INSTITUTO

DE

T E C N O L O G A O RT

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS BIOQUMICA ANALTICA 2011

FABRICIO PIERSIMONI

CROMATOGRAFAS
Cromatografa en Papel Objetivo: Familiarizarse con la tcnica cromatogrfica , en general y con la de particin en particular. Comparar la corrida en papel con la desarrollada en TLC. Resumen: Se utilizar papeles Whatman N1 para la separacin de soluciones de colorantes comnmente utilizados en qumica. Reactivos: Soluciones de colorantes entregadas por el docente. Eluyente: n-butanol:etanol:amonaco 2 N (60:20:20). Materiales e instrumental: Papel Whatman 1 Cuba cromatogrfica Tubos capilares Placas de TLC Procedimiento: Cortar una hoja de papel Whatman N1 del tamao adecuado para la cuba cromatogrfica que se utilizar (para ello previamente hacer un molde con un papel cualquiera). Trazar la lnea de siembra con un lpiz de trazo fino, aproximadamente a1.5 cm del borde inferior. Marcar los puntos de siembra sobre dicha lnea, dejando espacios de 1 cm entre ellos y 1 cm de cada borde del papel. Realizar la siembra con un capilar previamente cortado. Se sembrar una mezcla de distintos colorantes. Introducir el papel en la cuba previamente saturada con el solvente de desarrollo. Una vez que el solvente haya alcanzado la altura deseada (como mnimo el 80% de la altura total del papel) sacar el cromatograma de la cuba. Marcar el frente de solvente con un lpiz y dejar secar. Medir el Rf . Realizar el mismo procedimiento utilizando una placa de TLC. Resultados Consignar los valores de Rf obtenidos para los indicadores utilizados. Comparar los Rf de los componentes de la mezcla con los Rf de los patrones, a su vez comparar las corridas hechas en las distintas fases estacionarias.

Cromatografa en Capa Fina (TLC)

Objetivo: Familiarizarse con la tcnica de cromatografa en capa delgada para la separacin de distintos compuestos: aminocidos y pigmentos liposolubles. Aplicacin de la tcnica a productos naturales. Resumen: Se estudiar la influencia del volumen de siembra y la naturaleza del solvente (polaridad) en el desarrollo del cromatograma. Se aplicar la tcnica para identificar los aminocidos presentes en jugos de fruta. Lo mismo para la separacin e identificacin de clorofila Ay B. 1.1 Cromatografia de aminocidos Reactivos: Aminocidos Patrones al 0,25% en isopropanol:agua (10:90) de distintos aminocidos Solvente: n-butanol:cido actico glacial:agua (3:1:1) Revelador: ninhidrina 0,2% en acetona, recientemente preparada Materiales e instrumental: Cromatofolios recubiertos con slica gel Cuba cromatogrfica Tubos capilares Papel de filtro Embudo Erlenmeyer Varillas de vidrio Procedimiento:

Separacin de aminocidos por cromatografa Como aplicacin de la tcnica se utilizarn jugos de frutas con la intencin de identificar los aminocidos presentes en cada uno. Se sembrar entre 3 y 5 gotas de las soluciones patrn de los aminocidos presentes en el jugo de cada fruta, conjuntamente con gotas del jugo de fruta sin diluir y diluido 1:5. Se utilizar 5 ml de zumo de cada fruta recientemente extrado. Se filtra por papel, y se agregan 15 ml de alcohol para precipitar las protenas y las sales. Se vuelve a filtrar o centrifugar. Diluir 1:5. Se aplica una gota de cada solucin en un cromatofolio. Se deben aplicar tambin muestras mayores, por ejemplo, de 2 de 3 gotas; para evitar que la mancha se extienda indebidamente, despus de la aplicacin de cada gota, se deja secar y se vuelve aplicar otra gota en el mismo punto, as hasta completar. Siempre que se trabaje con aminocidos hay que evitar tocar con los dedos la superficie de las placas o del papel, puesto que la transpiracin contiene aminocidos. Para eI revelado pulverizar abundantemente con ninhidrina y colocar en estufa 5 minutos. Identificar los aminocidos presentes en cada muestra por comparacin con los patrones (sembrar los patrones correspondientes a los aminocidos que correspondan a la fruta utilizada).

