factores de extrema importancia para el desarrollo de los embriones de los vertebrados. Otro factor fundamental en la embriologa de los vertebrados es la existencia de inducciones morfogenticos. El caso mejor conocido es el del "organizador" de Spemann, responsable de la formacin del sistema nervioso. El organizador es una regin de la gstrula, mas o menos coincidente con el creciente gris del huevo fecundado, que posteriormente se diferenciar a corda (borde dorsal de la joven gstrula). Cuando el organizador acta sobre el ectoblasto, este se transforma en sistema nervioso, mientras que si el ectoblasto no esta en contacto con el cordoblasto, solo dar lugar a ectodermo (piel) (Figura 19). Para la induccin neural se precisan dos factores: el estimulo inductor, proveniente del organizador (cordoblasto), y la "competencia" del ectoblasto reaccionante. Si el ectoblasto es tornado de una gstrula de edad avanzada, ya no tiene capacidad de reaccionar ante el estimulo inductor procedente del organizador, no es competente, y solo puede formar epidermis. Es de notar que durante el desarrollo de los vertebrados ocurren muchas inducciones, adems de la induccin neural "primaria". As, la formacin del cristalino, del ojo, de la glndula pancretica, etc., son debidas a procesos inductivos, con interacciones entre clulas provenientes de dos capas diferentes. Una de las tareas fundamentales de la embriologa molecular actual es la de arrojar alguna luz sobre las bases bioqumicas de los gradientes morfogenticos y de los fen6menos de induccin descubiertos por los embrilogos experimentales. (c) Teoras genticas sobre, la morfognesis El gran geneticista y embrilogo T.H. Morgan se dio cuenta de que la heterogeneidad citoplsmica, que tan importante era en los estados iniciales del desarrollo embrionario, poda tener un efecto sobre la actividad gentica. En 1934 sugiri que durante la segmentacin que sigue a la fecundacin del huevo, existiran ncleos idnticos distribuidos en un citoplasma heterogneo [Figura 20 (a), (b) ] ; y en consecuencia los genes se haran activos en ciertas partes del embri6n y en otras no [ Figura 20 (c)] . Bajo el impulso de los genes activos, el citoplasma seria cada vez mas diferente en las distintas partes del embrin, y esto llevara, por un mecanismo en cadena, a una activacin progresiva de mas genes y, finalmente, a la diferenciacin celular [Figura 20 (d)]. Gurdon ha demostrado recientemente que los ncleos de clulas diferenciadas presentes en el adulto aun contienen genes iguales a los del huevo fecundado, y que el proceso de diferenciacin que se produce durante el desarrollo no es irreversible. Este importante hecho se ha demostrado por experimentos de transferencia nuclear (Figura 21). La inyeccin de ncleos de renacuajo o adulto de sapo Xenopus en huevos no fecundados, despus de destruir los cromosomas del huevo por radiaciones UV, da lugar al desarrollo de larvas perfectamente normales en un pequeo porcentaje de los huevos inyectados (muchos de los ncleos injertados estn lesionados y son muy anormales despus de su transplante al citoplasma del huevo).

Dado que, como demuestra este experimento, un huevo que ha recibido un ncleo de un rgano adulto perfectamente diferenciado puede dar a su vez tejidos adultos de todos los tipos (sistema nervioso, msculo, rin, hgado), se deduce que el ncleo adulto ha retenido todas las potencialidades del ncleo de un huevo fecundado. Pero, por supuesto, los experimentos de Gurdon no demuestran que la actividad de los genes sea la misma en el adulto que en el huevo recin fecundado, y por ello la teora de Morgan an es una de las mejores que tenemos para explicar la morfognesis en los embriones. Hoy en da pensamos que durante la fase mas temprana de la segmentacin los genes nucleares estn reprimidos (es decir, son incapaces de sintetizar mRNAs y no pueden en consecuencia dirigir la sntesis de nuevas protenas). Mas tarde estos genes serian desreprimidos, en otras palabras, podran sintetizar molculas especficas de mRNA que permitiran al citoplasma la construccin de nuevas protenas. La morfognesis seria pues el resultado de la activacin diferencial de genes: los genes que dirigen la sntesis de una determinada protena (por ejemplo la hemoglobina) serian activos solo en una zona determinada y en cierto estado del desarrollo. Pero la causa que determina que los genes estn activados o bloqueados sigue siendo totalmente desconocida. Derivados de los conocidos trabajos de Jacob y Monod sobre regulacin gentica en las bacterias, Davidson y Britten por un lado, y Georgiev por otro, han propuesto teoras mucho mas complejas, excesivamente complicadas para ser presentadas aqu, y que tienen un grave inconveniente: son tan intrincadas que no pueden ser aun probadas experimentalmente. Las teoras que postulan que las molculas de DNA son modificadas qumicamente durante la diferenciacin embrionaria no tienen mucho xito, porque, como hemos visto, Gurdon ha demostrado que los ncleos adultos aun contienen en forma activa todos los genes necesarios para una morfognesis completa. Dichas teoras tampoco son capaces de explicar el hecho, hoy Bien establecido, de- que las clulas diferenciadas (por ejemplo las clulas de cartlago o msculo) pueden desdiferenciarse y volverse a diferenciar cuando las condiciones de cultivo son modificadas por cambios en el medio externo, teniendo en cuenta que es altamente improbable que estos pequeos cambios sean capaces de modificar qumicamente y de manera reversible las molculas de DNA. Ms tentadoras son las teoras que intentan explicar la morfognesis por una amplificacin selectiva de genes, segn las cuales los genes que dirigen la sntesis de protenas especficas (por ejemplo hemoglobina) sufriran una replicacin selectiva en las clulas que producen tales protenas. Si esto fuera as, habra ms copias de los genes de hemoglobina en las clulas que se diferenciaran a glbulos rojos de la sangre que en las dems clulas del organismo. An no sabemos si esto es o no verdad, pero las evidencias actuales indican que tal amplificacin no ocurre en el caso de los genes de la hemoglobina (5 a 6 copias). Esta teora, adems, implicara que ciertos genes podran replicarse independientemente del resto del genoma, lo cual se ha demostrado que efectivamente ocurre durante la ovognesis de los anfibios, como mas tarde veremos. Seria un error pensar que hay una relacin directa entre el contenido en DNA del ncleo de un huevo fecundado y la complejidad de su desarrollo embrionario. Por ejemplo, ya vimos como el ncleo de un tritn contiene aproximadamente 6 veces ms DNA que el ncleo de una rana, a pesar de que el desarrollo embrionario es muy similar en todos los anfibios, y de que no hay raz6n para pensar que el tritn contenga 6 veces ms protenas especficas que la rana. Adems, en el gusano Nematodo Ascaris y en muchos insectos,

durante la segmentacin, una parte importante del DNA es eliminado al citoplasma, donde es completamente degradado. Solo las clulas que formaran los vulos y espermatozoos conservan todo su DNA, mientras que las clulas somticas, que forman el resto del cuerpo, contienen una cantidad mucho menor de este cido. El significado de estos hechos an no es claro, pero es posible que una parte importante del DNA presente en el ncleo no tenga ninguna funcin gentica, y este relacionado solo con la regulacin de la actividad gentica o con el mantenimiento de la estructura de los cromosomas. Otras teoras hacen nfasis en el citoplasma, en lugar del ncleo, suponiendo la existencia en aquel de unas partculas especficas, autorreproductibles (los hipotticos plasmgenes). Se sabe que algunas organelas citoplsmicas, como por ejemplo los centriolos de la clula en divisin, los cilios y flagelos, las mitocondrias de todas las clulas eucariontes y los cloroplastos de las clulas de las plantas verdes, pueden autorreproducirse. Dado que tanto las mitocondrias como los cloroplastos contienen DNA y que en ellas puede producirse mutaciones citoplsmicas no-mendelianas, tericamente podran jugar un papel en la diferenciacin celular. Mas adelante veremos que algunas observaciones experimentales son compatibles con este punto de vista. Mas recientemente, Bell ha defendido que ciertas partculas que contendran DNA, los Isomas (donde I significa informacin) podran escapar del ncleo al citoplasma, donde se replicaran de forma autnoma. Si el DNA de estas partculas se transcribiera, adems de replicarse, la multiplicacin localizada de I-somas pudiera ser un factor importante en la diferenciacin celular. De hecho, los I-somas corresponden exactamente a la definicin de los hipotticos plasmagenes, pero su existencia es aun muy dudosa. Por otro lado, Curtis ha defendido la existencia de una herencia cortical. En experimentos con huevos de Xenopus, este autor ha mostrado que cuando el cortex del creciente gris es lesionado superficialmente, muchos huevos no se desarrollan. Algunos de ellos sin embargo llegan a adultos y pueden ser cruzados con sapos normales. El cruce entre un macho proveniente de un huevo cuyo creciente gris haba sido lesionado y una hembra normal da descendencia normal; pero el cruce recproco, entre una hembra procedente de un huevo cuyo creciente gris (cortex dorsal) haba sido lesionada y un macho normal da lugar a una alta proporcin de letales. La mayora de los embriones mueren en los primeros estados del desarrollo (blstula, gstrula terminal), como si su propio creciente gris hubiera sido lesionado. Esto querra decir que el cortex dorsal tiene su propia herencia, debida a la presencia de partculas citoplsmicas que se autorreplicarian. Pero recientes observaciones realizadas por nosotros ponen de entredicho la existencia de esta herencia cortical en el huevo do Xenopus. Hemos observado que una ligera lesin en el cortex del huevo induce muchas anormalidades mitticas, de las que resulta un aneuploidismo (es decir, los diferentes ncleos del embrin operado tienen diferente contenido de DNA). Dado que se sabe que el aneuploidismo es letal, los experimentos de Curtis podran ser explicados sin apelar a una hipot6tica herencia cortical: una ligera lesin del citoplasma puede producir aberraciones cromosmicas, que a su vez conduciran a la letalidad en la descendencia.

CAPITULO 4 GAMETOGENESIS Y MADURACIN: FORMACIN DE LOS VULOS Y ESPERMATOZOOS 1. Ovognesis La formacin del vulo en el ovario es un periodo de gran importancia en la ontognesis. Adems de producirse una acumulacin de materiales de reserva que sern progresivamente utilizados hasta el momento en que el embrin sea capaz de alimentarse por si mismo, en este periodo hay una intensa actividad gentica que conduce a la sntesis de muchas e importantes macromolculas (RNA, protenas) que sern utilizadas en estados posteriores del desarrollo. Aunque el oocito es desde luego un lugar donde se sintetizan grandes cantidades de glucgeno, lpidos y protenas a un ritmo progresivamente menor, hasta su detencin, cuando el vulo alcanza su volumen final, seria un error subestimar la ayuda que, para esta acumulacin de sustancias de reserva (sobre todo de protenas) la ofrecen las clulas que le rodean. Los oocitos de los anfibios, que constituirn el tema fundamental de este capitulo, estn rodeados por una capa de clulas foliculares. Como se muestra en la Figura 22, esta capa se halla en ntimo contacto con la superficie del oocito, que esta recubierta por unas microvellosidades cuya funcin es permitir el paso al interior del oocito de unas gotas liquidas ricas en protenas, por un proceso llamado pinocitosis (la clula "bebe" el fluido que le rodea). La mayora, si no todas las protenas del vitelo, provienen del hgado de la hembra. Bajo el estimulo de las hormonas sexuales femeninas, el hgado sintetiza un complejo de lpidos y fosfoprotenas, la vitelogenina, que pasa al torrente sanguneo y es tornado de el por el oocito mediante pinocitosis, proceso en el que estn involucrados varios grupos sulfhidrilo (SH). La porcin fosfoproteica (que ahora se llama fosvitina, y que es muy similar a la casena de la leche) se acumula en forma cristalina como plaquetas vitelinas (Figura 23). En los insectos, las protenas del vitelo tambin proceden de la sangre de la madre, pero el oocito esta rodeado por unas clulas nodrizas ricas en DNA y en RNA, y que en muchas especies, despus de producir los ribosomas precisos para el huevo, son finalmente englobadas en el citoplasma del oocito. En estos casos, el oocito tiene una sntesis proteica y de RNA prcticamente nula, y puede ser comparado a un parasito que depende de la sangre materna, de la actividad de la clula nodriza y finalmente del suicidio de esta ltima, para su crecimiento. En las pginas que siguen vamos a estudiar primero el citoplasma y despus el ncleo de un oocito de anfibio. (a) citoplasma Bajo las microvellosidades de la membrana plasmtica yacen muchos grnulos corticales (Figura 22), que probablemente no tienen funcin alguna antes de la fecundacin. Al estudiar la distribucin y sntesis del rRNA, lo primero que se observa es que hay muy pocos ribosomas en los oocitos jvenes antes del comienzo de la vitelogenesis. Estos oocitos, que miden alrededor de 0,1 mm. de dimetro, poseen en lugar de ribosomas unas estructuras filamentosas que contienen RNAs de bajo peso molecular, incapaces de sostener la sntesis proteica. Durante la vitelogenesis, el oocito crece de 0,1 mm. a 1 mm. o incluso ms, y hay un gran incremento del nmero de ribosomas, que se distribuyen

segn un gradiente decreciente del polo animal al vegetativo (gradiente de polaridad). Tambin hay acumulacin local de ribosomas alrededor del gran ncleo (vescula germinal) del oocito (Figura 24). Los factores responsables de la aparicin de este gradiente de polaridad animal-vegetativa son desconocidos. Se puede excluir la intervencin de factores simples del tipo de la gravedad o del aporte sanguneo; es posible que la polaridad este bajo control gentico La mayora de los ribosomas estn libres, y solo unos pocos estn unidos a las membranas dando lugar a un discreto retculo endoplsmico, o en forma de polisomas. Los recientes experimentos de Gurdon y sus colegas han mostrado la evidencia espectacular de que, en los oocitos de Xenopus, la mayora de los ribosomas no estn involucrados en la sntesis proteica. Microinyectando en los oocitos de este anfibio un mRNA especifico extrado de los glbulos rojos sanguneos inmaduros de un conejo, que se sabia que codificaba la hemoglobina, los autores obtenan la sntesis de una cantidad apreciable de hemoglobina de conejo, lo que demuestra, entre otras cocas, que la mayora de los ribosomas de los oocitos no estaban "programados"; es decir, podan aceptar y unirse a cualquier tipo de mRNA que se les presentase. Los oocitos muy jvenes, que aun tienen muy pocos ribosomas, sintetizan solo pequeas cantidades de rRNAs de illo peso molecular (28 S y 18 S), y parece que se dedican sobre iodo a la sntesis de tRNAs y de rRNA de 5 S, as como de sus inmediatos precursores. Mas adelante, durante la vitelogenesis, el oocito se concentra en la sntesis de los grandes RNAs de 28 S y 18 S; y dado que el rRNA de 5 S ya ha sido sintetizado, esto permite la acumulacin de una enorme cantidad de ribosomas, mucho mayor de la necesaria para la sntesis de las protenas del oocito. Tambin se ha observado que durante la vitelogenesis se sintetizan cantidades apreciables de mRNA (3 a 5% del total de RNA). Analicemos ahora la sntesis proteica. Como vimos, dicha sntesis es muy reducida antes de la vitelogenesis. Durante esta fase, la sntesis proteica decrece en intensidad a lo largo del gradiente animal-vegetativo de distribucin de los ribosomas que ya ha sido descrito, y que se muestra en la Figura 20. Las plaquetas vitelinas (Figura 23) contienen los ya mencionados cristales de fosfoprotenas (fosvitina) rodeados por una membrana, as como cierto nmero de enzimas hidrolticas (fosfatasas, proteasas) capaces de digerir las fosfoprotenas del vitelo durante el desarrollo embrionario. Estas enzimas estn localizadas en la membrana que rodea a las plaquetas vitelinas, y presentan grandes similitudes con las enzimas halladas en los lisosomas, diminutas vacuolas digestivas intracelulares de todas las clulas. Sin embargo, no se pueden hallar lisosomas verdaderos en los oocitos de los anfibios, y es posible que las plaquetas vitelinas correspondan a lisosomas modificados. Se ha hallado DNA y RNA en el interior de estas plaquetas vitelinas; no se sabe nada sobre su funcin, pero es probable que, como las fosfoprotenas del vitelo, sean un material de reserva para ser utilizado posteriormente por el embrin. El DNA vitelino es muy similar al DNA nucleico, y es posible que se origine, como la fosvitina, en el hgado de la hembra, pues cuando el hgado esta en periodo de mxima sntesis de vitelogenina, muchos glbulos rojos sanguneos nucleados y clulas hepticas degeneran; su ncleo

para al torrente sanguneo, y su DNA probablemente sea tornado, mediante pinocitosis, por el oocito en crecimiento e incorporado a las plaquetas vitelinas, quizs formando un complejo con la fosfoprotena. Es importante notar que el oocito sintetiza muchos tipos de enzimas durante la oognesis, varias de ellas aparentemente intiles para el propio oocito, y que solo servirn en estados mucho ms tardos del desarrollo. Esto es especialmente chocante en el caso de una enzima relacionada con la sntesis del colgeno, protena que no es detectable en los huevos de anfibio antes del estado de gstrula o incluso de nurula. Sorprendentemente, la enzima esta presente en el oocito mucho antes de que se sintetice su sustrato. El oocito prev su futuro; construye grandes reservas de todos los tipos de RNAs, ribosomas, enzimas, sustancias alimenticias y todo lo necesario para sobrevivir a los avatares de la vida embrionaria en el difcil mundo del exterior del organismo materno. El huevo precisa de un importante aporte de energa para la sntesis de nuevas macromolculas y para la construccin de sus estructuras; y por ello no es sorprendente hallar en el un enorme nmero de mitocondrias, posiblemente muchas mas de las que precisa para la propia oogenesis. Estas mitocondrias contienen, adems de las enzimas respiratorias habituales, molculas de DNA circular, de alrededor de 5 pm de longitud, y de un peso molecular de 10 millones de daltons. El DNA mitocondrial sintetiza los rRNAs mitocondriales que forman parte de los ribosomas mitocondriales de 55 S y que, a su vez, utilizan unos tRNAs mitocondriales especficos para la sntesis proteica. Como ya vimos antes, la informacin presente en el DNA mitocondrial no permite la sntesis de un nmero muy amplio de protenas. Como veremos, los espermatozoos tambin poseen mitocondrias. Esto conduce a un problema gentico interesante: las nuevas mitocondrias formadas durante el desarrollo embrionario proceden de la replicacin de las organelas maternas (del vulo) o paternas (del espermatozoo)? Esta duda ha sido ya despejada mediante recientes experimentos en que se cruzaban dos especies diferentes, pero muy relacionadas, del sapo Xenopus (X. laevis y X miilleri). Las dos especies haban sido elegidas porque las propiedades de sus DNAs mitocondriales son tan diferentes que pueden ser fcilmente distinguidos por simples mediciones fsicas. Los experimentos han mostrado de manera concluyente que el DNA mitocondrial formado por el embri6n es del tipo materno, lo cual excluye la posibilidad de que el DNA mitocondrial del espermatozoo pueda tener una funcin gentica importante en el desarrollo embrionario. (b) El Ncleo ( Vescula Germinal) Los constituyentes fundamentales del gran ncleo del oocito son la envoltura o membrana nuclear, los cromosomas, los nucleolos y el jugo nuclear; y en este orden sern estudiados. (1) La Membrana Nuclear Como en todos los ncleos, esta formada por dos capas (capa interna y capa externa); pero suele ser mas gruesa que en la mayora de las clulas. Es posible aislar por diseccin

la vescula germinal de un oocito, y si se aplasta, se pueden ver fcilmente los restos de la membrana nuclear a microscopia ptica. Si se examinan al microscopio electrnico (Figura 26), queda uno sorprendido por la regularidad y el gran tamao de los poros nucleares. Un anlisis ms detallado muestra que estos poros en realidad son estructuras muy complicadas, y han sido llamadas complejos porosos del ncleo. Tienen una forma octogonal, estn reforzados por un sistema de filamentos muy finos y obturados por un granulo central que posiblemente contenga RNA. Los estudios sobre permeabilidad de la vescula germinal muestran que los poros de la membrana nuclear no son simples orificios que permitan el libre paso de grandes molculas del ncleo al citoplasma y viceversa. Experimentos en que se inyectaban sustancias inertes de un peso molecular conocido en el citoplasma de los oocitos, han mostrado que las molculas globulares de peso molecular mayor de 60.000 (daltons no pueden pasar del citoplasma al ncleo. Por microscopa electrnica se ha visto que si se inyecta ferritina (una molcula que tiene un dimetro de 60 a 70 A y un peso molecular del orden de 350.000 daltons) en el citoplasma de un oocito, las partculas se acumulan alrededor de los "poros" y permanecen bloqueadas en su centro. Estos experimentos muestran que el paso del ncleo al citoplasma de grandes macromolculas (por ejemplo, las partculas ribonucleoproteicas que sirven para transportar los rRNAs del ncleo al citoplasma, y que tienen un peso molecular de alrededor de un milln de daltons, o incluso ms) no puede ser explicado solamente por un mecanismo de permeabilidad. El complejo poroso del ncleo debe ser concebido como una estructura viviente, siempre en estado dinmico. Podra uno imaginar, por ejemplo, que ciertas enzimas hidrolticas (proteasas) digeriran localmente el complejo poroso, permitiendo el paso de grandes macromolculas; despus, el agujero podra ser reparado por los polisomas, que son muy abundantes alrededor de la membrana nuclear. Esto de momento no es mas que una hiptesis; pero concuerda bien con recientes experimentos en los cuales se observe) que al inyectar varios tipos de protenas (marcadas con iodo radiactivo) en el citoplasma de los oocitos de anfibios, las protenas bsicas de bajo peso molecular, incluyendo las histonas, que generalmente se hallan en el ncleo, no se limitan a cruzar la membrana nuclear, sino que son rpidamente acumuladas dentro del ncleo. Esta acumulacin no se observa cuando se inyecta una protena neutra, indiferente, como por ejemplo la ovoalbmina de huevo de gallina. Todos estos experimentos muestran claramente que la membrana nuclear desarrolla una considerable selectividad en su permeabilidad. La selectividad tambin afecta a los ines, y as se ha visto que el Na+ se concentra en la vescula germinal despus de ser inyectado en el citoplasma. 2) Cromosomas En los oocitos muy jvenes, que pueden hallarse en los pequeos sapos Xenopus recin acabada la metamorfosis, los cromosomas an estn en un estado muy temprano de la meiosis (paquiteno). En la cromatina pueden observarse dos partes claramente diferenciadas, ambas conteniendo DNA: un "casquete" formado por una materia bastante homognea, relacionada con la formacin de los nucleolos, como veremos cuando estudiemos estas organelas; y unos cromosomas, anchos, que en este estado estn estrechamente emparejados (Figura 27). Cuando el oocito, durante el periodo de vitelogenesis, empieza a crecer, los cromosomas se expanden de manera considerable y toman una forma plumosa caracterstica (1)

(Figura 28). Estn formados por una fila de grnulos ricos en DNA, los crommeros, de los que unas delgadas expansiones laterales, llamadas "loops", se proyectan al jugo nuclear. Los cromosomas "plumosos" estn en el estado de diploteno de la meiosis, y como se muestra en la Figura 28, se hallan localmente emparejados, mantenindose un cromosoma unido a su homlogo por unos puntos llamados quiasmas. Este aspecto "plumoso" es debido a la presencia de loops o asas laterales, fcilmente visibles en los oocitos de anfibio y que son de gran utilidad para los anlisis citogenticos. Puede ocurrir que un loop falte en uno de los lados del cromosoma y este presente en el otro; esto es debido a la falta de actividad de uno de los dos genes alelos, en condicin heterocigtica. Es de notar que muchos citlogos piensan que esta estructura plumosa esta universalmente presente en todos los cromosomas, y se exagera de una manera importante en el oocito en crecimiento de los anfibios. La Figura 29 muestra el esquema propuesto por Gall y Callan para explicar la estructura de los cromosomas plumosos. Segn este esquema, cada cromosoma esta compuesto de dos filamentos homlogos (cromtides), estrechamente emparejados. Cada cromtide estara formada por una cola fibra gigante (de varios centmetros de longitud) de DNA de doble cadena enrollada; los crommeros seran regiones donde la fibra de DNA estara repetidamente enrollada y condensada en grnulos visibles microscpicamente, mientras que los ejes de los loops seran la misma fibra de DNA, pero sin enrollar. El DNA presente en los loops estara siendo transcrito a RNA (probablemente mRNA) de una forma secuencial por la enzima RNA-polimerasa, que ira corriendo a lo largo del loop, comenzando en un extremo y terminando en otro. Los argumentos presentados en favor del modelo que se muestra en la Figura 29 son bastante fuertes: cuando el cromosoma se trata con la enzima desoxirrihonucleasa (DNasa), que es capaz de romper el DNA en Pequeas piezas, la estructura de todo el cromosoma (crommeros y loops) se colapsa y desaparece rpidamente. Adems, la autorradiografa (procedimiento fotogrfico que permite ver el material radioactivo microscpicamente) muestra que la sntesis de RNA realmente ocurre de manera secuencial de un extremo del loop al otro. Es de notar la similitud que existe entre los modelos en la Figura 4 (Crick) y 29 (Gall y Callan); y pudiera muy bien ser que los crommeros estuvieran formados por el DN A repetitivo, con una funcin regulatoria, y los loops por las secuencias nicas, con funcin gentica. Los cromosomas plumosos, que tienen 4 veces el contenido en DNA del espermatozoo haploide, no se replican durante los varios meses que dura la vitelognesis. Mtodos muy delicados utilizados en biologa molecular, sobre todos los mtodos de hibridacin molecular entre DNA y RNA marcado (que dan informacin sobre hasta que punto son hom6logas las secuencias de bases de estos dos cidos nucleicos) y la microscopia electrnica han llevado a la conclusin de que el mRNA sintetizado en los loops es de gran tamao, y en el caso del oocito de anfibio, contiene 4 a 5 veces ms secuencias nicas", no repetitivas, que una bacteria. Es decir, contiene 4 a 5 veces ms informacin gentica que el DNA bacteriano. Al final de toda la oogenesis, los cromosomas plumosos se condensan progresivamente y acaban situados juntos en el centro de la vescula germinal. Simultneamente, su actividad de sntesis de RNA decae.

(2) Nucleolos El nmero de nucleolos vara considerablemente entre los oocitos de las diferentes especies. Mientras que los oocitos de la mayora de los invertebrados contienen solamente un gran nucleolo, los oocitos de mayor tamao de los vertebrados tienen cientos de nucleolos de diferentes tamaos. Hay ms de 1000 grandes nucleolos en la vescula germinal del oocito de anfibio. La ultraestructura del nucleolo del oocito es del tipo clsico (Figura 30.). Cada uno tiene un centro fibrilar y un cortex granuloso. Sin embargo, los jvenes oocitos previtelognicos de Xenopus, que como vimos no sintetizan los grandes rRNAs de 28 S y 18 S, carecen de la parte granular y son exclusivamente fibrilares. La citoqumica muestra que la parte granular esta formada por partculas que contienen RNA, y que pudieran ser los precursores de los ribosomas citoplasmticos. Se ha visto que el gran nucleolo nico del oocito de estrella de mar, que puede ser aislado y analizado bioqumicamente, contiene alrededor de 7 % de un RNA que, como el rRNA, es rico en guanina (G) y citosina (C). Sin embargo el RNA nucleolar tiene un peso molecular (alrededor de 3 millones de daltons) mayor que los rRNAs. Como veremos, esta gran molcula es el precursor de los rRNAs de 28 S y 18 S de los ribosomas citoplasmticos. El resto del nucleolo esta formado por protenas, principalmente del tipo de las fosfoprotenas y las protenas bsicas, similares a las protenas ribosmicas. Es altamente probable que las protenas nucleolares sean enteramente de origen citoplasmtico, y entre ellas estn un nmero importante de enzimas relacionadas con la sntesis o destruccin de RNA. De especial importancia es una RNA-polimerasa muy activa, insensible a la amanitina, y que esta especializada en la sntesis de los RNAs nuclear y ribosmico. Esta enzima es inactiva en ausencia de un DNA que suele localizarse en et propio nucleolo, donde da lugar al llamado organizador nucleolar. El DNA del organizador nucleolar no puede observarse con los mtodos citoqumicos clsicos para la deteccin de DNA a no ser que se utilicen en condiciones especiales, que induzcan su condensacin. Miller ha conseguido aislar el organizador nucleolar de las vesculas germinales de los anfibios, que visto en microscopia ptica aparece como una estructura en forma de anillo. Utilizando la microscopa electrnica, Miller ha obtenido fotografas extraordinarias, que nos dan la imagen de lo que hoy se entiende por "un gen en plena accin" (Figura 31). El organizador nucleolar esta formado por una fibra de DNA que a intervalos regulares da lugar a cadenas en crecimiento de RNA. Las molculas de RNA-polimerasa pueden visualizarse en las microfotografas como pequeos puntos a lo largo de la molcula de DNA. Estas fotografas muestran que solo algunas partes del DNA circular estn siendo transcritas, dando lugar a cadenas polinucleotdicas de RNA nucleolar. Las otras regiones, que permanecen genticamente silentes y no son transcritas por la polimerasa, son llamadas espaciadores. Dado que el oocito de anfibio contiene ms de 1000 nucleolos, se deduce que deben existir muchas copias de los genes encargados de la sntesis del RNA nuclear; es decir, estn considerablemente amplificados. Pero dnde y cuando ocurre la amplificacin de estos genes encargados de codificar la sntesis de rRNA (o mas exactamente, la sntesis del precursor nucleolar del rRNA)? Se ha demostrado que la ampliacin de los genes de rRNA ocurre en los casquetes que aparecen en el estado de paquiteno de la oognesis, y que han sido representados en la

Figura 27. El DNA del casquete es replicado muchas veces durante la fase inicial de la oogenesis; pero no se transcribe a RNA hasta una fase mucho ms tarda, cuando comienza la vitolognesis y la sntesis de rRNA. Pardue y Gall han demostrado tajantemente, mediante un mtodo muy elegante de hibridacin molecular in situ, la veracidad de esta tesis, segn la cual el DNA que est en los nucleolos en forma de organizador nucleolar en realidad procede del DNA extracromosmico que inicialmente estaba en los casquetes. Si un corte como el de la Figura 27 es primero calentado para desnaturalizar el DNA (es decir, para separar las dos hebras de la doble hlice) y posteriormente tratado con rRNA radiactivo (28 S y 18 SI este se hibrida solo con el DNA del casquete; ello demuestra que el DNA extracromosmico del casquete y los rRNAs tienen muchas secuencias nucleotdicas en comn. En concordancia con esta conclusin, la microscopa electrnica muestra que los primeros nucleolos aparecen en el casquete. Cada nucleolo contiene parte del DNA que haba en el casquete, en forma del organizador nucleolar presente en cada uno de los cientos de nucleolos dispersos en la vescula germinal. Mtodos fsicos y bioqumicos han mostrado que el DNA del organizador nucleolar (que ya podemos llamar DNA ribosmico o, en abreviatura, rDNA) es diferente del DNA cromosmico, y su mayor contenido en GC le da una mayor densidad. Debido a la amplificacin de casi un milln de veces tie los genes de rRNA, el rDNA representa en el oocito de Xenopus alrededor de 2/3 del DNA total, mientras que el DNA cromosmico constituye solamente el tercio restante. La amplificacin de los genes de rRNA es de un milln de veces porque el rDNA esta ya amplificado mil veces en las clulas somticas ordinarias (hgado, glbulos rojos de la sangre), que tienen solamente dos nucleolos. Por supuesto, la ampliacin del rDNA es mucho menos importante (16 veces en Urechis) o incluso indetectable (estrella de mar) en los oocitos que contienen solo un nucleolo. Algunos trabajos importantes, realizados especialmente por Drown y Birnstiel, han dado una idea muy exacta de la distribucin respectiva del rDNA y del espaciador en el organizador nucleolar. Como se muestra en el Figura 32, los pesos moleculares del rDNA y del espaciador (que tiene un Contenido an mayor de G + C) son, respectivamente, 4,4 millones y 5 millones de daltons. Solo una pequea parte del espaciador (M.M. 600.000 daltons) es transcrita por la RNA-polimerasa; pero este fragmento transcrito es rpidamente degradado en el propio ncleo. 2. Maduracin del Oocito El oocito, una vez alcanzado su tamao final, puede considerarse como adulto y esta preparado para su maduracin. La rotura de la vescula germinal es seguida por la formacin de un huso mittico que emigra al polo animal, y en un periodo de tiempo mas o menos largo acontecen las dos divisiones meiticas. La primera reduce los cromosomas a un nmero haploide (n). La segunda, en cambio, es una mitosis del tipo habitual en lo que respecta a los cromosomas; pero la divisin del citoplasma, como se vi en la Figura 11, es extremadamente inequitativa, y en consecuencia se forman dos diminutos cuerpos polares que son rechazados al polo animal. Generalmente la maduracin no es un proceso espontaneo, y debe ser inducida por tratamiento hormonal. Este tratamiento no siempre conduce a una maduracin completa; en los anfibios, por ejemplo, la regla es que el oocito elimine el primer cuerpo polar y quede bloqueado en la metafase de la segunda divisin meitica; en el erizo de mar, por

el contrario, la maduracin es completa y se eliminan los dos cuerpos polares antes de la fecundacin. En todos los casos, la maduracin reactiva los procesos de sntesis, generalmente bastante deprimidos, del oocito que ha terminado su crecimiento; pero despus de un primer brote de actividad debido el tratamiento hormonal, el desarrollo vuelve a bloquearse, y el oocito queda inerte hasta su fecundacin. Se puede conseguir la maduracin de los oocitos adultos (que han terminado su crecimiento) de los anfibios administrando al medio hormonas pituitarias o progesterona. En los oocitos de la estrella de mar, la maduracin puede ser inducida por una base prica relativamente simple, la 1-metiladenina. En otros huevos marinos, un ligero cambio en el equilibrio inico del agua de mar (aumento de los iones de Ca+ + o de K ) Basta frecuentemente para inducir la maduracin. En las lneas que siguen vamos a concentrarnos en la maduracin de los de anfibio, que son los mejor estudiados desde el punto de vista molecular. (Para mas detalles, ver la excelente revisin que recientemente han realizado Smith y Ecker sobre este problema). Cuando la maduracin es inducida por hormonas pituitarias, estas actan sobre las clulas foliculares que rodean al oocito, que a su vez comienzan a producir progesterona o una hormona similar a la progesterona. Si la hormona utilizada es la propia progesterona, esta act directamente sobre la membrana celular del oocito, y en pocos minutos se induce la maduracin, aunque la hormona haya sido ya retirada. Si la hormona es inyectada en el interior del oocito, es completamente ineficaz. Esto tambin es cierto para la maduracin del oocito de estrella de mar: la 1-metiladenina actita en pocos minutos cuando se administra en solucin en agua de mar, y es inactiva si es microinyectada en el oocito. De estos experimentos se deduce que los ltimos estados de la maduracin (desde la rotura de la membrana nuclear en adelante) son desencadenados por un estimulo que acta sobre la membrana celular del oocito. Cuando la maduracin en el oocito de anfibio es inducida por hormonas pituitarias, puede ser completamente bloqueada por la administracin de actinomicina, En cambio, si la maduracin es inducida por progesterona, el veneno tiene un efecto paradjico: acelera la rotura de la, vescula germinal. Estos experimentos muestran que se precisa de la sntesis de RNA en la clula folicular para la produccin de la hormona similar a la progesterona, pero no se necesita ningn tipo de sntesis de RNA para obtener la maduracin cuando la propia progesterona es utilizada como estimulo directo del oocito. Por el contrario, la sntesis proteica es un requerimiento absoluto para la maduracin. Independientemente del tratamiento hormonal utilizado, no hay ningn signo de maduracin y la vescula germinal permanece intacta si los oocitos han sido previamente tratados con puromicina o cicloheximida. Incluso un tratamiento relativamente breve (5 horas) con cicloheximida es capaz de impedir totalmente la maduracin inducida por la progesterona. Por tanto, es claro que algn tipo de sntesis proteica resulta absolutamente indispensable para la maduracin. Veamos ahora los cambios morfolgicos que conducen a la rotura de la vescula germinal tras el tratamiento hormonal (Figura 33). El primer signo de que el oocito responde al tratamiento es la acumulacin de ribosomas, mitocondrias y pequeas plaquetas vitelinas en la porcin inferior (basal) de la vescula germinal. Poco tiempo despus, los cromosomas sufren una intensa condensacin y los nucleolos comienzan a desmoronarse. La membrana nuclear se rompe en su porcin basal y los ribosomas y las partculas de glucogeno invaden el jugo nuclear; los nucleolos desaparecen totalmente, a excepcin de sus organizadores nucleases, que se hacen visibles como pequeos grnulos ricos en

DNA. Entonces, a expensas de las protenas del jugo nuclear, se forma un huso que emigra hacia el cortex del oocito, donde, en pocas horas, se eliminar el primer cuerpo polar. Los organizadores nucleolares tambin emigran hacia el polo animal, pero lo hacen ms lentamente que los cromosomas porque no estn unidos a las fibras del huso. Progresivamente los organizadores nucleares van hacindose ms visibles por los mtodos de tincin especficos para el DNA (especialmente la reaccin de Feulgen). Mientras que los grnulos que contienen DNA procedentes de los organizadores son muy numerosos en los oocitos de anfibio; como podra esperarse, en los oocitos de estrella de mar no hay ms que uno. El que los organizadores nucleolares, invisibles en el oocito que ha terminado su crecimiento, se hagan tan evidentes durante la maduracin, incita a pensar en una posible sntesis de DNA a lo largo de este proceso. A favor de este punto de vista se pueden presentar varios argumentos: en el oocito de estrella de mar, la 1-metiladenina induce una pequea pero constante sntesis de DNA; en los anfibios tratados con progesterona tambin puede detectarse una pequea sntesis de DNA cromosmico. Adems, Gurdon ha demostrado que si se inyectan ncleos de tejidos adultos (cerebro, hgado), en los que ya no hay divisiones celulares, en el citoplasma de un oocito de anfibio en fase de maduracin, el DNA de los ncleos inyectados es replicado casi instantneamente. Este experimento funciona incluso cuando se inyecta DNA puro en un oocito en el momento de la rotura de la vescula germinal o en un vulo no fecundado. En estas condiciones, cualquier tipo de DNA es replicado. Por el contrario, si se inyectan ncleos adultos o DNA puro en el citoplasma o en la vescula germinal de un oocito que no ha sido tratado con hormonas, no puede observarse ningn tipo de replicacin. Estos experimentos demuestran que la maduracin induce la formacin o activacin de todo el aparato preciso para la sntesis de DNA. Adems, se ha observado que cuando se induce la maduracin por tratamiento hormonal, hay un considerable incremento de la actividad de varias enzimas relacionadas con la sntesis de DNA (incluyendo la esencial DNA-polimerasa). Dado que en los estados que siguen a la maduracin cualquier tipo de DNA inyectado en el oocito puede actuar de "patrn" para la DNA-polimerasa y ser inmediatamente replicado, no sera sorprendente que el rDNA del organizador nucleolar, que ha sido arrojado al citoplasma pudiera tambin replicarse. Pero ciertas evidencias experimentales hablan en contra de esta hiptesis, y es poco probable que este rDNA amplificado tenga ningn tipo de funcin fisiolgica o bioqumica despus de la maduracin. Se ha demostrado que a pesar de que no es rpidamente degradado por las enzimas intracelulares, en los estados finales de la maduracin no sigue replicndose en el citoplasma, como sera el caso de un virus. Es probable que la pequea sntesis de DNA que ocurre durante la maduracin tenga ms relacin con el aumento del nmero de mitocondrias que con ningn tipo de acontecimiento nuclear. Hemos visto antes que la actinomicina paradjicamente acelera la maduracin inducida por la progesterona. Este hallazgo sugiere que durante la maduracin normal se sintetizara o activara algn tipo de represor de la sntesis de RNA. Dicho represor, como la propia actinomicina, inducira la condensacin de los cromosomas y la rotura de los nucleolos. Recientes experiencias han dado ms peso a esta teora, y se ha visto que la maduracin inhibe la sntesis de RNA, especialmente de las molculas de alto peso molecular.

Por otro lado, la maduracin estimula la sntesis proteica. En las pocas horas que siguen al tratamiento con progesterona se sintetizan muchos nuevos tipos de protenas. Su naturaleza y funcin an son desconocidas: algunas de ellas estn probablemente relacionadas con la sntesis de DNA que, como hemos visto, se activaba durante la maduracin. Otras probablemente no tengan ningn papel en este estado, y adquirirn importancia en fases ulteriores del desarrollo. Se ha demostrado que ciertas protenas sintetizadas despus del tratamiento con progesterona son tomadas por el ncleo durante la segmentacin, y se sospecha, aunque sin la suficiente comprobacin experimental, que pudieran tener relacin con el control de la actividad gentica del ncleo en esta importante fase. El fenmeno morfolgico ms notable que acontece durante la maduracin es, por supuesto, la rotura de la vescula germinal y el derramamiento de sus componentes al citoplasma. Sin embargo, como muestran los preciosos experimentos de Ecker y Smith, la vescula germinal no tiene ninguna intervencin en muchos acontecimientos que ocurren durante la maduracin. Beker y Smith extirparon por microdiseccin las vesculas germinales de unos oocitos de anfibio y posteriormente aadieron progesterona a los oocitos enucleados. La sntesis de nuevas protenas y los cambios fisiolgicos que ocurrieron en los cortex durante la maduracin no podan ser distinguidos de los de los oocitos normales tratados con la misma hormona. Sin embargo, parece ser que la mezcla del jugo nuclear y el citoplasma es precisa para que se produzca la divisin celular. Los ncleos inyectados en el oocito durante la maduracin no solo son capaces de replicar su DNA, sino que adems pueden dividirse: y sin embargo esta divisin no ocurre cuando son inyectados en oocitos que han sido enucleados antes del tratamiento con la progesterona. La extirpacin de la vescula germinal en el oocito de anfibio tampoco impide otro importante fenmeno: la emigracin al polo vegetativo de unos grandes grnulos ribonucleoproteicos, requeridos para la formacin de las clulas de la "lnea terminal" (es decir, las que darn lugar a las gnadas: ovarios o testculos). Si el citoplasma de los oocitos en maduracin se inyecta a oocitos normales, se induce La maduracin de estos. Estos experimentos solo tienen xito cuando el citoplasma es tornado de un oocito que ha sido tratado con progesterona durante al menos 12 a 20 horas, que es el tiempo que tarde la sntesis proteica inducida por la hormona en alcanzar su mxima intensidad. Dado que, como vimos, tambin existe sntesis proteica en los oocitos enucleados tratados con progesterona, se intent averiguar si el citoplasma de dichos oocitos era capaz de inducir la maduracin de un oocito receptor normal. Al hacer estos experimentos se obtuvieron resultados positivos, lo que sugiere que entre las protenas sintetizadas en ausencia del ncleo se encuentran tambin uno o ms factores inductores de la maduracin. El citoplasma de los oocitos que han terminado su maduracin y estn bloqueados en la metafase de la segunda divisin mei6tica ya no es capaz de inducir maduracin y, por el contrario, tiene un efecto inhibidor sobre el desarrollo en fases ms tardas. Si el citoplasma de un oocito bloqueado al final de la maduracin se inyecta en uno de los blastmeros de un huevo en segmentacin las divisiones celulares de dicho blastmero se detienen, mientras que los dems siguen dividindose normalmente.

Como se ye, durante la maduracin inducida por hormonas ocurren muchos curiosos e importantes fenmenos: se construye la maquinaria precisa para la sntesis del DNA; se reprime la sntesis de RNA; se sintetizan muchas nuevas protenas; se forman sustancias que inducen la maduracin y que en consecuencia tienen un efecto positivo sobre el desarrollo; y al final de la maduracin se acumulan inhibidores de la divisin celular. Es de notar que este proceso no es igual en el sapo Xenopus que en la rana, que es el caso que hasta ahora hemos descrito. En Xenopus, la progesterona induce la maduracin incluso cuando es inyectada en el interior del oocito; y tras una estimulacin inicial, deprime intensamente la sntesis proteica. La transferencia de extractos de vulos maduros a oocitos receptores suele producir citolisis ms que maduracin, y ms por inhibicin de la sntesis proteica que por estmulo. Es, pues, peligroso generalizar prematuramente las observaciones realizadas sobre la maduracin de la rana a otras especies de anfibios. Especialmente sorprendente resulta el hecho de que, tanto en la rana como en el sapo, muchos de estos procesos no son afectados por la extirpacin de la vescula germinal antes de la administracin de la hormona. Claramente, la progesterona no acta en el oocito del anfibio estimulando la transcripcin de DNA e induciendo la sntesis de nuevos mRNAs, como lo hace en muchos otros casos. Los mecanismos de control de la maduracin tras tratamiento con progesterona deben pues actuar a nivel post--transcripcional. Se conocen algunos casos de control post-transcripcional en la induccin de la sntesis enzimtica por hormonas corticoesteroideas, en los que la actinomicina tiene una accin estimulante. Se piensa que en estos casos la hormona tendra una actuacin antagnica a una protena represora, que al combinarse con el mRNA especifico para la enzima, inhibira su traduccin. Un mecanismo similar probablemente ocurra en la maduracin inducida hormonalmente, con la diferencia de que la complejidad del problema es mucho mayor, pues en este caso no se trata de la sntesis de una sola enzima, sino de muchas protenas que ejercen efectos tanto positivos como negativos sobre el desarrollo. 3. Espermatognesis La razn por la que una clula sufre una divisin meitica en vez de mittica sigue siendo desconocida, a pesar de que la espermatognesis, por la sincronicidad que hay entre sus clulas, ofrece un material de estudio mucho ms favorable que la oogenesis. Uno de los factores que ayuda a mantener unidos a los cromosomas homlogos durante el emparejamiento es la existencia de complejos sinaptinmicos (Figura 34). Estas curiosas estructuras solo se encuentran en los quiasmas que unen las regiones homologas de los cromosomas emparejados en el momento del crossing-over. Los inhibidores de la sntesis proteica hacen desaparecer los complejos sinopatinmicos, y en consecuencia los cromosomas emparejados se separan, lo cual demuestra que estos complejos, formados por protenas y RNA, y que aparentemente no contienen nada de DNA, colaboran para mantener unidos a los cromosomas emparejados. Sin embargo, los complejos sinaptinmicos parecen demasiado largos para tener la especificidad necesaria para controlar el muy exacto intercambio de DNA que ocurre a nivel molecular durante el crossing-over, y que conduce a las recombinaciones genticas. Hasta el momento, todas las hip6tesis presentadas para explicar la recombinacin gentica durante la meiosis carecen de base experimental seria, y solo se ha llegado a establecer claramente un hecho, aunque no se sabe todava si tiene una significacin general: en las anteras de la azucena se ha hallado que despus del periodo de replicacin normal del DNA cromosmico, se

sintetiza un tipo especial de DNA. Este DNA de replicacin tarda, cuantitativamente de poca importancia y que esta ligado a protenas y lpidos, pudiera tener alguna funcin en el emparejamiento de los cromosomas meiticos y en la recombinacin gentica. Despus de las dos divisiones meiticas, las cuatro espermtides haploides se transforman en espermatozoos maduros (Figura 35) por un proceso llamado espermiognesis. Durante este proceso, la mayora del citoplasma degenera, el RNA citoplasmtico es rechazado por la espermtide y finalmente se degrada, y el ncleo va condensndose progresivamente. La figura 35 muestra un espermatozoo adulto y maduro. En la extremidad anterior se observa un grnulo especial, el acrosoma, que se origina a partir del complejo de Golgi de la espermtide. El acrosoma contiene un material granuloso, el grnulo acrosmico, cuyo papel en la fecundacin ser descrito en el prximo captulo. Adems, el acrosoma posee un cierto nmero de hidrolasas acidas: fosfatasa acida, catepsina (que es una enzima proteoltica), hialuronidasa (que ataca a las mucoprotenas), etc. El acrosoma puede ser considerado, por su contenido enzimtico, como un lisosoma especializado. Detrs del acrosoma esta el ncleo, que forma la mayor parte de la "cabeza" del espermatozoo. Contiene una dotacin haploide (n) de DNA, que corresponde a los genes paternos y que esta muy fuertemente ligada a unas protenas intensamente bsicas. Durante la espermiognesis, las histonas habituales son progresivamente remplazadas por un tipo especial de histonas "muy ricas en arginina" o incluso por protaminas (polipptidos con un elevado contenido en arginina). El resultado es que el complejo DNA-protenas bsicas se hace casi cristalino en el ncleo del espermatozoo, y el DNA queda completamente reprimido e inactivado. En el ncleo del espermatozoo no hay ningn nucleolo. Detrs del ncleo se encuentra la pieza intermedia, que contiene las mitocondrias. Estas organelas suelen estar bien desarrolladas, y a veces son muy numerosas. Cuando son un nmero pequeo (solo una o dos), son de gran tamao. Contienen todas las enzimas respiratorias y son capaces de llevar a cabo una fosforilizacin oxidativa extremadamente activa. Oxidan activamente tanto los sustratos endgenos (fosfolpidos) como los exgenos (fructosa). Tambin en la pieza intermedia se hallan dos centriolos, uno proximal y otro distal, que aunque presentan la misma complicada estructura al microscopio electrnico, tienen funciones diferentes. Como veremos ms adelante, el centriolo proximal es probablemente necesario para la fecundacin, mientras que el distal esta en la base del flagelo y probablemente controla sus movimientos. El flagelo, que frecuentemente esta rodeado por una vaina proteica en espiral, forma la cola del espermatozoo. Como todos los flagelos, esta formado por 9 filamentos externos y 2 centrales, de naturaleza qumica bastante bien conocida. El constituyente fundamental de estos filamentos es la tubulina, protena contrctil muy similar a las protenas contrctiles del msculo, actina y miosina. Como la actomiosina, la tubulina espermtica se contrae en presencia de ATP, y esta asociada a una enzima (llamada dinena) que rompe la molcula de ATP y libera energa. La protena del espermatozoo similar a la miosina se diferencia de esta inmunolgicamente, y adems esta ligada al GTP en lugar de al ATP. Los espermatozoos tambin contienen actina, muy similar, si no idntica, a la actina muscular, pues es capaz de ligarse a la miosina muscular. Como se puede ver, el espermatozoo es una clula altamente especializada. Como ha perdido sus ribosomas, es incapaz de sintetizar protenas, y dado que el ncleo esta totalmente condensado y reprimido, tampoco existe sntesis de RNA. El flagelo le da al

espermatozoo la movilidad que precisa, y para ello obtiene energa de las muy activas mitocondrias; mientras que el acrosoma, como veremos, ayuda al espermatozoo a alcanzar la superficie del vulo. Es sorprendente la analoga que existe entre los espermatozoos y los bacteriofagos (Figura 9). En ambos casos, se trata de mquinas altamente especializadas en la inyeccin de DNA, es decir, de material gentico, en una clula receptora. CAPITULO 5 FECUNDACIN: COMO DESPIERTA EL HUEVO DORMIDO 1. Generalidades La fecundacin es un acontecimiento de importancia esencial en la vida de todos los organismos de reproduccin sexual. No solo inicia el proceso de desarrollo embrionario, sino que adems tiene consecuencias genticas fundamentales: se restaura el estado diploide (2n) y se introducen los caracteres hereditarios paternos en el huevo fecundado (tambin llamado zigoto). Asimismo, en la mayora de las especies, el sexo del futuro adulto se determina en este momento. La Figura 36 resume los cambios morfolgicos que ocurren en la fecundacin. El vulo puede, segn las especies, estar en cualquier estado de la maduracin (oocito de primer orden con vescula germinal intacta, metafase de la primera divisin meitica, oocito de segundo orden que ya ha expulsado el primer cuerpo polar, metafase de la segunda divisin meitica, otide que ya ha eliminado los dos cuerpos polares). Si la maduracin an no ha terminado (o ni siquiera ha empezado), el contacto de la cabeza del espermatozoo con la membrana celular del vulo induce o termina este proceso. Como primer fen6meno visible, aparece una membrana de fecundacin, que rodea al huevo. La membrana se forma inicialmente en el punto de entrada del espermatozoo y progresa de all hacia el polo opuesto del huevo. Su crecimiento es rpido (algunos segundos) en los huevos pequeos, como por ejemplo en los huevos de erizo de mar, y mucho ms lento en los huevos grandes (una hora o ms en los huevos de rana). Entre la membrana y la superficie del huevo esta el espacio perivitelino, lleno de un fluido perivitelino. El hecho de que el huevo este ahora inmerso en un medio lquido le permite rotar bajo influencia de la gravedad, y el polo animal queda en la parte superior, mientras que le pesado polo vegetativo queda hacia abajo. Aproximadamente en estos momentos, los radios del ster comienzan a rodear la cabeza del espermatozoo, dando lugar al espermster. Despus este ster regresa, y el ncleo del espermatozoo, que se ha hinchado y se llama ahora proncleo masculino, se mueve hacia el ncleo del vulo (proncleo femenino). Los dos proncleo finalmente se fusionan (anfimixia) y se realiza la fecundacin. Aparecen dos steres en extremos opuestos del ncleo del zigoto y se produce una mitosis, que marca el comienzo del siguiente estado: la segmentacin. Esto es una rpida descripcin de la fecundacin, que en forma alguna es un proceso constante, y que muestra marcadas diferencias en las distintas especies animales. En las siguientes lineal, vamos a estudiar algunos detalles de este proceso, tomando como ejemplo el huevo de erizo de mar que ha sido el ms extensamente estudiado. El primer fenmeno que debe citarse es la reaccin acrosmica [Figura 37 (a), (b)]. El acromosoma del espermatozoo se abre cuando entra en contacto con la capa gelatinosa que rodea al vulo, y el grnulo acrosmico se convierte en un filamento recto, bastante

rgido, que penetra en la superficie del vulo. Esta reaccin acrosmica es inespecfica; adems de ser inducida por la capa gelatinosa, puede inducirse por agua de mar alcalina, contacto con vidrio, etc. La penetracin del ncleo del espermatozoo en el vulo no es debida a la retraccin del filamento acros6mico, sino a la fusin de las membranas de la vescula acrosmica y del vulo no fecundado [Figura 37. (c), (d)1. Una vez que las dos membranas se han fusionado, puede considerarse realizada la fecundacin, y el ncleo del espermatozoo se introducir en el huevo a travs del canal que queda entre las dos membranas fusionadas. El ncleo del espermatozoo an tiene su cromatina condensada y no esta rodeado por una membrana nuclear. Pero, tras algunos minutos, la cromatina del proncleo masculino comienza a descondensarse y pronto es rodeada por una membrana nuclear formada por el retculo endoplsmico (sistema de la membrana interna) del huevo. Hay alguna evidencia de que existe en la membrana del huevo una determinada protena o glucoprotena (es decir, protena asociada a un azcar) que acta como receptor especifico del espermatozoo, pues si se bloquean los restos de azucares de la membrana de un vulo no fecundado con concanavalina A, sustancia de origen vegetal que tiene gran afinidad por las glicoprotenas, la fecundacin es imposible. El crecimiento de la membrana de fecundacin, tambin llamado reaccin cortical o activacin del huevo, se acompaa de profundos cambios en la ultraestructura del cortex del huevo. Los microvilli que se vean en el oocito se retraen, y la superficie del huevo se hace perfectamente lisa. Los grnulos corticales se abren y vierten su contenido al medio externo (agua de mar en el caso del erizo de mar). Los grnulos corticales contienen una proteasa y unas glucoprotenas de carcter fuertemente cido(los llamados polisacridos cidos o mucopolisacridos, que contienen grupos SO3 H, muy cidos). Estas glucoprotenas acidas precipitan cuando entran en contacto con el agua de mar e inmediatamente se polimerizan. El resultado es la formacin de una membrana de fecundacin prcticamente cristalina. Inmediatamente por fuera de la membrana del huevo se extiende una delgada capa mucosa extracelular alrededor de la superficie del huevo: es la capa hialina, que se cree acta como barrera contra la polispermia, es decir, la penetracin de ms de un espermatozoo en el huevo. La polispermia es un fen6meno fisiolgico en los huevos grandes (por ejemplo, los de Urodelos), donde la reaccin cortical es lenta; pero incluso en este caso, solo un ncleo de espermatozoo se une al ncleo del vulo, y todos los dems ncleos finalmente degeneran. Existen varios agentes que inhiben la formacin de la membrana de fecundacin; pero de especial utilidad para el experimentador que desea trabajar con huevos "desnudos", sin membrana, son la tripsina (una enzima proteoltica) y el ditiothreitol (un reactivo que contiene grupos SH, capaces de romper los enlaces SS presentes en las protenas). Es necesario que el espermatozoo entre en contacto con la membrana del vulo para que se produzca la reaccin cortical. Si se inyecta un espermatozoo en un vulo de erizo de mar, tanto el vulo como el espermatozoo se mantienen inertes. Si se aade esperma al medio en que se encuentra el huevo con un espermatozoo ya inyectado en su interior, se produce una membrana de fecundacin normal. Es decir, un huevo que ha sido fecundado artificialmente por inyeccin de un espermatozoo puede ser refecundado, convirtindose, naturalmente, en disprmico. La refecundacin tambin puede obtenerse disolviendo la capa hialina del huevo fecundado por tratamiento con lcalis o con agua del mar sin calcio, y posteriormente volviendo a aadir esperma al medio. El origen del espermster todava no esta absolutamente claro. En contra de la teora clsica, parece ser que se forma a partir del centriolo proximal del espermatozoo.

Antiguos experimentos realizados por Lillie mostraron que si se centrifuga un huevo recin fecundado de gusano Nereis, la pieza intermedia y la cola del espermatozoo se rompen y no penetran en el huevo; y sin embargo se forma espermster. Pero nadie ha repetido estos experimentos ni ha estudiado con microscopa electrnica el origen del espermster en estos huevos. Es posible que el centrosoma proximal quede unido al ncleo del espermatozoo roto. Lo que si ha demostrado la microscopa electrnica es que las mitocondrias del espermatozoo se degradan rpidamente cuando penetran en el huevo. La frecuente aparicin de citsteres en los huevos puede arrojar alguna luz sobre la formacin del espermster. Los steres nunca se forman en el citoplasma de oocitos inmaduros, pero frecuentemente se pueden ver pequeos steres cuando, durante la maduracin, la membrana nuclear se rompe y el jugo, nuclear se mezcla con el citoplasma. Es fcil producir experimentalmente la aparicin de cientos de steres en el citoplasma de vulos no fecundados o de huevos recin fecundados tratndolos con agua pesada (oxido de deuterio, D2 0). Estos citsteres aparecen simultneamente, y no se dividen en las faces ulteriores. Mediante microscopia electrnica puede verse en el centro de cada ster un pequeo grnulo que probablemente sea un diminuto centriolo (precentriolo). Dado que los citsteres aparecen despus de tratamientos con D2 0, en condiciones en que esta suprimida todo tipo de sntesis proteica, de RNA, y de DNA, es probable que resulten del autoensamblaje de subunidades proteicas preexistentes que estaban dispersas en el citoplasma. Sabemos muy poco sobre los factores que controlan la anfimixia, es decir, la fusin de los dos proncleos. Antiguos experimentos realizados por A. Brachet mediante polispermia artificial en huevos de rana mostraron que la atraccin que existe entre dos proncleos no depende de sus "sexos". Si penetran numerosos espermatozoos (100 o mas) en un huevo que ha sido sometido a un tratamiento para retardar la reaccin cortical, pueden fusionarse cabezas de espermatozoos adyacentes en grupos de 2 6 3. Estos huevos intensamente polisprmicos nunca llegan a la segmentacin. Es probable que, en la fecundacin normal, el espermster colabore en la emigracin del proncleo masculino hacia el femenino. Respecto al hinchamiento del proncleo masculino, puede decirse que esta controlado por las condiciones prevalentes en el citoplasma. A. Brachet consigui6 hace tiempo fecundar un vulo de erizo de mar que no haba terminado aun su maduracin; y hallo que si los cromosomas del vulo estaban en un estado de condensacin, el proncleo masculino se mantenla condensado. Si por el contrario el ncleo del vulo ya se haba hinchado, el ncleo del espermatozoo rpidamente hacia lo mismo. Resultados similares han sido obtenidos mucho ms recientemente por Gurdon, que, como hemos visto, haba inyectado ncleos en oocitos de anfibio en diferentes estados de la maduracin. Est comprobado hoy en da que el hinchamiento nuclear no es simplemente resultado de la hidratacin del ncleo, sino que tambin es debido al paso de protenas citoplsmicas desde el citoplasma al ncleo. Vamos ahora a estudiar los cambios fsicos y qumicos que ocurren durante la fecundacin. De aqu en adelante, a no ser que se indique lo contrario, nos referiremos al huevo de erizo de mar.

2. El Problema de la Fertilizina (Gamonas) En los inicios de este siglo, Lillie observo que el agua de mar en la que haban sido dejados durante algn tiempo vulos no fecundados ("agua de huevos"), ejerce varios efectos sobre los espermatozoos: los aglutina por sus cabezas, aumenta su movilidad y los hace permanecer activos durante ms tiempo. Este agua contiene, pues, un factor (fertilizina) que aumenta la actividad de los espermatozoos. Para Lillie, la fertilizina atraera los espermatozoos, y tendra pues una actividad quimiotctica. Pero esto pronto demostr ser incorrecto. Trabajos posteriores demostraron que el espermatozoo tambin libera al agua de mar circundante sustancias con efectos biolgicos. Estas sustancias producidas por los gametos, y que pueden ser superficialmente comparadas con hormonal, fueron denominadas gamonas; los vulos produciran ginogamonas y los espermatozoos androgamonas. Se admite la existencia de dos ginogamonas, la ms importante de las cuales es la fertilizina de Lillie. Recientes trabajos han mostrado que la fertilizina es idntica a la capa gelatinosa protectora que rodea a los vulos no fecundados. Muchos de sus efectos son inespecficos, como por ejemplo la induccin de la reaccin acrosmica y el incremento de la motilidad y del consumo de oxigeno de los espermatozoos. Estos efectos pueden ser imitados por cualquier sustancia capaz de adherirse a los metales pesados (especialmente cobre) que estn presentes en el agua de mar y que tienen efectos adversos sobre los espermatozoos. El nico efecto especfico de la fertilizina es la aglutinacin de los espermatozoos, fenmeno que pudiera ayudar a prevenir la polispermia cuando los vulos estn en presencia de un exceso grande de espermatozoos. La sustancia activa presente en la capa gelatinosa es una glicoprotena acida que se une a un receptor presente en la cabeza del espermatozoo. Este receptor es la antifertilizina espermtica, una de las androgamonas. La reaccin entre fertilizina y antifertilizina espermtica se cree que es altamente especfica y en esencia similar a las reacciones inmunolgicas de tipo antgeno-anticuerpo. La importancia fisiolgica de la fertilizina es dudosa, puesto que los huevos de erizo de mar sin capa gelatinosa pueden an ser fecundados; y adems, en muchas especies animales no se puede detectar ningn tipo de fertilizinas. Sin embargo, ciertos estudios realizados sobre huevos de rana han demostrado que los vulos de estos animales no pueden ser fecundados si se elimina la capa gelatinosa por tratamiento con cianuro concentrado; y la fecundacin vuelve a hacerse posible si al huevo sin capa gelatinosa se le administra, con el esperma, un extracto de esta gelatina. La segunda ginogamona es la antifertilizina del vulo. Si a la fertilizina se le aaden restos de vulos que han sufrido citolisis, la ginogamona se hace inactiva. En los huevos de erizo de mar, el factor que neutraliza la actividad de la fertilizina esta asociado a grnulos pigmentados. Existen dos androgamonas. Una es la ya mencionada antifertilizina espermtica, el receptor especfico de la fertilizina, localizado en la superficie de la cabeza del espermatozoo. Es una protena acida de bajo peso molecular, que a altas concentraciones es capaz de aglutinar los vulos (pero no los espermatozoos).

La otra androgamona ha sido llamada lisina espermtica. Extractos de espermatozoos son capaces de disolver la capa gelatinosa que rodea y protege el vulo. Es probable que la lisina no sea otra coca que las enzimas hidrolticas presentes en el acrosoma, especialmente las hialuronidasas. 3. Cambios Fsicos Fundamentales durante la Fecundacin La viscosidad del huevo sufre un aumento nada mas acontecida la fecundacin, para despus volver a disminuir. Nuevamente aumenta cuando se forma el espermster, que es una estructura gelatinosa, de gran viscosidad. As mismo, la fecundacin va seguida de cambios muy evidentes en la permeabilidad, acompaados de rpidas e intensas modificaciones del potencial de membrana del huevo. Hay un importante aumento de la permeabilidad al agua y a las sales, y es particularmente notorio el gran aumento de permeabilidad al fosfato inorgnico, que se hace aproximadamente 40 veces mayor que en el vulo no fecundado. Esta mayor toma de fosfato es debida a la sntesis de un nuevo sistema enzimtico para el transporte de este compuesto en la propia superficie del huevo. A pesar de la gran toma de fosfato, la concentracin de ATP (adenosintrifosfato) en el huevo apenas vara. De especial importancia para los embrilogos moleculares es el hecho de que la permeabilidad a los precursores de la sntesis de protenas (aminocidos) y de cidos nucleicos (nuclesidos) es muy baja en lo vulos no fecundados. Esto no implica necesariamente que no haya sntesis proteica o de cidos nucleicos. En los huevos de anfibio, por ejemplo, la permeabilidad a estos precursores de la sntesis de macromolculas permanece excepcionalmente baja incluso despus de la fecundacin. Para estudiar la sntesis de cidos nucleicos o de protenas de estos animales es necesario inyectar el precursor marcado dentro del huevo, lo cual, dado su tamao (1 a 2 mm., de dimetro, frente a los 0,1 mm., del huevo de erizo de mar) es una tarea relativamente fcil. En los huevos de erizo de mar, la permeabilidad a los aminocidos y a los nuclesidos aumenta intensamente inmediatamente despus de la fecundacin. 4. Cambios Metablicos Generales (a) Consumo de Oxigeno Warburg descubri hace mas de 60 aos que la respiracin de los vulos no fecundados de erizo de mar aumenta considerablemente (3 a 4 veces) inmediatamente despus de la adicin de esperma. Sin embargo, este no es un fenmeno general presente en todos los huevos, como se muestra en la Figura 38. Si se compara la toma de oxigeno de los huevos fecundados y no fecundados de cierto nmero de animales, se halla que la respiracin puede aumentar (como en el erizo de mar), permanecer constante, o incluso disminuir tras la fecundacin. La Figura 38. muestra claramente que los huevos fecundados de todas las especies estudiadas en este trabajo (que tienen aproximadamente el mismo tamao y viven todas en el agua de mar) tienen prcticamente el mismo consumo de oxigeno, mientras que la respiracin de los vulos no fecundados de las mismas especies muestra grandes variaciones. La conclusin que puede sacarse de estos experimentos es que la fecundacin no aumenta necesariamente la respiracin del huevo; lo que hace es regular este proceso. La respiracin del vulo no fecundado, que es una clula inactiva, es frecuentemente anormal; y la fecundacin devuelve este parmetro a los valores normales.

Esta conclusin se comprob6 en los huevos de erizo de mar mediante delicados experimentos que hicieron posible medir la respiracin de un pequeo nmero de oocitos perfectamente sincrnicos, cuidadosamente seleccionados. Como se muestra en la Figura 39, el consumo de oxigeno del oocito (que an tiene su vescula germinal intacta) es alto; decae considerablemente en el vulo no fecundado (que ya ha eliminado sus dos cuerpos polares) y permanece bajo durante un tiempo considerable, hasta que la fecundacin lo devuelve a sus elevados niveles iniciales. Lo peculiar del huevo de erizo de mar no es tanto el gran aumento de la respiracin que sigue a la fecundacin como el muy bajo ritmo respiratorio del vulo no fecundado. A pesar de los mltiples esfuerzos realizados, an no conocemos la razn' del gran aumento de la respiracin que sufren los huevos de erizo de mar tras la fecundacin. No es debido, como demostr Runnstrom, a un cambio en la concentracin de citocromoxidasa, enzima clave de la cadena respiratoria. Es sin embargo posible que en el vulo no fecundado, la citocromoxidasa este bloqueada en estado de inhibicin (como si hubiera reaccionado con cianuro o con sulfuro de hidrogeno). En general, el consumo de oxigeno de las clulas est regulado por la concentracin interna de cido adenosindifosfrico (ADP), que es el fundamental aceptor de fosfato; y sin embargo la concentracin de ADP no vara de manera clara durante la fecundacin en el huevo de erizo de mar. Una posibilidad, si bien tan solo se trata de una hiptesis, es que los sustratos oxidables no estn presentes en suficiente cantidad en el vulo no fecundado. Esta demostrado que al menos una enzima es activada en los segundos que siguen a la fecundacin. Es la NAD-kinasa, responsable de la fosforilacin de la coenzima respiratoria NAD (nicotinamida-adenn-dinucletido), pasndola a la forma fosforilada, NADP. Esta sntesis o activacin de la NAD-kinasa es el cambio bioqumico ms rpido que hasta el momento ha sido detectado tras la fecundacin del vulo de erizo de mar . Cuando se aade esperma a los vulos de erizo de mar, se observar un gran incremento de la produccin de CO2, muy superior al atribuible a la oxidacin celular. Como Runnstrom inicialmente demostr, este aumento es debido a una produccin acida. Esta generalmente aceptado hoy da que este cido no tiene nada que ver con la respiracin. Como vimos, los mucopolisacridos cidos presentes en los grnulos corticales son liberados inmediatamente despus de que el espermatozoo entre en contacto con el vulo; un exceso de estas molculas acdicas entra en contacto con el agua de mar y, en consecuencia, se forma CO2 a partir de los bicarbonatos que contiene. Veamos en pocas palabras los cambios respiratorios que sufren los huevos de rana tras la fecundacin. El consumo de oxigeno no se ye afectado, pero hay, como en el erizo de mar, una superproduccin inicial de CO2. Este exceso de CO2 tiene un origen diferente que en el erizo de mar: cuando los vulos no fecundados estn acumulados en el tero de la rana hembra, el CO2 no puede escapar a travs de las paredes uterinas, tapizadas de moco. Por ello, el vulo no fecundado esta intoxicado en el momento de la puesta por un gran exceso de CO2. La relacin real CO2/O2 (cociente respiratorio: C.R.) cae tras la fecundacin desde el valor 1, caracterstico de la oxidacin de hidratos de carbono, que se encuentra en el vulo no fecundado, a valores tan bajos como 0,65. Este bajo C.R. sugiere que, en los huevos de rana, la oxidacin del sustrato es incompleta en la etapa que sigue inmediatamente a la fecundacin y durante la primera parte de la segmentacin.

(b) Metabolismo de Hidratos de Carbono Tanto los huevos de erizo de mar como los de rana contienen todas las enzimas necesarias para las vas clsicas del metabolismo de hidratos de carbono (glucolisis, ciclo del cido tricarboxlico y oxidacin directa de hexosa monofosfato). En los huevos de erizo de mar se ha sealado que el contenido en glucgeno desciende en los primeros 10 minutos que siguen a la fecundacin y posteriormente vuelve lentamente a sus valores iniciales. (c) Metabolismo Proteico La sntesis proteica se discutir mas adelante en una seccin especial. La fecundacin induce en el erizo de mar varios cambios en la solubilidad y en la carga elctrica de las protenas; el patrn electrofertico cambia y puede aislarse una nueva protena soluble en C1K. Esta protena, que se localiza en el cortex del huevo y que contiene grupos SH (sulfhidrilo), probablemente juegue un papel importante en los cambios corticales que siguen a la fecundacin y que conducen a la primera segmentacin. Tras la fecundacin la relacin sulfhidrilo-disulfuro (SH/ SS) sufre cambios en esta fraccin proteica soluble en C1K. Estos cambios probablemente es-ten relacionados con la contractilidad del cortex, pues la protena antes citada presenta todas las caractersticas de las protenas "contrctiles". En el prximo capitulo volveremos sobre este tema. En el huevo de erizo de mar se ha observado un descenso temporal del contenido total de protenas, particularmente de protenas ribosmicas, inmediatamente despus de la fecundacin. Probablemente esta proteolisis este relacionada con la activacin de varias proteasas distintas que ha sido sealada por algunos autores y que, como veremos, puede ser de gran importancia fisiolgica. (d) Metabolismo Lipdico Como se vio en el caso del glucgeno y las protenas, a la fecundacin del vulo de erizo de mar sigue la rotura de algunos constituyentes, en este caso lipdicos. El contenido en fosftidos desciende, mientras que aumenta el colesterol libre a expensas de los esteres de colesterol. Es de inters el hecho de que el esperma contiene una lecitinasa que transforma los fosftidos en lisolecitinas, sustancias muy relacionadas con la actividad de la membrana. Las lisolecitinas, que pueden producirse por efecto de la lecitinasa presente en el veneno de serpiente, son capaces de destruir la membrana celular de glbulos rojos sanguneos. La produccin y posterior inactivacin de una lisolecitina podra explicar los cambios corticales (particularmente la rotura de los grnulos corticales) que siguen inmediatamente a la inseminacin. 5. Sntesis de cidos Nucleicos y Protenas El sbito e intenso aumento de la sntesis de DNA y protenas que se produce en ausencia de sntesis apreciable de RNA hace del problema de la fecundacin del huevo de erizo de mar uno de los mas apasionantes de la embriologa molecular. Examinaremos primero la sntesis de DNA y despus, conjuntamente, la sntesis de RNA y protenas.