Ac. asptico Naranja Limn Pomelo si si si

Asparagi na Si No

Ac. glutamin glutm a ico Si si Si Si

histidina

treonina

serina si si si

prolina si

alanina si si

arginina si si

si

si

Resultados Comparar los Rf de los componentes del jugo con los valores de los patrones e identificarlos en las muestras de jugo de fruta. Calcular la polaridad del solvente utilizado. 1.2) Cromatografa de Pigmentos Pigmentos Vegetales Introduccin Muchos de los colores asociados a las plantas superiores se deben a la presencia de determinados compuestos qumicos o pigmentos. Estos se encuentran estrechamente ligados a las actividades biolgicas del propio vegetal. Si bien es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo y azul. El color particular que presenta determinado rgano vegetal depende del predominio de uno u otro de dichos pigmentos, o de la combinacin de varios de ellos. Cuando ciertas partes del vegetal presentan color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ella no es absorbida selectivamente como en las partes coloreadas, sino que es trasmitida o reflejada sin sufrir modificaciones. Clorofilas Son los pigmentos verdes implicados en la fotosntesis de la plantas superiores. Este nombre se extendi posteriormente a todas la clases de pigmentos fotosintticos porfirnicos. Las molculas de clorofila se encuentran estrechamente unidas a lpidos, protenas y lipoprotenas. Entre las clorofilas ms abundantes se encuentra la A y la B, siendo la primera la predominante. Las feofitinas pertenecen al grupo de las clorofilas. La estructura qumica de la feofitina A corresponde a una clorofila A sin Mg, y la B a la clorofila B sin Mg. Objetivo: Separacin de los pigmentos de hojas verdes. Resumen: Las hojas verdes presentan una serie de colorantes, entre ellos la clorofila, responsable del color, y los carotenos cuya presencia no es tan evidente, ya que habitualmente su color no alcanza a manifestarse. Se proceder a su extraccin por solventes y a su separacin por cromatografa en placa delgada. Reactivos: Acetona Etanol ter de petrleo (fraccin 60-80 C) Solvente de desarrollo: ter de petrleo (fraccin 60-80 C) y acetona (7:3). Sulfato de sodio anhidro (secado en estufa a 100 C durante una hora y conservado en desecador. ter de petrleo 40-60 ter de petrleo 60-80 Dioxano Isopropanol Materiales e Instrumental: Ampolla de decantacin Erlenmeyer Probeta Varillas de vidrio Embudo Algodn

Bao termostatizado Ampolla de decantacin Cristalizador Cromatofolios de silicagel Cuba cromatogrfica Capilares Procedimiento: Extraccin de los pigmentos: Pesar 70 g de hoja de espinaca fresca (limpia y seca). Cortar en trozos pequeos. Escaldar en agua hirviente durante 1 minuto. Proceder a desechar la solucin escurriendo lo mximo posible. Dejar enfriar. Agregar al material vegetal, aproximadamente, 25 ml de etanol, agitar con varilla de vidrio y luego escurrir y desechar el solvente. Con este procedimiento se elimina el agua que contiene las hojas y las sales solubles en agua. Pasar a un erlenmeyer de 250 ml, agregar 60 ml de acetona y mezclar con varilla de vidrio. Colocar en bao de Mara a 40 C durante 10 minutos. La solucin verdosa se trasvasa a un erlenmeyer de 250 ml, presionando bien la pasta para extraer todo el solvente. Se obtiene el extracto 1. A la pasta anterior se la trata con una nueva porcin de 40 ml de acetona, se mezcla bien y se lleva a bao de Mara a 40 C durante 10 minutos. La solucin verdosa (extracto 2) se agrega el extracto 1. La solucin formada por los extractos se filtra por una fina capa de algodn, recogiendo el filtrado en una ampolla de decantacin. Se procede a realizar dos extracciones con 15 ml (cada vez) de ter de petrleo, porcin 40/60. La fase inferior (acetnica) se desecha, se recoge la fase etrea en un cristalizador. Para el sacado de esta solucin se agregan, aproximadamente, 3 g de Na2SO4 anhidro. Dejar algunos minutos. La solucin sobrenadante (extracto etreo de los pigmentos) ser utilizada para sembrar las cromatografas y conservar para estudios posteriores. Se siembran cantidades crecientes en una placa (silicagel). Se utilizan como solventes de corrida las siguientes mezclas: ter de petrleo 60-80/acetona (7:3) Correr junto con las muestras de clorofilas patrones entregados por el docente. Resultados Consignarlos Rf de clorofilas y los patrones. Compararlos. Calcular la polaridad del solvente utilizado