(a) Sntesis de DNA En los dos proncleos, la sntesis de DNA comienza pocos minutos despus de la inseminacin. En el erizo de mar se completa en aproximadamente 20 minutos, es decir, antes de la anfimixia. El contenido en DNA de cada uno de los proncleos se duplica, y en consecuencia el contenido en DNA del ncleo del zigoto es 4 veces el de una clula haploide (4C). En los huevos de anfibio, la microinyeccin de timidina marcada (el precursor clsicamente utilizado en el estudio de la sntesis de DNA) muestra que la replicacin de DNA comienza muy poco despus de la fecundacin, y acaba antes de la anfimixia. Como ya vimos, toda la maquinaria necesaria para la sntesis de DNA se prepara durante la maduracin, y concretamente la DNA-polimerasa se sintetiza en aquel periodo. Esta enzima esta presente en el citoplasma del vulo en forma activa, pues si se inyecta en esta clula un DNA extrao, el cido se replica. Sin embargo, el DNA presente en los cromosomas no se replica hasta algunos minutos despus de la fecundacin, y la sntesis de DNA no comienza en el proncleo masculino antes de que este se hinche. Aunque an no es mas que una hiptesis, es posible que la sntesis de DNA comience en los dos proncleos cuando la DNA-polimerasa citoplsmica (y quizs otras enzimas que regulan la sntesis de DNA) se haya trasladado al ncleo La sntesis de DNA se detiene en cuanto se completa la replicacin, es decir, cuando la cantidad de DNA es exactamente el doble de la inicial. El por qu es as, por que la enzima no continua fabricando mas DNA tras la duplicacin, sigue siendo uno de los grandes problemas no resueltos de la biologa molecular. (b) Sntesis de RNA y Protenas Los experimentos de Monroy fueron los primeros en dernostrar que, en los huevos de erizo de mar, la fecundacin estimula la sntesis proteica tan dramticamente como lo hace con el consumo de oxigeno (Figura 40.). Para poder burlar la barrera impermeable del vulo no fecundado, inyecto un aminocido marcado (metionina) en hembras de erizo de mar. El aminocido penetraba muy Bien en los oocitos ovricos maduros, pero no se incorporaba a las protenas del vulo no fecundado. Pocos minutos despus de aadir esperma, el aminocido marcado libre comenzaba a ser incorporado de forma muy activa a las protenas, demostrando la existencia de una intensa sntesis proteica. La primera explicacin que se propuso para esta sbita explosin de la sntesis proteica fue la siguiente: en el huevo fecundado, el proncleo producira inmediatamente nuevas molculas de mRNA; estas se combinaran con los ribosomas preexistentes, dando lugar a nuevos polisomas, que serian el lugar donde acontecera la sntesis proteica. En aparente concordancia con esta hip6tesis se hallo que los ribosomas aislados de los vulos no fecundados, en contraste con los extrados de los huevos fecundados, no eran capaces de sintetizar protenas in vitro. Si a los ribosomas de un vulo no fecundado se les aada un mRNA artificial, el acido poliuridlico (poli U, que contiene solo el codon UUU, codificador del aminocido fenilalanina) y fenilalanina radiactiva, se segua la sntesis in vitro de polifenilalanina. El poli U tena mucho menos efecto en los ribosomas de huevos fecundados, que ya estaban en forma de polisomas, ensamblados por mRNAs endgenos.

Si esta hiptesis fuera correcta, tan pronto como el vulo fuera fecundado habra una sbita sntesis de mRNAs; y sin embargo todos los experimentos en que se aadan precursores marcados de RNA (32 pi uridina marcada) a huevos fecundados de erizo de mar fracasaron en su intento de detectar cualquier tipo de sntesis nuclear de RNA, hasta estados posteriores del desarrollo (segmentacin con 2 0 4 blastmeros). Adems, la actinomicina, que bloquea la sntesis de RNA, no evita el aumento de la sntesis proteica y no detiene la fecundacin. Sin embargo, an era posible que estos resultados negativos fueran simplemente debidos a una Baja permeabilidad del huevo fecundado respecto a los precursores del RNA y a la actinomicina. Esta posibilidad ha sido descartada por experimentos realizados con fragmentos anucleados de huevos de erizo de mar (Figura 41.). Las potencialidades de desarrollo y sntesis de macromolculas de dichos fragmentos sern examinadas en otro captulo. Para nuestro propsito es suficiente decir que los vulos no fecundados de cierta especie de erizo de mar, Arbacia, pueden ser fcilmente divididos en dos mitades, una nucleada y otra anucleada, por centrifugacin en condiciones experimentales adecuadas. Ninguno de los dos fragmentos del vulo no fecundado es capaz de realizar una sntesis proteica mensurable, pero si estos fragmentos son activados tratndolos con agua de mar hipert6nica que induce la reaccin cortical con formacin de una membrana de fecundacin en ambos fragmentos de vulo, pero que no permite un ulterior desarrollo, tanto la mitad nucleada coma la anucleada se hacen capaces de realizar una sntesis proteica activa. De hecho, la incorporacin de aminocidos a protenas es mas intensa en la mitad anucleada que en la nucleada. El que la mitad anucleada, tras ser activada, es un lugar de verdadera sntesis proteica se demuestra por el hecho de que la puromicina, el clsico inhibidor de la sntesis proteica, inhibe la incorporacin de aminocidos. Adems, por mtodos fsicos se puede demostrar que tanto el fragmento anucleado una vez activado como el huevo fecundado normal sintetizan las mismas protenas (en particular, tubulina). Finalmente, se ha demostrado que los fragmentos anucleados activados contienen polisomas activamente comprometidos en la sntesis proteica, polisomas que no son detectables en los fragmentos anucleados que no han sido activados con agua de mar hipertnica . Estos experimentos descartan definitivamente la posibilidad de que la estimulacin de la sntesis proteica que sigue a la fecundacin sea debida a la produccin de mRNAs por parte de los proncleos, pues se puede obtener una estimulacin idntica en ausencia completa de ncleo. Esta situacin nos recuerda lo que se mencion6 en el capitulo anterior respecto a la maduracin de los vulos de anfibio; vimos que la progesterona inducia la sntesis de las mismas protenas, independientemente de que la vescula germinal estuviera presente o hubiera sido extirpada quirrgicamente. En ambos casos, la sntesis proteica tiene que estar necesariamente controlada a nivel de la traduccin, y no de la transcripcin. Quedan dos posibilidades para explicar el incremento de la sntesis proteica que se produce en el fragmento anucleado una vez activado y en el huevo fecundado de erizo de mar. Una de ellas es la existencia de molculas de mRNA encubiertas, que habran sido sintetizados de antemano por el oocito y acumuladas en el vulo no fecundado. Estos mRNAs seran incapaces de unirse a los ribosomas, dar lugar a polisomas y ser soporte de la sntesis proteica. La segunda posible explicacin es que los mRNAs sean sintetizados sobre un molde de DNA citoplsmico tras la activacin o la fecundacin. El RNA citoplsmico recin formado se ligara a los ribosomas preexistentes y dirigira la

sntesis proteica. Es de notar que estas dos posibilidades no tienen por que excluirse mutuamente. Examinemos primero la segunda posibilidad, que defiende la intervencin de un DNA citoplsmico en la sntesis proteica, tras la activacin o la fecundacin (Figura 41.). Es un hecho que las mitades nucleadas y anucleadas del vulo no fecundado de erizo de mar (que contiene aproximadamente 10 veces mas DNA que el espermatozoo), tienen aproximadamente el mismo contenido de DNA entre si, lo que demuestra que la mayor parte del DNA presente en los vulos de erizo de mar esta localizado en el citoplasma. El DNA citoplsmico esta formado por molculas circulares, con una estructura en doble hlice y una composicin de bases similar a la del DNA nuclear. La mayor parte, si no todo, esta localizado en las mitocondrias, a pesar de que an no se ha descartado por completo la posibilidad de que parte del DNA este presente en las plaquetas vitelinas. Los fragmentos anucleados de vulo de erizo de mar son capaces de sintetizar cantidades mensurables de RNA despus de ser activados; y no es imposible que este RNA sintetizado despus de ser tratados con agua de mar hipertnica sea capaz de dirigir algn tipo de sntesis proteica, pero parece improbable que pueda ser responsable de la gran explosin que ocurre tras la fecundacin. Esta sntesis proteica acontece en los polisomas, y an no conocemos ningn caso en el cual la sntesis proteica citoplsmica sea dirigida por un mRNA de origen mitocondrial; por el contrario, hemos visto antes que la mayora de las enzimas mitocondriales son sintetizadas por los polisomas citoplsmicos dirigidos por unos mRNAs transcritos de los genes nucleares. Podemos concluir del anlisis de esta situacin que en el huevo fecundado de erizo de mar probablemente exista una sntesis proteica dirigida por DNAs y RNAs citoplsmicos o mitocondriales, pero de importancia minoritaria; probablemente este limitada en el mejor de los casos a la sntesis de unas pocas protenas mitocondriales. La mayor parte de las protenas sintetizadas en la fecundacin deben tener otro origen, y la nica posibilidad es la intervencin de molculas encubiertas de RNA de origen materno. Cules son las evidencias en favor de la hiptesis del mRNA encubierto? Monroy mostr, y Spiegelman confirm6 mas tarde, que los vulos no fecundados de erizo de mar contienen grandes cantidades de RNA "molde". Esto quiere decir que si el RNA extrado de vulos no fecundados se aade a ribosomas extrados de bacterias o del hgado de un mamfero, dicho RNA es capaz de desarrollar una sntesis proteica en este sistema acelular, es decir, in vitro. Para ser base de la sntesis proteica tiene obligadamente que unirse a los ribosomas hepticos o bacterianos y dar Lugar a polisomas, y esta es naturalmente una de las propiedades fundamentales de los mRNAs. No existen grandes diferencias entre la actividad de molde de los RNAs extrados de los vulos no fecundados de erizo de mar y los extrados de las larvas (pluteus). Esto mismo es cierto si se compara la actividad de molde de los RNAs aislados de los vulos no fecundados de rana, y los aislados de los renacuajos. Ello significa que la cantidad de RNA con capacidad de molde presente en los vulos no fecundados es suficientemente alta como para ser base, al menos tericamente, de la intensa sntesis proteica que existe en las larvas pluteus y en los renacuajos. Recientemente, el laboratorio de Gross ha demostrado que este RNA molde es una mezcla de mRNAs verdaderos, y se pudo demostrar que los vulos no fecundados de erizo de mar (e incluso sus fragmentos anucleados) contienen, de forma encubierta, el mRNA especifico para la protena tubulina.

Los RNAs encubiertos o RNAs de molde presentes en los vulos probablemente se originen en el ncleo del oocito durante la oognesis. Ya vimos que aproximadamente el 3 % de los RNAs sintetizados en el estado plumoso por el oocito de anfibio son del tipo mRNA; es posible que una gran parte de los mRNAs sintetizados durante la oognesis sean acumulados en una forma inactiva para ser utilizados en estados mas tardos del desarrollo, concretamente a partir de la fecundacin. En los vulos no fecundados de erizo de mar, el RNA molde esta ligado a partculas de un tamao aun debatido (ribosomas o partculas mas pequeas), y se ha hallado que puede liberarse de ellas por un tratamiento suave con enzimas hidrolticas, lo cual sugiere que el mRNA materno esti "encubierto" por estar unido a protenas. Vale la pena recordar aqu que, como ya se menciono, en los primeros momentos que siguen a la fecundacin aparece una nueva actividad proteoltica en el huevo. Sin embargo, cuando la capacidad de molde de los RNAs extrados del vulo no fecundado de erizo de mar 'se prueba con los ribosomas obtenidos de los mismos vulos, no se observa ninguna actividad (en contraste con los resultados positivos que se obtienen con ribosomas bacterianos y hepticos). Esto muestra que algo debe fallar en la maquinaria de sntesis proteica del vulo no fecundado. Por alguna razn, sus ribosomas no estn funcionando adecuadamente. Una de las razones que explica el mal funcionamiento de los ribosomas del vulo es la ausencia de los factores proteicos precisos para el inicio de la sntesis proteica y en particular para ligar el mRNA a los ribosomas (ver Capitulo 3). Pero, como han mostrado Monroy y sus colegas, hay tambin un defecto en los propios ribosomas. Por ejemplo, los ribosomas inactivos de los vulos no fecundados se hacen activos y capaces de sntesis proteica si son tratados durante un breve espacio de tiempo con tripsina, lo que sugiere la posibilidad de que estn revestidos por una protena que les impida unirse a los mRNAs maternos. Esta observacin vuelve a hacernos pensar en la funcin fisiolgica que pudiera tener el aumento de actividad proteoltica que sigue a la fecundacin. Un hecho en favor de la teora que defiende que los ribosomas presentes en el vulo no fecundado tienen una conformacin anormal es su "pegajosidad". Cuando se colocan en condiciones en las que los ribosomas normales se disociaran en sus subunidades constituyentes, estos ribosomas no se disocian; parece como si sus dos subunidades estuvieran pegada una a otra por una especie de cemento, que probablemente no sea mas que una cubierta proteica eliminable por digestin ligera con tripsina. Finalmente, en el laboratorio de Monroy se ha demostrado que los ribosomas de los vulos no fecundados contienen un inhibidor de la sntesis proteica. Si estos ribosomas se lavan, se puede extraer de ellos una protena que inhibe particularmente la sntesis proteica de los ribosomas aislados de huevos fecundados; mientras que es imposible aislar por el mismo mtodo de lavado, ningn tipo de inhibidor a partir de los ribosomas extrados de los huevos fecundados. Todos estos experimentos muestran claramente que en los vulos no fecundados de erizo de mar operan muchos mecanismos de control negativos e inhibitorios reduciendo la sntesis proteica. La fecundacin o la activacin suprimen estos mecanismos de control negativos, de forma que la sntesis rpidamente aumenta. Sin embargo, la diferencia entre el vulo no fecundado y el huevo fecundado no es una cuestin de todo o nada. Los vulos no fecundados de erizo de mar ya contienen algunos polisomas, y su actividad de sntesis proteica es pequea, pero existe. De hecho, se ha hallado que un corto tratamiento con tripsina o la eliminacin del CO2 presente en los vulos no fecundados es suficiente para obtener un aumento en la formacin de polisomas, inmediatamente

seguido por una explosin de la sntesis proteica. Es decir, los mecanismos de control negativos que inhiben la sntesis proteica en los vulos de erizo de mar deben ser, a pesar de su complejidad, enormemente lbiles. Pueden estos hallazgos obtenidos en huevos de erizo de mar ser generalizados a otras clulas y huevos? Hechos muy similares se han comprobado en semillas de plantas en germinacin, donde los ribosomas son inactivos en las semillas secas y se hacen activos cuando se induce la germinacin ponindolas en condiciones de humedad adecuadas. Tambin se ha sealado que los ribosomas de ciertas clulas cancerosas humanas (las llamadas clulas HeLa) son inactivos durante la divisin celular, y que un tratamiento con tripsina los reactiva, exactamente igual que en el caso de los ribosomas del vulo no fecundado de erizo de mar. Cuando se examina lo que se sabe sobre la sntesis proteica de otros huevos aparte del de erizo de mar, se llega a la conclusin de que este es un caso extremo. Los vulos no fecundados de la estrella de mar, del molusco Mactra y del gusano Cerebratulus muestran sntesis proteica, pero esta se incrementa tras la fecundacin, aunque no de una forma tan dramtica como en el caso del erizo de mar. As mismo hemos visto (Figura 38.) que el huevo de erizo de mar es tambin un caso especial en lo que concierne al consumo de oxigeno. Uno podra preguntarse si la sntesis proteica no descendera tras la fecundacin en aquellos vulos que muestran una disminucin del consumo de oxigeno tras este proceso. Experimentos preliminares realizados en el gusano poliqueto Chaetpterus han mostrado que hay una detencin temporal de la sntesis proteica cuando los vulos son activado por la administracin de un exceso de C1K en el agua de mar. Este tratamiento, como la fecundacin, disminuye el consumo de oxigeno del huevo en casi el 50 7c, En consecuencia, es posible que la produccin de energa resultante de las oxidaciones y fosforilizaciones que acontecen en la mitocondria sea otro mecanismo de control de la sntesis proteica en el momento de la fecundacin. Los vulos de rana tambin merecen mencin. Su actividad de sntesis proteica disminuye progresivamente a medida que se mueven a lo largo del tracto genital (oviducto, tero) de la hembra. Con la fecundacin, la sntesis proteica vuelve a un nivel equivalente al del vulo ovrico una vez acabada la maduracin. Pero no es completamente seguro que este efecto sobre la sntesis proteica sea debido a la propia fecundacin. Como ya se mencion, pudiera atribuirse a la liberacin del exceso de CO2 que se haba acumulado cuando los vulos fueron almacenados en el tero materno. Si esto fuera as, los huevos de rana y de erizo de mar se comportaran de la misma forma frente a la "intoxicacin" por CO2, que actuara en ambos casos inhibiendo la sntesis proteica. En conclusin, parece que la importancia del incremento que sufren la sntesis proteica y la respiracin durante la fecundacin depende fundamentalmente del estado de represin que reina en el vulo no fecundado. El efecto fundamental de la fecundacin es eliminar las inhibiciones responsables de que el vulo no fecundado sea una clula "adormecida", casi "latente", en lo que se refiere a produccin de energa por parte de las mitocondrias y a sntesis proteica por parte de los polisomas. En otras palabras, la accin fundamental de la fecundacin sera la desrepresi6n, ms que la activacin; pero esta desrepresion no actita a nivel gentico, como es habitual, sino a nivel post-transcripcional.

6. Activacin Partenogentica Los viejos embrilogos experimentales de comienzos de siglo no eran tan sofisticados como los embrilogos moleculares de hoy en da; y no hacan ninguna distincin entre desrepresion y activacin, aunque como veremos, uno de ellos al menos se daba perfecta cuenta de que el vulo no fecundado era inactivo porque estaba "intoxicado" (en nuestra terminologa moderna, diramos reprimido). La estimulacin partenogentica del desarrollo obtenida tratando a los vulos no fecundados con agentes qumicos o fsicos era por lo tanto considerada como una activacin del vulo "dormido". Vamos a presentar brevemente los dos mtodos fundamentales de partenognesis (que fueron descubiertos a principios de siglo por Loeb y Bataillon) porque an conservan gran inters para el embrilogo molecular. Trabajando con vulos de erizo de mar, Loeb descubri, como ya hemos visto, que sufren una activacin cuando son tratados con agua de mar hipertnica. Se crea la membrana de fecundacin normalmente, pero sin embargo no aparece ms que un ster, el "monster" (naturalmente, de origen materno). En el mejor de los casos, los cromosomas podrn sufrir unos pocos ciclos de replicacin alrededor de este monster; pero dado que es nico, no se podr formar un aparato mittico tpico (para detalles, ver el prximo capitulo), con dos steres y un huso. La consecuencia es que el 6vulo no puede seguir dividindose, y no es capaz de continuar su desarrollo. Pero Loeb hallo que si los vulos activados eran sometidos tras unos pocos segundos a un segundo tratamiento, esta vez con cido butrico apareca un segundo ster y el vulo se desarrollaba partenogenticamente (es decir, sin intervencin del espermatozoo) hasta alcanzar el estado de larva pluteus. Bataillon, trabajando con vulos de rana, hallo que podan ser activados por puncin con una aguja limpia, dando lugar a una membrana de fecundacin y sufriendo posteriormente una serie de ciclos de divisin abortivos, con un solo ster. Sin embargo, si la aguja en vez de estar limpia estaba contaminada con clulas sanguneas, de forma que una clula nucleada fuera introducida en el 6vulo en el momento de la puncin, se formaba un segundo ster alrededor de la clula inyectada; las mitosis eran entonces normales y el desarrollo llegaba hasta el estado de renacuajo. La clula que haba sido introducida en el vulo no fecundado contena pues un "segundo factor" necesario para la formacin del segundo ster y para el futuro desarrollo. Dado que la introduccin de un glbulo rojo sanguneo anucleado de mamfero no tena efecto, Bataillon concluyo que el "segundo factor" deba estar ligado de alguna forma al ncleo celular, y que se requiere una "cariocatalisis" para el desarrollo partenogentico. La naturaleza qumica de este "segundo factor" de la partenognesis an no se conoce con exactitud. Recientes trabajos han mostrado que no esta localizado en el n6cleo sino en el citoplasma. De acuerdo con los hallazgos de Bataillon, no esta presente en las clulas rojas de la sangre de los mamferos, pero puede hallarse en los extractos citoplsmicos de prcticamente todas las clulas animales. Estos recientes experimentos han mostrado que el "segundo factor" puede precipitar de un preparado de clulas homogeneizadas por centrifugacin a 10.000 g. Es una protena con propiedades muy similares a las de los microtbulos que constituyen el aparato mittico, y que sern examinados mas a fondo en el prximo capitulo. Su actividad se pierde al ser tratada con colchicina y aumenta en presencia de agua pesada (D20). El segundo factor aparentemente cataliza el que las protenas que constituyen los microtbulos se organicen en fibras astrales. Esta es una propiedad del centriolo, y es muy posible que el segundo

factor sea sencillamente un centriolo que, al ser introducido en el vulo por puncin, permitira la construccin de un aparato mittico bipolar en esta clula activada. Es importante notar que la activacin partenogentica, incluso si no va seguida de un ulterior desarrollo, induce los mismos cambios metablicos que la fecundacin. En el vulo de erizo de mar, el tratamiento con agua de mar hipertnica, incluso en ausencia de un segundo tratamiento con cido butrico, es suficiente para incrementar tanto la respiracin como la sntesis proteica. Parece pues que el papel que juega el espermatozoo en los primeros sucesos metablicos es de muy poca importancia. Esta 1tima afirmacin ya no es cierta para el desarrollo mas tardo. Los embriones partenogenticos son, en regla general, haploides, y mueren durante el desarrollo. El sndrome haploide puede ser fcilmente demostrado en los huevos de rana fecundados por un esperma previamente irradiado durante poco tiempo (1 a 2 minutos) con una lmpara UV. Los espermatozoos siguen siendo perfectamente mviles y puede obtenerse el mismo porcentaje de fecundaciones que con esperma normal no irradiado; pero la cromatina del espermatozoo ha sido daada irreversiblemente. Los cromosomas paternos son eliminados al citoplasma, donde su DNA sufre una degradacin completa durante la primera segmentacin del huevo. Inicialmente el desarrollo es normal, pero la mayora de los huevos no consiguen gastrular adecuadamente. Los dems pueden alcanzar, en el mejor de los casos, un estado de renacuajo profundamente anormal. Desarrollan un intenso edema, tienen una cabeza reducida, branquias muy pequeas y son incapaces de digerir completamente su vitelo. Este sndrome haploide es siempre letal. Sin embargo, unos pocos huevos pueden librarse de la muerte y llegar a adultos. Su observacin citolgica muestra que son siempre diploides o poliploides, con 2n, 4n, 6n, u 8n cromosomas. Esta regulacin del nmero de cromosomas, inicialmente observada por Bataillon mediante su sistema de puncin, es debida a que, en algunos huevos, los cromosomas sufren uno o ms ciclos de replicacin monasteriales antes de que se forme un segundo ster alrededor de la clula nucleada que se ha inyectado. Las causas bioqumicas del sndrome haploide son an completamente desconocidas. Dado que hoy en da es fcil obtener un abundante nmero de haploides por fecundacin de vulos de rana por esperma irradiado con UV, sera fcil estudiar los cambios moleculares que ocurren en los embriones haploides. Lo nico que sabemos sobre ellos es que, como era de preveer, un ncleo haploide sintetiza la mitad de la cantidad de RNA que se produce en un ncleo diploide. El ncleo haploide tiene, naturalmente, la mitad de tamao que el diploide, y contiene solo un nucleolo en lugar de dos. Sin embargo, el nmero de clulas que se hallan en un embrin haploide es aproximadamente el doble de las que se hallan en uno diploide, de forma que los embriones haploides y diploides tienen aproximadamente el mismo tamao. 7. La embriologa molecular y teoras clsicas sobre la fecundacin Tanto Loeb como Bataillon construyeron teoras sobre la fecundacin basadas en sus propios trabajos, sobre huevos de erizo de mar y rana respectivamente. Loeb propuso que los dos factores precisos para inducir el desarrollo partenogentico en los vulos de erizo de mar (agua de mar hipertnica y acido kith-1m o viceversa) podran tener efectos opuestos. Inicialmente se desarrollara una incipiente citolisis, que conducira a la muerte del huevo a no ser que el segundo agente partenogentico restaurara las condiciones normales. Por analoga, el espermatozoo, en la fecundacin, inducira primero unos cambios lticos y posteriormente restaurara la situacin a su

normalidad. Hay alguna evidencia bioqumica que apoya la teora de Loeb, por lo menos en el caso del huevo de erizo de mar. Ya hemos mencionado la inicial rotura y posterior resntesis de macromolculas tales como el glucgeno, ciertas protenas, fosftidos y esteres de colesterol. La presencia en el espermatozoo de una lecitinasa, as como la sntesis o activacin de las proteasas inmediatamente despus de la fecundacin, pueden ser tomados como argumentos a favor de una incipiente citolisis. La rotura de los grnulos corticales, que se ha visto que contienen fosfatasas acidas y una proteasa, y que guardan, pues, cierto parecido con los lisosomas, puede tambin ser un signo de citolisis incipiente. Para Bataillon, el vulo es una clula intoxicada, y la eliminacin del fluido perivitelino conducira a una "purificacin" de la clula (reaction d'epuration). Aunque esta parte de su teora probablemente ya no sea cierta, pues algunos huevos muestran muy poca o ninguna reaccin cortical con la fecundacin, la embriologa molecular ha suministrado mltiples pruebas de que efectivamente el vulo no fecundado esta intoxicado (o reprimido) por los productos de su propio metabolismo. Esta intoxicacin es probablemente debida a la muy Baja permeabilidad del vulo no fecundado. Como vimos, los estudios realizados sobre la respiracin de los huevos de invertebrados muestran que el consumo de oxgeno es anormal en los vulos no fecundados y vuelve a la normalidad gracias a la fecundacin. Otros argumentos bioqumicos en favor de la teora de Bataillon son la inactividad de la citocromoxidasa, la conformacin anormal de los ribosomas, la presencia en estos de un inhibidor de la sntesis proteica, y la existencia de mRNAs inactivos, encubiertos, en el vulo no fecundado. El hecho de que el citoplasma de oocitos de rana que ya han acabado su maduracin bloquee la divisin celular cuando se inyecta en un huevo en segmentacin, tambin abunda en favor de la teora de Bataillon. Bataillon hizo nfasis en el papel del CO2 en la intoxicacin del vulo no fecundado. De hecho, pudo demostrar que si los huevos de rana eran tratados con un exceso de CO2, se activaban (ciclos cromosmicos monasteriales) en lugar de segmentarse. Si el CO2 se eliminaba, la segmentacin normal volva a ser posible. Algunos de los experimentos descritos en este capitulo han mostrado que el contenido en CO2 de los huevos puede tener un papel (que merece ulteriores estudios) en la regulacin de la sntesis proteica, tanto en los huevos de erizo de mar como en los de anfibios. Cuando hoy en da miramos las teoras propuestas hace tiempo por Loeb y Bataillon, llegamos a la conclusin de que estos dos grandes embrilogos mostraron una notable capacidad de observacin. Actualmente sus teoras, en lugar de contradecirse, se completan armoniosamente una a otra. CAPITULO 6 SEGMENTACIN DEL HUEVO: HISTORIA DE LA DIVISIN CELULAR 1. Generalidades En el captulo 3 ya mencionamos que los diferentes tipos de huevos sufren diferentes formas de segmentacin. Segn la cantidad y localizacin del vitelo, la segmentacin ser a) igual y total, b) desigual y total, c) parcial, o d) superficial. Estas diferencias son, en general debidas al hecho de que el vitelo constituye una barrera para el avance del surco divisorio que divide al huevo en sus blastmeros. Sin embargo, esta explicacin no

siempre es satisfactoria. No explica porque la segmentacin es desigual en los huevos de moluscos (ver Figura 13) y gusanos, en los que la distribucin del vitelo no muestra ninguna peculiaridad. No se conocen las causas de esta segmentacin desigual; deben de depender de algn rasgo desconocido de la arquitectura del huevo, dado que se pueden descartar propiedades particulares del huso o de los steres. Teniendo en cuenta que, como veremos, el cortex del huevo juega un papel esencial en la formacin del surco divisorio, se puede razonablemente suponer que la arquitectura del cortex es asimtrica en los huevos que sufren una segmentacin desigual; pero esta hiptesis an no ha sido probada. Sea cual sea el tipo de segmentacin, el periodo de desarrollo que sigue inmediatamente a la fecundacin se caracteriza por la velocidad y frecuencia de las divisiones celulares (mitosis). Las mitosis de los huevos no son esencialmente diferentes de las de otras clulas. Como se muestra en la Figura 42, todas las fases clsicas de las mitosis se reconocen fcilmente durante la segmentacin del huevo. Los cromosomas se hacen claramente visibles en la profase; forman una placa ecuatorial en medio del huso en la metafase; y se mueven hacia los dos polos del huso (donde, alrededor de los centriolos, pueden observarse grandes steres) durante la anafase. Los ncleos reaparecen en la telofase, cuando el surco divisorio separa al blastmetro en segmentacin en dos clulas hijas. Las mitosis se suceden rpidamente en el huevo en segmentacin, y esta elevada actividad mittica conduce a la fragmentacin del huevo en un nmero siempre creciente de blastmeros. Inicialmente se alcanza el estadlo de mrula, y por fin el de blstula, que marca el final del periodo de segmentacin. En muchos huevos, como por ejemplo los de erizo de mar y los de anfibio (Figura 14 y 15), los blastmeros exudan un fluido hacia el centro del huevo, y acaban rodeando una cavidad central llena de este fluido. Es el blastocele, que adems de agua y sales, contiene protenas y glucgeno segregados por las clulas vecinas. En los comienzos de la segmentacin, las mitosis son perfectamente sincrnicas. Mas adelante esta sincrona se pierde y las clulas se dividen mas rpidamente en las proximidades del polo animal (donde dan Lugar a micrmeros) que en el polo vegetativo, cargado de vitelo (donde dan Lugar a macrmeros. Ver Figura 15). Las causal de esta perdida de sincrona no son bien conocidas. La asincronia probablemente no sea debida a diferencias en la velocidad de replicacin del DNA en los ncleos individuales; y es casi seguro que esta bajo control de factores citoplsmicos, como sugiere el hecho de que la sincrona se pierde mas rpidamente de lo normal tras una ligera centrifugacin, que altera el gradiente vitelnico por sedimentacin de las plaquetas vitelinas en el polo vegetativo. Son dignas de mencin algunas particularidades de la segmentacin del huevo, que la diferencian de la divisin celular clsica. Lo primero que debe destacarse es que, en general, los ncleos de los huevos en segmentacin no tienen nucleolos. En vez de verdaderos nucleolos, con microscopia electrnica pueden verse unos cuerpos parecidos a ellos, que han sido denominados nucleolos de segmentacin (Figura 43). Su estructura es puramente fibrilar, y carecen de la clsica zona, externa granulosa, generalmente rica en partculas ribonucleoproteicas (ver Figura 30). De hecho, es imposible demostrar citoqumicamente la existencia de RNA en el huevo en segmentacin. As mismo, no se detecta incorporacin alguna de uridina marcada, precursor clsico de la sntesis de RNA. Estos fenmenos se atribuyen generalmente a que los ncleos en rpida divisin no tienen tiempo de elaborar verdaderos nucleolos. Sin embargo, esta explicacin no parece

muy plausible. Si se lentifican o detienen las mitosis de un huevo en segmentacin administrando inhibidores de la sntesis de DNA (hidroxiurea, fluorodesoxiuridina o desoxiadenosina, por ejemplo), el nmero y tamao de los nucleolos de segmentacin aumenta, pero siguen siendo nucleolos de segmentacin tpicos, y no se transforman en nucleolos verdaderos: no contienen RNA, no incorporan uridina marcada, y siguen siendo fibrilares y careciendo de una zona externa granulosa. Dado que los nucleolos de segmentacin son de naturaleza proteica, probablemente representen un acumulo de protenas sintetizadas en el citoplasma. Lo que se sabe a ciencia cierta es que los nucleolos de segmentacin pueden formarse en condiciones en que la sntesis de RNA y la produccin de energa estn prcticamente suprimidas. Debe uno esperar hasta el estado tardo de blstula, justo antes del comienzo de los movimientos de gastrulacin, para encontrar verdaderos nucleolos ricos en RNA, que aparecen en todas las clulas, tanto en el polo vegetativo como en el animal, aproximadamente en el mismo momento. Existe una notable excepcin a la regla de que los huevos en segmentacin carecen de verdaderos nucleolos; es el caso de los huevos de mamfero, en que muy poco tiempo despus de la fecundacin aparecen grandes nucleolos ricos en RNA. Veamos ahora en pocas palabras los cromosomas del huevo en segmentacin. Ms adelante analizaremos porque la replicacin cromosmica es mucho mas rpida en la segmentacin que en estados mas tardos del desarrollo, pero pueden ya citarse algunas peculiaridades de los cromosomas durante esta fase. Por ejemplo, normalmente los mtodos citoqumicos muestran la presencia de cantidades detectables de RNA en los cromosomas durante la metafase y la anafase, mientras que esto no ocurre en el huevo en segmentacin. Hay otra peculiaridad de los cromosomas de los huevos de anfibio en segmentacin digna de ser mencionada. El desarrollo de la sntesis cromos6mica de. DNA puede ser estudiado administrando a la clula el precursor especfico (timidina radiactiva) y analizando la incorporacin de este contraste radiactivo mediante autorradiografa. Cuando se utiliza este mtodo en clulas de larvas jvenes de anfibio, se observa que en ciertos cromosomas, los extremos an no estn marcados cuando ya las partes centrales son radiactivas. Estos cromosomas contienen pues en sus extremos regiones especializadas donde el DNA es replicado mas tarde que en los dems sitios. En los huevos en segmentacin no existen estas regiones de replicacin tarda, y todo el cromosoma se marca uniformemente. Esta observacin sugiere que las protenas ligadas al DNA cromosmico, probablemente del tipo de las histonas, estn uniformemente distribuidas en la mrula, pero no en el joven renacuajo. Tambin hay diferencias qumicas entre las histonas del huevo en segmentacin y las de los embriones ms avanzados. El huevo en segmentacin, como el espermatozoo maduro, contiene unas histonas particularmente ricas en el aminocido arginina. Estas "histonas de la segmentacin" son progresivamente sustituidas por las histonas clsicas de los tejidos adultos durante el ulterior desarrollo. Asimismo, deben mencionarse las anomalas mitticas, pues resultan muy frecuentes en los huevos en segmentacin en cuanto estos son situados en medios ligeramente adversos (Figura 44). La frecuente aparicin de citsteres ya ha sido mencionada. Su formacin no esta ligada a la presencia del ncleo, pues pueden aparecer en fragmentos anucleados de huevo de erizo de mar tratados con agua pesada (D20). Como ya vimos, su formacin requiere que previamente el jugo nuclear de la vescula germinal se haya mezclado con el citoplasma en la etapa de maduracin. Sin embargo, las protenas encargadas de la construccin de

los radios astrales (tubulinas) no estn acumuladas en la vescula germinal, sino que estn dispersas en el citoplasma. Como ya se dijo, la formacin de citsteres no precisa de sntesis de DNA, RNA, ni protenas. La tendencia del huevo fecundado a formar mltiples steres se confirma con la frecuente aparicin de mitosis pluricntricas, que conducen a una distribucin desigual de los cromosomas en las clulas hijas; el resultado es un aneuploidismo (los diferentes blastmeros contienen distinto nmero de cromosomas), condicin letal si esta muy difundido. El desarrollo se detiene en el estado de, blstula y los embriones pronto mueren. La frecuente aparicin de citsteres y mitosis pluricntricas en el huevo en segmentacin muestra que su citoplasma es un medio particularmente favorable para la replicacin de los centriolos. Dado que esta replicacin es posible en fragmentos anucleados y en huevos en que los cromosomas han sido destruidos por irradiacin intensa con rayos X, se deduce la posibilidad de que existan mitosis acromosmicas. El huevo puede dividirse incluso en ausencia completa de cromosomas, en cuyo caso el propsito fundamental de la mitosis, es decir, la distribucin equitativa de los cromosomas entre las clulas hijas, evidentemente no se cumple. Menos frecuentes son las mitosis anastrales, en los que existe huso pero no hay steres. Estas mitosis constituyen la norma general en las clulas vegetales, pero los blastmeros que las sufren no consiguen dividirse. Puede a veces hallarse otro tipo de anomala mittica, en la que no se forma huso. Dado que estas mitosis fueron inicialmente observadas tras tratamiento con colchicina, se les dio el nombre abreviado de c-mitosis. Los cromosomas se dividen, pero permanecen en el centro de la clula. Si la clula consigue recuperarse y formar un huso y unos steres normales, las clulas hijas sern poliploides (generalmente tetraploides, con 4n cromosomas). En los huevos en segmentacin, las c-mitosis pueden fcilmente obtenerse por tratamientos tan simples como el calor o el frio. Tambin son frecuentes las anormalidades cromosmicas, que resultan de alteraciones en las molculas de DNA. Los cromosomas pueden romperse en fragmentos que no contienen la parte especializada precisa para unirse a las fibras del huso (el centrmetro); y acaban perdindose y degenerando en el citoplasma. En muchas ocasiones, y quizs en todas, el centrmero esta formado por unas molculas de DNA diferentes de las del resto del DNA cromosmico. En el ratn, el intensamente repetitivo DNA satlite, rico en A-T (ver Capitulo 2), esta acumulado en la regin del centrmero. Cuando la cromatina es daada irreversiblemente, con degradacin del DNA, se convierte en una masa esfrica y densa. Este fenmeno se llama picnosis, y es un claro signo de muerte celular. Es de notar que la picnosis (y en consecuencia la muerte celular) es un fenmeno fisiolgico durante el desarrollo embrionario, en estados posteriores a la segmentacin. Es por ejemplo frecuente en el ojo y el cerebro de renacuajos jvenes perfectamente normales. Parece que en estos rganos un cierto nmero de clulas resultan "sacrificadas" por el bien de las dems, que son capaces de reutilizar los productos de la degradacin de las macromolculas presentes en las clulas sacrificadas. Finalmente, en los huevos en segmentacin es posible detener la formacin de surcos divisorios sin interferir con la divisin nuclear. Los cromosomas y los steres se dividen repetidas veces, dando lugar a varios ncleos hijos en un huevo no dividido o en un gran blastmero. Los narcticos del tipo del uretano y el ter son especialmente activos en esta detencin de la formacin del surco divisorio sin afectar la replicacin cromosmica.

2. Bioqumica de la segmentacin (a) Produccin de energa Tanto en el huevo de erizo de mar como en el de anfibio, el consumo de oxgeno aumenta progresivamente a lo largo de la segmentacin. Este aumento parece estar controlado, como es habitual, por la concentracin en el huevo del principal aceptor de fosfatos: el ADP (adenosindifosfato). Por el contrario, los efectos de las condiciones anaerobias (ausencia de oxigeno) y del cianuro (que se combina con la citocromoxidasa, inhibiendo la respiracin) son diferentes en los huevos de erizo de mar y de anfibio. Mientras que en el erizo de mar estas condiciones provocan la detencin casi instantnea de la segmentacin, los huevos de rana son capaces de alcanzar lentamente el estado de blstula temprana en ausencia total de oxigeno, o en presencia de concentraciones de cianuro que inhiben prcticamente del todo su consumo. Pero esta diferencia entre los huevos de erizo de mar y de anfibio es ms aparente que real. Sabemos que la verdadera fuente de energa de los organismos vivos es el ATP (adenosintrifosfato), y que la sntesis de ATP a partir de ADP y de fosfato inorgnico (fosforilacin) esta acoplada a las oxidaciones catalizadas por la cadena respiratoria. Este acoplamiento puede ser interrumpido por el veneno dinitrofenol, en presencia del cual la respiracin aumenta y la, concentracin de ATP disminuye. A pesar del aumento de la respiracin, las clulas tratadas con dinitrofenol tienen menos energa disponible para los procesos sintticos que las clulas normales, porque contienen menos ATP. Ahora bien, tanto en los huevos de erizo de mar como en los de anfibio, el dinitrofenol bloquea casi inmediatamente la segmentacin. Otra prueba de que la energa debe suministrarse en forma de ATP se obtiene mediante experimentos en los que se mide el contenido en ATP de huevos situados en condiciones de anaerobiosis. En los dos tipos de huevos antes citados el contenido en ATP disminuye, pero esta disminucin es mucho ms rpida en el huevo de erizo de mar que en el de rana. En ambos, la segmentacin se detiene cuando el contenido en ATP ha alcanzado el 50 por ciento del valor inicial. Existen variaciones cclicas del consumo de oxigeno durante la divisin celular? Mediante estudios muy cuidadosos, Zeuthen ha conseguido medir por mtodos extraordinariamente sensibles la respiracin de un solo huevo de erizo de mar durante las primeras segmentaciones. Como se muestra en la Figura 45, pueden observarse pequeas variaciones cclicas en la toma de oxigeno. Dado que estas variaciones no se encuentran al medir la respiracin de un vulo no fecundado, puede deducirse con relativa seguridad que estos cambios cclicos que se detectan durante la segmentacin son reales, y no debidos a errores experimentales. De hecho, se han hallado cambios similares al estudiar la oxidacin de glucosa radiactiva administrada a huevos de erizo de mar en segmentacin. Los picos de actividad respiratoria parecen corresponder a los estados de la mitosis en que el ncleo esta rodeado por una membrana (final de la telofase, interfase, comienzo de la profase). Por el contrario, la respiracin estara disminuida durante la metafase y la anafase. Experimentos en que se estudiaban los efectos del monxido de carbono (CO), otro inhibidor de la citocromoxidasa, sobre la segmentacin, han mostrado que los huevos de erizo de mar construyen una "reserva energtica" que es posteriormente utilizada para las mitosis. Sin embargo, la oligomicina, que inhibe el consumo de oxigeno y aumenta el contenido en ATP de las clulas, bloquea rpidamente la divisin celular en los huevos

de erizo de mar en segmentacin; ello demuestra que esta "reserva energtica" no es simplemente el contenido en ATP del huevo, y que las cosas son mas complejas de lo que parecen. (b) Composicin qumica del aparato mittico El aparato mittico comprende el huso, los cromosomas, los centriolos y los dos steres; y mediante estudios citoqumicos se ha visto que esta formado por protenas, RNA y glucgeno. La microscopa electrnica muestra que el huso y los steres estaran constituidos por microtbulos (Figura 46). En realidad, los radios astrales son unos cilindros huecos en los que pudiera existir movimiento de fluidos. El RNA presente en el huso no es ms que un acmulo de ribosomas atrapados entre los microtubulos, y lo mismo puede decirse de las partculas de glucgeno. A partir de huevos de erizo de mar en segmentacin, Mazia consigui6 aislar un aparato mittico completo e intacto (Figura 47). Utilizando preparaciones muy limpias, pudo demostrar que esta formado por protenas, y que el RNA presente en el no es mas que un contaminante procedente de los ribosomas. El aparato mittico contiene por lo menos tres protenas diferentes. La mayor, tubulina, es una protena que contiene azufre y posee propiedades contrctiles: se contrae en presencia de ATP y simultneamente hidroliza sus enlaces fosfato ricos en energa. En este sentido, la tubulina y la miosina del msculo pertenecen a la misma clase de protenas, aunque qumicamente difieren una de otra. La tubulina tambin es el constituyente fundamental de los monsteres y citsteres. Los microtbulos son el resultado de la polimerizacin lineal de las pequeas molculas de tubulina, que se unen una a otra dando lugar a una fibra. Los enlaces entre ellas son del tipo SS (disulfuro). Cuando estos enlaces SS son destruidos por un agente reductor como el mercaptoetanol (HSCH2 CH2 OH), el aparato mittico aislado se desvanece rpidamente. Los propios microtbulos estn unidos entre si y agrupados paralelamente por puentes de hidrogeno, que pueden ser destruidos mediante tratamiento con urea concentrada o con formamida. Si un aparato mittico aislado se trata con estas sustancias, su estructura se pierde rpidamente. La colchicina es una droga conocida por su capacidad de detener la mitosis impidiendo la formacin del huso. Ms arriba ya mencionbamos la existencia de las c-mitosis. El mismo efecto puede obtenerse con otro veneno del huso, la vinblastina, que, como la colchicina, se combina fcil y firmemente con la tubulina, impidiendo su polimerizacin. Si se tratan huevos de erizo de mar con colchicina, su segmentacin se detiene rpidamente porque no se forma aparato mittico, a pesar de que las protenas encargadas de su formacin, y en particular la tubulina, estn presentes en cantidades similares a las de los huevos normales. Estos experimentos muestran que la colchicina acta de la misma manera sobre los huevos vivos que sobre la tubulina aislada, impidiendo la polimerizacin lineal de esta protena. Son de inters los efectos del mercaptoetanol sobre los huevos de erizo de mar vivos, pues es capaz de inhibir la formacin del aparato mittico sin interferir con la replicacin de los centriolos ni de los cromosomas. En consecuencia, los huevos que han sido dejados durante algn tiempo en mercaptoetanol y que posteriormente son devueltos al

agua de mar normal, se segmentan directamente en cuatro blastmeros, sin dividirse previamente en dos clulas. La formamida tambin impide la segmentacin de los huevos de erizo de mar y de rana por destruccin del aparato mittico una vez formado. (c) Replicacin de DNA durante la segmentacin En todas las clulas, la sntesis de DNA acontece en un periodo especfico de la interfase, llamado periodo S. Justo despus de la divisin celular, el ncleo contiene una cantidad diploide (2 C) de DNA. Durante las horas que siguen, en un periodo denominado G1 (en la Figura 48 se muestra un esquema de ciclo celular), no hay ningn tipo de sntesis de DNA. Posteriormente se alcanza el periodo S, durante el cual el contenido en DNA se dobla, alcanzando el valor 4 C (es decir, 4 veces el valor que se observa en el ncleo del espermatozoo). La fase S dura algunas horas, y es seguida por el periodo G2. La clula no se divide inmediatamente despus de la replicacin del DNA; antes deben producirse otros fen6menos, necesarios para que la clula entre en mitosis, que se desarrollan a lo largo de las horas que dura el periodo G2. Finalmente, la clula se divide y el ciclo vuelve a comenzar. Por supuesto, algunas clulas no se dividirn nunca mas (por ejemplo, las clulas nerviosas (neuronas) de nuestro cerebro), y se dice que permanecen en G0. Pero hay una diferencia fundamental entre los huevos en segmentacin y las dems clulas: la interfase es ms corta en los primeros, y en consecuencia los periodos G1 y G2 son prcticamente inexistentes. En otras palabras, el huevo en segmentacin replica su DNA "a toda velocidad", como lo hacen las bacterias. La sntesis de DNA solo se detiene cuando el huevo esta en plena mitosis (metafase, anafase). Mas adelante, al final de la segmentacin, la actividad mittica disminuye, y pueden detectarse ciclos celulares normales. Las razones que explican por que el huevo en segmentacin es capaz de sintetizar DNA tan rpidamente ya han sido mencionadas. Como vimos, toda la maquinaria precisa esta preparada en el citoplasma desde la maduracin. Tanto los precursores de la sntesis de DNA como las enzimas necesarias para su replicacin estn ya presentes. La DNApolimerasa, encargada de la construccin de una nueva cadena polinucleotdica sobre un molde de DNA, puede ya hallarse en grandes cantidades en el citoplasma; y en cada divisin se traslada de este al ncleo. Por ello, la cantidad total de DNA-polimerasa es aproximadamente la misma en el vulo no fecundado y en la blstula, que contiene varios cientos de clulas; pero tambin es similar la cantidad de enzima que hay en cada ncleo en todos los estados: el ncleo del zigoto y el ncleo de una clula de la blstula tienen la misma cantidad de DNA-polimerasa. Otras clulas no son tan afortunadas como el huevo en segmentacin, y tienen que sintetizar la polimerasa precisa para la replicacin de su DNA; esto requiere tiempo y explica la necesidad del periodo G1. Pero, incluso en el erizo de mar, la maquinaria precisa para la sntesis de DNA no esta totalmente preformada en el vulo no fecundado. Cuando el huevo ha alcanzado el estados de 4 u 8 clulas, se agotan las reservas preexistentes de precursores del DNA (principalmente de timidina). En este momento comienza la sntesis de las enzimas requeridas para la formacin de timidina especialmente de la ribonucletidorreductasa, que transforma los ribonucletidos en desoxirribonucletidos); el ritmo de mitosis comienza a disminuir y aparece la fase G1.

Probablemente, la replicacin del DNA durante la segmentacin siga la regla de todos los dems seres vivos, y sea de tipo semiconservativo (Figura 49). Esto significa que al comenzar el periodo S las dos hebras complementarias de la doble hlice de DNA se desenrollan y se separan. Cada hebra es copiada por una DNA-polimerasa, de forma que, en las clulas hijas, el DNA estar formado por una hebra preexistente y una recin sintetizada. An no se ha demostrado que la replicacin en los huevos en segmentacin sea del tipo semiconservativo, pero no hay ninguna razn que induzca a pensar que estos vayan a ser una excepcin a la regla universal. Mas arriba veamos que en el huevo de erizo de mar en segmentacin, el consumo de oxigeno es ligeramente mas elevado durante la interfase (es decir, durante la fase S) que durante la propia mitosis. Es posible que, al menos en los huevos, exista una correlacin directa entre respiracin y sntesis de DNA. Dicha correlacin puede comprobarse al comparar ambos parmetros en embriones normales (diploides) y partenogenticos (haploides) de erizo de mar, Chaetopterus y anfibio. En los haploides, tanto la sntesis de DNA como la respiracin aumentan ms lentamente que en los diploides. Ya mencionamos antes que los huevos de anfibio contienen una reserva de DNA citoplsmico, localizado en las plaquetas vitelinas. No se sabe con certeza si este DNA sirve para la sntesis del DNA nuclear durante el desarrollo embrionario, pero parece verosmil que as sea, en cuyo caso es probable que se utilice en estados posteriores a la segmentacin pues en este periodo la rotura de plaquetas vitelinas es muy limitada o inexistente. No se sabe si el DNA vitelino, que tiene la misma composicin que el DNA nuclear, es utilizado en forma de grandes molculas, o como pequeos precursores, tras muchas roturas. Lo que si se sabe es que al microinyectar un DNA radiactivo aislado de bacterias en un huevo de anfibio en segmentacin, aquel se acumula rpidamente en el ncleo; y dado que parte de dicho DNA puede recuperarse del huevo sin haber sido degradado, se deduce que durante la segmentacin, grandes molculas de DNA pueden moverse fcilmente del citoplasma al ncleo. En consecuencia, se puede considerar la posibilidad de que el ncleo tome el DNA vitelino en forma de gran des fragmentos sin degradar. La posible capacidad del DNA citoplsmico para replicarse independientemente ser estudiada mas adelante, cuando, en el capitulo 9, examinemos las actividades bioqumicas de los fragmentos anucleados de huevo. De momento Basta saber que este problema an no ha sido definitivamente resuelto. (d) Sntesis de RNA durante la segmentacin En los huevos de anfibio y de erizo de mar, la sntesis de RNA durante la segmentacin es dbil en comparacin a la de estados posteriores, y de hecho no hay sntesis mensurable de rRNA. Esto quiere decir que en este estado no se estn formando nuevos ribosomas, y por lo tanto el huevo esta viviendo a costa de la enorme reserva de ellos construida durante la oognesis. No ocurre lo mismo en los huevos de los mamferos, pobres en ribosomas: en los huevos de ratn y de conejo en segmentacin puede fcilmente detectarse actividad de sntesis de rRNA. Por el contrario, en los huevos de anfibio y de erizo de mar, los organizadores nucleolares, ciertamente presente en una pareja de cromosomas, no presentan ninguna actividad de sntesis de rRNA durante la segmentacin. Aunque no se sabe a ciencia cierta, parece probable que esta inhibicin sea debida a la unin del rDNA de los organizadores nucleolares con un represor, que de

hecho ya ha sido detectado en oocitos maduros (ver capitulo 4). Naturalmente, esta inactividad de sntesis de rRNA durante la segmentacin concuerda perfectamente con la ausencia de verdaderos nucleolos en este periodo del desarrollo, excepcin hecha de los mamferos. En los embriones de polio, la sntesis de rRNA comienza un poco antes (hacia la mitad del estado de blstula) que en los huevos de anfibio y erizo de mar. En los huevos de anfibio, la sntesis de mRNAs comienza al principio de la segmentacin y se mantiene, a un ritmo bajo y constante, todo a lo largo de este estado. Los mRNAs recin sintetizados son de tamaos muy heterogneos, y representan toda una familia de molculas portadoras de informacin. La sntesis de tRNAs, que precede en algunas horas a la de rRNA, comienza hacia el final de la segmentacin, en el estado de blstula temprana. En los huevos de erizo de mar la situacin parece ms compleja. No se detecta sntesis de nuevas especies de mRNAs hasta que el huevo alcanza el estado de 2 a 4 blastmeros. Estos mRNAs se encuentran en partculas ribonucleoproteicas, asociadas a protenas, formando unos complejos que Spirin ha denominado informosomas. Los mRNAs sintetizados durante la segmentacin son, como en los huevos de anfibio, muy heterogneos. Los viejos y estables mRNAs que estaban acumulados en el vulo no fecundado son nuevamente sintetizados, y simultneamente se forman nuevas especies de mRNAs que no existan previamente en el huevo. Los experimentos de hibridacin molecular muestran la complejicidad de la situacin. Los RNAs sintetizados durante la segmentacin no se forman solo en el ncleo, sino tambin en et citoplasma, probablemente en las mitocondrias. Al comenzar la gastrulacin hay una explosin en la sntesis de RNAs sobre moldes de DNA mitocondrial, que corresponde al aumento del nmero de organelas que se observa tras la segmentacin. Entre los mRNAs sintetizados durante la segmentacin se encuentra el encargado de dirigir la sntesis de las histonas. Este tipo de mRNA, identificado y aislado en los huevos de erizo de mar en segmentacin, es una pequea molcula de 9 S, como era de prever dado el exiguo tamao de las histonas. Las histonas se sintetizan en pequeos polisomas, fcilmente separables de los grandes agregados ribosmicos por centrifugacin diferencial. La sntesis del mRNA encargado de la formacin de histonas es cuantitativamente importante durante la segmentacin, pues estas protenas constituyen el 50 por ciento del total de protenas sintetizadas es este estado. Recientes experimentos han mostrado que, como los genes del rRNA, los genes de las histonas son amplificados durante la oognesis. La existencia de muchas copias hace posible que el huevo sintetice preferentemente histonas en vez de otras protenas. Ciertos experimentos realizados con inhibidores de la sntesis de cidos nucleicos y de protenas sugieren una posible correlacin entre las sntesis de DNA y de histonas. Esto no es sorprendente, pues las histonas estn unidas en el ncleo al DNA. Sin embargo, como acabamos de ver, las histonas no se sintetizan en el ncleo, sino en pequeos polisomas citoplsmicos. Por lo tanto, las histonas recin sintetizadas deben emigrar del citoplasma al n6cleo, donde se combinan con el DNA y probablemente reprimen la sntesis de mRNAs, incluyendo quizs la del mRNA encargado de la sntesis de las propias histonas. Este mecanismo de control podra hacer posible una regulacin muy precisa y delicada de la formacin de estas protenas.

Los huevos de erizo de mar contienen al menos tres tipos diferentes de RNA-polimerasa, responsables de la sntesis de RNA. La polimerasa I esta especializada en la sntesis de rRNA; su actividad aumenta paralelamente al aumento del nmero de clulas, y por lo tanto su actividad por clula permanece constante. Las polimerasas II y III, mas activas que la polimerasa I, mantienen una actividad constante todo a lo largo del periodo de segmentacin, lo cual implica que su actividad por clula va decayendo progresivamente. Es muy probable que, como la DNA-polimerasa, estas dos enzimas se encuentren en el citoplasma del vulo no fecundado, y que pasen de all al ncleo durante la segmentacin. Se supone que la RNA-polimerasa II es la enzima responsable de la sntesis de los nuevas tipos de mRNAs que se producen durante la segmentacin. Sin embargo, nos espera una sorpresa al examinar los efectos que producen los inhibidores de la sntesis de RNA sobre la segmentacin. Ni en el huevo de erizo de mar ni en el de anfibio se ye la divisin celular afectada por la actinomicina. Esta droga no detiene la segmentacin en los huevos de erizo de mar hasta la eclosin, es decir, hasta el estado de blstula tarda. An mas sorprendente es el caso de los huevos de anfibio, en los que pueden inyectarse dentro del huevo grandes dosis de actinomicina sin que se observen efectos inmediatos. Se suceden repetidas divisiones celulares normales y finalmente se alcanza el estado de blstula. Debe pues deducirse que toda la informacin requerida para las sucesivas segmentaciones esta ya presente en el vulo no fecundado en forma de molculas de RNA materno encubiertas, y que para las repetidas mitosis no se precisa de la sntesis de ningn tipo de molcula de RNA, ni siquiera del mRNA encargado de la sntesis de las histonas. Tambin ofrece interesantes resultados la microinyeccin de a -amanitina, capaz de bloquear la actividad de la RNA-polimerasa II sin afectar a la RNA-polimerasa I. La segmentacin se detiene en el estado de blstula, como tras la inyeccin de actinomicina; y el examen citolgico muestra que las blstulas bloqueadas no tienen nucleolos, a pesar de que la a -amanitina no afecta a la enzima que sintetiza los rRNAs y sus precursores macromoleculares (polimerasa I). Este experimento demuestra que la sntesis de los rRNAs y la formacin de nucleolos por parte de los organizadores nucleolares no estn controladas solamente por la RNA-polimerasa I; y que la desrepresion del rDNA del organizador nucleolar aparentemente requiere la sntesis de un mRNA sintetizado por la RNA-polimerasa II. (e) Sntesis proteica durante la segmentacin Tanto en el huevo de erizo de mar como en el de anfibio, los niveles de sntesis proteica van aumentando progresivamente todo a lo largo de la segmentacin, y se forman muchas nuevas protenas, adems de las histonas. En los huevos de anfibio, la sntesis proteica sigue el gradiente animal-vegetativo de distribucin del RNA, ya presente en el oocito, siendo esta sntesis mas intensa en el polo animal que en el polo vegetativo, mas pobre en polisomas. En los huevos de erizo de mar se ha demostrado que se traducen tanto los mRNAs maternos preexistentes como los mRNAs recin formados. Los clsicos inhibidores de la sntesis proteica puromicina y cicloheximida ejercen sobre la segmentacin los efectos previsibles: tanto en los huevos de erizo de mar como en los de anfibios, las mitosis se bloquean casi inmediatamente. Estas drogas inicialmente inhiben la sntesis de protenas citoplsmicas, y posteriormente tambin detienen la formacin de protenas nucleares y de DNA. Como ya se seal anteriormente, no es en

absoluto seguro que haya sntesis proteica en los ncleos. Dado que mltiples experimentos han demostrado que las protenas sintetizadas en el citoplasma son capaces de emigrar al ncleo, es perfectamente comprensible que si se suprime la sntesis de protenas citoplsmicas, el ncleo contenga una menor concentracin de protenas recin sintetizadas. Es de notar que en los huevos de anfibio, la inyeccin de inhibidores de la sntesis mitocondrial de protenas y de RNA (cloranfenicol y rifampicina, respectivamente) no tiene efecto sobre la segmentacin ni sobre el ulterior desarrollo, y que de los huevos inyectados salen renacuajos perfectamente normales. Se deduce por lo tanto que el DNA mitocondrial puede jugar solo un papel secundario en las fases tempranas del desarrollo. En cambio, las mitocondrias tienen durante la segmentacin la importante funcin de producir energa, como ya vimos al estudiar los efectos de la anaerobiosis, del cianuro, y del dinitrofenol sobre la divisin celular. No se sabe atm si las protenas que constituyen el aparato mittico (tubulinas) son o no sintetizadas de nuevo. Nadie duda que el vulo no fecundado contiene grandes cantidades de tubulina y protena relacionadas. Pero existen buenas evidencias de que durante la segmentacin se sintetizan an ms protenas de este tipo. El caso del aparato mittico sera pues bastante similar al de las histonas, que ya vimos: el vulo no fecundado contendra ya tanto tubulina como el mRNA encargado de su sntesis; pero durante la segmentacin se formaran aun ms molculas de esta protena, bajo el control de molculas de mRNA recin sintetizadas. Otra pregunta an no resuelta es la siguiente: Es la sntesis proteica cclica en relacin con el ciclo mittico? Los experimentos realizados con huevos de erizo de mar han dado resultados conflictivos. Una conclusin prudente sera el que estas variaciones cclicas de la sntesis proteica, de existir, tendran una importancia cuantitativa pequea. Obviamente, esto tambi6n se aplica a los cambios cclicos del ritmo respiratorio, previamente discutidos. (f) Formacin del Surco Divisorio En los grandes huevos de anfibio es claro que para la progresin del surco divisorio que separar los blastmeros, se requiere de una expansin de la membrana celular. Este aumento de superficie no implica necesariamente la sntesis de nuevas protenas de la membrana. El huevo tiene un gran acumulo de membranas, presentes en forma de un discreto retculo endoplsmico, que podran ser simplemente unidas a la membrana celular cuando esta se expande durante el proceso de formacin del surco divisorio. Otro factor importante para la segmentacin citoplsmica en los huevos de anfibio es la formacin, durante la telofase, de un rea gelificada y muy viscosa alrededor de los steres. Los steres en si son demasiado pequeos para tener un papel importante en la formacin de los surcos divisorios, pero cada ster esta rodeado por un gel periasterial; y si este gel no se produce, como por ejemplo en los huevos tratados con narcticos, no se forma surco divisorio alguno. Como ya vimos, en estos huevos "narcotizados", pueden producirse varios ciclos de mitosis sin que exista segmentacin. En los huevos de erizo de mar se ha demostrado que el cortex del huevo tiene propiedades contrctiles autnomas. Aunque se extirpe todo el aparato mittico de los

huevos en metafase o anafase, estos continan dividindose en el momento correcto. Adems, puede observarse la contraccin de pedazos de cortex aislados si se aade ATP al medio en que se encuentran. Estas notables propiedades de cortex del huevo de erizo de mar se deben a que contiene una protena contrctil, muy similar a la tubulina del aparato mittico. Dicha protena posee grupos SH, que sufren un ciclo de oxidacinreduccin durante la divisin; es soluble en C1K, precipita ante el calcio, y, como el propio cortex, se contrae en presencia de ATP. Recientemente ha sido posible demostrar en el cortex de los huevos tanto de anfibio como de erizo de mar, la presencia de unos microfilamentos de solo 40 a 50 A de grosor (por lo tanto mucho menores que los microtbulos), que forman un anillo contrctil en los surcos divisorios. Estos microfilamentos probablemente es-ten formados por una protenas contrctil del tipo de la actina, muy similar a la actina muscular; y pueden ser destruidos selectivamente por una droga llamada citocolasina B. Si se aade esta droga a huevos de erizo de mar o de anfibio en segmentacin, el avance del surco divisorio se detiene inmediatamente, para volver a avanzar normalmente en cuanto se elimina la citocolasina B por lavado. Estos experimentos inducen fuertemente a creer que los microfilamentos juegan un papel directo e importante en la formacin y progreso del surco divisorio durante la segmentacin. Pero la formacin del surco divisorio es sin duda un proceso ms complejo, que no puede ser explicado solo por la intervencin de los microfilamentos. Recientes experimentos realizados sobre huevos de anfibio han mostrado que si con una microaguja se extirpa parte de la sustancia situada en el vrtice del surco y se inyecta en el cortex del polo animal del huevo, en el punto de inyeccin se forma un nuevo surco divisorio. Es decir, ciertas sustancias presentes en el vrtice del surco divisorio pueden inducir una contractilidad localizada del cortex del huevo. CAPITULO 7 EMBRIOLOGA QUIMICA DE LOS HUEVOS DE INVERTEB RADOS En el captulo 3 ya hemos descrito los experimentos que condujeron a la distincin entre los huevos mosaico de los gusanos y moluscos, y los huevos regulativos. Conocemos mucho mejor la bioqumica de los huevos regulativos porque su prototipo es el huevo de erizo de mar, que puede fcilmente obtenerse en grandes cantidades. Por el contrario, es mucho ms difcil obtener suficiente material de la mayora de los gusanos y moluscos para su anlisis bioqumico, por lo que nuestros actuales conocimientos sobre su embriologa molecular son muy limitados. La mayora de los trabajos realizados sobre estos huevos se basan en mtodos citoquimicos o en observaciones al microscopio electrnico; estos mtodos, a pesar de su evidente inters, no proporcionan informacin suficiente si se quiere, por ejemplo, estudiar la sntesis de algunos tipos especficos de RNA. Buena parte de los estudios sobre huevos mosaicos de invertebrados se deben a Reverberi y su escuela. Estos investigadores han centrado su atencin principalmente en la distribucin de las mitocondrias a lo largo del desarrollo. En las lneas que siguen vamos a presentar brevemente los hallazgos fundamentales realizados sobre huevos mosaicos, y a dar una descripcin mas detallada de la embriologa molecular del erizo de mar.

1. Beroe Los huevos de este Ctnoforo contienen un plasma cortical que, en algunos blastmeros, da una fluorescencia verde y sufre una distribucin muy precisa durante la segmentacin, hallndose mas adelante exclusivamente en las placas ciliadas del adulto (Fig. 50). El plasma cortical se comporta pues como una localizacin germinal tpica. Mediante mtodos citoquimicos ha sido posible estudiar mas detalladamente preparaciones de huevos centrifugados, y se ha observado que el elemento importante del plasma cortical no es el material fluorescente, sino el acmulo de mitocondrias, que pueden ser detectadas por su actividad oxidativa y reductora. 2. Tubifex Los huevos fecundados de este Oligoqueto presentan dos "plasmas polares" opuestos (Figura 51.), que contienen acmulos de mitocondrias prximos a los polos animal y vegetativo. Ms adelante, las mitocondrias se concentran en unos blastmeros determinados, llamados 4D, 2d y 4d. La embriologa experimental ha demostrado que este ultimo, que contiene el mesodermo, es especialmente importante para el desarrollo del embrin. Por microscopia electrnica se ha observado que la proporcin de mitocondrias, ribosomas, gotas de grasa y plaquetas vitelinas no es la misma en los tres blastmeros. As, se ha visto que el 4d es el que contiene, adems de muchos ribosomas, el mayor nmero de mitocondrias y de cuerpos grasos; aunque ninguno de los tres posee una organela de manera especifica. 3. Chaetopterus Ya hemos mencionado varias veces los huevos de este Poliqueto. Un dato ms merece ser consignado: cuando los vulos no fecundados son tratados con CIK, sufren una maduracin seguida, como es habitual, por la formacin de un monster. Sin embargo, en Chaetopterus pueden sucederse varios ciclos monasteriales. El cortex del huevo se contrae repetidas veces, como si este fuera a dividirse, pero los surcos divisorios rpidamente se desvanecen. En cada ciclo monasterial los cromosomas se replican, con lo que finalmente se obtiene un huevo con un solo ncleo, del tamao de la vescula germinal del oocito, pero relleno por cientos de cromosomas. Entonces el gran ncleo se rompe dando lugar a ncleos hijos, que contienen cantidades variables de DNA. Simultneamente se produce una separacin del vitelo y del citoplasma claro, rico en RNA, quedando el vitelo totalmente rodeado por el citoplasma claro. Finalmente este citoplasma, que contiene abundantes ribosomas, puede dar lugar a cilios. Este fen6meno ha sido denominado diferenciacin sin segmentacin: de un 6vulo no fecundado de Chaetopterus se desarrolla una forma de larva unicelular ciliada (Figura 52.). Se sabe muy poco sobre la bioqumica de esta curiosa diferenciacin sin segmentacin, pero se ha observado que la velocidad de respiracin y de sntesis de DNA es menor que en el huevo fecundado normalmente. Durante los repetidos ciclos monasteriales no se forman nucleolos, que solo se hacen visibles cuando se produce la separacin entre el vitelo y el citoplasma rico en RNA, por lo que se sospecha que el mecanismo que controla la desrepresion de los organizadores nucleolares opera de la misma forma durante la diferenciacin sin segmentacin que durante el desarrollo normal.

4. Mytilus Este mejilln comestible, como Chaetopterus, provee material suficiente para hacer anlisis bioqumicos. Sin embargo, hasta el momento, solo se ha estudiado en el un nico tema: la respiracin de los blastmeros aislados. Como en el resto de los huevos de segmentacin espiral (ver Figura 52.), en el huevo de Mytilus, durante el estado de "trbol", se forma un lbulo polar, que se introduce en uno de los dos primeros blast6meros (CD), mayor que el otro (AB). En el estudio realizado sobre este huevo se compar6 la respiracin de los 16bulos polares aislados y los blastmeros AB y CD. Como se muestra en la Figura 53, el consumo de oxigeno de los dos tipos de blastmeros sigue curvas diferentes, y el descenso en la respiracin que se produce normalmente con la eclosin no se observa en el blastmero CD. De especial inters es la respiracin baja y constante de los lbulos polares aislados, que pudiera estar relacionada con la ausencia de sntesis nuclear de DNA, en oposicin a lo que ocurre en los blastmeros AB y CD, donde la divisin celular es muy activa (los lbulos polares son siempre puramente citoplsmicos). 5. Ilyanassa Los huevos de este molusco gasterpodo han sido mejor estudiados, desde el punto de vista molecular, que la mayora de los dems huevos de segmentacin espiral. Como en el resto de los huevos mosaicos, durante la segmentacin se acumulan mitocondrias y lpidos en ciertos blastmeros. Por el contrario, los ribosomas y la enzima soluble dipeptidasa estn distribuidos homogneamente, a pesar de la gran complejidad de la segmentacin espiral. Queremos insistir sobre la importancia que para la morfognesis tiene el 1bulo polar en Ilyanassa (ver Figura 13.). Si se extirpa este 1bulo durante el estado de trbol, se obtienen embriones con pie, concha y ojos reducidos o incluso ausentes. El 1bulo polar es rico en plaquetas vitelinas, y contiene unas vesculas rodeadas por una doble membrana, cuyo exacto significado es an oscuro. Como los de anfibio y de erizo de mar, los huevos de Ilyanassa contienen un importante exceso de DNA en comparacin con el espermatozoo, pero an no se sabe si este DNA citoplsmico esta localizado en las mitocondrias o en las plaquetas vitelinas (o en ambas). La sntesis de RNA y de protenas aumenta notablemente tras la gastrulacin; el RNA sintetizado es al parecer, fundamentalmente del tipo mRNA. La extirpacin del lbulo polar tiene efectos lesivos sobre la sntesis de RNA y de protenas, pero la inhibicin no es inmediata, y no se hace evidente hasta pocos das despus. Este experimento muestra un hecho interesante: el citoplasma puede ejercer un control sobre la transcripcin que se aplaza hasta que la morfognesis comienza realmente. El 1bulo polar aislado tiene capacidad de sntesis proteica, y quizs incluso de una sntesis limitada de RNA. A juzgar por ciertas autorradiografas a nivel de microscopia electrnica, esta sntesis proteica se produce en las mitocondrias y en los polisomas. Se han obtenido resultados similares con huevos de otros moluscos gaster6podos, concretamente Lymnea y Dentalium.