Cromatografa de Adsorcin En Columna

Objetivo: Separacin de los pigmentos presentes en las hojas verdes por la tcnica de cromatografa en columna. Resumen: La separacin de los componentes de una mezcla se basa en las distintas fuerzas de atraccin que stos tienen con el adsorbente (fase fija). El ms fuertemente atrado por el adsorbente ser el ms difcil de eluir con el solvente (fase mvil) y ser el que menos se desplazar. En base a esto los distintos pigmentos se separaran de acuerdo a su afinidad por la fase estacionaria como asi tambin por el eluyente. Reactivos: Eluyente ter acetona Materiales e Instrumental: Almina activada, a 180 C durante 2 horas. Pipetas Pasteur Lana de vidrio Espectrofotmetro Procedimiento: Se prepara una columna de almina bsica. Se utiliza un tubo de vidrio con robinete (semejante a una bureta) de aproximadamente 12 cm de longitud. Se llena con ter de petrleo (60-80) y se va cargando con la almina de tal manera que el empaquetado sea uniforme. No se debe permitir que la columna se seque (en el caso que ocurra esto y el material aparezca quebrado o con grietas, se deber comenzar el proceso nuevamente). Sembrar los pigmentos del prctico anterior. Eluir con el solvente ter: acetona. Recoger los pigmentos a medida que van saliendo de la columna con la precaucin de cambiar de tubo cuando el eluido cambia de color. Una vez separados los componentes se reconocern cada uno de los componentes de la muestra espectro de absorcin de cada uno. Resultados Determinar el mximo de absorcin de cada una de las muestras recogidas en los tubos y compararlas con los valores de tabla para clorofila A y B. Reactivos: ter de petrleo 60-80 Acetona Alcohol absoluto Materiales e Instrumental: Almina bsica activada, a 180 C durante 2 horas. Columna de vidrio (tubo de vidrio con robinete) Tubos de ensayo graduados Pipetas Pasteur Lana de vidrio Espectrofotmetro Procedimiento:

Separacin El eluyente a utilizar es una mezcla ter de petrleo (60-80)-acetona (9:1). Con ste corren las xantfilas y se retiene la clorofila (100 ml). Se siembra con pipeta Pasteur (0,5 ml) de la solucin etrea de pigmentos. Se abre el robinete para que la solucin penetre dentro del relleno de la columna y se comienza a eluir. Se ver extender la zona verde de la clorofila y luego comienza a separase y adelantarse una zona de color rojizo que contiene los carotenos. Si la columna fue bien armada, estas zonas tendrn bordes netos. Cuando se note la presencia de lquido coloreado a nivel de la lana de vidrio, se debe comenzar a recoger fracciones de 1 ml. Tener en cuenta que los carotenos se oxidan rpidamente en presencia de la luz. Cuando se ha eludo en forma completa las xantfilas, se cambia el eluyente por otro ms polar. En este caso se utiliza la mezcla acetona-alcohol absoluto (1:1) (100 ml). Se eluirn las clorofilas, recogiendo fracciones de 1 ml. Caracterizan espectrofomtrica A las fracciones eludas de la columna se les determina el espectro de absorcin. De esta manera se determina el pico de absorbancia para cada pigmento. Beta-Carotenos: 436 nm Xantfilas: 474 nm Clorofila A: 665 nm Clorofila B: 649 nm Resultados Graficar absorbancia vs. volumen eluido.