En Lymnea la sntesis de RNA aparentemente comienza ms tarde que en Ryanassa, concretamente durante la segmentacin. En Dentalium, el lbulo polar, que como en Ilyanassa, es muy importante para la morfognesis, posee abundantes mitocondrias. As mismo contiene unas inclusiones ricas en DNA, que en realidad son bacterias simbiticas, sin ninguna funcin especial en el desarrollo. La presencia de bacterias simbiticas en huevos es una advertencia en contra de interpretaciones precipitadas de los hallazgos bioqumicos. Si por ejemplo se descubre una actividad de sntesis de DNA en un lbulo polar aislado, carente de ncleo, ello no significa necesariamente que el DNA mitocondrial pueda replicarse en ausencia del ncleo, pues dicha actividad puede ser debida a la multiplicacin de bacterias que contengan DNA. 6. Tunicados (ascidias) Los extensos estudios de Reverberi y sus colegas han mostrado que en las larvas de ascidia existe una estrecha correlacin entre el acmulo de mitocondrias y la formacin de msculos. Como se muestra en la Figura 54, el huevo de ascidia esta formado por cierto nmero de "plasmas" distinguibles, que, tras una precisa reparticin en los diferentes blastmeros durante la segmentacin, acaban dando lugar a las distintas partes de la larva. El mioplasma (que dar lugar a los msculos) posee abundantes mitocondrias, y en el estado de 4 clulas se encuentra acumulado en los dos blastmeros posteriores. Si pocos momentos despus de la fecundacin el huevo es centrifugado, se forman larvas anormales, con una distribucin atpica de las clulas musculares; y sin embargo cada una de estas clulas posee abundantes mitocondrias, que parecen pues tener una accin directa sobre la diferenciacin muscular. Tambin en apoyo de esta hiptesis esta el hecho de que los inhibidores de la citocromoxidasa y de la succinico-deshidrogenasa (dos enzimas mitocondriales tpicas) tienen efectos adversos sobre la diferenciacin de las clulas musculares. La microscopa electrnica y las medidas de actividad de la citocromoxidasa confirman que los blastmeros posteriores, que contienen el mioplasma, poseen 3 a 4 veces ms mitocondrias que los anteriores. Sin embargo, si se separan los blastmeros anteriores de los posteriores y se mide la respiracin de cada uno de ellos, las diferencias halladas son muy pequeas, lo cual demuestra que en los huevos de ascidia, el nmero de mitocondrias presentes en cada blastmero no es el factor limitante del ritmo respiratorio. Recientemente se han publicado datos muy curiosos sobre la sntesis de RNA en las ascidias. Aparentemente, en ciertas especies no hay sntesis de RNA mensurable a lo largo del desarrollo, hasta el estado de larva, en el que puede fcilmente reconocerse al microscopio la presencia de clulas altamente diferenciadas (clulas nerviosas, de la corda, musculares, etc.). Solo cuando la larva comienza la metamorfosis aparece actividad de sntesis de RNA. De acuerdo con estos hallazgos bioqumicos esta el hecho de que, al parecer, la actinomicina no afecta al desarrollo de la ascidia hasta la metamorfosis. De estos experimentos se deduce que el desarrollo de la ascidia hasta la fase de larva mvil es controlado por la traduccin de mRNAs maternos preexistentes. Mediante experimentos sobre mergonas hbridas, se ha podido demostrar la importancia que tienen estos RNAs maternos para el desarrollo. Si unos huevos de la especie A se parten en dos mitades (merogonia) y las mitades anucleares se fecundan con esperma de la especie B (hibridacin), en las ascidias se desarrollan exclusivamente mergonas

hbridas del tipo A, es decir materno o citoplsmico. El ncleo del espermatozoo no ejerce ningn efecto importante o especifico sobre el desarrollo, como sera previsible si produjera mRNAs necesarios para la diferenciacin. 7. Huevos de erizo de mar En el captulo 3 ya vimos como el huevo de erizo de mar en el estado de 2 blastmeros tiene una extraordinaria capacidad de regulacin. La separacin de los dos primeros blastmeros conduce al desarrollo completo y normal hasta el estado de larva pluteus de cada uno de ellos (Driesch). Por el contrario, las secciones ecuatoriales en el estado de mrula tienen consecuencias muy diferentes. Como se muestra en la Figura 18, el desarrollo de las mitades animal y vegetativa aisladas es completamente diferente (Horstadius). Muchos agentes pueden producir en huevos completos una animalizacin (es decir, un desarrollo similar al de la mitad animal). Por el contrario, la vegetalizacin, que representa el polo opuesto del desarrollo, es mucho mas difcil de obtener tratando huevos enteros con sustancias qumicas. Solo el cloruro de litio (C1Li) produce una vegetalizacin realmente satisfactoria, idntica a la obtenida por el mtodo mucho mas delicado de cortar el huevo en dos mitades (Figura 18.). Como puede suponerse, los embrilogos moleculares, que requieren grandes cantidades de material para sus experimentos, han trabajado poco sobre mitades de mrula aisladas, y han preferido trabajar a gran escala, tratando huevos enteros con agentes vegetalizantes. Los esmerados y laboriosos trabajos de Horstadius, que fue el primero en conseguir cortar un huevo de erizo de mar en una mitad animal y una mitad vegetativa, le llevaron a la conclusin de que en el huevo de este animal existen dos gradientes opuestos, y casi hostiles: el gradiente animal, que decrece del polo animal hacia el vegetativo; y el gradiente vegetativo, que va en direccin contraria. Solo se puede conseguir un desarrollo normal hasta larva pluteus si se mantiene el equilibrio entre estos dos gradientes opuestos. Horstadius tambin demostr6 que los micrmeros, que son los blastmeros ms vegetativos del huevo, tienen una importancia esencial en el desarrollo. El injerto de micrmeros en una mitad animal aislada puede inducir la gastrulacin y la formacin de un arqunteron en el lugar del injerto, y en cantidades suficientes corrige completamente la animalizacin, dando lugar a la formacin de una larva pluteus normal. Este breve resumen de embriologa experimental del erizo de mar era necesario antes de pasar a discutir su embriologa molecular. De entrada se nos plantean dos problemas: Cul es la naturaleza qumica de los gradientes animal y vegetativo? Cul es la base molecular de la regulacin embriolgica? Vamos a analizar sucesivamente cada una de estas dos cuestiones. La naturaleza qumica de los gradientes morfogenticos existentes en los huevos de erizo de mar ha sido estudiada exhaustivamente por Runnstrom y sus colegas suecos. Lindahl, estudiando el efecto de los agentes animalizadores y vegetalizadores sobre el consumo de oxigeno de los huevos de estos animales hall que, como se muestra en la Figura 55, el C1Li no tiene efecto sobre el ritmo respiratorio de los huevos recin fecundados, pero frena el aumento que normalmente se produce durante la segmentacin. Apoyado en este y otros experimentos, Lindahl sugiri una hiptesis segn la cual el metabolismo sera cualitativamente diferente en los dos polos opuestos del huevo: en el polo animal

predominara el metabolismo hidrocarbonado, mientras que en el vegetativo el metabolismo seria principalmente proteico. Los experimentos realizados para probar esta hiptesis han dado resultados conflictivos, y de momento aun no se puede extraer una conclusin firme. Por ejemplo, se ha observado que el consumo de oxigeno de las mitades animal y vegetativa aisladas es similar, y que, contrariamente a lo que se poda esperar, el litio no ejerce una actividad inhibitoria mas intensa sobre la mitad animal que sobre la vegetativa. Por otro lado, Horstadius ha demostrado mediante un simple y elegante mtodo citoquimico la existencia, en la blstula de erizo de mar, de dos gradientes de reduccin opuestos. Como se muestra en la Figura 56, si se tien los huevos con un colorante vital que pierde el color al reducirse, y se colocan en condiciones anaerobias, se observan dos centros de actividad reductora, localizados respectivamente en los polos animal y vegetativo. As, la mitad animal tiene un centro reductor localizado en el polo animal, mientras que la mitad vegetativa tiene otro centro reductor, pero esta vez localizado en el polo vegetativo. Si se injertan micrmeros en una mitad animal aislada, puede observarse el desarrollo de un nuevo centro reductor alrededor de los micrmeros injertados. Desgraciadamente, el significado bioqumico de estos centros reductores es an oscuro y complejo, pero estos experimentos permiten una bonita visualizacin al microscopio de los dos gradientes opuestos, animal y vegetativo. Los experimentos diseados para demostrar que el polo vegetativo es una regin de intenso metabolismo proteico tambin han arrojado resultados contradictorios. Un argumento indirecto en favor de esta hiptesis es el hecho de que el cloranfenicol, que tcnicamente inhibe preferentemente la sntesis proteica mitocondrial, es uno de los mltiples agentes animalizadores. As mismo, se ha sealado que la incorporacin de aminocidos a las protenas, a juzgar por ciertas autorradiografas, es ms importante en el polo vegetativo (especialmente en los micrmeros) que en el recto del embrin. Sin embargo, los anlisis bioqumicos no han confirmado estos hallazgos autorradiogrficos. El ritmo de sntesis proteica sigue de cerca la curva de consumo de oxigeno que se muestra en la Figura 55, aumentando durante la segmentacin, nivelndose con la formacin de los cilios en el momento de la eclosin de la blstula, para posteriormente volver a elevarse. Seg Berg, no hay diferencia entre las mitades animal y vegetativa en lo que a sntesis proteica se refiere; y los micrmeros aislados no tienen una sntesis proteica por unidad de volumen mayor que la de los dems blastmeros. Berg tambin ha estudiado los efectos del CILi sobre la sntesis proteica, hallando que esta no es inhibida hasta el final de la segmentacin. A partir de este momento las larvas se hacen anormales. Los efectos del CILi sobre la sntesis proteica son iguales en las mitades animales que en las vegetativas; y dado que son bastante similares a los de la actinomicina, que no inhibe la sntesis proteica hasta pasada la segmentacin, Berg ha sugerido que el CILi actuaria primariamente sobre la sntesis de mRNA. Esta hiptesis, aunque es muy sugestiva, an no ha recibido confirmacin experimental. Estudiando los efectos del CILi sobre la sntesis de ciertas enzimas en el curso de desarrollo del erizo de mar, Gustafson hallo que esta sustancia tiene una cierta accin inhibitoria sobre las enzimas cuya actividad aumenta de manera importante durante el desarrollo, sin afectar a otro grupo de enzimas, que mantienen una actividad constante. Segall este autor, las enzimas del primer grupo estaran localizadas en las mitocondrias, y

el CILi actuaria inhibiendo la multiplicacin o la diferenciacin de las mitocondrias del polo animal. Sin embargo, los recuentos de mitocondrias realizados en las diferentes partes del huevo y del embrin mediante el microscopio electrnico no han conseguido demostrar una actividad de multiplicacin mitocondrial importante en la vecindad del polo animal. Los experimentos de Lallier, demasiado numerosos para ser descritos aqu, han demostrado que los agentes animalizadores y vegetalizadores modifican el equilibrio sulfhidrilo-disulfuro (SHSS---) de las protenas del huevo. Quizs sea este equilibrio el que regula la organizacin animal-vegetativa del huevo de erizo de mar. Estos experimentos y los resultados hasta cierto punto frustrantes de los intentos anteriores hacen pensar que la solucin de este problema difcilmente puede esperarse de los estudios realizados sobre parmetros tan generales como la respiracin o la sntesis proteica total. Si las protenas estn relacionadas con la diferenciacin animal-vegetativa, deben buscarse protenas especficas en vez de protenas totales. En este sentido, el grupo sueco de Runnstrom y Horstadius ha dado un importante primer paso, aislando sustancias de actividad animalizadora y vegetalizadora a partir de vulos no fecundados de erizo de mar. Aunque estas sustancias an no han sido estudiadas exhaustivamente, se sabe ya que se trata de pptidos, que mediante cromatografa pueden separarse en agentes animalizadores y agentes vegetalizadores. Uno de ellos contiene tript6fano, y otro parece estar ligado a un nucletido. Naturalmente, sera de gran inters saber si en el estado de mrula los agentes animalizadores estn en el polo animal y los vegetalizadores en el vegetativo. Si en la diferenciacin animal-vegetativa estn envueltas protenas o polipptidos, se podra esperar la intervencin de un RNA en su sntesis, aunque evidentemente no se puede descartar la posibilidad de que existieran previamente en cantidades suficientes. En este sentido es de notar el trabajo de Czihak, que por autorradiografa descubri que las primeras clulas que sintetizan RNA en su ncleo, durante el estadlo de 16 clulas, son los micrmeros. Este RNA de bajo peso molecular (constante de sedimentacin de alrededor de 5 S) difunde fuera del ncleo y se traslada a las clulas vecinas, como se pudo demostrar injertando micrmeros marcados en mitades animales aisladas no marcadas. Dado que los micrmeros injertados son capaces de inducir la formacin de un arqunteron secundario en las mitades animales aisladas, es tentador el especular con la posible funcin del RNA de 5 S recin sintetizado en esta induccin. Adems, el bajo peso molecular de este RNA concuerda bien con el hallazgo de que los factores animalizadores y vegetalizadores son polipptidos pequeos. La segunda cuestin bsica que nos plantebamos respecto a la embriologa molecular del huevo de erizo de mar esta en relacin con el clsico experimento de Driesch sobre.regulacin embrionaria. Si cada uno de los dos primeros blastmeros es capaza de formar un embri6n completo cuando estn separados y solo medio cuando estn unidos, parece lgico deducir que el material que los mantiene unidos debe tener propiedades inhibitorias sobre el desarrollo. Recientemente hemos podido estudiar este problema experimentalmente, pues el cemento intercelular que mantiene unidos a los blastmeros puede eliminarse colocando al huevo en agua de mar carente de calcio y de magnesio. Se introdujeron mrulas de erizo de mar en este tipo de medio para disociar sus blastmeros.

Posteriormente se recupero este "medio condicionado", en el que los blastmeros disociados se haban desarrollado durante 1 a 2 horas y se le repuso el calcio y el magnesio. Al investigar los efectos de este medio condicionado sobre huevos "receptores" recin fecundados, se hallo que era capaz de detener su desarrollo en el estado de mrula tarda o de blstula. Estos experimentos muestran que, como preveamos, la matriz intercelular que mantiene unidos los blastmeros tiene efectos inhibitorios sobre el desarrollo del huevo de erizo de mar. Es posible obtener medios condicionados con propiedades inhibitorias a partir de vulos no fecundados, huevos fecundados o blstulas. En cambio, los obtenidos a partir de gstrulas no tienen efectos sobre el desarrollo de huevos receptores normales, lo cual demuestra que la matriz que une las clulas sufre cambios cualitativos o cuantitativos durante el desarrollo. El medio condicionado no tiene una especificidad de especie importante. Un medio preparado a partir de huevos de Paracentrotus es capaz de inhibir el desarrollo, de huevos de Arbacia, aunque de manera ligeramente menos efectiva. Si se calienta, el medio condicionado a 60, la actividad inhibitoria desciende, aunque sin llegar a desaparecer. Es de notar que el medio condicionado preparado a partir de mrulas frecuentemente tiene una intensa accin animalizadora, incluso despus de ser calentado, lo cual sugiere que entre los constituyentes de la matriz intercelular, compuesta fundamentalmente por glicoprotenas, pueden hallarse los polipptidos termoestables animalizadores descubiertos en los vulos no fecundados. Mn es pronto para decir si la continuacin de estos trabajos nos har comprender la regulacin embrionaria en los huevos de erizo de mar, pero por muy incompletos que sean los actuales resultados, dan bases para nuevas investigaciones, bases que no podan hallarse en el concepto filosfico de "entelequia" de Driesch. CAPITULO 8 EMBRIOLOGA QUIMICA DE LOS HUEVOS DE VERTEBRADOS Este capitulo versar fundamentalmente sobre los huevos de anfibios, dado que hay muy pocos trabajos realizados sobre otro tipo de huevos. Son de notar los estudios de un grupo de investigadores rusos sobre los huevos de un pez, la locha Misgurnus fossilis, recientemente revisados por Kafiani. De la biologa molecular de los reptiles se sabe muy poca cosa. Se ha trabajado bastante sobre embriones de polio, pero siempre en estados tardos del desarrollo, pues su segmentacin parcial y el pequeo tamao del embrin en comparacin con la enorme masa de vitelo hacen difcil el estudio de su embriologa molecular. Los embriones de mamfero deben ser cultivados in vitro, por lo que el material disponible para estudios bioqumicos es muy limitado. Los periodos del desarrollo que vamos a estudiar fundamentalmente en este captulo son la gastrulacin, caracterizada por intensos movimientos celulares, y la neurulacin, en que como consecuencia de una induccin se produce la organognesis primaria. La neurula contiene un sistema nervioso cerrado, una corda (notocorda), un mesodermo que se subdivide en somitas (que darn lugar principalmente a los msculos y al esqueleto), las piezas intermediarias (que formaran los riones) y las placas polares (que darn lugar a los glbulos rojos de la sangre y a la cavidad peritoneal del adulto). En el centro de la neurula el mesodermo esta an indiferenciado. La Figura 57 muestra diferentes secciones de una neurula; y en la Figura 16 puede verse un esquema del proceso de la gastrulacin.

Para ms detalles, el lector interesado puede consultar cualquiera de los mltiples libros de texto existentes sobre embriologa descriptiva y experimental. El problema fundamental que vamos a discutir es el de los aspectos moleculares de la induccin neural. Sus bases experimentales ya han sido presentadas en el captulo 3, y los experimentos mas importantes se muestran de una manera esquemtica en la Figura 19. Si se extirpa el ectoblasto de una gstrula y se cultiva in vitro, solo se consigue una diferenciacin a ectodermo (piel). Si el mismo ectoblasto se pone en contacto con el organizador (borde dorsal del blastoporo, que se diferenciar posteriormente a corda), este ectoblasto se transformar por induccin en un sistema nervioso. Pero antes de llegar al problema fundamental, hay que decir unas palabras sobre la respiracin del huevo de anfibio durante los periodos de gastrulacin y de neurulacin. 1. Respiracin de la gstrula y de la nurula El consumo de oxigeno, que aumentaba lentamente durante la segmentacin, muestra un incremento mucho mas intenso durante la gastrulacin y sobre todo durante la neurulacin. Los efectos de la anaerobiosis y del cianuro se hacen mucho ms enrgicos que durante el periodo de segmentacin, y si se suprime la energa producida por la oxidacin celular, el desarrollo tarda muy poco en detenerse. Con la gastrulacin aumenta el cociente respiratorio (CO2/02), lo cual sugiere que la gstrula utiliza fundamentalmente hidratos de carbono como fuente de energa. En apoyo de ello esta el hecho de que el glucgeno no se degrada de forma apreciable durante la segmentacin, y en cambio durante la gastrulacin y la neurulacin hay una importante actividad de glucogenolisis. Se han realizado laboriosos trabajos para medir la respiracin de fragmentos aislados de diferentes partes de la gstrula. Como se muestra en la figura 58, los huevos fueron cortados en 6 partes diferentes que correspondan, respectivamente, a (1) ectoblasto dorsal (tambin llamado neuroblasto, porque normalmente dar lugar al sistema nervioso); (2) ectoblasto ventral, que formar la piel; (3) cordoblasto (el organizador"); (4) mesoblasto ventral, sin capacidad inductora; (5) endoblasto dorsal; y (6) endoblasto ventral. El consumo de oxigeno de estas 6 partes decrece de acuerdo con una regla muy simple: 1 > 2 > 3 > 4 > 5 > 6. Esto significa que la velocidad de respiracin vara segn dos gradientes, uno animal-vegetativo y otro dorso-ventral. El borde dorsal de blastoporo (fragmento nm. 3) tiene un metabolismo de hidratos de carbono mucho mas activo que el mesoblasto ventral (fragmento nm. 4), que unas horas mas tarde se invaginar y dar lugar al borde ventral del blastoporo. Inicialmente se pens que el elevado metabolismo hidrocarbonado del borde dorsal tendra alguna relacin con su actividad inductora. Actualmente esta idea no se acepta, y se cree que este intenso metabolismo se utiliza para la consecucin de los movimientos morfogenticos. Como ya hemos dicho, la invaginacin comienza antes en el borde dorsal que en el ventral, y este movimiento celular va acompaado de una intensa degradacin de las reservas de glucgeno de ambos bordes del blastoporo.

En cualquier caso, la induccin del sistema nervioso se acompaa de un aumento del consumo de oxigeno. Si, como vimos, se ponen en contacto un fragmento de ectoblasto con un fragmento de cordoblasto, se produce la inducc4n neural; mientras que si los dos fragmentos se mantienen separados no habr induccin alguna. La respiracin es mas elevada y aumenta mas rpidamente en el primero de los casos (fragmentos en contacto) que en el segundo (fragmento separados). Esto no debe sorprendernos, pues, como veremos, la induccin se caracteriza por un rapidsimo aumento de la sntesis de cidos nucleicos y protenas, y estos procesos requieren la intervencin del ATP, cuya sntesis esta acoplada a las oxidaciones mitocondriales. Por ello, durante la induccin neural las mitocondrias aumentan de tamao, se hacen estructuralmente ms complejas y adquieren un mayor contenido de citocromoxidasa . Tambin en los huevos de aves y mamferos puede verse que la morfognesis precisa de la produccin de energa. Se pueden sacar del vitelo embriones de pollo muy jvenes, cultivarlos in vitro en un medio simple con sales y obtener su diferenciacin en sistema nervioso, corda, somitas, etc. Pero el cultivo no tendr xito a menos que aadamos al medio glucosa u otro azcar metabolizable. En los huevos de mamferos deben tambin aadirse al medio productos intermedios del metabolismo de los hidratos de carbono para que se produzca la segmentacin y el ulterior desarrollo. 2. Naturaleza de las sustancias inductoras Desde que, alrededor de 1930, se descubri que el borde dorsal hervido o tratado con alcohol an tiene capacidad de induccin (aunque menos normal que la sustancia viva), se han realizado mltiples intentos de aislar la sustancia inductora. Esta bsqueda dio durante mucho tiempo resultados frustrantes y desesperanzadores por razones inesperadas. Las clulas del ectoblasto reaccionan "demasiado Bien", y sufren transformacin neural incluso cuando son tratadas simplemente con agentes estimulantes inespecficos. Los primeros experimentos, debidos principalmente a Holtfreter, mostraron que prcticamente cualquier tejido animal o vegetal puesto en contacto Intimo con clulas "competentes" (esto es, clulas tomadas de la regin del polo animal de una gstrula joven) era capaz de inducir la formacin de un sistema nervioso. Slo los tejidos muy inactivos, del tipo de la piel de pltano o las alas de insecto, eran incapaces de dar lugar a la reaccin. Se dedujo que la sustancia inductora (tambin llamada evocador) estaba presente en todos los tejidos, y que seria relativamente fcil aislarla y purificarla a partir de rganos grandes, como el hgado de buey o de caballo. Pronto se descubri6 que muchas sustancias no relacionadas, como los esteroles, los cidos grasos, el glucgeno, los nucletidos, el ATP, etc., eran capaces de inducir la formacin de sistema nervioso. Inicialmente se pens que estos resultados inespecficos seran debidos a la presencia de algunos contaminantes comunes en las preparaciones utilizadas para las pruebas biolgicas. Pero hacia 1935 se descubri que incluso compuestos puramente sintticos, como los colorantes bsicos azul de metileno y rojo neutro, eran activos. Esto condujo a la conclusin de que todas estas sustancias qumicas actuaban de manera indirecta, liberando de forma inespecfica al verdadero inductor, que

debla estar presente en las clulas ectoblsticas competentes en una forma compleja y encubierta. La mayora de los embrilogos interesados en el problema (y yo entre ellos) abandonaron la bsqueda cuando Holtfreter demostr que una simple variacin del pH de la solucin salina en la que se cultivaban fragmentos de ectodermo era capaz de producir numerosos casos de transformacin espontanea' del ectoblasto en clulas nerviosas. No menos penoso era el hecho de que sales simples como el C1Li o el CLNa, as como el polvo de vidrio o el Tefln eran tambin buenos inductores de la formacin de sistema nervioso. De hecho, incluso el CO2 y el amoniaco eran activos, de forma que uno tenia que llegar a la triste conclusin de que el organizador podra actuar simplemente produciendo estos sencillos productos finales de su metabolismo, que liberaran una sustancia "neurognica" desconocida a partir de un complejo inactivo presente en las clulas del ectoblasto competente. Fue preciso un gran valor por parte de investigadores como Yamada y Tiedemann para volver a abordar el problema, hacia el ao 1950. Seleccionaron especies de anfibios en las que era difcil obtener una neuralizacin espontanea del ectoblasto explantado, y en las que la simple insuflacin de CO2 en el medio era insuficiente para transformar el ectoblasto en clulas nerviosas; buscaron protenas que fueran agentes inductores especficos, y pudieron al menos demostrar un punto: efectivamente es posible aislar con casi total pureza protenas con diferentes capacidades inductoras especificas. Una protena soluble, que puede aislarse y purificarse a partir de medula sea o de embriones de pollo, actita como factor mesodermalizante transformando el ectoblasto de una gstrula en un tejido mesodrmico del tipo de la corda o el msculo. El ectoblasto, que normalmente habra formado epidermis (o clulas nerviosas, si estuviera en presencia de un inductor) se convierte en una cola que no tiene o casi no tiene sistema nervioso. Otra protena, que esta asociada a los ribosomas de los embriones de pollo, es un factor neuralizante, que a bajas concentraciones es capaz de transformar clulas ectoblsticas en clulas neurales con gran eficacia. Una tercera protena es un inhibidor del factor mesodermizante, y quizs tenga una funcin de control sobre su actividad. A pesar de que no puede descartarse del todo la posibilidad de un mecanismo basado en la liberacin de otra sustancia activa,- hoy en da parece difcil poner en duda que existen diferentes protenas con distintos efectos sobre la morfognesis, y que estos efectos son especficos. Esto nos hace pensar que concretamente en el propio embrin normal de anfibio, es muy posible que existan varias protenas responsables de la diferenciacin del sistema nervioso sobre el tejido mesodrmico. De hecho, recientemente se ha descubierto que los embriones de anfibio, efectivamente contienen un factor mesodermalizante, biolgicamente similar al aislado a partir de embriones de pollo. Para completar esta demostracin sera importante saber si estos factores mesodermalizantes obtenidos a partir de medula sea, embriones de polio y gstrulas de anfibio son tambin qumicamente similares y si pertenecen a la misma clase de protenas. Como puede verse, existen grandes analogas entre dos problemas ya que hemos discutido: los gradientes animal y vegetativo del huevo de erizo de mar y la induccin neural del huevo de anfibio. En ambos casos el sistema biolgico es extraordinariamente sensible a los efectos de agentes tan simples como iones o pequeas molculas orgnicas;

y esto fue y sigue siendo un serio obstculo para la embriologa molecular. En cualquier caso, los intentos realizados en los arios recientes de aislar sustancias especficas biolgicamente activas a partir de los propios huevos han sido ya gratificantes. Su continuacin debiera posibilitarnos el anlisis de las bases moleculares de la diferenciacin, tanto de los huevos de erizo de mar como en los de anfibio. 3. Localizacin y sntesis del RNA Como ya sabemos, los ribosomas estn distribuidos en los anfibios segn un gradiente decreciente animal-vegetativo, que se observa en el oocito, el vulo no fecundado y la blstula. Parte de estos ribosomas estn en forma de polisomas, pues la sntesis proteica sigue el mismo gradiente, decreciente progresivamente del polo animal al vegetativo. Este gradiente de polaridad preformado es de gran importancia para el futuro desarrollo, pues el polo animal dar lugar a la cabeza del renacuajo y del adulto, mientras que del polo vegetativo se originar la cola. El gradiente de polaridad preformado corresponde pues al gradiente antero-posterior o cefalocaufal del embrin . La organizacin dorsoventral es mucho menos evidente en estos estados tempranos del desarrollo. Ya vimos en ciertas especies la aparicin de un creciente gris en el huevo fecundado. La localizacin de este creciente gris, que corresponde aproximadamente al futuro borde dorsal de blastoporo (es decir, al cordoblasto, que mas tarde inducir la formacin del sistema nervioso) puede ser fijada a voluntad por el investigador (Figura 59). Si se coloca el huevo en posicin oblicua y as se fecunda, se formar la membrana de fecundacin, y por efecto de la gravedad, el huevo rotar como indica la flecha. Tras la rotacin, el polo animal quedar en posicin superior, el vegetativo quedara en la parte inferior; el creciente gris y posteriormente el borde dorsal del blastoporo aparecer siempre en el lado indicado en la Figura 59 por una bombilla. Naturalmente, esto no es debido a un efecto fotodinmico, y el resultado ser el mismo exista o no luz elctrica. La formacin del creciente gris se debe a cambios corticales que ocurren durante la rotacin del huevo, y quizs en concreto al engrosamiento de la capa cortical, que simultneamente aumento su permeabilidad. Como ya mencionamos, si el cortex del creciente gris es lesionado por puncin, se producen embriones deficientes, con una corda y un sistema nervioso muy pobremente desarrollados. Dado que el borde dorsal del blastoporo es tan activo en la morfognesis por su capacidad inductora, parecera lgico suponerle una actividad de sntesis de RNA y protenas mayor que la de las regiones ms ventrales de la gstrula. Si fuera as, el creciente gris podra estar dotado de unas propiedades especiales, incluso en el huevo fecundado, que le permitiran ejercer algn tipo de control sobre la actividad de los ncleos de la mitad dorsal del embrin. Desgraciadamente, por una razn inesperada, los experimentos realizados para probar esta hip6tesis no han dado resultados todo lo concluyentes que seria de desear. Una ligera lesin del creciente gris, o, en menor grado, de otras regiones del cortex del huevo, produce con gran frecuencia anormalidades mitticas en el huevo en segmentacin. Es frecuente en estos huevos levemente lesionados la aparicin de mitosis pluricntricas que conducen al aneuploidismo, condicin que, como ya vimos, es letal; y por lo tanto si un huevo cuyo cortex ha sido ligeramente daado detiene su desarrollo en el estado de blstula, es casi imposible saber si esta detencin es debida a una lesin citoplsmica o una lesin nuclear (aneuploidismo). La respuesta vino gracias a unos experimentos en los

que se lesionaba el cortex dorsal (creciente gris) o el ventral, y despus se microinyectaba uridina marcada (precursor de la sntesis de RNA). As se pudo demostrar que la sntesis de RNA corre siempre paralela al desarrollo. Si el desarrollo se detiene en una fase temprana, por ejemplo en el estado de blstula, la sntesis de RNA ser prcticamente nula; si se desarrollan embriones anormales, existir una estrecha relacin entre las deficiencias en la morfognesis y el descenso en la sntesis de RNA. Adems, se observo que los casos de detencin del desarrollo o de embriognesis anormal son mucho mas frecuentes tras lesin del cortex dorsal del huevo fecundado que cuando se lesiona el ventral. El anlisis se hace mucho ms fcil en el estado de gstrula, pues el lado dorsal se aprecia claramente por la presencia del borde dorsal del blastoporo. Estudios citoqumicos, posteriormente confirmados por anlisis bioqumicos, han demostrado que el contenido en RNA es superior en el borde dorsal que en el ventral; y trabajos posteriores utilizando uridina marcada como trazador han evidenciado que, as mismo, la sntesis nuclear de RNA es mas importante en el borde dorsal que en el ventral. Como era de esperar, tambin la sntesis proteica es mayor en aquel que en este. El borde dorsal contiene menos vitelo, pero ms ribosomas y polisomas que el ventral, como se muestra esquemticamente en la Figura 20. Estudios similares, aunque menos extensos, indican que lo mismo ocurre en los embriones de los dems vertebrados (exceptuando quizs a los mamferos). Al gradiente de polaridad inicial del huevo fecundado corresponde el gradiente anteroposterior (cefalocaudal) de distribucin del RNA; posteriormente aparece un gradiente dorsoventral de sntesis de RNA, que se sobreimpone al anteroposterior preexistente, y que solo se hace claramente visible al producirse la gastrulacin. Aparentemente, la morfognesis resulta de la interaccin entre estos dos gradientes de distribucin y de sntesis de RNA, que son desde luego idnticos a los gradientes morfogenticos de la embriologa experimental. Naturalmente, es de vital importancia para los embrilogos moleculares el saber mas sobre el tipo de RNAs sintetizados durante la gastrulacin y la neurulacin. Una parte importante de estos RNAs recin sintetizados son sin duda tRNAs y rRNAs. Los nucleolos aparecen poco antes de la gastrulacin; y como era de prever, su reaparicin va ligada a la sntesis de precursores nucleolares de rRNA y de rRNAs citoplsmicos. La gastrulacin es pues el estado en que se producen nuevos ribosomas. Existen buenas evidencias de que las sntesis de los rRNAs de 28 S y 18 S, as como la de protenas ribosmicas estn coordinadas, pues el citoplasma no comienza a formar estos ltimas hasta que, en el estado de gstrula, los organizadores nucleolares vuelven al trabajo y "desreprimen" la sntesis de rRNA. Gracias a los trabajos de Denis tenemos abundante informacin sobre la sntesis de mRNA. Sus experimentos de hibridacin molecular muestran la aparicin, durante la gastrulacin de los anfibios, de una nueva poblacin de mRNAs estado-especficos, es decir que no pueden detectarse en estados posteriores del desarrollo, y que probablemente estn relacionados con los movimientos celulares caractersticos de la gastrulacin. Para estados ms avanzados del desarrollo se admite como regla general que poco antes de la diferenciacin de cada rgano, se sintetizan molculas nuevas e

inestables de mRNA, y que cuando la organognesis ha concluido y comienza la diferenciacin citolgica de las clulas (por ejemplo, cuando se forman neuronas en el tubo neural an indiferenciado), aparecen molculas de mRNA estables. Durante la induccin neural hay un claro aumento de la sntesis de DNA (como demuestra la intensa actividad mittica), as como de RNA y de protenas. El ncleo sintetiza nuevas especies de mRNA, y esta sntesis puede ser inducida en fragmentos aislados de ectoblasto por el simple hecho de aadir al medio los factores proteicos neuralizantes y mesodermalizante antes mencionados. Es claro que la induccin neural se acompaa de una desrepresion del genoma. Ello produce un gran aumento en la sntesis de nuevos mRNAs, que a su vez conducen a la formacin de sus correspondientes protenas. Volvamos ahora al problema de la estimulacin de la sntesis de rRNA al final de la segmentacin. En la desrepresin de los genes del organizador nucleolar que ocurre en este estado toman parte sin duda factores citoplsmicos. Si los huevos fecundados son levemente centrifugados para incrementar la concentracin de plaquetas vitelinas en la mitad vegetativa, los nucleolos que aparecen en esta regin son de muy pequeo tamao o no aparecen en absoluto; mientras que por el contrario, se estimula su formacin y crecimiento en las proximidades del polo animal (centropetal). Los acmulos de plaquetas vitelinas ejercen pues una actividad inhibitoria sobre los organizadores nucleolares. Se han hecho varios intentos de demostrar durante la segmentacin la existencia de un represor especfico de los organizadores nucleares, pero hasta el momento no se han obtenido resultados concluyentes. Son mucho ms notables las evidencias genticas que demuestran que los organizadores nucleolares estn directamente relacionados con la sntesis de los rRNAs de alto peso molecular (28 S y 18 S). Se ha descubierto en Xenopus una mutacin consistente en la perdida selectiva de los organizadores nucleolares como consecuencia de una deleccin cromos6mica. Los organismos normales poseen dos organizadores nucleolares, localizados en una parte de los cromosomas, y que habitualmente dan lugar a dos nucleolos. La perdida por deleccin de uno de los organizadores nucleolares trae como consecuencia la formacin de un solo nucleolo, aunque ello no afecta para nada al desarrollo; y estos animales "heterozigticos" dan lugar a adultos perfectamente normales. Los adultos heterozigticos pueden ser cruzados entre si, y como era de esperar por las leyes de Mendel, el 25 por ciento de su descendencia no presenta ningn organizador nucleolar. Estos mutantes nu-0 son letales, y mueren cuando los renacuajos comienzan a alimentarse. Brown y Gurdon han demostrado que no son capaces de sintetizar rRNAs de 28 S y de 18 S, y que as mismo, su sntesis de protenas ribosmicas es deficitaria, lo que demuestra definitivamente que los organizadores nucleolares son los responsables directos de la sntesis de todos los ribosomas formados por el huevo. El que el desarrollo de estos mutantes alcance etapas relativamente avanzadas del estado de larva confirma que el oocito construye una reserva de ribosomas suficiente como para llegar, sin mas sntesis ribosmica, a un estado del desarrollo en que el renacuajo es capaz de hallar la comida por si solo.