Cromatografa de Intercambio Inico

Objetivo: Aplicar la tcnica de intercambio inico a la separacin de los iones presentes en una solucin. Resumen: Se utilizar una columna de resina catinica para retener, primero, y eluir, despus, una solucin de Cu2+. Reactivos: Resina Dowex (catinica), previamente equilibrada con agua destilada. Solucin de HCl 0,2 N HClO4 (c) Solucin de CuSO4 conteniendo 5,5 mg Cu2+/ml Materiales e instrumental: Columnas cromatogrficas Pipetas Tubos de ensayo Procedimiento: Retencin y elucin de Cu2+ en una columna de intercambio inico: Se utilizar una solucin madre de cobre conteniendo 5,5 mg Cu2+/ml, como CuSO4. Con esta solucin se har la curva de calibracin en el espectrofotmetro. Para ello se procede de la siguiente manera: Preparar un blanco conteniendo 5 ml de agua destilada y 0,5 ml de HClO4 (c). Preparar seis muestras segn el cuadro: Solucin madre 0,5 ml 1,0 ml 2,0 ml 3,0 ml 4,0 ml 5,0 ml agua hasta 5 ml hasta 5 ml hasta 5 ml hasta 5 ml hasta 5 ml hasta 5 ml HClO4 (c) 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Realizar las lecturas de absorbancia para cada una de las muestras a 800 nm. Construir el grfico de absorbancia vs [Cu2+]. Se utilizar una columna Dowex (catinica), previamente equilibrada con agua destilada. Se siembran 5 ml de la solucin madre y se eluye con HCl 0,2 N, y se toman fracciones de 2 ml. A cada fraccin se le agregan 3 ml de agua destilada y 0,5 ml de HClO4 (c). Medir absorbancia en cada muestra. Consignar los valores en una tabla. Volumen eluido (ml) 2 4 6 8 10 Absorbancia [Cu2+]

Resultados Con la curva de calibracin calcular la concentracin de cobre en cada fraccin. Consignar en una tabla [Cu2+] vs volumen eludo. Representar el cromatograma ([Cu2+] vs volumen eludo).

1.7) Cromatografa de Intercambio Inico Objetivo: Aplicar la tcnica de intercambio inico a la desionizacin de una muestra de agua de dureza conocida , por medio de intercambio aninico y catinico. Resumen: Se utilizar una columna de resina catinica para retener, primero y eluir despus, una muestra de agua, y luego una columna de resina aninica.

Cromatografa de Exclusin Molecular o Permeacin en Gel

Objetivo: Familiarizarse con el uso de las resinas de exclusin o tamices moleculares. Su utilizacin para caracterizacin de peso molecular. Resumen: La cromatografa de permeacion en gel es un mtodo de purificacin de polmeros naturales y sintticos, que separa molculas en funcin de sus tamaos moleculares. La matriz slida que se va a utilizar en la practica esta constituida por un polmero de dextrano entrecruzado con epiclorhidrina. Es un polisacrido altamente hidrofilico, al igual que el almidn, que se hincha en contacto con un solvente acuoso. Su nombre comercial es el de Sephadex G-100. Se fabrica en partculas esfricas porosas con distinto grado de entrecruzamiento y por lo tanto con diferentes capacidades de separacin de molculas. Las propiedades ms importantes del Sephadex G-100 son; Separa protenas en el rango de 4000 150000 Da Retiene una cantidad de agua de 10 ml +/- 1 ml por gramo de Sephadex seco Su densidad es de 1.04g/ml La forma de gel se consigue por hidratacin Reactivos: Sephadex G-100 Solucin de NaCl 0.9 % Buffer acetato 0,2 M (pH 6) Solucin de azul Dextrano: 0,3 % p/v en buffer Solucin de mioglobina: 0,1% p/v en buffer Solucin de Catalasa: 0,1 % p/v en buffer Solucion de Albumina: 0.1% p/v en buffer Solucion de Vitamina B12 Materiales e instrumental: Columna cromatogrfica pipetas tubos de ensayo Procedimiento: Preparacin de la columna Se mezcla una cantidad adecuada de Sephadex con la fase movi l(NaCl 0.9%) para permitir la hidratacin y formacin del gel. Una vez hidratado se vierte dentro de la columna cromatografica poco a poco y sobre las paredes de la misma para evitar la formacin de burbujas. La altura de la columna preparada debe ser de aproximadamente 10 cm.A continuacin se hace pasar suficiente cantidad de fase movil para lograr un buen empaquetamiento de la columna. Es importante antes de verter el gel en la columna colocar un trozo de lana de vidrio en la base de la misma para evitar que el gel se vaya con la fase movil. Caracterizacin de hemoglobina: Como eluyente se usa una solucin 0,5 M en NaCl y 0,1 M en buffer acetato (pH 6). Como patrones se utilizarn solucin de azul Dextrano (0,3 % p/v en buffer), solucin de mioglobina (0,1% p/v en buffer) y solucin de hemoglobina (0,1% p/v en buffer). La columna se equilibrar con el buffer salino. Aplicar 1 ml de solucin de hemoglobina (1 % p/v en buffer) sobre el lecho de la columna, teniendo cuidado de no agitar el Sephadex. Abrir la llave de la columna permitiendo que la muestra penetre dentro de la resina (tener cuidado de que no se seque porque se quebrara). Agregar suficiente cantidad de buffer, despus de