4. Relacin entre sntesis de RNA y morfognesis Muchos experimentos han confirmado, de forma indirecta pero convincente, que, como vimos, existe una estrecha correlacin entre la sntesis de RNA y el desarrollo embrionario. Vamos a describir brevemente los ms importantes. Por ejemplo, si en los huevos de anfibio se inyecta ribonucleasa, enzima capaz de degradar el RNA (y especialmente el mRNA), el desarrollo se detiene en la segmentacin; pero si a estos huevos tratados con ribonucleasa se les aade RNA, se forma un sistema nervioso. La actinomicina, que no inhibe la segmentacin de los huevos de anfibio, si es capaz de bloquear su gastrulacin; y en estados ms tardos da lugar a embriones microceflicos o incluso casi totalmente indiferenciados. Sin embargo, ciertos rganos son ms resistentes a la droga que otros. Por ejemplo, pueden formarse riones y odos en embriones prcticamente carentes de sistema nervioso. Este hallazgo concuerda con la hiptesis de que ciertos mRNAs relacionados con la diferenciacin embrionaria son ms estables que otros. La actinomicina inhibira la sntesis de los mRNAs inestables requeridos para la organognesis del sistema nervioso sin afectar a los mRNAs preexistentes, ms estables, que se encuentran en las areas del odo y los riones. Otros experimentos con actinomicina han confirmado que la induccin es realmente una desrepresion. Si un organizador es tratado con actinomicina y puesto en contacto con un ectoblasto normal, se produce la induccin neural. Por el contrario, si un fragmento de ectoblasto tratado con actinomicina se pone en contacto con un organizador normal, no se observa ningn tipo de diferenciacin neural. El ectoblasto es incapaz de responder al estimulo inductor si no puede sintetizar RNA; en cambio el organizador mantiene su capacidad inductora incluso en ausencia de sntesis de RNA. Esto concuerda bien con la hiptesis segn la cual la actividad inductora seria debida a la presencia de protenas preexistentes en el borde dorsal del blastoporo. Los experimentos realizados con otros inhibidores de la sntesis de RNA, como por ejemplo las histonas y la 04 -amanitina, conducen a conclusiones similares. Los trabajos realizados con el inhibidor de la sntesis proteica puromicina, aunque menos extensos que los anteriores, han mostrado que como era de prever, los embriones tratados con esta droga son frecuentemente microceflicos. El desarrollo de los ojos y del cerebro requiere un gran aumento del nmero de clulas, para lo cual obviamente se precisa de sntesis de DNA y de protenas. Es interesante el hecho de que las clulas del ectoblasto mantienen durante ms tiempo su competencia respecto al factor proteico mesodermalizante de Tiedemann si son previamente tratadas con puromicina. Los factores responsables de que, a medida que madura la gstrula, el ectoblasto pierda esta competencia son an desconocidos, pero quizs estn en relacin con la aparicin de nuevas protenas que conduciran a un estado de mayor diferenciacin. Finalmente, algunos experimentos realizados sobre huevos centrifugados y tratados, que no podemos describir aqu, coinciden plenamente con la conclusin de que la morfognesis esta controlada, en los huevos de vertebrados, por la sntesis ordenada de mRNA y protenas a lo largo de los gradientes cefalocaudal y dorsoventral (Figura 20).

5. Tamao y modo de accin del agente inductor Durante la induccin neural existe un estrecho contacto entre las clulas inductoras del cordoblasto y las clulas reaccionantes del neuroblasto. As mismo, se observe) que si dos fragmentos explantados de cordoblasto y de neuroblasto se colocaban juntos, rpidamente se pegaban uno al otro. Mas adelante volveremos sobre las propiedades de la membrana en la gstrula, pero desde ahora mismo nos podemos plantear dos preguntas: Existe durante la induccin algn movimiento de sustancias qumicas de una clula a otra? Es necesario el contacto ntimo entre el tejido inductor y el tejido que reacciona para que se produzca la induccin? Experimentos con tejidos explantados, previamente tenidos con colorantes vitales o tratados con precursores marcados de la sntesis de RNA o de protenas, muestran que existe un paso de molculas relativamente grandes de las clulas inductoras a las reaccionantes. Pero la migracin no ocurre solo en este sentido, y pudo observarse que los colorantes y los contrastes radiactivos tambin podan moverse desde el tejido reaccionante hacia el inductor. Por lo tanto, los experimentos no demuestran la existencia de un transvase unidirectional de macromolculas, responsable de la induccin neural. Examinemos ahora la segunda cuestin. En los primeros experimentos se introdujo una membrana de celofn entre los fragmentos de cordoblasto y de ectoblasto, y se observe) que esto hacia desaparecer la actividad inductora, por lo que se dedujo que para que se produjera la induccin era indispensable un contacto directo entre los tejidos reaccionantes. El experimento permite otra conclusin. Dado que las membranas de celofn no permiten el paso de molculas grandes del tipo de las protenas y los cidos nucleicos pero si de molculas pequeas, es claro que la induccin neural no puede ser simplemente el resultado de una sobreproduccin de pequeas molculas del tipo del CO, , amoniaco o cido lctico por parte de las clulas inductoras. Ulteriores experiencias mostraron que, aunque la segunda conclusin permanece valida, la primera (la necesidad de un contacto ntimo entre los dos tejidos) debe revisarse. Si en lugar de la membrana de celofn se utilizan filtros de "milipore", que permiten el paso de macromolculas sin filtrar las clulas, es posible obtener inducciones a travs del filtro. La microscopia electrnica muestra que las clulas de los dos tipos de tejidos envan largos filamentos (11amados pseuclpodos o filpodos) a travs de los poros del filtro, pero los filamentos de un tejido nunca llegan a ponerse en contacto con los del otro. Por lo tanto, la induccin es debida a la liberacin de sustancias solubles por parte de la clula inductora, aunque an no se ha descartado una posible intervencin de las glicoprotenas que forman la matriz intercelular. El hecho de que se pueda obtener una induccin tratando fragmentos de ectoblasto explantados con una solucin de las protenas neuralizantes o mesodermalizantes no hace mas que corroborar que el contacto de clula a clula no es indispensable para que se produzca la induccin. De hecho, se ha comprobado por mtodos citoqumicos que las protenas inductoras son tomadas por las clulas mediante pinocitosis, y que parte de ellas pueden ser ms tarde vistas en el ncleo, donde quizs tenga una funcin de desrepresi6n de la cromatina.

Es de notar que el proceso de induccin a travs de filtro no se limita a la induccin del sistema nervioso de los anfibios. Se han realizado observaciones similares en la induccin del sistema nervioso en aves, del cristalino por parte de la copa ptica, de los tbulos renales, de las clulas glandulares del pncreas, etc. Parece pues generalizable que no se precisa de contacto ntimo entre inductor y reaccionante para que se produzca una induccin. 6. Bases moleculares de los movimientos celulares Los movimientos celulares constituyen una parte esencial de la morfognesis temprana, y particularmente de la gastrulacin y la neurulacin. Durante esta ltima, el sistema nervioso forma inicialmente una placa, posteriormente se transforma en canal y finalmente da lugar a un tubo. La transformacin de la placa neural en tubo neural es totalmente bloqueada por el mercaptoetanol, que posee grupos SH y que, como vimos, tambin es capaz de impedir la formacin del aparato mittico durante la segmentacin. As mismo, otras sustancias que afectan el equilibrio SHSS tambin inhiben el cierre del tubo neural. Por el contrario, si una neurula joven, que an tiene el sistema nervioso en forma de placa neural, es tratada con ATP, se observa una marcada aceleracin del proceso de formacin y cierre del tubo neural, Naturalmente, las sustancias del tipo del ATP y del mercaptoetanol tienen mltiples efectos colaterales sobre la sntesis de macromolculas, pero es posible que, como en el caso del aparato mittico y de los surcos divisorios, su diana fundamental sean los microtbulos y los microfilamentos contrctiles previamente mencionados (capitulo 6). Recientes trabajos han aportado abundantes evidencias en favor de esta hiptesis. Tanto la colchicina (que reacciona con la tubulina) como la citocolasina B (que destruye los microfilamentos) inhiben la gastrulacin y la neurulacin en los huevos de anfibio. Estos importantes procesos morfogenticos deben originarse por la intervencin de protenas contrctiles que, induciendo contracciones localizadas en las clulas, modificaran su forma. Las clulas de la blstula tienen una forma cubica; pero la constriccin resultante de la contraccin del anillo de microfilamentos situados en su extremo apical cambiaria su forma, convirtindolas en clulas trapezoidales. Si este cambio ocurriera en un gran nmero de clulas vecinas, toda la poblacin de clulas sufrira los intensos movimientos tan caractersticos de la gastrulacin y la neurulacin. Recientes estudios a nivel molecular sobre los cambios de forma que sufren las clulas en estos primeros pasos de la morfognesis han demostrado que, durante la formacin del sistema nervioso en la neurula, los responsables del aumento de longitud de las clulas son los microtbulos, mientras que los microfilamentos contrctiles se encargan de la constriccin apical que cambia su forma. Probablemente, las futuras investigaciones que se realicen en este campo darn interesantes e importantes resultados. CAPITULO 9 INTERACCIONES BIOQUMICAS ENTRE EL NUCLEO Y EL CITOPLASMA DURANTE LA MORFOGNESIS Repetidas veces hemos visto como el ncleo y el citoplasma se influyen recprocamente todo a lo largo del desarrollo normal del huevo. Estas interacciones pueden ser modificadas experimentalmente de dos formas diferentes. La tcnica ms radical seria cortar el huevo en dos partes y comparar las potencialidades morfogenticos y

bioqumicas de las mitades nucleada y anucleada. La otra posibilidad seria modificar el ncleo, por ejemplo introduciendo un ncleo extrao en el huevo, por hibridacin o por transplante nuclear. Este capitulo versar fundamentalmente sobre los estudios bioqumicos realizados en fragmentos anucleados de huevos y en hbridos. Sin embargo, vamos a comenzar con un material diferente: el alga unicelular gigante Acetabularia; pues este organismo presenta numerosas ventajas para el estudio de la funcin del ncleo en la morfognesis y de las interacciones bioqumicas entre ncleo y citoplasma. 1. Biologa y bioqumica del alga Acetabularia (a) Ciclo biolgico Regeneracin El alga verde gigante Acetabularia, que mide 5 cm de longitud, contiene un solo ncleo durante la mayor parte de su ciclo vital (Figura 60). Este ncleo, grande, con poca cromatina, y provisto de un nucleolo gigante rico en RNA, esta situado en la parte basal del alga (llamada rizoide). En el extremo apical del tallo, el alga uninucleada forma una sombrilla (o sombrerete), que posteriormente ha de servir para su reproduccin sexual (formacin de cistes, que a su vez darn lugar a los gametos). La morfologa del sombrerete es especie-especfica, y permite una clasificacin taxonmica de las diferentes especies de Acetabularia. Las especies mas importantes para los bioqumicos son A, mediterrnea y A. crenulata, que pueden ser fcilmente cultivadas en grandes cantidades en el laboratorio. En Acetabularia, la morfognesis esta afectada por la cantidad de luz que recibe. Si el aporte de luz es abundante, rpidamente se forman sombreretes sobre tallos cortos; mientras que si el alga recibe poca luz, se forman tallos muy largos, los sombreretes tardan en aparecer y son de pequeo tamao. La ausencia total de luz detiene el crecimiento e induce numerosos cambios degenerativos en el ncleo (disminucin del tamao, reduccin del contenido en RNA y de las dimensiones del nuclolo), que son reversibles si se vuelve a aportar luz al alga. Este sencillo experimento muestra claramente que la estructura y la composicin qumica del ncleo dependen de la energa, derivada de la fotosntesis, que aporta el citoplasma. Acetabularia se ha convertido en un sujeto fascinante para los bilogos y los bioqumicos desde el fundamental trabajo de Hammerling, aproximadamente en 1930. Este autor descubri que si el alga es cortada en dos pedazos, tanto el fragmento nucleado como el anucleado son capaces de regenerar y formar un sombrerete tpico. Los fragmentos anucleados pueden sobrevivir durante varias semanas y formar sombrillas siempre y cuando este presente la porcin apical del tallo. El alga contiene pues sustancias morfogenticos distribuidas a lo largo de un gradiente apicobasal. Como se muestra en la Figura 61, los fragmentos basales, a pesar de que estn pr6ximos al ncleo, difcilmente son capaces de regenerar y nunca forman sombreretes. Sin embargo, las sustancias morfogenticos son producto de los genes, y provienen del ncleo. Esto tambin ha sido demostrado por Hamerling, que consigui injertar fragmentos nucleados de A. mediterrnea sobre tallos anucleados de A. crenulata y viceversa. El resultado es, en general, la formacin de un sombrerete "hibrido", que pronto degenera y es sustituido por

el sombrerete tpico del fragmento nucleado. Hay una especie de "lucha" entre las sustancias morfogenticos preexistentes en la mitad anucleada de una de las especies, y las sustancias recin formadas por el ncleo presente en la mitad nucleada. La batalla es finalmente ganada por el ncleo. Las causas que hacen que el gradiente de distribucin de las sustancias morfogenticas decrezca del extremo apical del tallo hacia el basal y no en la direccin opuesta, como era de prever dado su origen nuclear, no estn an claras. Recientes experimentos realizados por investigadores rusos han mostrado que es posible desplazar por centrifugacin prcticamente todo el contenido del alga hacia uno de los dos extremos, apical o basal, del fragmento anucleado; y sin embargo la polaridad permanece inalterada y el sombrerete se forma en el extremo que inicialmente era apical. Por lo tanto, es probable que la polaridad este ligada a las propiedades de la membrana y de la pared celular, que en el extremo apical, zona donde se produce el crecimiento, son diferentes. En este extremo apical hay un acmulo de RNA, protenas, glicoprotenas y polisacridos, y resulta posible, aunque no es mas que una hip6tesis, que la membrana contenga receptores especficos para las sustancias morfogenticas. (b) Estudios bioqumicos (1) Sustancias morfogenticas y mRNAs. Evidentemente, el problema fundamental es el de la naturaleza qumica de las sustancias morfogenticas. Hay muchas y buenas razones para pensar que, dado que son sintetizadas en el ncleo y que transportan la informacin necesaria para la produccin de las mltiples protenas precisas para la formacin del sombrerete, las sustancias morfogenticas son una familia de molculas de mRNA estables. Hasta el momento no se ha publicado ninguna experiencia que contradiga esta hiptesis; y en cambio, como veremos hay mltiples evidencias circunstanciales en su favor. Sin embargo, an no se ha conseguido una prueba directa, como seria el aislamiento de los mRNAs producidos por el ncleo y la demostracin de que tienen actividad biolgica. En favor de la hiptesis de que se trata de molculas de mRNA hay numerosos hechos. Las radiaciones UV de longitudes de onda que afectan a la integridad de los cidos nucleicos inhiben la regeneracin de las mitades anucleadas, especialmente cuando lo irradiado es el apex del tallo, punto donde se acumulan las sustancias morfogenticas. La irradiacin de las mitades nucleadas tiene solo efectos transitorios: la regeneracin se detiene pero posteriormente recomienza, siempre y cuando el dao nuclear sea reversible. Como se muestra en la Figura 62, se obtienen resultados similares tratando fragmentos vivos del alga con la enzima ribonucleasa. La perdida de la capacidad de regeneracin es irreversible en el caso de los fragmentos anucleados y reversible en el caso de los nucleados. Aparentemente, la ribonucleasa destruye los mRNAs preexistentes, y no pueden producirse nuevos mRNAs a no ser que el ncleo este presente. La hiptesis de que se trata de molculas de mRNA predecir que, por el contrario, la actinomicina no debiera inhibir la regeneracin de las mitades anucleadas (pues la droga no inactiva los RNAs preexistentes) pero si la de las mitades nucleadas (pues la actinomicina inhibe la sntesis nuclear de nuevas molculas de mRNA). Como muestra la Fig. 62 esquemticamente, los hechos experimentales coinciden plenamente con las predicciones.

Sin embargo, en los fragmentos anucleados tratados con actinomicina, a los pocos dias se puede observar un efecto secundario inesperado. Mientras que la formacin inicial de la sombrilla era perfectamente normal, su crecimiento esta claramente deprimido. Este efecto secundario probablemente es debido a que los cloroplastos, que existen en gran nmero en el alga, contienen su propio DNA. La actinomicina se ligara al DNA cloroplstico y en consecuencia se producira una alteracin de la actividad de la organela que conducira a un crecimiento mas lento del sombrerete. Los cloroplastos tambin contienen grandes cantidades de RNAs de muchos tipos, como veremos mas tarde. La gran abundancia de RNA cloroplstico es una de las causas que explica por que an no se han podido aislar mRNAs nucleares, mucho menos abundantes que los primeros. Sin embargo, la autorradiografa aporta algunas pruebas en favor de la hiptesis de que las sustancias mofogenticas son mRNAs estables. Si un alga normal es tratada durante poco tiempo con uridina marcada, esta resulta rpidamente incorporada al RNA nuclear; y si el alga es posteriormente cultivada en agua de mar normal, se puede seguir la migracin de los RNAs sintetizados en el ncleo, que inicialmente se trasladan al citoplasma, para posteriormente acumularse en el pex del tallo (donde, como sabemos, tambin se concentran las sustancias morfogenticas). (2) Produccin de energa El consumo de oxigeno y la fotosntesis se mantienen normales durante algunos das en los fragmentos anucleados. Despus, el ritmo de fotosntesis, as como el contenido en ATP descienden. Es de particular inters la existencia de un ritmo circadiano en la actividad fotosinttica. Si, se somete a las algas a periodos alternantes de luz y oscuridad de aproximadamente 12 horas cada uno, cuando son cultivadas con .luz continua "recuerdan" este ritmo fotosinttico durante cierto tiempo. Los fragmentos anucleados retienen su ritmo circadiano de fotosntesis durante muchas semanas. Sin embargo, si se injerta un fragmento nucleado con un ritmo determinado en una mitad anucleada que tiene una periodicidad diferente, el ncleo impone su ritmo a los cloroplastos de la mitad anucleada. Es posible combinar en estos experimentos mitades nucleadas que han perdido su ritmicidad con fragmentos anucleados que poseen un ritmo normal, o viceversa, y se observa que solo se mantiene un ritmo circadiano cuando los fragmentos nucleados han mantenido su ritmo. Estos experimentos, as como otros realizados con inhibidores de la sntesis de RNA y de protenas, han mostrado que el ritmo circadiano de fotosntesis de los fragmentos anucleados no es totalmente autnomo; y que sobre este ritmo citoplsmico se puede sobreimponer un control nuclear, probablemente ejercido por mRNAs. Los estudios realizados sobre otros ritmos circadianos hallados en Acetabularia, relacionados con la forma de los cloroplastos, su contenido de RNA, polisacridos y ATP, etc., arrojan resultados y conclusiones similares.

(3) Sntesis proteica Tanto en la mitad nucleada como en la anucleada, el contenido en protenas se dobla aproximadamente en las dos semanas que siguen a la seccin del alga. Dado que muchas de las protenas recin sintetizadas son enzimas especficas y que, como sabemos, la sntesis de enzimas esta controlada por los genes, se deduce que la informacin que emerge de los genes deben conservarse en el citoplasma de los fragmentos anucleados. La nica explicacin que la biologa molecular puede ofrecer para esta paradoja es la intervencin de molculas estables de mRNA sintetizadas en el ncleo y conservadas en el citoplasma. Ciertas enzimas, como por ejemplo las fosfatasas y las enzimas relacionadas con la formacin de la pared celular, muestran un notable aumento de actividad durante la formacin del sombrerete, tanto en los fragmentos anucleados como en los nucleados. Igual que las sustancias morfogenticas, algunas de estas enzimas estn distribuidas a lo largo del gradiente apico-basal, lo cual sugiere que sus correspondientes mRNAs pudieran tener la misma distribucin espacial. En los fragmentos anucleados, la regeneracin se ye rpida e irreversiblemente bloqueada por la puromicina y la cicloheximida, los dos clsicos inhibidores de la sntesis proteica citoplsmica. Por el contrario, el cloranfenicol y la tetraciclina, que inhiben la sntesis proteica cloroplstica y mitocondrial, tienen muy poco efecto sobre la regeneracin. Dado que, en el caso de los fragmentos nucleados, los efectos de la puromicina y la cicloheximida sobre la regeneracin son reversibles, es fcil deducir que las protenas sintetizadas en los polisomas citoplsmicos bajo la direccin de mRNAs de origen nuclear son ms importantes para la morfognesis que las protenas cloroplsticas recin sintetizadas. Los cloroplastos contienen sus propias enzimas, y a primera vista, parecera lgico que su sntesis estuviera controlada por un DNA cloroplstico en vez de un DNA nuclear. Los experimentos realizados por Schweiger, en los que mitades nucleadas de A. mediterrnea eran injertadas en mitades anucleadas de A. crenulata y viceversa, han mostrado que en todo caso esto no es cierto para las lctico y mlico-deshidrogenasas. Las enzimas presentes en los cloroplastos del "hibrido" son progresicamente remplazadas por otras, caractersticas de las especies que aportan el ncleo. El mismo control nuclear ha sido hallado en la sntesis de las protenas insolubles que forman la membrana cloroplstica (4) Sntesis de RNA Como el contenido de protenas, el contenido total de RNA tarda aproximadamente dos semanas en duplicarse en cada uno de los fragmentos. Este gran aumento es debido a la sntesis de RNAs citoplsmicos, especialmente de rRNAs cloroplsticos. Como ya se dijo, la produccin nuclear de mRNAs no es cuantitativamente apreciable, y de hecho hasta el momento no ha sido detectada. Sin embargo, el nucleolo contiene grandes cantidades de un RNA que presenta una composicin de bases diferente de las de los clsicos precursores nucleolares de rRNAs. No es especialmente rico en G + C, y tiene un contenido de bases muy similar al del DNA nuclear. Dado que Acetabularia contiene muy pocos ribosomas en comparacin a la enorme masa de cloroplastos, hasta el

momento no ha sido posible aislarlos y analizar la composicin de bases de sus rRNAs. Quizs el nucleolo de Acetabularia contenga un depsito de mRNAs de composicin similar a la del DNA. Acetabularia tambin contiene RNA "molde", capaz de ser base de una sntesis proteica en un sistema acelular de ribosomas bacterianos. El contenido en RNA "molde" disminuye cuando se forma el sombrerete, de acuerdo con la hip6tesis de que los mRNAs acumulados en el citoplasma resultan degradados cuando ya no son precisos. Esto ocurrirla tras la sntesis de unas enzimas cuya actividad aumentara al formarse el sombrerete. Tambin se ha observado que Acetabularia contiene un tipo muy estable de RNA, que se mantiene radiactivo hasta un mes despus de que las algas tratadas durante pocos minutos con uridina marcada hayan sido trasladadas a agua de mar no radiactiva. Se ha demostrado la formacin de polisomas en mitades anucleadas, especialmente despus de ser sacadas a la luz tras un periodo de cultivo en la oscuridad. Este efecto de la luz sobre la formacin de polisomas sugiere que su mRNA pudiera ser de origen cloroplstico. Los experimentos con rifampicina muestran que la sntesis cloroplstica de RNA tiene una importancia relativamente pequea en la morfognesis. La refampicina inhibe rpidamente la sntesis de RNA cloroplstico, tanto en los fragmentos anucleados como en los nucleados, sin afectar a la sntesis nuclear de RNA; y sin embargo en los fragmentos anucleados tratados con rifampicina se forman y crecen sombreretes razonablemente normales. (5) Sntesis de DNA. Autonoma de los cloroplastos. El gran ncleo de Acetabularia contiene tan poco DNA que resulta indetectable por medios citoqumicos o bioqumicos. Sin embargo, se conoce el contenido y la composicin de bases del DNA de los gametos. Probablemente el DNA nuclear no se replica durante toda la vida vegetativa del alga (que dura varios meses). Solo cuando el sombrerete esta totalmente formado, el gran ncleo se divide, y entonces puede naturalmente detectarse actividad de sntesis de DNA en los ncleos hijos en divisin. Esta situacin es una reminiscencia de la maduracin y la segmentacin de los huevos. Como vimos, la vescula germinal esta especializada en la sntesis de RNA, y los cromosomas plumosos no replican su DNA. La maquinaria de sntesis de DNA se construye durante la maduracin, y se utiliza muy eficazmente durante la segmentacin. Si, como en el experimento de Gurdon, se inyectan ncleos adultos en un oocito, los ncleos continan sintetizando RNA. Si los mismos ncleos se inyectan en un oocito que ya ha sufrido la maduracin, se detiene la sntesis de RNA, y el DNA se replica. Por lo tanto, la eleccin entre transcripcin o replicacin del DNA la determinan factores presente en el citoplasma. Esto mismo ocurre en Acetabularia. Si se corta en dos un alga que ya ha comenzado a formar el sombrerete, se inhibe la rotura del ncleo primario, y no se formaran ncleos hijos ni habr replicacin de DNA. La diseccin ha modificado la composicin qumica del citoplasma de forma tal que, como en el oocito, se impiden los cambios citoplsmicos que determinaran que el DNA nuclear fuera replicado en vez de transcrito.

Por el contrario, tanto en el fragmento nucleado como en el anucleado, existe una intensa actividad de sntesis de DNA cloroplstico y mitocondrial. En ambas mitades, el contenido total de DNA aumenta de 2 a 3 veces durante los primeros 10 das. Pero los experimentos realizados con bromuro de etidio, que se une preferentemente a las molculas de DNA circular presentes en las mitocondrias, hacen pensar que es poco probable que la sntesis citoplsmica de DNA pueda tener una funcin importante sobre la regeneracin en ausencia del ncleo. El DNA cloroplstico puede ser transcrito a RNA cloroplstico, y este traducido, como demuestra el hecho de que los cloroplastos de Acetabularia aislados pueden sintetizar RNA y protenas siempre y cuando se les aporte luz. Como en el caso de las mitocondrias, las protenas as sintetizadas probablemente estn mas en relacin con la formacin de las membranas y lamelas cloroplsticas que con las enzimas cloroplsticas precisas para la fotosntesis. En todo caso, el cloroplasto contiene toda la maquinaria precisa para la sntesis proteica: DNA, todos los tipos de RNAs, ribosomas, factores de iniciacin, etc. Todos estos factores muestran que los cloroplastos, en Acetabularia, gozan de una considerable autonoma respecto del ncleo. Los recuentos de cloroplastos realizados tanto en fragmentos nucleados como anucleados muestran un claro aumento en su nmero. Estas organelas, debido a que poseen DNA, son capaces de una multiplicacin aut6noma. Pero esta multiplicacin es mas activa en la mitad nucleada que en la anucleada. En esta ltima pueden verse grandes cloroplastos en forma de pesas de gimnasia, y parece como si faltara algn factor originado en el ncleo y necesario para la divisin de la organela. Por lo tanto, la independencia del cloroplasto respecto del ncleo es grande, pero dista de ser completa. Esta conclusin concuerda perfectamente con todo lo que ha sido antes dicho sobre el control nuclear de los ritmos circadianos de actividad fotosinttica y de sntesis de enzimas cloroplsticas. En las lneas que siguen vamos a comparar los fragmentos nucleados de los huevos de erizo de mar y de otros animales, con Acetabularia. 2. Bioqumica de los fragmentos anucleados de huevo (a) Observaciones biolgicas El nico material que puede obtenerse en cantidades suficientes para anlisis bioqumicos sencillos son los fragmentos anucleados de huevos de erizo de mar. Como ya se mencion6 y se muestra en la Figura 41, los vulos no fecundados de Arbacia pueden ser divididos en dos mitades por centrifugacin en un gradiente de densidad. El pigmento rojo pesado se acumula en el extremo apical del huevo; y este, tras alargarse, toma una forma de pesas de gimnasia y finalmente se divide en dos fragmentos. El fragmento ligero y transparente contiene el ncleo, gotas de grasa, mitocondrias y una capa clara de ribosomas Hamada hialoplasma. El fragmento pesado es anucleado y contiene los grnulos del pigmento rojo y la mayor parte del vitelo. Por microscopia electrnica se puede ver que las mitades ligeras tambin poseen plaquetas vitelinas, y que en las mitades pesadas tambin existen mitocondrias y gotas grasas. Por lo tanto, las dos mitades tienen todos los tipos de inclusiones del huevo, pero en proporciones diferentes.

Las nicas organelas especficas son el ncleo, que siempre est en el fragmento ligero, y los grnulos de pigmento, que solo existen en la mitad pesada. Ambos fragmentos pueden ser fecundados o activados partenogenticamente por el mtodo clsico de Loeb (tratamiento con agua de mar hipertnica y acido butrico). Tras la fecundacin, las mitades nucleadas se desarrollan bastante bien y dan lugar a larvas pluteus normales. El desarrollo de los fragmentos anucleados es menos normal, y no es fcil obtener larvas; aunque este deficiente desarrollo es probablemente debido mas al ex ceso de vitelo, que dificulta la segmentacin, que al haploidismo. El desarrollo partenogentico de las mitades nucleadas es prcticamente igual de correcto que el de los huevos normales. En cambio, el desarrollo de los fragmentos anucleados tras activacin partenogentica es completamente abortivo. El citoplasma da lugar a la repetida formacin de steres y de surcos irregulares, que dividen al huevo dando lugar a una especie de mrula. Pero nunca puede reconocerse el patrn tpico de segmentacin del huevo de erizo de mar (Figura 14.), con micrmeros, mesmeros y macr6meros. El equivalente a la larva en estado de blstula no forma cilios, y no se produce la eclosin. Como puede verse, no hay verdadera morfognesis, y estamos muy lejos de la formacin de la elegante sombrilla especie-especifica de Acetabularia. En los fragmentos anucleados activados de huevo de erizo de mar, solo la formacin de steres y surcos desarrolla cierta autonoma respecto del ncleo. Aparte de este, el nico material anucleado procedente de huevos que ha sido objeto de algn estudio bioqumico son los lbulos polares que pueden obtenerse de los huevos de los moluscos Mytilus e Ilyanassa, en el estado de trbol. Estos lbulos nunca forman steres y no son capaces de segmentarse; todo lo que se puede observar son contracciones localizadas del cortex, que confirman que la contractilidad de las protenas corticales tiene cierta autonoma respecto del ncleo. (b) Estudios bioqumicos Vamos a presentar brevemente los resultados, pues lo ensencial ya ha sido dicho en los captulos anteriores. Consideraremos primero la produccin de energa y posteriormente la sntesis de macromolculas. La respiracin de los fragmentos nucleados y anucleados del vulo de erizo de mar es, como la del propio vulo sin fragmentar, muy baja. Si los fragmentos son fecundados o sufren activacin partenogentica; el consumo de oxgeno aumenta notablemente. La respiracin de la mitad anucleada se hace incluso mayor que la de la nucleada, lo cual demuestra que el papel jugado por el proncleo femenino en la oxidacin celular es insignificante. Esta conclusin concuerda con el hallazgo, ya mencionado, de que el consumo de oxgeno de la vescula germinal del oocito de rana aislado es prcticamente inapreciable; de hecho, los oocitos de rana normales y anucleados tienen aproximadamente el mismo ritmo respiratorio. El mayor consumo de oxgeno de la mitad anucleada probablemente se deba al hecho de que, como muestra la microscopa electrnica, los fragmentos nucleados y anucleados, tras su separacin por centrifugacin, contienen dos poblaciones distintas de mitocondrias, que difieren en el tamao, la estructura y, probablemente, en el contenido de enzimas respiratorias. De hecho las

mitades pesadas, anucleadas, contienen una mayor proporcin de enzimas respiratorias mitocondriales reductoras (deshidrogenasas) que los fragmentos nucleados. Como ya hemos visto (Figura 53.), los lbulos polares aislados del molusco Mytilus tienen un ritmo respiratorio bajo, que no aumenta con el paso del tiempo, en contraste con lo que ocurre en los blastmeros, donde existe una rpida multiplicacin nuclear. Pasemos ahora a la sntesis de macromolculas. Como ya vimos, tanto en el oocito de anfibio como en el vulo de erizo de mar, la sntesis proteica es independiente de la presencia del ncleo. Ambas clulas responden de la misma manera, exista o no ncleo, a la estimulacin de la sntesis proteica inducida por la progesterona en el caso de los oocitos de anfibio y por el agua de mar hipertnica en el caso de los vulos de erizo de mar. En ninguno de los dos sistemas hay indicios de que las protenas sintetizadas en presencia del ncleo sean diferentes de las sintetizadas en ausencia de el. Pero esta afirmacin solo es valida para la sntesis de las protenas "tempranas", que se construyen en las primeras horas consecutivas a la estimulacin de los vulos u oocitos anucleados. Los fragmentos anucleados de vulo de erizo de mar son incapaces de sintetizar las protenas caractersticas de estados posteriores del desarrollo, que pueden ser detectadas por mtodos inmunolgicos en las larval pluteus y en los adultos. En resumen, pueden utilizar los mRNAs preformados de origen materno acumulados durante la oognesis; pero son incapaces de sintetizar las protenas caractersticas de una mayor diferenciacin, pues estas protenas estn codificadas por nuevas poblaciones de mRNAs sintetizados por el ncleo en los estados de blstula tarda. Todo lo que sabemos sobre la sntesis proteica en lbulos polares aislados es que, en Ilyanassa, es fcilmente detectable, y que ocurre tanto en los polisomas citoplsmicos como en las mitocondrias. Sobre la naturaleza, enzimtica o de otro tipo, de las protenas sintetizadas en preparaciones de huevos anucleados, no se sabe prcticamente nada. Lo nico que sabemos con certeza es que en los fragmentos anucleados de erizo de mar, una de estas protenas es la tubulina, la protena fundamental del aparato mittico. Este hallazgo bioqumico esta en perfecto acuerdo con el hecho biolgico de que los fragmentos anucleados, tras activacin partenogentica, pueden formar steres y segmentarse. Tras ser activados partenogenticamente, los vulos anucleados de rana tambin son capaces de segmentarse y de dar lugar a una forma anormal de blstula. Las protenas que sintetizan son iguales a las formadas por los huevos fecundados normales durante la segmentacin; pero estos fragmentos anucleados no muestran el incremento en la sntesis de ciertas protenas especficas que normalmente se produce en los estados medio y final de la blstula. No hay duda de que los fragmentos anucleados de 6vulo de erizo de mar son capaces de sintetizar RNA, siempre y cuando hayan sido activados por tratamiento con agua de mar hipertnica. En estas condiciones se sintetizan varios tipos de RNAs. Su anlisis en ausencia del ncleo muestra un pico en la regin de 15 S 18 S, lo cual demuestra que la sntesis de RNA no se restringe a la produccin de RNAs de pequeo peso molecular, y no puede explicarse por una mera repeticin de la secuencia terminal CCA de los tRNAs, a pesar de que en ausencia del ncleo esta repeticin ciertamente existe. An no

se sabe si todas o solo parte de las molculas de RNA producidas por los fragmentos anucleados tras activacin partenogentica son sintetizadas en las mitocondrias; pero hay pocas dudas de que si no todas, al menos la mayor parte de ellas son de origen mitocondrial. Esto explica que varias actividades de la mitocondria (transcripcin del DNA mitocondrial y actividad respiratoria) se depriman tras la activacin partenogentica. La situacin no es clara en los que respecta a la posibilidad de una sntesis de DNA en ausencia del ncleo. Esta sntesis, que implicara una multiplicacin de las mitocondrias, no parece existir en los fragmentos anucleados activados de vulos de erizo de mar. Sin embargo, se ha mantenido la existencia de una sntesis neta de DNA en vulos no fecundados de rana en los que se haban eliminado los cromosomas por extirpacin microquirrgica del huso de maduracin. Pero estos experimentos deben ser repetidos en condiciones de absoluta esterilidad, pues las bacterias pueden multiplicarse fcilmente si penetran dentro de los huevos, y la posibilidad de esta contaminacin an no ha sido descartada. Por lo tanto, todava no se ha demostrado de manera tajante la multiplicacin de mitocondrias en fragmentos anucleados de huevo. 3. Bioqumica de los hbridos letales (a) Observaciones biolgicas Cuando se fecundan vulos de una especie con espermatozoos de otra, pueden ocurrir varias cosas. En muchos casos los espermatozoos ni siquiera tocan la superficie del vulo, y no ocurre nada. En otros, los espermatozoos entran en contacto con la membrana del vulo y permiten que se produzca la reaccin de activacin, pero no penetran en su interior y ni siquiera actan como un verdadero agente partenogentico. En el recto de las ocasiones, el espermatozoo penetra en el huevo y se produce la anfimixia. Sin embargo, muchas veces los cromosomas paternos que han sido introducidos en el huevo por el espermatozoo son eliminados al citoplasma durante la segmentacin, all son degradados, y el desarrollo acaba siendo de tipo haploide o partenogentico (pseudohbridos). En los verdaderos hbridos, los cromosomas paternos no son eliminados, el desarrollo es normal durante un periodo de tiempo ms o menos largo, posteriormente los embriones hbridos desarrollan anormalidades y finalmente mueren. Por eso se llaman hbridos letales. Cuando los cromosomas de las especies paterna y materna son suficientemente parecidos desde el punto de vista gentico, los hbridos son viables, y alcanzan el estado de adulto, aunque no siempre sean capaces de reproducirse. Es frecuente la esterilidad, porque los cromosomas homlogos no pueden sufrir un correcto emparejamiento durante la meiosis. Este captulo versar fundamentalmente sobre los hbridos letales tempranos, debido a que tienen un gran inters para la embriologa molecular. Cuando los vulos de unas especies comunes de erizo de mar o de rana son fecundados con esperma de otras especies igualmente normales, el desarrollo frecuentemente se detiene en el estado de blstula tarda o de gstrula temprana. Como ya hemos visto, en este estadlo se producen cambios bioqumicos fundamentales en el embrin, el ms notable de los cuales es la reanudacin de la sntesis de rRNA. Mltiples estudios bioqumicos han intentado averiguar por que los embriones hbridos no son capaces de superar este estado crtico de la gastrulacin.