cerrar la llave. Abrir la llave dejando que el lquido fluya fuera de la columna, La muestra de hemoglobina se mover lentamente a travs de la columna y la banda comenzar a extenderse. Mantener siempre suficiente cantidad de buffer para impedir que se seque. Recoger fracciones de eludo de 1 ml cada una (en tubos numerados). Seguir recogiendo fracciones hasta que no haya color en los tubos. Repetir la operacin con 1 ml de una mezcla conteniendo igual volumen de mioglobina y azul Dextrano. Observar la separacin, recogiendo fracciones de 1 ml, como en el caso anterior seguir hasta desaparicin de color. Observar contra un fondo blanco todos los tubos y determinar la fraccin de color ms intenso. Anotar a qu nmero de tubo corresponde. (Esto coincide con el volumen de elucin para cada muestra pues se recogieron fracciones de 1 ml cada una). Para el azul dextrano este volumen define el volumen muerto (Vo), o sea el volumen requerido para eluir un compuesto que no penetra en los poros del gel. El azul dextrano tiene un peso molecular de 2.106 daltons y el G75 excluye cualquier material con peso molecular mayor de 50000 daltons. Consignar los volmenes de elucin para las tres muestras. Resultados: Construir un grfico de volumen de elucin vs log PM (peso molecular). Para el azul dextrano considerar un peso molecular de 50000, para la mioglobina considerar 17000. De acuerdo a la teora, estos puntos pertenecen a una misma recta. De sta determinar el peso aparente de la hemoglobina.

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Espectrofotometra
Dosificacin de Protenas: Introduccin: En trabajos de bioqumica, frecuentemente es necesaria la determinacin de la concentracin de protenas. Hay diferentes mtodos disponibles, de los cuales su eleccin, depende de los siguientes factores; - la cantidad total de protena disponible - la concentracin de la solucin - la necesidad de conservar la muestra intacta luego del ensayo - la presencia en la muestra de compuestos que interfieran el ensayo - la especificidad del ensayo - la rapidez con la que se necesita el resultado Las tcnicas ms utilizadas estn basadas en la espectroscopia y pueden dividirse en dos categoras de acuerdo al cromforo que detecta el ensayo: - cromforos presentes en las protenas; ensayos en los cuales no se necesita adicionar ningn reactivo para cuantificar la muestra (ej. Espectroscopia UV) - cromforos que resultan de reacciones qumicas de las protenas; las soluciones de protenas a cuantificar carecen de color por lo tanto es necesario adicionar algun reactivo que reaccione qumicamente con la protena dando un color que pueda ser cuantificado en el espectrofotmetro (ej. Ensayo de Biuret, Bradford, Lowry, etc.)

Reaccin del Biuret : La reaccin del Biuret est basada en la formacin de un complejo azul prpura entre los enlaces peptdico y el ion Cu2+ en medio alcalino. Este complejo absorbe luz en el espectro visible (=540 nm).

Este mtodo tiene la ventaja de que es poco influenciado por la composicin aminoacdica de las protenas presentes en la muestra ya que es una reaccin en la que interviene directamente el enlace peptdico. Sin embargo, se trata de un mtodo que, comparado con otros mtodos disponibles, resulta poco sensible, ya que cada ensayo requiere una cantidad de protena superior a 0,1 mg. Adems, son numerosos los compuestos que interfieren, entre otros, sacarosa, Tris, glicerol, EDTA. Reactivos: Patrn de protenas. Albmina 10mg/ml Reactivo de Biuret. Disuelva 3,8 gr de CuSO4.5H2O y 6.7 gr de NaEDTA en 700 ml de agua destilada. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1 gr de KI como estabilizante. Mtodo: Aadir 1 ml del reactivo de Biuret a los tubos estndar y a las muestras problemas como se indica en la tabla. Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer absorbancia a 545 nm frente al blanco de la reaccin.

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Reactivos Resultados Tubos Estndar(ul) H2O(ul) Biuret(ml) A 545 nm [protena] Blanco 0 100 1 1 25 75 1 2 50 50 1 3 75 25 1 4 100 0 1 Muestras M1 100 0 1 M2 100 0 1 M3 100 0 1

Mtodo de Lowry para determinacin de protenas: En 1927, Folin y Ciocalteu pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que es la base del mtodo descrito ms tarde por Lowry en 1951. An hoy, el mtodo de Lowry es ampliamente empleado. En este ensayo tiene lugar una serie de reacciones de oxidacin / reduccin cuyos detalles no se conocen con precisin. Transcurre en por lo menos dos pasos. En el primer paso, se forma el complejo del biuret. Las condiciones de este ensayo favorecera la reduccin del Cu2+ del complejo para dar Cu+ y enlaces peptdicos oxidados, en el segundo paso, el Cu+ reduce el reactivo de Folin-Ciocalteu (inicialmente de color amarillo), lo cual da lugar a varios compuestos de color azul que pueden ser detectados a 750 nm. El componente activo del reactivo de Folin-Ciocalteu es el cido mixto fosfomolibdotngstico: 3H2O-P2O5-13WO3-5MoO3-10H2O. La reduccin de este reactivo se manifiesta por la prdida de uno, dos o tres tomos de oxgeno del tungstato y/o del molibdato, obtenindose las especies de color azul. Adems de la reaccin del complejo biuret formado en la primera etapa, tambin contrubuyen a la reduccin del reactivo las cadenas laterales de algunos aminocidos (Tyr, Trp, y en menos medida Cys-Cys, Cys e His). Este ensayo es mucho ms sensible que la simple formacin del complejo biuret. Pueden medirse cantidades de protena del orden de unos pocos microgramos. La susceptibilidad a la composicin aminoacdica de las protenas es una de las desventajas del mtodo. Adems, algunos agentes reductores frecuentemente utilizados en preparaciones de protenas (-mercaptoetanol, ditiotreitol) y quelantes de metales (EDTA), interfieren el ensayo. Reactivos: Solucin alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 g/l en NaOH 0,1 M) Solucin de sulfato de cobre-tartrato sdico potsico (5 g/l CuSO4.5H2O en tartrato sdico potsico 10 g/l). Preprese en fresco mezclando las dos soluciones por separado. Solucin alcalina. Preprese el mismo da mezclando 50 ml de la primera solucin con 1 ml de la segunda. Reactivo de Folin-Ciocalteau. Diluya el reactivo comercial con un volumen igual de agua, el mismo da que se va a utilizar. Esta es una solucin de tungstato de sodio y molibdato de sodio en cido fosfrico y cido clorhdrico. Patrn de protena. Solucin de albmina 0,2 mg/ml Mtodo: A 1 ml de la muestra agregue 5 ml de solucin alcalina. Mezcle vigorosamente y deje reposar a temperatura ambiente por 10 minutos o ms. Agregue 0,5 ml del reactivo diluido de FolinCiocalteau en forma rpida y mezclando inmediatamente. Despus de 30 minutos lea la absorbancia contra el blanco apropiado a 750 nm. Determine la concentracin de protenas de una solucin problema despus de preparar una curva patrn.