Antes de analizar la bioqumica de los embriones letales tempranos, debe mencionarse un importante hecho biolgico: si un pedazo de hbrido letal de anfibio que detuvo su desarrollo en el estado de gstrula temprana es injertado en un husped normal, habitualmente se produce la "revitalizacin" del tejido injertado. Si, por ejemplo, se injerta el borde dorsal de una gstrula hbrida bloqueada en una gstrula receptora normal, el borde dorsal injertado se diferencia a corda e induce la formacin de un sistema nervioso secundario en el husped. Esta revitalizacin no es especie-especfica, y puede obtenerse el mismo resultado (diferenciacin a corda e induccin neural en el husped) injertando el borde dorsal de un hbrido de dos especies de rana sobre una gstrula de Urodelo (tritn, ajolote). Se ha intentado explicar la revitalizacin suponiendo que las clulas husped suministraran al injerto unas sustancias inespecficas que las clulas hbridas seran incapaces de sintetizar. Pero recientemente se ha demostrado que, at menos en algunos hbridos letales, basta disociar las clulas del embrin bloqueado y cultivarlas en solucin salina para obtener una amplia diferenciacin de las clulas hibridas. El "medio condicionado" preparado a partir de estas clulas es altamente txico para los embriones normales. Por lo tanto, es posible que la letalidad sea debida, al menos en parte, a la produccin y retencin de sustancias toxicas (represores) producidas por el metabolismo. (b) Estudios bioqumicos sobre hbridos letales (1) Respiracin La mayor parte de los estudios bioqumicos llevados a cabo sobre hbridos letales de erizo de mar han sido realizados con la combinacin Paracentrotus Arbacia. Estos embriones se segmentan normalmente, llegan a la eclosin, y mueren durante la gastrulacin. Los huevos de Paracentrotus (P) tienen un consumo de oxgeno superior al de los de Arbacia (A). La respiracin de los hbridos P x A es inicialmente similar a la de la especie materna (P), pero mas adelante, el ritmo de respiracin va disminuyendo hasta alcanzar valores intermedios entre los tpicos de A y de P. Esta reduccin del ritmo respiratorio en los hbridos P X A sugiere la existencia de un control negativo, debido a los genes paternos A, que solo se hace efectivo algunas horas antes de la detencin del desarrollo. La informacin que tenemos sobre hbridos de anfibios es ms abundante. La combinacin mejor estudiada es la obtenida a partir de dos especies americanas de rana: Rana pipiens x Rana sylvcitica, cuyo desarrollo se detiene en la gastrulacin. La respiracin muestra el incremento habitual durante la segmentacin y luego se hace absolutamente constante hasta la muerte del embrin, que se produce algunos das despus. Esta disminucin relativa del ritmo respiratorio afecta a todas las partes del embrin, como muestran las medidas de consumo de oxgeno realizadas sobre gstrulas hbridas disecadas. El descenso en la respiracin es igual en el ectoblasto, el mesoblasto y el endoblasto; y, como era de prever, va ligado a una disminucin del metabolismo de hidratos de carbono. La glucogenolisis es ms lenta; la glucolisis esta disminuda; y, tras

la detencin del desarrollo, el contenido en ATP en condiciones anaerobias desciende ms deprisa en las gstrulas hbridas que en los controles. Sin embargo, estos resultados no se pueden generalizar a todas las combinaciones de hbridos entre anfibios. Aparentemente, lo mas frecuente es que el consumo de oxgeno siga aumentando, pero a un ritmo menor de lo normal. En los hbridos bloqueados, el contenido en ATP es normal en condiciones aerobias, pero cae rpidamente por debajo de lo normal en ausencia de oxgeno. Esto significa que en anaerobiosis la produccin de ATP es deficiente, lo cual confirma que en los embriones hbridos el metabolismo de los hidratos de carbono es anormal. Sin embargo, no sabemos en que paso enzimtico de la degradacin de los azcares esta el obstculo. (2) Sntesis de cidos nucleicos y protenas Consideraremos primero los hbridos letales de equinodermos, y posteriormente los de anfibios. Se ha estudiado la sntesis proteica en varias combinaciones de erizos de mar. La reserva de aminocidos solubles y de pequeos pptidos es del tipo materno, incluso cuando los efectos del ncleo paterno debieran ser evidentes. En la combinacin Paracentrotus X Arbacia (P X A) pueden detectarse protenas paternas (antgenos) por mtodos inmunolgicos en la blstula hbrida. La cantidad de protenas paternas sintetizadas es aproximadamente la mitad de la producida por un Arbacia diploide (AA), e idntica a la cantidad sintetizada en el mismo estado por un embrin haploide partenogentico. Como ya hemos visto, los fragmentos anucleados de Arbacia no son capaces de sintetizar este antgeno, y por tanto se deduce que la cantidad de antgeno producida depende del nmero de genes de Arbacia presente, independientemente de que es-ten situados en un citoplasma propio de Arbacia o en un citoplasma extrao de Paracentrotus. Sin embargo, en otras combinaciones de erizos de mar (Strongylocentrotus X Dendraster) que detienen su desarrollo en estados mas tardos que la combinacin P X A, no pueden detectarse ningn tipo de antgenos paternos. En estos hbridos hay una enzima bien caracterizada. Se trata de la "enzima de la eclosin", que permite a la blstula disolver la membrana de fecundacin y nadar libremente en el mar. Se ha descubierto que en S X D, esta enzima es exclusivamente del tipo materno, lo cual sugiere que, en contraste con la combinacin P X A, sus cromosomas paternos deben ser parcial o totalmente eliminados (o inactivados), y debe existir una absoluta dominancia materna. Es mas probable que se trate de una inactivacin de los cromosomas paternos que de una eliminacin, pues existen datos de hibridacin molecular que muestran DNA paterno en las clulas. En todo caso, quizs un cuidadoso anlisis citolgico resolviera este problema, pues bastara la perdida de unos pocos cromosomas paternos para impedir la sntesis de antgenos y enzimas de la eclosin de su estirpe. Es seguro que la detencin de la sntesis de DNA no es responsable del bloqueo del desarrollo, pues en los embriones P X A bloqueados en el estado de gstrula continua existiendo sntesis de DNA, aunque a un ritmo menor que en los controles. Esta disminucin del ritmo probablemente se deba a una discreta eliminacin de cromosomas paternos durante el desarrollo, Jo cual tambin explicara por que estos hbridos, una vez

bloqueados, contienen 3 veces mas DNA materno que paterno, como muestra la hibridacin molecular. Tambin la sntesis de RNA esta perturbada en los hbridos P X A. Los estudios citoqumicos muestran que su ncleo contiene un exceso de RNA, y por autorradiografa se puede observar que este RNA recin sintetizado no se traslada del ncleo al citoplasma a la velocidad normal. Parece como si en estos hbridos ocurriera algo a nivel de la membrana nuclear que condujera a la acumulacin de RNA en el ncleo. Los experimentos de hibridacin molecular muestran que los embriones hbridos bloqueados contienen 3 veces ms RNA paterno que materno. Dado que esta relacin es exactamente la opuesta de la existente entre los DNAs paterno y materno, es claro que el DNA paterno se transcribe aproximadamente 10 veces mas rpido de lo que debiera; y que el mecanismo que normalmente frena la transcripcin, en este caso no funciona. Aparentemente, el huevo se protege contra esta sobreproduccin de RNA paterno por parte del ncleo construyendo una barrera a nivel de la membrana nuclear, que dificulta el transporte de los RNAs nucleares anormales al citoplasma. En otras palabras, la membrana nuclear tendra una funcin similar a la de la aduana y los carabineros en la frontera entre dos pases. Esta cuestin, en los hbridos de rana, no ofrece diferencias fundamentales; pero existen algunas peculiaridades dignas de mencin. La hibridacin modifica las propiedades de la membrana plasmtica, y su permeabilidad a los aminocidos y al fosfato aumenta. Adems, si las clulas de una gstrula de hibrido letal son disociadas ex trayendo el calcio- y el magnesio del medio, tienen grandes dificultades para volver a reagruparse cuando se reponen estos Tones. Como ya hemos visto, estas clulas disociadas pueden exudar sustancias capaces de reprimir el desarrollo de clulas normales. Otra caracterstica de los hbridos letales de rana es que sus reservas de vitelo son utilizadas mucho mas lentamente que en los controles, y las enzimas presente en las plaquetas vitelinas no se sintetizan o liberan al ritmo normal. Las razones de este retraso en la vitelolisis son desconocidas. Como en los hbridos de erizo de mar, en los hbridos de rana los antgenos paternos se hacen detectables en el estado de blstula. Adems, en estos hbridos aparece una protena bsica adicional. Se ha estudiado la sntesis de varias enzimas. En cierta combinacin letal entre ranas, las esterasas se mantienen del tipo materno. En otra, que es viable, las enzimas que catalizan el metabolismo oxidativo de los azucares muestran valores intermedios entre los hallados en las especies paterna y materna; pero si se extirpa el ncleo antes de la fecundacin, en orden a obtener un hibrido mergono (que es letal en un estado posterior a la gastrulacin), la sntesis de estas enzimas sigue el patrn paterno. Como en los hbridos de erizo de mar, la sntesis de DNA se hace ms lenta, pero no se detiene, al bloquearse el desarrollo. Lo mismo sucede con la sntesis de histonas, que se mantiene bien coordinada a la de DNA. En todo caso, la sntesis de DNA y RNA se detiene antes que la sntesis proteica. Cuando el hibrido esta a punto de morir y ya no puede sintetizar cidos nucleicos, puede compararse a un fragmento de huevo anucleado,

donde la sntesis proteica puede continuar durante mucho tiempo gracias a los ribosomas y mRNAs maternos preexistentes. Como en los huevos de erizo de mar, en la mayora de los ncleos de los hbridos bloqueados puede observarse un exceso de RNA. Sin embargo, existen otros ncleos que tienen un contenido normal o incluso disminuido de este cido nucleico. En conjunto, pues, la gstrula contiene un mosaico de ncleos ricos y pobres en RNA. Gurdon ha conseguido una situacin en cierta forma diferente a la hibridacin letal inyectando un ncleo tornado de una blstula de Discoglosus en un vulo anucleado de Xenopus. En contraste con los hbridos letales, en este caso existe en el huevo un ncleo diploide extrao, pero no hay ncleo haploide materno. Como muchos hbridos letales, estos huevos detienen su desarrollo en el estado de blstula tarda. El anlisis de la sntesis de RNA de estas blstulas bloqueadas muestra que no hay produccin de rRNA, y que la sntesis de mRNA y tRNA esta disminuida. Seria muy interesante extender este trabajo a varias posibles combinaciones de hbridos letales, y analizar los RNAs acumulados en sus ncleos. Como puede verse, falta an mucho para que podamos comprender las razones moleculares de la letalidad de los hbridos, tanto de erizo de mar como de anfibio. Es posible, aunque solo se trata de una conjetura, que la detencin del desarrollo seguida de la muerte celular sea en gran parte debida a la acumulacin de protenas extraas del tipo paterno. Algunos de nuestros recientes experimentos apoyan esta hiptesis. Si en un blastmero de un huevo de anfibio en el estado de 2 clulas se inyecta hemoglobina de conejo o el mRNA encargado de su sntesis, el desarrollo del blast6mero se frena y las clulas descendientes acaban por morir. Sin embargo, no se observa efecto letal tras la inyeccin de rRNA. Por lo tanto, la sntesis de una protena extraa o su introduccin en el interior del huevo puede detener el desarrollo y producir la muerte celular. 4. Bioqumica de los mutantes de anfibio No hay duda de que la embriologa molecular hara grandes progresos si pudieran obtenerse fcilmente mutantes carentes de un paso metab6lico especfico. Huelga recordar que la biologa molecular no seria lo que es hoy sin los extensos estudios realizados sobre miles de mutantes de bacterias y fagos. Existen varios mutantes en anfibios, y su nmero aumenta cada ario; pero muy pocos de ellos han sido sometidos a anlisis bioqumicos. Esto es lamentable, pues el ya comentado mutante carente de nucleolo (nu-o) de Xenopus ha tenido un papel de enorme utilidad, si no decisivo, en la comprensin de la intervencin de los organizadores nucleolares en la sntesis de rRNA y en la formacin de ribosomas. Los nicos mutantes que han sido analizados desde el punto de vista bioqumico, aunque de manera limitada, son los mutantes o y cl de ajolote. Ambas mutaciones conducen a una letalidad temprana cuando estn en estado homozigtico; o significa carente de vulos, y cl significa detencin de la segmentacin (1). En condicin heterozigtica, los mutantes o alcanzan el estado de adultos y son frtiles, aunque muchos individuos mueren antes de llegar a adulto. Los mutantes oo homozigticos mueren antes o durante

la gastrulacin. Es muy interesante el hecho, descubierto por Briggs, de que estos mutantes pueden ser salvados si se inyecta en el huevo recin fecundado el contenido de la vescula germinal de un oocito normal. La inyeccin de este jugo nuclear en uno de los dos primeros blastmeros permite el ulterior desarrollo y la gastrulacin del blastmero receptor, en tanto que el otro es bloqueado. Por lo tanto, el jugo nuclear de los oocitos normales contiene un factor, probablemente una protena, precisa para el desarrollo a partir del estado de gstrula, que no puede ser sintetizada por los mutantes o. Sern de gran inters los estudios que se realicen en el futuro sobre la naturaleza qumica de este factor "correctivo". Lo nico que sabemos de el es que esta presente en el jugo nuclear de los oocitos de muchas variedades de anfibio, y que por lo tanto no tiene especificidad de especie. No existe factor correctivo en el citoplasma de los oocitos ovricos, pero puede observarse su presencia en la vescula germinal en todos los estados de la oognesis. Recientemente se ha demostrado que la sntesis proteica es anormal tanto en los mutantes o como en los c/. En el ajolote, la pauta de sntesis proteica permanece constante desde la fecundacin hasta el estado de 64 blastmeros, y luego varia, tanto en los huevos normales como en los mutantes. Sin embargo, esta variacin es anormal en los mutantes o y c/, lo cual sugiere la existencia de una influencia materna sobre la sntesis proteica. Se han obtenido resultados similares en Drosophila, donde una mutacin llamada naranja oscuro (dor) (1) produce la muerte temprana de los embriones homozigticos (dor/dor). Los efectos de esta mutacin pueden ser corregidos inyectando en las bstulas dor/dor citoplasma de vulos normales. Ann no se sabe si, como en los mutantes o de ajolote, el factor reparador esta acumulado en la vescula germinal durante la orognesis. La existencia de mutantes letales del tipo de o y dor proporciona posibilidades muy interesantes de anlisis bioqumico; probablemente se conseguir aislar el factor reparador y establecer su naturaleza qumica y su modo de accin. 5. Conclusiones y comentario general Ya es hora de que saquemos algunas conclusiones generales, antes de abandonar los estados tempranos del desarrollo y trasladarnos al tema, mucho ms complejo, de la diferenciacin embrionaria. Los trabajos resumidos en los captulos precedentes muestran claramente que la maquinaria qumica utilizada en los pasos iniciales del desarrollo ya ha sido sintetizada durante la oognesis. Adems de producirse un nmero tal de ribosomas que permiten el desarrollo hasta estados tardos de larva (renacuajo capaz de alimentarse por si solo) sin mas sntesis de rRNA ni protenas ribosmicas, se han acumulado en el vulo no fecundado gran variedad de mRNAs, poseedores de una amplia gama de informacin. Durante la segmentacin se sintetizan nuevas especies de mRNA, pero estas no son indispensables para este periodo, que puede producirse en ausencia completa de sntesis de RNA. El resultado de esta poltica tan econmica, casi avara, es que durante los estados tempranos del desarrollo la importancia del citoplasma supera ampliamente a la del ncleo. El punto crtico es el final de la segmentacin; de ah en adelante los movimientos de gastrulacin y la induccin neural se hacen imposibles sin informacin fresca, para lo que se precisa de una activacin y transcripcin de genes. Pero no debe uno olvidar que los procesos bsicos y fundamentales que controlan el desarrollo final ocurren siempre en estados muy tempranos. La polaridad, que controlar

la diferenciacin cefalocaudal; la formacin del creciente gris (consecuencia inmediata de la fecundacin y responsable de la organizacin dorsoventral del huevo); las localizaciones germinales de los huevos "mosaicos" y la regulacin embrionaria ocurren en estados en los que los genes estn casi totalmente reprimidos, y en los que la sntesis de mRNA es apenas detectable. La embriologa molecular esta pues cautiva en un dilema que enfrent a Spallanzani, Buffon y muchos otros embrilogos del siglo dieciocho: El desarrollo embrionario es debido a una preformacin o a una epignesis? Los mRNAs encubiertos presentes en los vulos no fecundados constituyen la base molecular de la preformacin; los mRNAs recin sintetizados por los genes activados representan, a nivel molecular, la epignesis. Pero volvamos a las distintas teoras de la diferenciacin que han sido presentadas en el capitulo 3. Cuando, como hemos hecho nosotros, se consideran solo los estados tempranos del desarrollo, y se estudian las teoras de la diferenciacin, no tiene uno mas remedio que llegar a la conclusin general que ya Morgan, alrededor de 1930, vio claramente. Su tesis de que la actividad de los genes esta controlada en los estados tempranos del desarrollo por las propiedades del citoplasma que rodea al ncleo sigue siendo totalmente valida. Las teoras que intentan explicar el desarrollo temprano en base a modulaciones o modificaciones qumicas de la molcula de DNA no parecen satisfactorias, pues el experimento fundamental de Gurdon muestra que una clula adulta y diferenciada y un huevo recin fecundado poseen los mismos genes, y sus ncleos tienen las mismas potencialidades morfogenticas. La teora del plasmagene, que supone la existencia de partculas autorreplicantes en el citoplasma, seria una importante aportacin a las ideas de Morgan, pero no las cambiara en profundidad desde el punto de vista terico. De todas formas, la existencia de los I-somas poseedores de DNA de Bell an no ha sido demostrada. Las mismas reservas existen hacia la teora de la "herencia cortical" propuesta por Curtis. La idea es ciertamente atractiva, pero ser difcil de demostrar, pues sabemos que ligeras lesiones del cortex del huevo, especialmente del creciente gris, frecuentemente se siguen de anormalidades cromosmicas. En cuanto a como se desreprimen los genes en el curso del desarrollo, solo nos esta permitido hacer conjeturas. Para los estados tempranos del desarrollo, que es lo que hasta ahora ha tratado este libro, es tentador especular con la posible penetracin en el ncleo de protenas sintetizadas en el citoplasma, como factor fundamental. Si estas protenas fueran sintetizadas bajo la direccin de mRNAs especficos recin formados, pueden imaginarse mecanismos de control muy precisos. Estas protenas podran ligarse a los loci genticos especficos donde se habran sintetizado sus mRNAs, y as ejercer un control positivo o negativo sobre la actividad del DNA. Un mecanismo similar explicara que los genes que han sido activos durante la oognesis y han dirigido la sntesis de los mRNAs maternos encubiertos se inactiven en estados posteriores. Pero estas ideas seguirn siendo hipotticas hasta que no conozcamos mejor los mecanismos de control que operan a los diferentes niveles, incluyendo el de la membrana nuclear. Esta membrana aparentemente desarrollada cierta selectividad, y no permite el paso al citoplasma de todos los RNAs sintetizados en el ncleo, ni permite que todas las protenas sintetizadas en el citoplasma pasen al ncleo con igual facilidad. El hecho cierto es que, tanto en el oocito como en el huevo en segmentacin, muchas protenas citoplsmicas recin sintetizadas se trasladan al ncleo. Que hacen all es an objeto de

especulaciones, pero parece lgico pensar que tengan una funcin relacionada con el control de la actividad gentica. Son tareas urgentes e importantes para los embrilogos moleculares del maana el anlisis bioqumico de las protenas presentes en la vescula germinal del oocito y en los ncleos de los huevos en segmentacin, y el estudio de la estructura molecular de la membrana nuclear. La importancia de estos trabajos se ye aumentada por una raz6n. Hay muchas pruebas de que la membrana nuclear juega un papel en la propia replicacin del DNA. En muchos casos, la autorradiografa ha mostrado que la sntesis de DNA comienza en ltimo contacto con la membrana nuclear. Adems, los bioqumicos que han intentado aislar el DNA recin replicado frecuentemente lo han hallado, como la DNA-polimerasa en las bacterias, asociado a los componentes de la membrana celular. Sin embargo, esta no es una regla universal. Naturalmente, la membrana nuclear es solo uno de los mltiples lugares donde puede existir una regulacin post-transcripcional. Como hemos comentado cuando examinbamos la estimulacin de la sntesis proteica que ocurre en los huevos de erizo de mar durante la fecundacin, existen muchos mecanismos de control que pueden operar en el citoplasma a nivel de la traduccin, es decir, sobre la formacin y funcionamiento de los polisomas. La disponibilidad de molculas de mRNA encubierto, la conformacin de los ribosomas, la presencia o ausencia de factores de iniciacin, elongacin y terminacin, la disponibilidad de todos los tipos de tRNAs, la capacidad de estos para aceptar aminocidos activados, la composicin de la reserva de aminocidos, etc., pueden todos ellos ser considerados como factores con una posible funcin sobre la regulacin de la sntesis de protenas especificas. Se han observado mltiples casos de control posttranscripcional en otros sistemas, aparte de los embriones en desarrollo. Por ejemplo, el tratamiento de clulas de hepatoma (un cncer de hgado) con ciertas hormonas esteroideas (corticoesteroides) induce la sntesis de una enzima Hamada tirosina-aminotransferasa. La administracin de actinomicina bajo ciertas condiciones aumenta la cantidad de enzima sintetizada. Esta "superinduccin" o "efecto paradjico" de la actinomicina debe producirse a nivel post-transcripcional, pues la transcripcin (sntesis de RNA) ha sido bloqueada por la propia actinomicina. Estos casos de superinduccin por actinomicina han sido hallados en muchos sistemas en que la sntesis de enzimas es estimulada por tratamiento hormonal; y no resulta fcil encontrarles una explicacin sencilla. Entre otras hip6tesis, se ha propuesto que la hormona tendra una actividad antagnica a la de un supuesto represor, que normalmente se unira al mRNA especfico de la enzima e impedira su traduccin. Todos los factores que hemos comentado siguen actuando en estados posteriores del desarrollo, cuando las clulas sufren su diferenciacin tpica desde el punto de vista morfolgico, fisiolgico y molecular; pero su importancia se hace cada vez menor a medida que progresa el desarrollo. Como veremos, el mecanismo que tomar las riendas ser la activacin selectiva y secuencial de ciertos genes o grupos de genes individuales.

CAPITULO 10 COMO SE DIFERENCIAN LAS CLULAS. PROBLEMAS PARA HOY Y PARA MANANA Introduccin general Los problemas bsicos relacionados con la diferenciacin embrionaria ya han sido comentados al principio de este libro. Repetidas veces nos hemos planteado una pregunta clave: Como es posible que los glbulos rojos de la sangre, capaces de sintetizar grandes cantidades de una protena especifica, la hemoglobina, aparezcan solo en reas muy localizadas del embrin y en un estadlo muy preciso de su desarrollo? . La Figura 64 ofrece un buen ejemplo de diferenciacin de clulas embrionarias. Es un corte transversal de un renacuajo joven, y muestra dos tipos de clulas altamente especializadas, que acaban de sufrir su diferenciacin embrionaria. Las clulas cartilaginosas y las clulas musculares estn situadas en inmediato contacto, y pueden fcilmente ser reconocidas por su morfologa. Las clulas cartilaginosas estn rodeadas por una matriz amorfa, constituida por unas glicoprotenas especiales llamadas condroprotenas. Las clulas musculares contienen fibrillas (las miofibrillas) constituidas por protenas completamente diferentes: las protenas contrctiles miosina y actina. Por lo tanto, la estructura, la funcin y la composicin bioqumica de las clulas cartilaginosas y musculares es especfica de cada una de las estirpes, y diferente a la de la otra. Sin embargo, si la seccin hubiera sido realizada un par de das antes, no habra podido observarse clulas tan diferenciadas. Un estudio histolgico del desarrollo embrionario durante este corto periodo de dos das habra mostrado que las clulas cartilaginosas y musculares tienen el mismo origen mesodrmico. En un grupo de clulas mesodrmicas, muy parecidas si no idnticas, algunas clulas darn lugar a grandes cantidades de glicoprotenas, y se convertirn en cartlago; otras sintetizaran protenas contrctiles y se diferenciaran a clulas musculares. Dado que gracias a los experimentos de transplante nuclear de Gurdon sabemos que todos los ncleos del renacuajo e incluso del adulto contienen los mismos genes que el huevo fecundado (zigoto), la diferenciacin solo puede ser explicada admitiendo que en las clulas musculares ciertos genes que dirigen la sntesis de protenas contrctiles son activos, mientras que los que dirigen la sntesis de la hemoglobina y de las condroprotenas estn "mudos". De la misma manera, los genes de la hemoglobina deben ser activos en los glbulos rojos en diferenciacin y los genes de las condroprotenas deben estar funcionando en las clulas cartilaginosas jvenes, mientras que en estas clulas los genes relacionados con la sntesis de grandes cantidades de las dems protenas especificas (que Holtzer Ramo protenas "de lujo") deben estar inactivados. Sin embargo, los genes que controlan la sntesis de las protenas imprescindibles para todas las clulas deben necesariamente estar siempre activos. Todas las clulas, cualquiera que sea su origen, precisan de energa, y deben poseer todas las enzimas necesarias para la fosforilizacin oxidativa (citocromoxidasa, deshidrogenasas, etc.). Todas las clulas diferenciadas contienen cantidades variables de estas enzimas, que Holtzer denomino protenas "domesticas", y que son precisas para la supervivencia de la clula. Por lo tanto, el problema de la diferenciacin se convierte, en el fondo, en una cuestin de regulacin de genes. Como se mencion en el captulo 2, la diferenciacin celular

puede ser explicada por la teora de Jacob y Monod, mediante un esquema propuesto por el propio Jacob. Tambin Davidson y Britten han presentado un modelo, mucho mas elaborado, que no podemos discutir aqu. Pero la idea bsica es la misma: la intervencin de un represor que se liga especficamente a un gen y detiene su actividad. Holtzer ha propuesto recientemente otra idea. Segn este autor, los genes que codifican la sntesis de las protenas especficas "de lujo", por ejemplo la hemoglobina, estaran amplificados; es decir, existiran varias copias de ellos. Si, gracias a un proceso de amplificacin selectiva de genes similar al observado en los genes de rRNA durante la oognesis, existieran mas copias de los genes de hemoglobina en las clulas que darn lugar a glbulos rojos que en las dems, seria comprensible que estas clulas, y no las otras, sintetizaran hemoglobina. Es imposible explicar en detalle y en pocas paginas todo el trabajo que se ha realizado y que se esta realizando sobre la diferenciacin celular. Por lo tanto nos vamos a centrar en la diferenciacin embrionaria, y solo ocasionalmente hablaremos de los estudios realizados por otros investigadores, que utilizan como mtodo fundamental el cultivo de tejidos. Pero antes de presentar y comentar los hechos conocidos, deben decirse unas Ultimas palabras de introduccin. El estudio de la diferenciacin celular no tiene un inters exclusivamente acadmico. Es un problema de fundamental importancia para la humanidad; porque el cncer es en gran parte una enfermedad en que las clulas se dividen, pero no consiguen diferenciarse. La solucin del problema de la diferenciacin celular conducir, tarde o temprano, a la solucin del problema del cncer. Si se consiguiera que las clulas malignas se diferenciaran, dejaran de dividirse y ya no seran malignas. 2. Propiedades especificas de las rnembranas celulares Como ha mostrado Hotfreter, ya en el estadlo de gstrula las clulas de las distintas partes del embrin difieren en sus afinidades tisulares. Como se muestra en la Figura 65, si se renen clulas del ectoblasto con clulas del endoblasto en un mismo explante, tras pocas horas de cultivo las dos estirpes se separan; es decir, tienen afinidad negativa, puesto que se rechazan mutuamente. Por el contrario, las clulas del mesoblasto se adhieren tanto al ectoblasto como al endoblasto, por lo que se dice que tienen una afinidad positiva con las clulas de estas dos capas. Se han observado fenmenos similares con clulas aisladas de embriones mucho ms avanzados. Por ejemplo, Moscona disocio clulas de la retina de embriones de polio y de rato, y las puso en contacto con otras clulas disociadas procedentes de los riones de los mismos embriones. El resultado fue que las clulas de la retina se reconocan unas a otras y daban lugar a una retina quimrica, formada por clulas de ratn y de polio; de la misma manera, las clulas de rin disociadas daban lugar a tbulos renales quimricos, constituidos por clulas procedentes de ambas especies de embriones. Como se ve, las clulas procedentes de un mismo tejido y miembros de la misma familia, se reconocan mutuamente.

Por el contrario, en otros sistemas existe una especificidad de especie. Como ha mostrado Giudice, si las clulas de una blstula de erizo de mar se disocian y se vuelven a reagregar, dan lugar a larvas pluteus relativamente normales. Sin embargo, si se mezclan clulas disociadas procedentes de blstulas de dos especies diferentes (por ejemplo Paracentrotus y Arbacia), se produce un "reagrupamiento". Las clulas rojizas de Arbacia se separan de las clulas de Paracentrotus, y en lugar de formarse larvas quimricas, se desarrollan larvas tpicas de cada una de las dos especies. Estas reacciones de incompatibilidad que producen el reagrupamiento de clulas pertenecientes a diferentes tejidos o a diferentes especies, son similares, a nivel celular, a lo que ocurre cuando un injerto (por ejemplo de corazn) es rechazado despus de que la operacin quirrgica tuviera xito. Se trata de manifestaciones de reacciones inmunitarias, que deben ser consecuencia de la composicin proteica de la membrana celular. En los experimentos de Holtfreter, las clulas mesoblsticas tendran una estructura "complementaria" a los antgenos de superficie del ectoblasto y el endoblasto, y esto las permitira adherirse a ellos. En cambio, la estructura molecular no complementaria de las protenas presentes en la membrana celular de estos dos tejidos explicara su mutuo rechazo (Figura 65). An sabemos poco, desde el punto de vista bioqumico, sobre la estructura molecular de la membrana celular; y su estudio es sin duda uno de los campos ms prometedores de la embriologa molecular. Se ha descubierto que el suero contiene unas protenas que afectan, de manera positiva o negativa, a la asociacin entre clulas. El estudio en profundidad de estas protenas quizs arroje resultados de extraordinario inters. Otro valioso instrumento para futuros estudios es la concanavalina A, que como ya se menciono, se liga especficamente a ciertos azucares presentes en las protenas de superficie, (que, a su vez, pertenecen a la familia de las glicoprotenas). La concanavalina A induce la agregacin de clulas embrionarias y tumorales disociadas, pero no de clulas adultas normales. Son dignas de mencin las reacciones inmunitarias que siguen a los injertos realizados en embriones de anfibio. El injerto de un fragmento de tejido, por ejemplo de un organizador, en un husped de otra especie, es inicialmente bien tolerado. El tejido injertado induce en el husped la formacin de una cabeza con ojos, nariz, etc.; pero tarde o temprano esta segunda cabeza es rechazada y destruida. Adems, estos experimentos muestran que la capacidad inductora del organizador no desarrolla ninguna especificidad de especie, mientras que la respuesta del husped al inductor si es especie-especifica, y en consecuencia determinada por los genes: si se injerta el organizador de una rana en el embrin de un tritn, aquel induce la formacin de tejido nervioso de tritn. Desde el punto de vista de respuesta inmunolgica, hay una diferencia importante entre los embriones de anfibio y los de mamfero. Si en estos se injerta un tejido extrao, no se observar reaccin de rechazo ni siquiera despus de la formacin del sistema inmunitario, que ocurre tras el nacimiento.

3. Efectos de los extractos de tejido sobre la diferenciacin celular Los extractos de tejido frecuentemente ejercen un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de los rganos homlogos. Por ejemplo, se ha observado que si se aaden glbulos rojos o cerebro de rana adulta en el medio en que se desarrollan huevos de este animal, se inhibe respectivamente el desarrollo de la sangre o del cerebro de los renacuajos. Las investigaciones similares que se han realizado sobre extractos de embri6n de polio muestran una situacin ms compleja. Los extractos contienen dos tipos de sustancias antagonistas: las fracciones proteicas inhiben el desarrollo, mientras que las nucleoprotenas tienen un efecto estimulante. Se ha trabajado mucho sobre los chalones, sustancias presentes en los extractos de tejido adulto que inhiben de manera especfica la actividad mittica, y en consecuencia la sntesis de DNA, de los rganos homlogos. Por ejemplo, un extracto de rin adulto reduce el nmero de mitosis ms eficazmente en el rin embrionario (pronefros) que en los dems tejidos de la larva de anfibio. En este campo sigue reinando la confusin, y a veces se publican resultados contradictorios debido a que se sabe muy poco sobre la pureza y composicin qumica de los chalones. A juzgar por sus propiedades qumicas generales, probablemente se trate de protenas o polipptidos. Otra importante tarea de los embrilogos moleculares del maana na ser aislar, purificar y estudiar los chalones. Solo entonces ser posible averiguar como actan sobre las "clulas diana" presente en los rganos homlogos. Debido a la insuficiente pureza de los extractos de tejido, no es sorprendente que se observen a veces efectos positivos sobre la diferenciacin. Utilizando un sistema aun mas complejo, Ebert ha observado un efecto de estimulacin del crecimiento del rgano homologo. Este autor injerto un fragmento de bazo adulto en una de las membranas que rodean el embrin de polio (la membrana corioalantoidea) y observo que el crecimiento del bazo del embrin era mucho mas intenso que el de los dems rganos embrionarios. Esto seria debido a la transferencia selectiva de protenas del bazo adulto al embrionario. Sin embargo, otros autores, trabajando sobre embriones ms jvenes, no consiguieron observar ningn tipo de transferencia especfica de protenas marcadas desde un tejido injertado (ojo, msculo) al rgano homlogo. 4. Estudios inmunolgicos sobre la diferenciacin embrionaria Los mtodos inmunolgicos (serolgicos) son de gran utilidad para la deteccin de protenas especficas. Si en un animal, como por ejemplo un conejo, se inyecta una protena (o antgeno), el animal produce en su suero un anticuerpo. El anticuerpo es una protena llamada inmunoglobulina, que reacciona de forma altamente especfica con el antgeno, dando lugar a un complejo antgeno-anticuerpo, menos soluble que el antgeno o el anticuerpo aislados. En consecuencia, la presencia de un antgeno puede ser detectada por su precipitacin inmunolgica despus de aadir el anticuerpo correspondiente. Si, por mtodos qumicos, se une el anticuerpo a un colorante fluorescente o a un marcador radiactivo, es posible ver al microscopio las clulas que contienen el antgeno.