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3) Absorcin ultravioleta de protenas y aminocidos: Las protenas contienen grupos funcionales que absorben luz en el UV y por lo tanto pueden ser utilizados para medir concentraciones por espectrofotometra. En particular, algunos residuos aminoacdicos absorben luz en el UV cercano. Por otra parte, el enlace peptdico en si mismo presenta un mximo de absorbancia a 190 nm.
Caractersticas espectrales de cromforos encontrados en las protenas Cromforo Triptofano (Trp) Tirosina (Tyr) Fenilalanina (Phe) Cistina (Cys-Cys) (nm)* 280 275 257 250 (M-1 cm-1)** 5500 1400 200 300

* longitud de onda de un mximo de absorbancia ** coeficiente de extincin molar

Absorbancia a 205 nm: La medida de la A205 (longitud de onda cercana al mximo del enlace peptdico) es especialmente til

Reactivos: Protenas (albmina y casena 5 g/l) Aminocidos (tirosina, triptofano y fenilalanina en agua 0,1 mM). Ajuste a pH 7,0 con HCl 10 mM y NaOH 10 mM. Mtodo: Haga un grfico del espectro de absorcin de los compuestos usados en el intervalo 190 400 nm. En el extremo inferior de longitudes de onda, debe diluirse la solucin de protenas aproximadamente 1/200. Cules aminocidos absorben ms fuertemente a 280 nm ?

DETERMINACIN DE PROTENAS POR ESPECTROFOTOMETRA 1. Objeto Determinar el contenido de protenas de una muestra utilizando el mtodo de Bradford. 2. Resumen El mtodo de Bradford c onsiste en la utilizacin de la reaccin entre la protena y el Coomassie Brilliant Blue G-250, que reacciona con aquella dando un color caracterstico. La posterior medicin de la absorbancia para distintas concentraciones de protena permite construir una curva de calibracin. 3. Reactivos cido fosfrico 85 % (p/v) Etanol 95% Solucin de Coomassie Brilliant Blue G-250: 100 mg se disuelven en 50 ml de etanol 95%. Solucin de NaCl 0,15 M. Se agregan 100 ml del cido fosfrico. Diluir a un volumen final de 1 litro. La solucin final es: 0,01 % (p/v) de Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7 % (p/v) etanol, y 8,5 % (p/v) en cido fosfrico. Soluciones de protena (SAB: seroalbmina bovina) al 0,1 % en 0,15 M NaCl. 4. Materiales e Instrumental

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Espectrofotmetro Micropipetas Tubos de ensayo Cubetas de plstico o vidrio (visible)

5. Procedimiento La solucin de protena conteniendo 10 a 100 g de protena en un volumen de hasta 0,1 ml se coloca en tubos de 12x100 mm. Se lleva a 0,1 ml con el buffer apropiado. Se agregan 5 ml del reactivo y se mezcla por inversin o vortex. Se mide la absorbancia a 595 nm despus de 2 minutos y antes de 1 hora en cubetas de 3 ml contra un blanco preparado con 0,1 ml del buffer apropiado y 5 ml del reactivo. Se grafica absorbancia vs la masa de protena (g), resultando una curva que ser usada para la resolucin de una muestra incgnita que ser entregada por el personal docente. Tabla N 6 Tubo N (por duplicado) 2 3 4 5 40 50 60 80 60 50 40 20 5 5 5 5

Blanco SAB (l) 0 muestra (l) NaCl (l) 100 reactivo (ml) 5 SAB: seroalbmina bovina.

1 20 80 5

6 100 5

M1 50 50 5

M2 100 5

6. Resultados Informar el contenido en protenas de la muestra incgnita.

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ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

Solucin (ml) Gel concentrador Geles separadores % de archilamida 4% 10% 7,5% A 3,75 3,75 B 2,0 C 1,3 10,0 7,5 D 0,105 0,11 0,11 E 0,004 0,012 0,012 F 0,05 0,15 0,15 Agua destilada 6,69 16,0 14,9 Volumen total 10,0 30,0 30,0 Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS) para protenas cidas y neutras