Los primeros intentos de utilizacin de mtodos inmunolgicos para el estudio de la diferenciacin embrionaria no llevaron muy lejos. Se utilizaban como antgenos embriones homogeneizados, en distintos estados de desarrollo; y lo nico que se descubri es que durante la gastrulacin aparecen nuevos antgenos, es decir, se forman protenas que no existan en estados anteriores. Como era de prever, la sntesis de nuevos antgenos contina tambin en los estados posteriores del desarrollo. El punto flaco de estos experimentos iniciales era que, desde of principio, el huevo contiene cientos de protenas diferentes, y por lo tanto un huevo homogeneizado no puede ser utilizado para la deteccin de una protena especifica. Hoy en die ya no se utilizan enfoques tan toscos, pues poseemos mtodos simples y eficaces, como la electroforesis y la cromatografa, que nos permiten la separacin de protenas. Para ver su efecto sobre el desarrollo, se ha administrado a huevos receptores normales el inmunosuero preparado contra huevos o embriones completos. Dicho "antisuero" es txico y detiene el desarrollo matando al embrin receptor, pero sin desarrollar la especificidad que se prevea. La nica forma de hacer verdaderos progresos en este campo es trabajando con preparaciones de antgenos qumicamente "limpias". Esto se ha intentado especialmente con las cristalinas (protenas especficas del cristalino) y las protenas contrctiles (actina y miosina) del corazn y de los msculos voluntarios. Todas estos protenas se pueden obtener de forma muy pura, y por lo tanto cabe utilizarlas como antgenos limpios para obtener anticuerpos especficos. Vamos a examinar brevemente los resultados obtenidos, gracias a los mtodos inmunolgicos, en los estudios realizados sobre la diferenciacin del cristalino y del corazn. El cristalino es inducido por la copula ptica, a expensas del ectodermo, en el estado de neurula tarda. Los anlisis inmunolgicos muestran que ya en la cabeza de la neurula joven pueden detectarse sus antgenos caractersticos, que se hallan presentes en todas las clulas a bajas concentraciones; y que cuando se induce la formacin del rgano se hacen detectables en el cristalino aun indiferenciado a concentraciones superiores a las del resto de los tejidos. La concentracin aumenta considerablemente durante la diferenciacin celular, caracterizada por la aparicin de fibras constituidas por cristalinas en el centro del rgano embrionario. Hay pues durante el desarrollo una progresiva restriccin de la sntesis de las protenas caracterstica del cristalino, que inicialmente se producan en toda la cabeza y al final solo se forman en el propio rgano. Otro sistema de inters es la llamada regeneracin Wolffiana del cristalino, que se da en los anfibios adultos o en los renacuajos avanzados. Cuando se extirpa quirrgicamente un cristalino maduro, se forma uno nuevo a expensas del borde superior del iris. Yamada ha estudiado en detalle las diferentes faces bioqumicas de esta regeneracin. El primer paso es la desdiferenciacin de las clulas del iris, que pierden su pigmento negro (melanina). La depigmentacin es seguida de sntesis de DNA y multiplicacin celular. Cuando la actividad mit6tica se detiene, sobreviene un periodo de intensa sntesis de RNA. Aparecen grandes nucleolos, y la sntesis de rRNA se hace muy evidente. Esta fase de sntesis de RNA es muy importante para el xito de la regeneracin, que por lo tanto es inhibida por la actinomicina, capaz de bloquear la formacin de RNA. Es probable que tambin se sinteticen durante este periodo los mRNAs de las cristalinas, pues estas

protenas se hacen detectables por mtodos inmunolgicos inmediatamente despus de la fase de intensa sntesis de RNA. Las diferentes cristalinas son sintetizadas una detrs de otra; inicialmente se encuentran tanto en el citoplasma como en el ncleo, pero posteriormente las del ncleo degeneran y acaban por desaparecer completamente. Estos experimentos muestran que los agentes inductores originados en la retina producen la desrepresion de los genes presentes en el iris; y como consecuencia de ello se induce la sntesis de las cristalinas en el rgano en regeneracin. La diferenciacin celular (formacin de las fibras del cristalino) y la sntesis de las cristalinas estn ntimamente relacionadas, y se producen simultneamente. Ebert ha estudiado por mtodos inmunolgicos la sntesis de las protenas contrctiles (actina y miosina) en el embrin de polio (Figura 66). Este autor observ que una de estas protenas, la miosina, ya esta presente en todo el rea embrionaria al comienzo de la gastrulacin. Mas adelante la miosina solo podr hallarse en dos regiones bien definidas, que posteriormente darn lugar al corazn. La actina, que no era previamente detectable, es sintetizada solo en las susodichas reas cardiacas, que por lo tanto son las nicas partes del embrin que contienen las dos protenas contrctiles. Este estudio muestra claramente que estas dos protenas no son sintetizadas simultneamente, y se ha descubierto que lo mismo ocurre en los huevos de anfibio. Adems, se ha demostrado que la, sntesis de miosina, que inicialmente era generalizada, a medida que progresa el desarrollo se va restringiendo a las futuras regiones cardiacas. Una gran parte del embri6n queda pues sin capacidad de sintetizar esta protena. En estados ms tardos, cuando los msculos comienzan a diferenciarse y a adquirir su estriacin tpica, la diferenciacin de las miofibrillas y la sntesis de la actomiosina son fenmenos ntimamente relacionados. Las futuras clulas cardiacas (11amadas fibroblastos cardiacos) pueden ser cultivadas in vitro, y se ha observado que no se diferencian a fibras contrctiles si son tratadas con actinomicina. Las fibras cardiacas continan latiendo rtmicamente cuando son cultivadas in vitro, y, sin embargo, el latido no se detiene por la adicin de actinomicina. Estos experimentos demuestran claramente una idea ya expuesta: para la diferenciacin se precisa de mRNAs inestables; pero una vez que las clulas se han diferenciado (en este caso, a fibras cardiacas capaces de latir), unos mRNAs estables toman las riendas para dirigir las actividades celulares. Incluso es posible que no se precisara de sntesis de RNA para continuar latiendo, si las protenas contrctiles del msculo fueran muy estables. 5. Sntesis de enzimas y diferenciacin embrionaria Frecuentemente se ha sugerido que la diferenciacin pudiera ser debida a la induccin de una sntesis enzimtica resultante de la aparicin, en una regin del embrin, del sustrato capaz de reaccionar con la enzima; o a la represin de la sntesis de una enzima debida a la acumulacin localizada de los productos finales de la reaccin enzimtica. Estos mecanismos de control de la sntesis de enzimas operan eficazmente en las bacterias, y el esclarecimiento de sus bases genticas y moleculares constituyo la raz del famoso modelo de Jacob-Monod sobre la regulacin de los genes bacterianos. Pero los huevos no son bacterias, y los intentos realizados para demostrar en embriones la existencia de una sntesis inducida por el sustrato hasta ahora han fracasado.

Una de las razones fundamentales de su fracaso probablemente sea el hecho ya mencionado de que los huevos contienen grandes reservas de todos los tipos de enzimas, que son sintetizadas durante la oognesis y almacenadas para ser utilizadas en estados mucho ms tardos del desarrollo. Como es natural, el aadir el sustrato a una reserva tan grande de enzimas no produce los mismos resultados dramticos que en las bacterias, donde las enzimas inducibles estn ausentes o presentes en muy pequeo nmero. De acuerdo con nuestros conocimientos actuales, las primeras enzimas que se sintetizan en los huevos de anfibio son las que actan en la degradacin oxidativa de los azcares (enzimas relacionadas con el ciclo del cido tricarboxlico y la oxidacin directa de hexosamonofosfato). Su sntesis puede ser ya detectada durante la neurulacin, cuando el consumo de oxigeno aumenta marcadamente y las mitocondrias, como ya mencionamos, se hacen mas complejas tanto desde el punto de vista ultraestructural como de contenido enzimtico. Varias enzimas hidrolticas (amilasa, proteasas, fosfatasas, etc.,) muestran un aumento de actividad en el tracto digestivo cuando este se hace funcional, tanto en las larvas pluteus de erizo de mar como en los renacuajos de anfibio o los embriones de polio. En estos casos, la sntesis enzimtica esta claramente ligada a la adquisicin de una funcin fisiolgica. La actividad de la enzima colinesterasa, que juega un papel esencial en el sistema nervioso, es ya importante en el vulo de anfibio; y aumenta considerablemente cuando, tras la induccin neural, las clulas nerviosas comienzan a diferenciarse a neuronas tpicas, fisiolgicamente activas. Un cambio similar en la actividad de la colinesterasa ha sido hallado en las clulas de un tumor del sistema nervioso, el neuroblastoma. Las clulas tumorales tienen una actividad de colinesterasa baja, pero si por un cambio de las condiciones de cultivo in vitro se diferencian a neuronas ms tpicas (con fibras nerviosas), la actividad de la colinesterasa aumenta notablemente debido a la sntesis de nuevas molculas de enzima. Tambin en otros sistemas se han observado cambios en la sntesis de enzimas en relacin con modificaciones del medio externo. Por ejemplo, la glutamina-sintetasa es una enzima, tambin relacionada con el metabolismo del sistema nervioso, que normalmente es sintetizada por la retina del embrin de polio en un determinado momento del desarrollo. Si las clulas de la retina son disociadas y posteriormente se permite su reagregacin, la sntesis de glutamina-sintetasa se adelanta en varias horas. Un adelantamiento an mayor se obtiene tratando las clulas de la retina con hormonas corticoesteroideas. Se conocen mltiples casos en los que la administracin de una hormona, incluso a clulas cultivadas in vitro, induce la sntesis de una enzima; pero la forma de actuacin de la hormona como inductor es an uno de los grandes problemas de la biologa molecular. En la mayora de los casos, la hormona se liga a una protena especifica (el receptor), presente en la membrana y/o en el citoplasma de la clula diana. El complejo hormona-receptor penetra en el ncleo y all desreprime el DNA, probablemente unindose a la protena acdica especifica presente en la cromatina. De resultas, se produce la sntesis del mRNA que portara la informacin precisa para la formacin de la enzima. Sin embargo, en otros sistemas, incluyendo el de la sntesis de glutamina-

sintetasa por parte de las clulas embrionarias de retina, la hormona no acta de esta manera. En estos casos, la hormona ejerce un control a nivel post-transcripcional, posiblemente inhibiendo la actividad de los mRNAs que codifican la formacin de represores de la sntesis enzimtica. Estos complejos mecanismos regulatorios ya han sido comentados en el captulo 4, cuando estudibamos la maduracin inducida por hormonas en los oocitos de anfibio. Naturalmente, es imposible comentar aqu todos los trabajos realizados sobre sntesis enzimtica durante el desarrollo, y cerraremos esta discusin con un ltimo ejemplo: el de la sntesis de enzimas pancreticas (tripsina, quimiotripsina, amilasa, etc.), que ha sido objeto de unos estudios muy interesantes realizados por Rutter. Los "acinis" pancreticos, que son las glndulas encargadas de la sntesis de enzimas digestivas, son inducidos por el mesnquima (tejido mesodrmico an indiferenciado) circundante. Esta induccin puede producirse a travs de un filtro, y no se detiene por la interposicin de una membrana "millipore" entre Los tejidos inductor y reaccionante. Rutter consigui6 aislar de los filtros una protena que tiene indudablemente una funcin esencial en este proceso, pues es capaz de inducir en las clulas reaccionantes la sntesis de un tipo especial de DNA de bajo peso molecular, seguida por la replicacin del DNA principal, lo que conduce a una sostenida actividad mit6tica. Solo cuando hay un nmero suficiente de clulas comienza la sntesis de RNA y de protenas. Las diferentes enzimas pancreticas son sintetizadas una despus de otra, en un orden constante. No hay evidencias de que las enzimas encargadas de una misma va metablica, por ejemplo del metabolismo de las protenas o de los azucares, sean sintetizadas juntas. Esto habla en contra de la existencia de un "opern" similar a los de las bacterias. Como puede verse, la secuencia de sucesos moleculares es exactamente la misma, mutatis mutandis, que la descrita en el caso de la regeneracin Wolffiana del cristalino. La induccin es seguida por la replicacin del DNA y la multiplicacin celular; posteriormente hay una sntesis de RNA (incluyendo rRNAs); y finalmente se forman, en un orden secuencial, las protenas tpicas del rgano (las protenas "de lujo" de Holtzer). 6. Protenas especficas y diferenciacin embrionaria Cuando una clula contiene una protena especifica y fcil de detectar como componente fundamental, puede utilizarse esta protena como un "marcador" de la clula, como vimos en el caso de la colinesterasa para las clulas nerviosas. Vamos a comentar algunos ejemplos en los que la presencia o ausencia de una protena tpica pueden ser tomadas como criterios relativamente fidedignos de diferenciacin celular. Un marcador muy apropiado es el pigmento marr6n-negruzco (melanina) que esta presente en las clulas pigmentadas (melanocitos). Durante el desarrollo embrionario, los melanocitos, que mas tarde emigraran a la piel y la protegern contra los excesos de luz, se originan en unas prominencias del sistema nervioso llamadas crestas neurales. Estas crestas neurales dan lugar tanto a clulas nerviosas como a melanocitos; si se cultiva in vitro un fragmento de ellas, puede observarse su diferenciacin en las dos estirpes celulares. Se ha demostrado que si se aade el aminocido fenilalanina al medio de cultivo, se estimula la diferenciacin de la cresta neural hacia melanocitos; por el contrario, la administracin de un "anlogo" de la fenilalanina, por ejemplo la fluorofenilalanina, inhibe la forma-don de los melanocitos, sin interferir con la de las

clulas nerviosas. Por lo tanto es posible enfocar la diferenciacin de la cresta neural hacia una u otra de las estirpes. Es de notar que los melanocitos pueden perder de una manera reversible la capacidad de sintetizar melanina. Cuando se cultivan in vitro melanocitos en forma de clulas aisladas, al cabo de unas cuantas divisiones pierden su coloracin; pero en cuanto hay un nmero lo suficientemente elevado como para permitir que exista contacto entre las clulas, vuelve a sintetizarse melanina. Estos casos de fcil desdiferenciacin y rediferenciacin no pueden ser Bien explicados por las teoras que suponen que las propias molculas de DNA sufren cambios qumicos durante la diferenciacin celular; y nos hacen ver lo importante que sera un conocimiento mas profundo de los factores que reprimen o desreprimen de una manera reversible la actividad de determinados genes especficos en las clulas de los organismos superiores. Recientemente se ha desarrollado un nuevo enfoque muy interesante para el estudio de la diferenciacin celular. Se trata de la tcnica de fusin celular, tambin llamada hibridacin somtica (Figura 67), inicialmente diseada por Ephrussi. Las propiedades de la membrana celular pueden ser alteradas por tratamiento con un virus hemoltico, denominado virus Sendai, incluso despus de que el virus haya sido inactivado y sea incapaz de multiplicarse en las clulas infectadas. Los cambios inducidos en la membrana permiten una fcil fusin entre dos (o mas) clulas de la misma o diferentes especies. Harris ha demostrado que cuando un glbulo rojo nucleado de gallina se fusiona a una clula cancerosa humana (clula HeLa), ocurren cambios muy notables. Antes de la fusin, el ncleo del glbulo rojo (eritrocito) estaba completamente inactivo, en una forma reprimida, y no sintetizaba ni RNA ni DNA. Por el contrario, el ncleo de la clula HeLa mostraba una intensa actividad de sntesis tanto de DNA como de RNA. Al fusionarse las dos clulas, se produce un heterocarion; existen dos ncleos de diferentes orgenes (gallina y hombre) en un mismo citoplasma. El anlisis de este hbrido de gallina y hombre muestra que el ncleo del eritrocito es rpidamente reactivado, y se hace capaz de sintetizar DNA y RNA. Antes de la fusin, el ncleo del eritrocito no contena nucleolos, que, en cambio, despus de la fusin son muy evidentes y ricos en RNA. Simultneamente, los organizadores nucleolares se reactivan, y puede detectarse por mtodos inmunolgicos la formacin de antgenos especficos de polio en la membrana celular del hbrido somtico. El citoplasma de la clula HeLa ha ejercido pues un efecto positivo, desrepresor, sobre el ncleo de polio, antes totalmente inactivo. Este efecto es totalmente similar al que ya hemos mencionado al citar los experimentos de Gurdon con vulos no fecundados de Xenopus: si se inyecta un ncleo tornado de un rgano adulto (cerebro, hgado), donde ya no hay sntesis de DNA, en un citoplasma joven, la sntesis de este cido nucleico se reanuda en el ncleo inyectado. Es claro que este mismo tipo de control positivo que ejerce el citoplasma del vulo sobre el ncleo adulto inyectado sigue operando en las clulas adultas activas. Esta elegante tcnica de fusin celular ha sido utilizada por Ephrussi para el estudio de la diferenciacin celular. Fusionando melanocitos con clulas embrionarias indiferenciadas (fibroblastos), dicho autor observo que en este caso la clula indiferenciada ejerce un control negativo sobre la diferenciada. El hbrido obtenido a partir de estas dos clulas perda rpidamente no solo la melanina, sino incluso la capacidad de sintetizar tirosinasa, una enzima precisa para la sntesis del pigmento. Se obtuvieron resultados similares a

partir de clulas hepticas y nerviosas. Al fusionarse con clulas indiferenciadas, las clulas del hgado perdan la capacidad de sintetizar ciertas enzimas y protenas de la sangre, y las clulas nerviosas ya no eran capaces de formar una protena (11amada S 100) que se encuentra normalmente en el sistema nervioso. An no se sabe si el control que ejercen las clulas indiferenciadas sobre las funciones diferenciadas es siempre negativo. Ciertos estudios sobre la fusi6n de clulas malignas con clulas normales muestran que los hbridos somticos pueden tener caractersticas muy complejas. La malignidad se comporta como un carcter recesivo, pero la interpretacin de estos resultados se complica por el hecho de que frecuentemente la fusi6n celular es seguida de la eliminacin de parte de los cromosomas (como ya hemos visto, esto tambin solfa ocurrir en los hbridos sexuales ordinarios). Recientes experimentos realizados en el laboratorio de Ephrussi muestran que si los melanocitos contienen el doble de cromosomas que los fibroblastos, los hbridos entre estas dos clulas ya no pierden la capacidad de producir melanina. Esto demuestra claramente la importancia que tienen la "dosificacin de los genes" sobre la expresin del fenotipo (produccin de melanina). Estudios an ms recientes indican que inmediatamente despus de la fusin desaparece el fenotipo diferenciado (formacin de pigmento, enzimas hepticas, protena S 100, malignidad, etc.); pero en cuanto se pierden un cierto nmero de cromosomas durante las divisiones celulares de la lnea hibrida, las diferenciaciones vuelven a reaparecer. Tenemos otro enfoque, tambin muy prometedor, para el estudio de la diferenciacin celular. Holtzer y sus colegas han demostrado que existe un anlogo de la timidina, la bromodeoxiuridina (BUDR), que es capaz de inhibir especficamente la diferenciacin celular. A unas concentraciones lo suficientemente bajas como para no detener la sntesis de DNA y la divisin celular, el BUDR impide la diferenciacin in vitro de los melanocitos, las clulas cartilaginosas, las clulas musculares, etc. Es de notar que esta sustancia no afecta la viabilidad de la clula, sino que inhibe especficamente la sntesis de las protenas "de lujo": melanina, condroprotenas y protenas contrctiles en las clulas pigmentadas, cartilaginosas y musculares, respectivamente. Tambin se ha descubierto que si se tratan embriones muy jvenes de polio con BUDR, se suprime la formacin de glbulos rojos y la sntesis de hemoglobina. Estos hallazgos han conducido a Holtzer a la conclusin de que la sntesis de las protenas "de lujo" especficas de cada tejido pudiera estar controlada por unos genes amplificados. El BUDR es un anlogo de la timidina; y esta es, como hemos visto, un precursor del DNA. Segn este investigador, las enzimas encargadas de la sntesis de DNA no diferenciaran entre timidina y BUDR, y en consecuencia se formara un DNA anormal, en que parte de los eslabones de timidina estaran sustituidos por BUDR. Debido a que los DNA normales y parcialmente sustituidos (por BUDR) tienen propiedades fsicas diferentes, se ha conseguido demostrar que esta sustitucin puede de hecho producirse en las clulas en divisin. Las bajas concentraciones de BUDR utilizadas en los experimentos sobre diferenciacin celular no detienen las mitosis, lo cual demuestra que la sustitucin de timidina por BUDR no es lo suficientemente extensa como para impedir la replicacin del DNA. Pero estas concentraciones quizs s basten para inhibir la amplificacin de genes; es decir, la multiplicacin selectiva de los genes que codifican las protenas "de lujo". Si estos genes fueran capaces de multiplicarse independientemente de los dems (como los genes del rRNA en los oocitos jvenes), su DNA se alterara en presencia del BUDR. En, lugar de las mltiples copias que normalmente se producen, solo habra un ejemplar de los genes

especficos, y en consecuencia no se podran sintetizar grandes cantidades de la protena "de lujo". Existe un buen argumento a favor de esta teora: si se aade timidina al BUDR, la diferenciacin se lleva a cabo normalmente. Los efectos desfavorables del anlogo son pues anulados si esta presente el precursor normal de la sntesis de DNA. Pero tambin existen numerosas dificultades con la teora que define la amplificacin gentica como mecanismo de diferenciacin celular. No es en absoluto seguro que en estos experimentos del BUDR acte especficamente sobre la sntesis de DNA. Por ejemplo, los efectos del BUDR pueden ser suprimidos no solo por la timidina, sino tambin por la uridina, que es generalmente un precursor de la sntesis de RNA. En el caso de las clulas musculares puede obtenerse el mismo efecto de inhibicin de la diferenciacin que produce el BUDR por un sencillo cambio del contenido en calcio del medio. Paradjicamente, el BUDR, as como los rayos X, inducen la transformacin de las clulas del neuroblastoma en neuronas tpicas; y los estudios bioqumicos realizados en este sistema no consiguieron demostrar ningn tipo de incorporacin del BUDR al DNA. Es posible que el BUDR no siempre acte selectivamente sobre la sntesis de DNA, y no se ha descartado la posibilidad de que tenga efectos importantes sobre la membrana celular o el citoplasma. Finalmente sera interesante saber si los genes que codifican las protenas "de lujo" estn realmente amplificados. La nica informacin que tenemos al respecto se limita a los genes de la hemoglobina del conejo, y a los genes de la fibroina de la seda de los gusanos de seda. En el primero de los casos, las investigaciones mas fiables indican que en los ncleos de las clulas productoras de hemoglobina, deben existir solo 4 0 5 copias de los genes de esta protena. El que existan 4 0 5 genes en lugar de los 4 previstos (2 genes para cadenas a y 2 genes para cadenas B, en una clula diploide) evidentemente no puede considerarse como una amplificacin. As mismo, en las glndulas productoras de seda de los gusanos de seda, los genes de la fibroina (la protena fundamental de la seda) tampoco estn amplificados. El embrilogo molecular no puede evitar plantearse una ltima pregunta, an no resuelta: la introduccin de los genes de la hemoglobina o de su mRNA correspondiente en un huevo fecundado sera capaz de inducir, adems de la sntesis de hemoglobina, la diferenciacin a glbulo rojo? Cuando sepamos si la induccin de la sntesis de una protena especfica (por ejemplo, la hemoglobina) obtenida introduciendo en el huevo su mRNA es capaz de provocar, adems de su diferenciacin qumica, su diferenciacin morfolgica, nuestras ideas sobre la diferenciacin celular asentaran sobre bases mucho mas firmes que las actuales. Debe sealarse un ltimo detalle. Para el estudio de la diferenciacin embrionaria sera importante tener mtodos que nos permitieran estimar la actividad gentica de las clulas individuales. Los mtodos bioqumicos generalmente precisan de grandes cantidades de material biolgico, que contienen una poblacin variable de clulas diferentes, quizs procedentes de diferentes tejidos y posiblemente en distintos estudios de su ciclo vital. Pero el embrilogo necesita estudiar los blastmeros individuales, tiene que analizar los cambios que se producen en las clulas que estn en estrecho contacto con el inductor; debe comparar la actividad gentica de las clulas localizadas en ambos extremos del gradiente morfogenetico, etc.

Para ello se ha diseado recientemente un mtodo de gran utilidad basado en el hecho de que la actinomicina tiene mucha mas afinidad por el DNA que por las nucleoprotenas. La medida de la capacidad que tiene un ncleo para ligar actinomicina marcada permite pues estimar la cantidad de lugares libres, capaces de ser transcritos, que existen en su molcula de DNA. La unin entre la cromatina y la actinomicina marcada puede detectarse por autorradiografa, despus de "teir" los cortes de tejido con la droga radiactiva. Este mtodo ya ha proporcionado mltiples y valiosos resultados en el campo de la embriologa molecular; y probablemente permita en el futuro anlisis an ms exacto, pues recientemente ha sido posible aplicarlo a cortes ultrafinos, que pueden ser estudiados al microscopio electrnico. Se ha descubierto por ejemplo que la capacidad de fijar actinomicina decrece durante la espermatognesis, y es insignificante en los espermatozoos. Como sabemos, estas clulas tienen su DNA estrechamente unido a protenas bsicas, y no sintetizan ni RNA ni protenas. Su cromatina esta totalmente reprimida e inactivada, y por lo tanto, a pesar de que contiene en su DNA haploide todos los genes paternos, no es capaz de unirse a la actinomicina. Esta tcnica tambin se ha demostrado muy til para la deteccin citoqumica de los organizadores nucleolares y del DNA vitelino; gracias a ella se ha demostrado que en la bstula y en la gstrula los ncleos del endoblasto tienen una cromatina mas activa que los del ectoblasto. El mismo mtodo ha demostrado que cuando, por induccin, el ectoblasto se transforma en sistema nervioso, las clulas reaccionantes muestran un aumento de la capacidad de ligar actinomicina, lo cual prueba que la induccin neural va unida a una desrepresion gentica. Cuando, en estados posteriores, comienza la diferenciacin embrionaria y empiezan a sintetizarse grandes cantidades de protenas especificas de cada tejido ("protenas de lujo"), se observa una disminucin de la capacidad de ligar actinomicina. Esto ltimo ha sido claramente demostrado en el cristalino, el cartlago y los glbulos rojos. La diferenciacin celular, caracterizada por la sntesis de protenas "de lujo" es pues un periodo de disminucin de la actividad gentica total. Muchos genes dejan de funcionar, y probablemente existe un desequilibrio entre esta inactivacin de ciertos genes y la activacin de los genes que codifican las protenas organo-especificas. Naturalmente, a uno le gustara ver al microscopio los genes relacionados con la sntesis de las protenas rgano-especificas, por ejemplo los genes de la hemoglobina. Esto no es solo un sueo. Ya ha sido posible ver al microscopio los genes amplificados de rRNA presente en el "casquete" del oocito joven de anfibio (ver capitulo 4). Esto pudo hacerse hibridando rRNA radiactivo al DNA presente en el ncleo. Tras la desnaturalizacin del DNA nuclear, solo el rDNA presente en el casquete ligaba rRNA marcado. Dado que esta tcnica ya ha sido utilizada a nivel de microscopia electrnica, no es absurdo pensar que se podr llegar a ver genes individuales en el ncleo de la clula. Tericamente esto se conseguira hibridando mRNA radiactivo de hemoglobina con el DNA presente en las clulas que producen esta protena. Sin embargo, los resultados que hasta ahora se han obtenido por este mtodo son an dudosos.

7. El futuro de la embriologa molecular Seria absurdo que alguien que ha presenciado los extraordinarios progresos realizados por la biologa molecular durante los ltimos 25 aos hiciera predicciones sobre el futuro desarrollo de la embriologa molecular. El descubrimiento de un material favorable, que pudiera ser analizado genticamente, que mostrara una buena diferenciacin celular, y que permitiera la preparacin de sistemas in vitro, seria suficiente para dar un gran paso adelante. Necesitamos un organismo que pertenezca a los Eucariontes, pero que sea de una sencillez comparable a la de las bacterias y los virus. Pero es dudoso que realmente exista un material ideal para el estudio de la diferenciacin celular. Lo nico que podemos hacer por ahora es seleccionar sistemas que presenten ciertas ventajas para el estudio de algn problema particular, y compararlos entre si. Esto es lo que hicimos, por ejemplo, cuando comparamos Acetabularia y los huevos de erizo de mar, desde el punto de vista de las potencialidades bioqumicas y morfogenticas de los citoplasmas anucleados. No hay duda de que, a pesar de su complejidad, el embrin en desarrollo es el mejor material que tenemos por ahora para el estudio de la diferenciacin celular. Probablemente la oognesis, la maduracin y la fecundacin sigan siendo temas atractivos para muchos bilogos moleculares. La reciente posibilidad de obtener la sntesis de una protena especfica (hemoglobina) inyectando su mRNA en el oocito de un anfibio, ofrece a la bioqumica un campo completamente nuevo. Quizs el oocito de anfibio se convierta pronto en un sistema ms til y eficaz que los ribosomas aislados de bacterias para el estudio de los mecanismos de la sntesis proteica. El xito que signific el aislamiento de los genes ribosmicos (rDNA) en el oocito de Xenopus sin duda impulsar a otros investigadores a intentar separar y purificar otros genes especficos. Quizs pronto sea posible sintetizar enzimticamente genes especficos. Como hemos visto, ya se ha aislado el mRNA de la hemoglobina, y la purificacin de los mRNAs de la miosina y la fibroina de la seda va avanzando rpidamente. Es posible, aunque evidentemente no seguro, que con la enzima RNA DNA transcriptasa (que sintetiza DNA sobre un molde de RNA) y utilizando estos mRNAs puros, se puedan sintetizar sus genes correspondientes. Si tuviramos genes "puros" en un tubo de ensayo, seria posible inyectarlos en los huevos y embriones en desarrollo. Lo que ocurrira es totalmente imprevisible. Para que el experimento tuviera xito y se pudieran obtener resultados positivos, seria necesario integrar los genes inyectados en los cromosomas del huevo receptor de forma que se replicaran en la mitosis, pues si no se perderan rpidamente. Estos experimentos de "transformacin" ya se han realizado en las bacterias. Hay pruebas de que el DNA puede penetrar en el ncleo de la clula una vez que ha sido introducido en el citoplasma, e incluso es posible que este DNA exgeno puede ser replicado, aunque de esto ultimo no hay pruebas fehacientes. Por lo tanto, no es ilusorio pensar que se pueda encontrar un da un material biolgicamente adecuado, y que esto permita integrar genes en el genoma de una clula husped de forma que se puedan replicar con ella. Pero esto solo se conseguir con experimentos audaces. Ya hemos visto como esta osada experimental, por ejemplo en los transplantes nucleares de Gurdon o en la inyeccin de DNA o del mRNA de la hemoglobina en huevos, ha proporcionado xitos rotundos y nos ha permitido llegar a importantes conclusiones.

Otro mtodo ampliamente estudiado y utilizado por la gentica bacteriana, que quizs nos permita introducir un gen nuevo en un huevo, es la transduccin. Un fago poseedor de ciertos genes, adems de su propio genoma, puede infectar una bacteria y suministrar estos nuevos genes a la clula husped. Muchos virus son capaces de infectar las clulas animales, y algunos de ellos, concretamente los virus oncognicos del tipo polioma, pueden transformar clulas normales en clulas cancerosas. Recientemente se ha demostrado que incluso el bacterifago, uno de los materiales mas utilizados en la gentica de fagos, puede infectar clulas humanas cultivadas in vitro. Se ha realizado un experimento en el cual unas de estas clulas, que debido a su constitucin gentica incompleta carecan de una enzima relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono, se infectaban con un fago que portaba un gen de origen bacteriano capaz de codificar la sntesis de esta enzima. El resultado fue que algunas de las clulas infectadas haban adquirido el gen transportado por el fago, y eran capaces de sintetizar la enzima durante muchas generaciones. Estos asombrosos experimentos sugieren que la introduccin, por medio de fagos transductores, de nuevos genes en huevos o embriones es una posibilidad real y no una vana esperanza. Otro mtodo para introducir nuevos genes seria la hibridacin celular, que ya esta siendo extensamente utilizada para anlisis genticos humanos, y que sin duda ser un instrumento cada vez mas til par el estudio de la diferenciacin celular. Este es un campo que esta en sus albores, y que indudablemente nos reserva grandes e inesperadas sorpresas. Probablemente la hibridacin y la transduccin tengan algunos caracteres en comn, pues se ha demostrado que un virus puede ser transportado por un espermatozoo e introducido en el vulo o en una clula por fecundacin o por hibridacin celular. El otro aspecto del problema gentico, es decir, la regulacin de la actividad de los genes, es an ms importante para comprender la diferenciacin celular. El problema es de una enorme complejidad, incluso en las bacterias, donde ya esta prcticamente resuelto. No hay duda de que en el futuro muchos bilogos moleculares van a concentrar su trabajo sobre el problema de la regulacin gentica en los Eucariontes. Seguramente el abordaje tendr que ser doble: por un lado el anlisis gentico del material mas favorable (y Drosophila sigue siendo uno de ellos), y por el otro el estudio bioqumico de las propiedades de la cromatina. Estamos empezando a comprender cada vez mejor la funcin de las histonas y de las protenas acidas de la cromatina en el control de la actividad gentica; pero la funcin del RNA cromos6mico, si es que existe, sigue siendo un enigma. Ya existen buenos modelos tericos, como el propuesto por Britten y Davidson, que intentan explicar la diferenciacin celular como resultado de la regulacin de la actividad gentica. Sin duda, los avances de la bioqumica nos permitirn comprobar experimentalmente la validez de estas hiptesis, y modificarlas si fuera necesario. Como los propios Davidson y Britten han admitido recientemente, estos modelos no pueden proporcionar una explicacin adecuada del desarrollo embrionario sin tener en cuenta la heterogeneidad del citoplasma del huevo. Este es un punto que hemos repetido hasta la saciedad en este libro, y que ya estaba claro en la mente de Morgan. Si queremos seguir adelante, tenemos que estudiar mucho mas a fondo, desde el punto de vista molecular, las localizaciones germinales, los gradientes morfogenticos, la regulacin embrionaria, las inducciones, etc. Estos factores morfogenticos fueron descubiertos hace

tiempo, gracias a los delicados y laboriosos trabajos de los embrilogos experimentales; y sera a un grave error desecharlos como "pasados de moda", pues existen y son de una importancia primordial para la morfognesis. Sin embargo, los problemas planteados por las localizaciones germinales, la regulacin embrionaria y los gradientes morfogenticos probablemente no atraigan la atencin de los bilogos moleculares, que intentan solucionar el problema de la diferenciacin celular desde el enfoque gentico que hace un momento presentbamos. Esto no es solo una cuestin de moda, hbito mental o ignorancia de los problemas bsicos de la embriologa; es tambin un problema de tcnica. Si suponemos que las protenas nucleares juegan un papel esencial en la regulacin de la actividad de los genes, para probar esta hiptesis seria necesaria aislar los ncleos de los diferentes blastmeros de los huevos en segmentacin y analizar sus protenas. Esto es posible, pero requiere tiempo y paciencia. El disecar el ncleo de un blastmero y analizar sus protenas con ultramicromtodos es mucho ms lento y difcil que el homogeneizar un hgado completo, aislar los ncleos por centrifugacin y analizar sus protenas en un aparato automtico. Tambin son precisos estos micromtodos para avanzar en un campo al que se le puede augurar un importante desarrollo en los aos prximos: la embriologa molecular de los mamferos, incluyendo el embrin humano. Ya sabemos un poco sobre la sntesis de RNA, el contenido en enzimas y el metabolismo respiratorio de los huevos de ratn, rata y conejo. Pero estos huevos no se pueden desarrollar in vitro ms all del estudio de blastocisto (preimplantacin). Para estados ms avanzados hay que implantar los embriones en una madre adoptiva preparada, lo cual hace que la experimentacin sea mucho ms difcil. Es de prever, pues, que se hagan importantes intentos de mejorar las condiciones de cultivo, para que se parezcan lo mas posible a las de la placenta. No es totalmente imposible que se pueda producir una "placenta artificial", como demuestra el hecho de que al menos un investigador afirma haber cultivado embriones de mamfero hasta el estado en que comienza a latir el corazn. Si esto se confirma y si el mtodo puede utilizarse de forma reproductible, ser posible estudiar in vitro la diferenciacin embrionaria de los embriones de mamfero, lo cual a su vez permitira un anlisis molecular de su desarrollo. Nos conducir todo esto finalmente a la produccin de "nios en tubos de ensayo"? Las perspectivas que abre la "ingeniera gentica" son sobrecogedoras. Ya se ha conseguido fecundar artificialmente vulos humanos, por lo que se puede empezar a pensar seriamente en la seleccin de la humanidad. Escogiendo correctamente los vulos y los espermatozoo, quizs podamos intentar conseguir una mayor proporcin de ganadores de premio Nobel o de jugadores de ftbol. Si se pudieran separar los espermatozoos portadores de cromosoma X de los portadores de cromosoma Y, lo cual probablemente se consiga tarde o temprano, se podra determinar artificialmente la proporcin de hombres y mujeres en el mundo. Estaramos en el Mundo Feliz de Huxley, una novela que seria una perfecta anticipacin de lo que pudiera ser la sociedad futura, si no faltara la palabra clave: el DNA. Los embrilogos moleculares tendran una tremenda responsabilidad en el desarrollo de esta sociedad. Ms que nunca, el cientfico debe ser consciente de su responsabilidad social y mantener una tica inquebrantable. Va en ello la paz y la prosperidad de la humanidad.