A: Solucin reguladora del gel separador B: Solucin reguladora del gel concentrador C: Solucin madre de acrilamida D: Solucin de persulfato de amonio E: Solucin de TEMED F: Solucin de SDS Tcnica para electroforesis en placa vertical: 1. Armar el molde formado por dos vidrios, bien desengrasados, separados por espaciadores del espesor deseado. 2. Preparar 15 ml de la solucin correspondiente al gel separador segn la porosidad deseada y verter en el molde . Dejar polimerizar. La polimerizacin debe tardar entre 10 y 15 min, en caso contrario, descartar. 3. Preparar 5 ml de la solucin correspondiente al gel concentrador, verterla en el molde hasta 0,5 cm del borde. Inmediatamente colocar el peine adecuado. Dejar polimerizar. Si la placa no se utiliza en el da debe guardarse en cmara hmeda a 4C. 4. Retirar el peine cuidadosamente, eliminando los restos de la solucin no polimerizada, lavando con agua destilada. 5. Colocar la solucin buffer Tris-glicina pH 8,3 del reservorio electrdico en el compartimiento inferior de la cuba en un volumen tal que permita el contacto con el gel Sembrar el volumen apropiado de la muestra ( alrededor de 20l por calle) 6. Conectar la fuente de poder y trabajar a 20 mA hasta que la muestra atraviese el gel concentrador y a partir de ese momento, a 25 mA o ms, siempre que no se supere un voltaje de 250V. 7. Finalizar la corrida cuando el azul de bromofenol alcance el borde inferior del gel. 8. Teir con azul brillante de Coomassie de 5 a 10 horas. 9. Decolorar por sucesivos pasajes en solucin decolorante. 10. Conservacin: A. En solucin de glicerol al 10% en H20 B. Por secado del gel empleando un equipo apropiado. C. Por secado del gel entre membranas de celofn. Tratamiento de las muestras:

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Mezclar el volumen adecuado de muestra con solucin buffer de muestra (Tris-HCl 0,125 M, 1% SDS, 1% -mercaptoetanol, gotas de azul de bromofenol y sacarosa 10%), de tal manera que la relacin protena:SDS sea 1:5 p/p. Colocar en bao a 100C durante 1 min. NOTA: Utilizar guantes para el armado de los geles debido a que la Acrilamida es muy toxica

Materiales y reactivos para las tcnicas electroforticas Electroforesis en gel de poliacrilamida: Buffer del gel separador (A) (Tris 0,375 M HCl, pH 8,8) Tris 45,4g HCl 1M 48,0ml Agua destilada c.s.p. 1000,0ml Titular hasta pH 8,8 con HCl 1M si es necesario. Buffer del gel concentrador (B) (Tris 0,125 M HCl, pH 6,8) Tris Llevar a pH 6,8 con HCl 1 M Agua destilada c.s.p. 15,0g 1000,0ml

Buffer de los reservorios electrdicos (Tris 0,025 M glicina 0,192 M, pH 8,3) Tris Glicina Agua destilada c.s.p. 3,0g (no) 14,4g 1000,0ml

Buffer de los reservorios electrdicos para SDS PAGE (Tris 0,025 mM glicina 0,192 mM, pH 8,3) Tris Glicina SDS Agua destilada c.s.p. Solucin madre de acrilamida (C) acrilamida 30,0g N,N mutilen bis archilamida 0,8g Agua destilada c.s.p. 100,0ml Agitar para disolver. Filtrar por Whatman N1 Conservar en frasco oscuro recubierto con papel metalizado, a 4C. Solucin de Persulfato de amonio (D) Persulfato de amonio 10% p/v 3,0g 14,4g 1,0g 1000,0ml

Solucin de TEMED (E) Solucin de N,N,N,N tetrametil-etilen-diamina (TEMED), densidad 0,78 g/ml. Solucin de SDS 20% p/v (F) Solucin colorante para protenas en PAGE Azul brillante de Coomassie R 250

0,2g

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Solucin lavadora o decolorante c.s.p. Solucin decolorante cido actico: metanol: agua destilada

100,0ml

1:3:6 v/v

Resultados: Establecer los Rf de los patrones de peso molecular y determinar los PM de las protenas incgnita

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